[Luận văn]nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng DP EG 2000

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ7

đ−ợc ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Đặng Hữu Anh

Lời cám ơn

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học khoá 14 chuyên ngành Thú y trường Đại học Nông nghiệp I, tôi đ7 nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo trong nhà trường Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo, cô giáo; đặc biệt

là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm-Bệnh lý Khoa Thú y trường Đại học Nông nghiệp I

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Bá Hiên, người đ7 tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Nguyễn Viết Không - Trưởng phòng Hoá sinh miễn dịch bệnh lý - Viện thú y quốc gia cùng các cán

bộ nghiên cứu trong bộ môn đ7 nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp và những người thân đ7 động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Rất mong nhận được sự đóng góp

ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn đồng nghiệp đối với đề tài nghiên cứu của tôi

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Đặng Hữu Anh

Mục lục

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các sơ đồ, đồ thị vii

Danh mục các hình và ảnh viii

1 mở đầu 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Error! Bookmark not defined 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Error! Bookmark not defined.

2 Tổng quan tài liệu Error! Bookmark not defined

2.1 Bệnh dịch tả vịt Error! Bookmark not defined. 2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh Error! Bookmark not defined 2.1.2 Truyền nhiễm học Error! Bookmark not defined 2.1.3 Triệu chứng và bệnh tích Error! Bookmark not defined 2.1.4 Chẩn đoán Error! Bookmark not defined 2.1.5 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt Error! Bookmark not defined

2.2 Virus gây bệnh dịch tả vịt Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Hình thái, kích thước Error! Bookmark not defined 2.2.2 Sức đề kháng Error! Bookmark not defined 2.2.3 Độc lực Error! Bookmark not defined 2.2.4 Đặc tính nuôi cấy Error! Bookmark not defined 2.3 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt Error! Bookmark not defined.

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Error! Bookmark not defined 2.3.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Error! Bookmark not defined 2.3.3 Độ dài miễn dịch Error! Bookmark not defined

3 Nội dung, Nguyên liệu, Phương pháp nghiên cứu Error!

Bookmark not defined

3.1 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.2 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined 3.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined. 3.3.1 Phương pháp xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà Error! Bookmark not defined

3.3.2 Phương pháp xác định chỉ số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000Error! Bookmark not defined

3.3.3 Phương pháp xác định chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000Error! Bookmark not defined

3.3.4 Phương pháp xác định mức độ tương đồng kháng nguyên giữa chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 và chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 (phương pháp PCR) Error! Bookmark not defined.3.3.5 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùngError! Bookmark not defined.3.3.6 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn Error! Bookmark not defined.3.3.7 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lựcError! Bookmark not defined.3.3.8 Phương pháp xác định khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined

4 Kết quả nghiên cứu và thảo luậnError! Bookmark not defined

4.1 Kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined.4.1.1 Khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà Error! Bookmark not defined.4.1.2 Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined.4.1.3 Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined.4.1.4 Xác định mức độ tương đồng kháng nguyên giữa chủng virus nhược

độc dịch tả vịt DP-EG-2000 và chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 Error! Bookmark not defined.4.2 Hoàn thiện quy trình nuôi cấy virus sản xuất vacxin Error! Bookmark not defined.

4.2.1 Kiểm định và bảo quản giống Error! Bookmark not defined.4.2.2 Chuẩn bị trứng Error! Bookmark not defined.4.2.3 Cấy virus sản xuất vacxin Error! Bookmark not defined 4.2.4 Thu hoạch, xử lý và bảo quản vacxin Error! Bookmark not defined.4.2.5 Sử dụng vacxin Error! Bookmark not defined.4.3 hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm vacxin Error! Bookmark not defined.

4.3.1 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin Error! Bookmark not defined

4.3.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin Error! Bookmark not defined

4.3.3 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin Error! Bookmark not

4.3.4 Kết quả xác định khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi được tiêm phòng vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined

4.4 kết quả ứng dụng vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 trong phòng bệnh và can thiệp dịch Error! Bookmark not defined.

4.4.1 Kết quả ứng dụng vacxin trong phòng bệnh Error! Bookmark not defined

4.4.2 Kết quả sử dụng vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 trong can thiệp dịch tại một số địa phương Error! Bookmark not defined

5 Kết luận và đề nghị Error! Bookmark not defined

5.1 Kết Luận Error! Bookmark not defined 5.2 đề nghị Error! Bookmark not defined.

Tài liệu tham khảo Error! Bookmark not defined

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t trong luËn v¨n

CPE : Cytopathogene effect

DEF : Duck Embryo Fibroblast

DEV : Duck enteritis virus

DNA : Dezoxy ribonucleic acid

DVE : Duck virus enteritis

ELD50 : 50 percent Embryo Lethal Dose

EID50 : 50 percent Embryo Infective Dose

LD50 : 50 percent Lethal Dose

NI : Neutralization Index

OIE : Office International des Epizooties

PBS : Phosphate Buffered Saline

PCR : Polymerase chain reaction

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined.Bảng 4.6 Kết quả xác định chỉ tiêu hiệu lực của vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined.Bảng 4.7 Biến động hàm lượng kháng thể của vịt được tiêm vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 Error! Bookmark not defined Bảng 4.8 Kết quả sử dụng vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 vào phòng bệnh cho vịt ở một số địa phương Error! Bookmark not defined.Bảng 4.9 Kết quả sử dụng vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 trong can thiệp dịch tại một số địa phương Error! Bookmark not defined

Danh mục các sơ đồ, đồ thị

Số sơ đồ,

Sơ đồ 1 Sơ đồ chẩn đoán bệnh dịch tả vịt 12 Sơ đồ 2 Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 62

Đồ thị 1 Biến động hàm l−ợng kháng thể của vịt đ−ợc tiêm vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 74

vi

Danh mục các hình và ảnh

Số hình,

Hình 1 Giản đồ một phần đoạn gen DNA-polymerase virus dịch tả vịt của Việt Nam sau khi giải trình trình tự và thành phần nucleotit và axit amin của

gen này 57

Hình 2 So sánh trình tự nucleotit của chủng virus cường độc dịch tả vịt phân lập ở Việt Nam (ký hiệu: DEV-VN) và chủng vacxin của thế giới (DEV-vx) 58

ảnh 4.1 Phôi gà đối chứng 49

ảnh 4.2 Phôi gà xuất huyết, còi cọc, gan phôi gà sưng, xuất huyết 49

ảnh 4.3 Kết quả chạy PCR xác định mức độ tương đồng kháng nguyên giữa chủng virus nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 và chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 56

ảnh 4.4 Vịt liệt chân 69

ảnh 4.5 Lách hoại tử 69

ảnh 4.6 Ruột xuất huyết 69

ảnh 4.7 Gan sưng, xuất huyết, túi mật sưng 69-

mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Vịt là loài thuỷ cầm được chăn nuôi nhiều nhất Trên thế giới hàng năm

có khoảng 550 đến 600 triệu vịt được chăn nuôi, trong đó ở châu á chiếm tới

80 - 86% tổng đàn vịt Nước ta hàng năm đàn vịt sản xuất khoảng 30.000 đến 40.000 tấn thịt hơi; 0,8 đến 1 tỷ quả trứng và khoảng 1000 đến 1500 tấn lông (Trịnh Quang Khuê, 2003) [25] Theo số liệu thống kê của FAO (2003) [42]: Tổng số vịt của Việt Nam là 60 triệu con, đứng thứ 2 thế giới, sau Trung Quốc

Một trong những bệnh quan trọng nhất và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi vịt là bệnh dịch tả vịt Căn bệnh là một loại DNA virus thuộc

họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus Bệnh gây nên tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt với tỷ lệ chết cao lên đến 90% Theo Quyết định số 63/2005/QĐ

- BNN [5] và Quyết định số 64/2005/QĐ - BNN [6] được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 thì bệnh dịch tả vịt được coi là bệnh nguy hiểm của động vật, phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh bắt buộc Bệnh dịch tả vịt là một trong 7 bệnh phải tiêm phòng bắt buộc và yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100%

Nhận thức được tầm quan trọng của việc phòng chống bệnh dịch tả vịt,

đ` có nhiều nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh dịch tả vịt được tiến hành Nhiều loại vacxin dịch tả vịt đ` được sản xuất và lưu hành trên thị trường Việt Nam Song việc sử dụng vacxin chủ yếu lại do người chăn nuôi quyết định Hơn nữa do khâu chăn nuôi chưa hợp lý, vệ sinh phòng bệnh chưa triệt để đ` ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả bảo hộ của vacxin Gần đây bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm-Bệnh lý (VSV-TN-BL) trường Đại học Nông nghiệp I đang có giống virus vacxin dịch tả vịt nhược độc chủng DP-EG-2000

xuất xứ từ nước ngoài Những nghiên cứu bước đầu về các chỉ tiêu vô trùng,

an toàn và hiệu lực của vacxin này đối với đàn vịt nuôi ở Việt Nam đ` cho kết quả tốt

Nhằm đóng góp thêm thông tin khoa học về tình hình bệnh, góp phần phòng chống bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam đạt hiệu quả cao Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng DP - EG - 2000"

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Kiểm tra sự ổn định một số đặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000

- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin

- Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin

- Bước đầu ứng dụng vacxin vào thực tế sản xuất

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Là cơ sở đề ra biện pháp phòng trị bệnh dịch tả vịt có hiệu quả cao

- Là cơ sở để sử dụng chủng virus nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 vào sản xuất vacxin phòng bệnh cho đàn vịt ở Việt Nam

2 Tổng quan tài liệu

Bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1923 tại Hà Lan ở một

đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày Baudet (1923) [36] khi nghiên cứu về bệnh này không tìm thấy vi khuẩn nhưng đ` gây được bệnh cho vịt khỏe bằng nước chiết phủ tạng của vịt ốm sau khi qua nến lọc Chamberland L3 Sau đó ông tiếp tục gây bệnh cho thỏ và gà nhưng không thành công Ông đ` kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus

Năm 1930, tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một trường hợp bệnh tương tự xảy ra ở một đàn vịt 150 con Năm 1942, dịch lại tái phát ở đất nước này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt Lần này, Boss (1943) [37] đ` phân lập ra virus và cấy truyền

18 đời trên vịt

Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss (1943) phân lập được, Jansen và Kunst đ` đề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) [58] Bệnh dịch tả vịt còn có các tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà Lan), Pest du canard (Pháp), Enteupest (Đức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006) [4]

* Phân bố bệnh

Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt đ` được Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện bệnh ở Anh Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra ở

Đức Do sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu Âu,

đặc biệt là Đức đ` đề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005 Tuy nhiên tỷ lệ chết đ` tăng đột biến trong những ngày này Tổng cộng có 17/124 (14%) loài chim trưởng thành và 149/184 (81%) loài chim 1 năm tuổi bị chết Phản ứng trung hoà sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đ` phát hiện vịt và các loài chim chết do bệnh dịch tả vịt (Kaleta E.F & cs, 2007) [50]

Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt được chẩn đoán lần đầu tiên ở tây bán cầu vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk, New York (Leibovitz & Hwang, 1967) [53] Vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thuỷ cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota Vụ dịch này đ` tấn công với sự tàn phá nhanh chóng và khốc liệt Gần 40% của 100.000 loài thuỷ cầm trú đông, hầu hết là vịt trời đ` bị chết Vào thời kỳ cao điểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1000 chim Tất cả những loài thuỷ cầm đại diện tại hồ Andes đều bị gánh chịu bao gồm ngỗng Canada, vịt trời, vịt đen, vịt lai nhọn đuôi, vịt trời Mỹ, vịt gỗ, vịt

mỏ nhọn Mỹ đầu đỏ mắt vàng, vịt Nga và vịt Bắc Kinh Những loài chim còn sống sau vụ dịch ở hồ Andes đ` phân tán rộng khắp vùng Bắc Mỹ Những mẫu máu được lấy từ những vịt sống sót ở hồ Andes đ` chỉ ra rằng có tới 30% số vịt đ` bị phơi nhiễm virus Tại tiểu bang Michigan (Mỹ) bệnh dịch tả vịt đ`

được báo cáo vào năm 1979 trên vịt Nga và vịt trời [55] Brand C.J., and D.E Docherty (1984) [38] đ` xác nhận bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Mỹ Năm 1993 bệnh dịch tả vịt lại tái phát ở hồ Finger (Mỹ)

Tại Châu á, năm 1944 bệnh xảy ra ở ấn Độ và tái phát vào năm 1963 Năm 1968, Jansen công bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc Khi nghiên cứu về bệnh này, Mukerji xác nhận chủng virus của ấn Độ và chủng virus của Hà Lan có cùng tính chất kháng nguyên Năm 1976, 1977 bệnh đ` phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Voxapeer Suwathanaviroij, 1978) [65] Năm

1979 đ` có báo cáo về sự xuất hiện bệnh dịch tả vịt ở đàn vịt trời và vịt Muscovy

* Bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam

Năm 1963, tại Cao Bằng, bác sỹ thú y Đặng Trần Dũng cho biết bệnh dịch tả vịt đ` xuất hiện làm thiệt hại trên 3000 vịt

Tháng 5 năm 1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt đ` làm thiệt hại tới 15000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội Chính từ ổ dịch này đ` phân lập ra virus và có thể nuôi cấy virus này trên màng niệu và xoang niệu phôi vịt 10 ngày tuổi (Trần Minh Châu, 1980) [9] Qua nghiên cứu thấy virus gây bệnh điển hình cho vịt và không có đặc tính ng−ng kết hồng cầu

gà Vũ Đình Tiếu và Mai Anh cho biết dùng vacxin dịch tả vịt để tiêm cho vịt có thể ngăn chặn đ−ợc dịch Từ đó bệnh dịch tả vịt chính thức đ−ợc công nhận có tại Việt Nam Tiếp theo, dịch đ` phát ra ở Hà Nội, Thanh Hoá, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nam Hà (cũ), Thái Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Cao Bằng, Hải H−ng (cũ)

Năm 1971, dịch lại phát ra ồ ạt ở các tỉnh Ninh Bình, Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc (cũ) và thành phố Hải Phòng Nhờ có tiêm phòng vacxin nên diện dịch đ` bị thu hẹp lại, chỉ còn âm ỉ ở một số cơ sở chăn nuôi phân tán

Năm 1980, dịch phát ra mạnh mẽ ở Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hoá và

đồng bằng sông Cửu Long Từ đó dịch lan ra tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang,

Năm 1989, Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh [34] cho biết đàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi Các tác giả đ` tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên

đàn vịt ở Phú Khánh

Năm 1999, Nguyễn Đức Hiền [20] đ` chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt ở Cần Thơ và theo kết quả chẩn đoán lâm sàng bệnh dịch tả vịt vào năm 2000-2002 của chính tác giả và cộng sự thì trên 1176 vịt được mổ khám có 455 vịt được chẩn đoán là mắc bệnh dịch tả vịt

Theo thống kê mới nhất của OIE (2006) [59]; Việt Nam là một trong những nước bị bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất Năm 1999, bệnh đ` làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt Năm 2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết 15.680 con và năm 2004 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (xem bảng 2.1)

Như vậy, bệnh dịch tả vịt là căn bệnh cần được quan tâm, nghiên cứu sâu nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi

2.1.2 Truyền nhiễm học

2.1.2.1 Loài mắc bệnh

Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt đầu

đỏ, … Các loài thuỷ cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim hoang d` cũng cảm nhiễm bệnh (Friend, 1973) [44], (Docherty D.E & Franson C.J., 1992) [41] Vịt là loài cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết có thể lên tới 100% Mức độ cảm nhiễm có thể khác nhau tùy theo giống vịt Loài vịt nhọn đuôi

được coi là ít cảm nhiễm nhất đối với bệnh (Sandhu T.S & Leibovitz L., 2003) [60] Theo Vandorssen (1955) [64] thì trong họ Anatideae, chỉ loài vịt xám

được coi là đề kháng với bệnh Các động vật khác như bồ câu, công và động

Kaleta EF & cs (2007) [50] cho biết tại vụ dịch ở châu Âu vào năm

2005, ngoài 34 loài thuộc bộ Anseriformes còn có thêm 14 loài thuỷ cầm cảm nhiễm với bệnh dịch tả vịt

Trong phòng thí nghiệm, vịt con là động vật thí nghiệm cảm nhiễm nhất

đối với bệnh Virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968) [49]

2.1.2.2 Mùa vụ phát bệnh

Bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4-6 Sự bùng nổ dịch bệnh phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh hưởng của nhân

tố stress (Sarmah R & Sarmah A.K., 1996) [61]

Theo Phạm Sỹ Lăng (2002) [28], ở Việt Nam, bệnh dịch tả vịt xảy ra quanh năm nhưng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời

vụ thu hoạch lúa: Vụ chiêm tháng 5-6, vụ mùa tháng 10-11

2.1.2.3 Lứa tuổi mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt từ 15 ngày tuổi trở đi bị nhiễm nhiều nhất (Nguyễn Xuân Bình, 2006) [4]

2.1.2.4 Chất chứa virus

ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất

là ở gan, lách và óc Tại Việt Nam đ` nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt bị gây nhiễm nhân tạo Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, virus đ` nhân lên, xâm nhập vào máu nhưng số lượng còn ít Đến 48 giờ, virus đ` xuất hiện trong nước mắt, nước mũi Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì tế bào niêm mạc đường tiêu hoá do tác động của virus bị huỷ hoại, tróc ra cùng với dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987) [11] Vịt bệnh mang virus rất lâu và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính Người ta

có thể phát hiện bệnh bằng kiểm tra nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi vịt

Shawky S., Schat K.A (2002) [63] cho biết virus dịch tả vịt có thể tiềm tàng trong cơ thể vịt và có khả năng tái hoạt động trở lại Sau 3 tuần gây nhiễm không tìm thấy virus dịch tả vịt trong lỗ huyệt nhưng 7-9 tuần sau gây nhiễm, bằng phản ứng PCR, tác giả đ` phát hiện thấy DNA virus dịch tả vịt trong thần kinh trung ương, hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức và túi Bursa 2.1.2.5 Đường xâm nhập và cách lây lan

Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi

Trong tự nhiên, đường xâm nhập chủ yếu của virus dịch tả vịt là đường tiêu hoá Vịt bệnh bài xuất căn bệnh theo phân, nước mắt, nước mũi làm ô nhiễm thức ăn nước uống và bệnh lây lan sang vịt khoẻ và các động vật cảm nhiễm khác Jansen (1964) [48] cho biết, nguồn nước và các động vật thuỷ sinh trong đó cũng đóng vai trò nhất định trong việc truyền lây căn bệnh Khi dịch xảy ra, việc bán chạy vịt bệnh, mổ thịt vịt ốm đều làm cho bệnh lan đi rất nhanh và xa Bệnh lây lan rất nhanh và mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess E.C & TM Yuill, 1981) [39]

2.1.3 Triệu chứng và bệnh tích

2.1.3.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh đối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần đầu tiên xảy ra hay đ` từng xảy ra đối với đàn vịt

ở đàn vịt con bệnh thường bắt đầu bằng những dấu hiệu: Nhiều con tự nhiên lờ đờ, không thích vận động, không muốn xuống nước ở vịt lớn khi lùa

ăn một số con rớt lại sau đàn Bắt xem thấy chân có dấu hiệu liệt, thân nhiệt cao ở đàn vịt đẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống, có khi

ngừng đẻ hẳn Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, đứng một chân, đầu rúc vào cánh Trong đàn vịt nhiều con có tiếng kêu khản đặc Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt đỏ Lúc đầu chảy nhiều nước mắt làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt Sau nước mắt đặc lại có màu vàng như mủ đóng đầy khoé mắt và có khi làm 2

mi mắt dính lại với nhau Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi Nhiều con đầu sưng to, sờ nắn có cảm giác đầu mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất lo`ng, có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh, 2001) [32]

Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác đáng chú ý như: Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh Vịt tì mỏ xuống đất Vịt đực bị

sa dương vật, niêm mạc có những vết loét Vịt đẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm Quang Hùng, 2003) [24] Sau khi xuất hiện triệu chứng được 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy rạc, tứ chi liệt, nằm một chỗ, rũ cánh, thân nhiệt giảm dần rồi chết

2.1.3.2 Bệnh tích

Xác chết gầy, bẩn; da vùng đầu, cổ, ngực, bụng, đùi xuất huyết lấm tấm Tổ chức liên kết dưới da vùng đầu, cổ thuỷ thũng, có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng Mổ khám các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ tim thì thấy ở các cơ quan này đều biểu hiện bệnh tích sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những điểm hoại tử màu trắng đục, to bằng đầu đinh ghim hoặc to hơn (Trần Kim Anh, 2004) [2]

Bệnh tích của bệnh dịch tả vịt đặc trưng là ở đường tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn

nhìn từ ngoài vào thấy có màu nâu hoặc tím rất đặc trưng (Trần Minh Châu, 1996) [12]

Phạm Quang Hùng (2003) [24] cho biết ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những đặc trưng riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết mô và tổn thương bộ máy sinh sản Còn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu

ở các Lymphoid

Nguyễn Đức Hiền (2005) [21] công bố tỷ lệ bệnh tích đặc trưng trên vịt thực nghiệm, trong đó: Niêm mạc mắt xuất huyết (95,45%); phổi viêm, tụ máu, thuỷ thũng (95,45%); dạ dày tuyến xuất huyết (100%); ruột non xuất huyết viêm loét (100%); ruột già xuất huyết viêm loét (97,73%); lách tụ máu

có nốt hoại tử và gan xuất huyết có nốt hoại tử (100%)

2.1.4 Chẩn đoán

Để chẩn đoán bệnh dịch tả vịt có nhiều phương pháp được sử dụng, dưới đây là sơ đồ chẩn đoán bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn 10 TCN 815-2006 [8]

2.1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng

Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, bệnh sử và truyền lây của bệnh như: Bệnh xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi; bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày

Kiểm tra triệu chứng: Vịt giảm ăn, mất thăng bằng, ỉa phân lo`ng, xù lông Mắt vịt có dử, mí mắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi

Đặc điểm dịch tễ học lâm sàng Kiểm tra

Lấy mẫu bệnh phẩm

Phát hiện kháng thể (SN) Phát hiện virus

Phân lập virus PCR

Giám định (VN)

Kiểm tra bệnh tích: Vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc màu Con

đực trưởng thành có thể xảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí ở con cái quan sát thấy các nang trứng bị xuất huyết Mạch máu bị tổn thương, tổn thương hệ bạch huyết, thoái hoá nhu mô, ống tiêu hoá có nhiều chất nhờn Đối với bệnh tích vi thể thấy xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các biểu mô của hệ thống tiêu hoá

Chẩn đoán phân biệt bệnh dịch tả vịt với một số bệnh sau:

Bệnh viêm gan do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1-3 tuần tuổi Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt, ít có hiện tượng hoại tử

Bệnh tụ huyết trùng và phó thương hàn: Do Pasteurella và Salmonella gây nên Đây là những vi khuẩn thường trú trong cơ thể vịt, ngay cả ở vịt khoẻ Cho nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khó khăn cho công việc chẩn đoán bệnh Tuy nhiên nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phó thương hàn đơn thuần thì khi điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu có thể nhanh chóng dập tắt dịch

- Ly tâm 2.000 vòng/15ph

- Lấy dịch trong ở trên

- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi trường thạch máu

b Phân lập virus

* Phân lập trên vịt con

Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đ` được xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt giống như đ` mô tả ở phần 2.1.3

- Thu hoạch gan phôi và nước niệu để giám định virus

* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đ` xử lý: 500àl/lỗ hoặc lọ Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập

- Quan sát bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc trưng với đám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó

- Thu hoạch hỗn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám định virus

c Phương pháp giám định virus

* Phương pháp trung hoà trên trứng vịt có phôi (VN-Virus Neutralization):

- Chuẩn bị:

+ Pha lo`ng virus phân lập: Nồng độ 10-1-10-9 với dung dịch PBS

+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ virus đ` pha lo`ng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đ` pha lo`ng theo tỷ lệ 1:1

* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):

- Chuẩn bị:

+ Tế bào DEF trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đ` nuôi cấy được 2-3 ngày + Pha lo`ng virus phân lập: các nồng độ 10-1-10-9 với môi trường nuôi cấy MEM

+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ virus đ` pha lo`ng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đ` pha lo`ng theo tỷ lệ 1:1

- Tiến hành:

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đ` nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ), 100àl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ

+ ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h

+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100àl/lỗ

+ Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co tròn và tụ lại thành đám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử

- Đánh giá kết quả:

+ Tính toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu thuỷ cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hoà SN), kết luận thủy cầm đ` nhiễm virus dịch tả vịt

2.1.4.3 Chẩn đoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Năm 1999, Pritchard L.I & cs [56] đ` phát triển phương pháp PCR để phục vụ cho việc phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chính xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở ngỗng

Phương pháp PCR hay phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, dựa trên nguyên tắc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt để tổng hợp nên một mạch DNA mới bổ sung với đoạn DNA khuôn mẫu Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

DNA mới tử mạch khuôn Tất cả những DNA polymerase đều cần những đoạn mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003) [14]; (Võ Thị Thương Lan, 2002) [26]

Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia:

1) DNA làm khuôn;

2) Hai đoạn mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược);

3) Enzym DNA-polymerase chịu nhiệt;

4) Môi trường đệm cung cấp ion Magiê (Mg++);

5) Phần nucleotid ở dạng deoxynucleotid (ký hiệu dNTP);

6) Nước tinh khiết

Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ:

1) Bung liên kết của DNA: Được thực hiện ở nhiệt độ 90°C- 98°C trong vài giây đến vài phút, các phân tử DNA xoắn kép sẽ bị tách ra, tạo nên các sợi

đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym DNA- polymerase xúc tác tổng hợp

2) Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi): Nhiệt độ được hạ xuống 37- 68°C, để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn

3) Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài): Nhiệt độ được nâng lên 68°C- 72°C trong vài chục giây đến vài chục phút, để các sợi DNA vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA sợi kép, chính là sản phẩm PCR

Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25- 35- 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối

cùng, có một chu kỳ bổ sung được duy trì ở nhiệt độ 72°C trong 5- 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn DNA mới xoắn lại, tạo nên sản phẩm PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm Kết quả là từ một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần (2n sau n chu kỳ) mà không cần đến tế bào sinh vật

Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%-2%,

Kỹ thuật điện di trên gel là hết sức quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở

pH trung tính, chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn Kiểu loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid Agarose được chiết xuất từ tảo biển, có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45°C, trong dung dịch đệm ở nồng độ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v) Khi làm nguội (dưới 45°C), agarose

đông lại thành gel Gel agarose thường được dùng để chạy trong máy điện di Gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi đưa

vào gel chạy tới đầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002) [22]

Theo Vũ Minh Thục (2004) [35], nhược điểm chính của phương pháp PCR là sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả

“dương tính sai”, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) [46] đ` khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đ` được kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gà, Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm

Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt Với hai đoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào

2.1.5 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt

2.1.5.1 Biện pháp can thiệp

Bệnh dịch tả vịt là bệnh không chữa được Nên giết chết và chôn sâu những vịt bị bệnh chết hoặc bệnh quá nặng Tuy nhiên với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách vacxin nhược độc cho toàn đàn Những vịt nào đ` bị nhiễm virus thì sẽ phát bệnh ngay, còn những vịt chưa bị nhiễm virus sẽ được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980) [9] Nên tăng cường thêm các biện pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt (sử dụng chất điện giải và vitamin)

Theo Archie Hunter (2002) [3] nếu có ổ dịch xảy ra, vịt khoẻ mạnh có tiếp xúc với mầm bệnh phải được tiêm phòng vì vịt phát triển miễn dịch chỉ trong một ngày sau khi tiêm phòng

2.1.5.2 Phòng bệnh

* Vệ sinh phòng bệnh

Đối với những nơi chưa có bệnh tốt nhất nên tự túc con giống Khi tạo

đàn không nên nhập chung nhiều đàn nhỏ lại Lò ấp trứng cũng không nên ấp trứng của quá nhiều đàn Sau mỗi lần ấp trứng cần tẩy uế lò ấp rồi sát trùng kỹ bằng hơi formol (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [31]

Lê Hồng Mận (2005) [30] khuyến cáo: Không chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi có nhiều nguồn nước chảy tới để đề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước Tuyệt đối không cho các loại gia cầm, thuỷ cầm khác vào trại Nên tẩy uế sát trùng định kỳ chuồng nuôi

Phạm Quang Hùng (2003) [24] nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ sinh như sau:

- Chuồng trại vịt cách xa khu dân cư Cổng trại phải có hố sát trùng (thường sát trùng bằng Cloramin 3%) Hạn chế người đi lại, người ra vào trại phải sát trùng giày dép, tay chân

- Điều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ Thức ăn, nước uống phải vệ sinh Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại

- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ

* Tiêm phòng bằng vacxin

- Vacxin để phòng bệnh dịch tả vịt có 2 loại là vacxin vô hoạt và vacxin nhược độc

+ Vacxin vô hoạt:

Để vô hoạt virus dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC (β propiolactone) Tại Việt Nam đ` chế thử vacxin vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan Theo OIE (2000) [58] vacxin vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất

+ Vacxin nhược độc:

Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus nhược

độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt và virus dịch tả vịt chủng Jansen thích nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp Đây là 2 loại vacxin có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông khô (Lê Hồng Mận 1999) [29]

- Về lịch trình sử dụng vacxin:

+ Với đàn vịt ở vùng dịch bị uy hiếp, cần tiêm phòng cho vịt con ngay sau khi vịt nở

+ Vịt nuôi thịt chỉ cần tiêm phòng 1 lần ở nơi không bị dịch uy hiếp,

có thể tiêm phòng cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi

+ Đối với vịt đẻ và vịt giống, lịch tiêm phòng yêu cầu chặt chẽ hơn Nguyễn Như Thanh (2001) [32], Phạm Quang Hùng (2003) [24] đề nghị tiêm phòng ngay sau khi vịt nở từ đàn vịt bố mẹ đ` được phòng bệnh dịch tả vịt Sau 45 ngày cần tiêm lại và sau 1 năm thì cứ 6 tháng lại tiêm phòng 1lần Lê Hồng Mận (1999) [29] cho rằng cần tiến hành tiêm phòng 2 lần/năm đối với vịt lớn; lần 1: cuối xuân đầu hè; lần 2: sau lần thứ nhất 6 tháng Ngoài ra tác

giả Trần Minh Châu còn đề nghị tiêm củng cố cho vịt con 10 ngày tuổi bằng vacxin viêm gan để đảm bảo cho đàn vịt nuôi tại những nơi bị ô nhiễm nặng

+ Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn [5] việc tiêm phòng vacxin bắt buộc đối với bệnh dịch tả vịt gồm:

Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi

Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia

đình trong phạm vi cả nước

Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi

Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin

+ Đối với trường hợp đàn vịt bố mẹ được tiêm vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, Nguyễn Xuân Bình (2006) [4] cho rằng không cần tiêm cho vịt con trước 2 tuần tuổi Do trong thời gian này, trong vịt con vẫn còn tồn tại kháng thể được truyền qua lòng đỏ trứng nên có khả năng xảy ra phản ứng trung hoà làm giảm hiệu lực của vacxin

2.1.5.3 Một số thông tin về vacxin dịch tả vịt ở Việt Nam

Năm 1969, chủng virus nhược độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt đ`

được sử dụng để sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam Khi nuôi cấy trên phôi vịt, virus gây bệnh tích phôi ổn định, thời gian chết phôi trung bình là 100 ± 24 giờ Trong nước niệu nang, hàm lượng virus có ELD50 lúc 72 giờ là 10 -4,75/0,2 ml Vacxin khi sử dụng pha 1/200 tiêm vào dưới da cho vịt con với liều 0,2 ml/con và tiêm cho vịt lớn với liều 1 ml/con Vacxin tạo được miễn dịch tốt cho đàn vịt Vịt con 1 ngày tuổi sau khi tiêm vacxin được bảo hộ chắc chắn 100% đến 45 ngày tuổi, vịt lớn kéo dài miễn dịch tới 9 tháng

Trần Minh Châu (1987) [11] đ` nghiên cứu chủng vacxin nhược độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà Tác giả cho biết, chủng virus này gây chết

phôi gà rất ổn định, thời gian chết phôi 72-120 giờ Virus vacxin có ELD50 từ

10-3,31/0,2 ml đến 10-4,5/0,2 ml Vacxin khi sử dụng an toàn cho vịt nhưng về hiệu lực cần nghiên cứu thêm Tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vô hoạt và đưa ra kết luận: Vacxin vô hoạt cũng tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng đáp ứng miễn dịch không mạnh mà giá thành lại cao

Lê Văn L`nh (1991) [27] nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vacxin dịch tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn định khi nuôi cấy trên phôi gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp; chỉ số ELD50 biến động trong khoảng

từ 10-3,31/0,2 ml đến 10-3,36/0,2 ml; CPE50 biến động từ 10-4,36 đến 10-4,54 Vacxin an toàn cho mọi lứa tuổi vịt, hiệu lực của vacxin cao Vacxin được chế biến dưới 2 dạng là vacxin tươi và vacxin đông khô

Vacxin tươi thường được đóng ở ampoul 100 liều, chỉ bảo quản tối đa

là 4 tháng ở kho lạnh và phải dùng không quá 6 giờ khi đ` pha lo`ng vacxin bằng nước sinh lý Vacxin đông khô thì thời gian bảo quản dài hơn (khoảng

1 năm) và ít bị mất hiệu lực khi gặp điều kiện bất lợi Vacxin đông khô có thể đóng ampoul 100 liều hoặc chai có từ 500-1000 liều (Nguyễn Như Thanh, 2001) [32] Tuỳ theo liều đóng vacxin mà pha lo`ng với nước sinh lý

đủ cho 0,2ml/vịt con và 0,3-0,5ml/vịt lớn Đường tiêm chủ yếu là dưới da hoặc bắp lườn

Nguyễn Đức Hiền (1999) [20] nghiên cứu và kết luận phương pháp nhỏ mắt hoặc tiêm bắp hoặc kết hợp cả hai đều cho đáp ứng miễn dịch tương đối giống nhau và đạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%

Nguyễn Ngọc Huân (2006) [23] khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt

đông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi ở nông hộ

Theo Quyết định số 04/2006/QĐ-BNN [7] ngày 12 tháng 01 năm 2006 công bố danh mục vacxin, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hoá chất dùng trong

thú y được phép lưu hành tại Việt Nam thì tại Việt Nam đang lưu hành 2 dòng sản phẩm vacxin phòng bệnh dịch tả vịt đều ở dạng đông khô đóng lọ từ 100

đến 1000 liều mang số đăng ký TW-XI-14 và TW-IV-5

Từ năm 2000 đến nay, bộ môn VSV-TN-BL trường ĐHNNI đang có những nghiên cứu về việc chế tạo vacxin mới với chủng virus cường độc dịch tả vịt DP-EG-2000 có xuất xứ từ nước ngoài Những kết quả thử nghiệm ban

đầu khá khả quan, dần đáp ứng được yêu cầu trong nghiên cứu và sản xuất 2.2 Virus gây bệnh dịch tả vịt

Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2001) [32] Theo Li H., Liu S., Kong X (2006) [54] virus gây bệnh dịch tả vịt có thể

được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae

là 93,5 nm; trong nguyên sinh chất có đường kính là 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm

Theo Trần Minh Châu (1980) [9], ở Việt Nam, virus dịch tả vịt cường

độc chủng 769 có hình thái và cấu trúc giống như virus mà Proctor S.M., Pearson G.L., Leibovitz L (1975) [57] đ` mô tả

Virus dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua được màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc; Hess và Dardini (1968) [47] đ` nhận xét, virus dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen và virus cường độc có kích thước 150 - 250 nm

2.2.2 Sức đề kháng

Với nhiệt độ, ở 220C virus giảm dần tính gây nhiễm đến 30 ngày thì chết Virus bị mất hoạt tính ở 500C sau 2 giờ 30 phút Nếu được sấy khô bằng CaCl2 thì sau 9 ngày virus bị chết (Hess, 1968) [47] Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [31] ở 00C - 40C virus không bảo quản được 3 tháng nhưng ngâm trong dung dịch Glyxerin 50% thì virus giữ được độc lực trong thời gian trên Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [32] trong điều kiện lạnh từ -100C đến -

200C, virus có thể tồn tại rất lâu Làm đông khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm mà còn không làm mất độc lực của virus

Với pH môi trường, virus ổn định ở pH từ 5-10 và bị bất hoạt khi pH <

3 hoặc pH > 10

Với một số nhân tố hoá học, virus dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform Dưới tác dụng của 2 chất này, virus bị phá huỷ Kunst (1967) [50] cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh hưởng tới virus Theo Nguyễn Thát (1975) [33] thì cồn 750 diệt virus trong 5-

30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút NaOH 2% và NH4OH 0,5%

ở 220C cũng giết chết virus sau 30 phút

Với một số enzym, virus dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tuỵ phá huỷ (Dardini A.H and W.R Hess, 1968) [40]

ở môi trường ngoài, với điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, virus có thể tồn tại tới 30 ngày (OIE, 2006) [59] Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài, 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có

thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt chúng vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987) [11]

Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc Điểm (2005) [16] cũng đ` phân lập thành công chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy

Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu Trong tế bào phôi gà, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình thành Plague Khi có mặt bổ thể, kháng thể dịch tả vịt có khả năng làm tan tế bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus

* Nuôi cấy trên phôi

Theo Jansen (1968) [49] virus dịch tả vịt sau khi đ` tiêm truyền trên phôi vịt sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi gà

Tuy vậy, khi nuôi cấy trên phôi vịt, tỷ lệ chết của phôi không cao và theo kinh nghiệm thì virus dịch tả vịt của Việt Nam có vẻ như khó nuôi cấy trên phôi gà (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [31]

Về khả năng nhân lên trên phôi của virus dịch tả vịt, Trần Minh Châu (1980) [9] cho rằng màng nhung niệu là đường tiêm truyền tốt nhất Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [32], nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, đầu; gan và quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày

Virus dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3-5 ngày Virus cường độc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi gà Đối với phôi gà 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi

Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà độc lực của virus

sẽ giảm dần với vịt Người ta sử dụng những chủng virus nhược độc này qua phôi gà, phôi vịt để chế tạo vacxin

* Nuôi cấy trên tế bào

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) [49] Burgess (1981) [39] công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987) [11]

ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường độc trên tế bào xơ

phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải đăng ten Lớp tế bào này sẽ bị phá huỷ hoàn toàn vào ngày thứ 4 Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ lo`ng, có thể phát hiện được Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp

tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) [13] Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây,

sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và có

đường kính 1-2 mm (Trần Minh Châu, 1987) [11]

Theo Dardini và Hess (1968) [40] Plague của virus dịch tả vịt cường

độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đường kính từ 1-8 mm Plague của virus dịch tả vịt nhược độc thì đều hơn, có bờ gọn và sáng, đường kính là 3-4 mm Nguyễn Như Thanh (2001) [32] mô tả, với các chủng virus nhược độc, Plague

đều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có đường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm

và sau 14 ngày sẽ là 10 mm

Sự xuất hiện Plague trên các môi trường nuôi cấy khác nhau là khác nhau Virus cường độc thì nhân lên và hình thành các Plague đẹp theo thứ tự các môi trường sau: tế bào xơ phôi ngan và uyên ương, xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt đen, vịt đầu đỏ; còn Plague trên tế bào xơ phôi vịt mốc và vịt b`i là kém nhất Virus dịch tả vịt nhược độc của Hà Lan lại có thứ tự các môi trường thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi gà, trĩ Mông Cổ, cun cút (Ronald Atlanasio, Robert Olson, James C Johnson, 1980) (Trần Minh Châu, 1987) [11] Đối với virus nhược độc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi gà Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào đ` bắt đầu có hiện tượng huỷ hoại Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng đám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nghiên cứu của bộ môn VSV-TN-BL trường ĐHNNI)

* Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh

Jansen (1968) [49] khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản nhiễm đ` chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt

đ` bị nhiễm virus dịch tả vịt cường độc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường độc dịch tả vịt trước 4 giờ thì trong 10 vịt được can thiệp bằng vacxin sẽ sống 8 con Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus trước 8 giờ, 15 vịt phát bệnh nhưng còn sống 3 con Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên,

dù tiêm vacxin vịt vẫn không được bảo hộ Như vậy rõ ràng interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus dịch tả vịt và hiện tượng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch để nhanh chóng dập tắt dịch

* Tế bào NK: Tăng cường hoạt động diệt những tế bào đ` bị nhiễm virus do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào đích (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tín hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào đích (Vũ Triệu An, 1997) [1]

* Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên

2.3.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Biểu hiện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là sự sản sinh ra kháng thể

đặc hiệu chống virus khi cơ thể bị virus xâm nhập Các công trình nghiên cứu

về đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trong bệnh dịch tả vịt đều tập trung xác định vai trò của các loại kháng thể được sinh ra và nguyên nhân, cách thức sản sinh

ra các kháng thể đó

2.3.2.1 Sự hình thành kháng thể kháng virus dịch tả vịt

* Miễn dịch chủ động tự nhiên: Sau khi vịt mắc bệnh dịch tả vịt và đ` khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus dịch tả vịt trong cơ thể Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại Bệnh tái phát thường ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy bên dưới lưỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả đ` phân lập được virus dịch tả vịt Do mang đặc tính của một virus Herpes, nên khi gặp điều kiện thuận lợi, virus lại tiếp tục phát triển và gây bệnh làm thành nốt rộp mới Tác giả đ` đề xuất phương pháp kiểm tra bệnh dịch tả vịt ẩn tính bằng cách khám nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi (Trần Minh Châu, 1987) [11]

* Miễn dịch chủ động nhân tạo: Vịt có được khả năng miễn dịch này nhờ được tiêm vacxin Hiệu lực và độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, đường đưa vacxin vào cơ thể, Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược độc Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn (Fenner, 1974) [43] Về đường đưa vacxin, Shawky S.A & Sandhu T.S (1997) [62] cho rằng đường đưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp