[Luận văn]kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi khuẩn e coli và salmonella SP phân lập từ phân lợn con hướng nạc ỉa phân trắng tại trại thành đồng mê linh hà nội

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ

KIỂM TRA TÍNH MẪN CẢM, TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA E.coli

VÀ Salmonella sp PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN CON HƯỚNG NẠC

ỈA PHÂN TRẮNG TẠI TRẠI THÀNH ĐỒNG - MÊ LINH - HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: THÚ Y

Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS BÙI THỊ THO

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các

số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều

đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Ngọc Hà

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy cô giáo Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và trau dồi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua

Xin chân thành cảm ơn cô giáo PGS.TS.Bùi Thị Tho đã hết lòng hướng dẫn giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện tốt đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất khoa Thú y, cùng toàn thể cán bộ và nhân viên trại lợn Thành Đồng - Mê Linh - Hà Nội

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, cơ quan, bạn bè đã tạo điều kiện và động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt đề tài này

Tác giả

Nguyễn Thị Ngọc Hà

2.1 Những nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ 32.2 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn 24

3 Đối tượng, nguyên liệu, nội dung và phương pháp

4.1 Xác định sự biến động về số lượng và số loại vi khuẩn hiếu khí

trong phân lợn con theo mẹ bình thường và ỉa phân trắng 364.1.1 Kết quả kiểm tra số lượng, tỉ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có

trong phân lợn con theo mẹ bình thường 37

4.1.2 Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ vi khuẩn hiếu khí có trong phân

4.1.3 Sự biến động về số lượng các loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp

trong phân lợn con theo mẹ ỉa phân trắng so với bình thường 46

4.2 Kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli và Salmonella phân lập từ phân

lợn con ỉa phân trắng với các thuốc thí nghiệm 524.2.1 Kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn con ỉa

phân trắng với các thuốc thí nghiệm 524.2.2 Kiểm tra tính mẫn cảm của Salmonella phân lập được từ phân lợn

con ỉa phân trắng với các thuốc thí nghiệm 56

4.3 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của E.coli và Salmonella phân

lập từ phân lợn con ỉa phân trắng với các thuốc thí nghiệm 604.3.1 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của E.coli phân lập từ phân lợn

con ỉa phân trắng với các thuốc thí nghiệm 604.3.2 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của Salmonella phân lập từ

phân lợn con ỉa phân trắng với các thuốc thí nghiệm 654.4 Kết quả điều trị thử nghiệm bệnh lợn con phân trắng tại trại 70

ST - Stable toxin độc tố chịu nhiệt

LT - Lable toxin độc tố không chịu nhiệt

RPF - Rapid permeability Factor yếu tố thẩm xuất nhanh

DPF - Delayed permeability Factor yêú tố thẩm xuất chậm

DANH MỤC CÁC BẢNG

4.1 Tỷ lệ, số lượng một số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con

4.2 Tỷ lệ, số lượng một số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con

4.3 Sự biến động 4 loại vi khuẩn hiếu khí trong phân lợn con ỉa phân

4.4 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn

4.5 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonella phân

lập từ phân lợn con theo mẹ ỉa phân trắng 584.6 Kết quả kiểm tra tính kháng của E.coli với các thuốc thí nghiệm 624.7 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của E.coli với các thuốc thí

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

4.1 Sự biến động về số lượng các vi khuẩn hiếu khí có trong phân

lợn con ỉa phân trắng so với bình thường 49 4.2 Tính mẫn cảm của vi khuẩn E.coli với các thuốc thí nghiệm 56 4.3 Tính mẫn cảm của vi khuẩn Salmonella với các thuốc thí

1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong giai đoạn hiện nay, bên cạnh sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp, Đảng và Nhà nước ta vẫn chủ trương coi phát triển nền nông nghiệp là then chốt Ngành công nghiệp phát triển làm diện tích đất nông nghiệp ngày càng thu hẹp Để đảm bảo nông nghiệp phát triển cần phát triển ngành chăn nuôi theo hướng công nghiệp hoá

Bên cạnh đó, nền kinh tế nước ta đang phát triển mạnh, mức sống của người dân ngày càng cao, nhu cầu về lương thực, thực phẩm tăng nhanh, đặc biệt

là nhu cầu về thực phẩm chất lượng cao Chính vì vậy, ngành chăn nuôi lợn ở nước ta đang phát triển theo con đường nạc hoá đàn lợn nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người dân

Trong những năm gần đây, số đầu lợn trong nước tăng rất cao, nhất là lợn nhập ngoại và lợn có tỉ lệ máu ngoại cao Theo thống kê của tổ chức nông lương Thế giới (FAO), Việt Nam là một nước nuôi nhiều lợn, đứng hàng thứ 7 Thế giới, hàng thứ 2 Châu Á và ở vị trí hàng đầu khu vực Đông Nam Châu Á

Tuy nhiên, một trong những trở ngại lớn đối với công tác chăn nuôi nước ta

là tình hình dịch bệnh Dịch bệnh thường xuyên xảy ra đã gây nhiều thiệt hại làm hạn chế sự phát triển, giảm hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi Trong đó có hội chứng tiêu chảy với đặc điểm và diễn biến bệnh hết sức phức tạp Bệnh xảy ra với tất cả các giống lợn, do nhiều nguyên nhân, tất cả các độ tuổi đều mắc nhưng gây hậu quả nghiêm trọng và tổn thất lớn nhất là ở lợn con theo mẹ Trong số các

nguyên nhân gây tiêu chảy, E.coli và Salmonella là hai nguyên nhân gây bệnh quan

trọng và rất phổ biến Do bệnh xảy ra với nhiều nguyên nhân khác nhau nên người chăn nuôi thường khó xác định chính xác nguyên nhân gây tiêu chảy với gia súc của mình Vì vậy, việc sử dụng thuốc điều trị một cách bừa bãi, không tuân theo

nguyên tắc đã dẫn đến sự tăng nhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, số lượng các chủng vi khuẩn kháng thuốc đang tăng lên nhanh chóng, đặc biệt là đã xuất hiện các chủng vi khuẩn đa kháng

Để có cơ sở cho việc phòng trị tiêu chảy ở lợn con theo mẹ và hạn chế hiện

tượng kháng thuốc đang ngày càng tăng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn con hướng nạc ỉa phân trắng tại trại Thành Đồng – Mê Linh – Hà Nội”

1.2 Mục đích của đề tài

+ Xác định sự biến động khu hệ vi sinh vật trong phân lợn con theo mẹ bình thường và khi bị ỉa phân trắng

+ Kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli, Salmonella phân lập từ phân lợn con

theo mẹ ỉa phân trắng với các thuốc kháng sinh và các thuốc hoá học trị liệu thường dùng trong điều trị

+ Kiểm tra tính kháng thuốc của E.coli, Salmonella phân lập từ phân lợn

con theo mẹ ỉa phân trắng với các thuốc kháng sinh và các thuốc hoá học trị liệu thường dùng trong điều trị

+ Xác định hiệu quả điều trị của một số thuốc sau khi làm kháng sinh đồ trong điều trị bệnh lợn con phân trắng

Đề tài được thực hiện tại bộ môn Nội – Chẩn - Dược - Độc chất, khoa Thú

y – Trường ĐHNN Hà Nội; phòng Vi khuẩn - Trung tâm chẩn đoán Quốc gia và trại lợn Thành Đồng – Mê Linh – Hà Nội

1.3 Ý nghĩa

Từ kết quả nghiên cứu sẽ giúp lựa chọn kháng sinh và thuốc hóa học trị liệu

có tính mẫn cảm cao với hai loại vi khuẩn E.coli và Salmonella để điều trị bệnh

lợn con phân trắng tại trại Thành Đồng

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ

2.1.1 Khái niệm

Tiêu chảy là một thuật ngữ diễn tả biểu hiện lâm sàng của hội chứng bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hoá Ỉa chảy là hiện tượng ỉa nhanh, nhiều lần trong ngày, trong phân có nhiều nước do ruột tăng cường co bóp và tiết dịch (Tạ Thị Vịnh, 1990) [49]

Lợn bị tiêu chảy thường mất nước, mất chất điện giải và kiệt sức Những lợn khỏi bệnh thường chịu hậu quả còi cọc, thiếu máu, chậm lớn dẫn đến tỷ lệ nuôi sống thấp và tỷ lệ chết cao Đây chính là một trong những nguyên nhân làm cho ngành chăn nuôi lợn bị tổn thất lớn (Lê Minh Chí, 1995) [2])

Fairbrother (1992) [54] đã nhận xét: tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn trên thế giới Bệnh xuất hiện ở cả 3 lứa tuổi, lợn sơ sinh, lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa

Theo Hoàng Văn Tuấn và cs (1998) [45], bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi lợn từ sơ sinh đến độ tuổi sinh sản nhưng xảy ra trầm trọng nhất ở lứa tuổi từ

sơ sinh đến cai sữa

2.1.2.Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con theo mẹ rất phức tạp Trong lịch

sử nghiên cứu, rất nhiều tác giả đã dày công tìm hiểu nguyên nhân Tuy nhiên, tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý, có liên quan đến rất nhiều yếu tố,

có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy, để phân biệt rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy là hết sức phức tạp Ngày nay, người ta thống nhất rằng, việc phân loại chỉ có ý nghĩa tương đối, chỉ nêu lên yếu tố nào là chính, xuất hiện đầu tiên; yếu tố nào là phụ hoặc xuất hiện sau, từ đó để đưa ra phác đồ phòng, trị bệnh có hiệu quả

Tiêu chảy ở lợn con theo mẹ thường do một số nguyên nhân chủ yếu sau đây:

2.1.2.1 Nguyên nhân do vi sinh vật

* Do vi khuẩn

Vi khuẩn là một trong những nguyên nhân quan trọng và chủ yếu gây tiêu chảy ở lợn con theo mẹ Trong đường ruột của tất cả các loài gia súc đều

có vi sinh vật sinh sống Số lượng và thành phần của chúng không giống nhau

ở từng đoạn ruột, tăng dần từ tá tràng đến trực tràng và biến động theo lứa tuổi Trong điều kiện bình thường vi sinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng

và có lợi cho cơ thể vật chủ (Lê Khắc Thận và cs, 1974) [36] Nhưng khi có các yếu tố gây bệnh tác động, trạng thái cân bằng trong hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ dẫn đến rối loạn tiêu hoá, các vi khuẩn đường ruột sinh sôi phát triển, tăng cường độc lực, sản sinh độc tố tác động vào niêm mạc ruột làm viêm ruột nặng thêm, gây nên tình trạng bệnh lý trầm trọng

E.coli là một vi khuẩn đóng vai trò quan trọng gây tiêu chảy Đây là

một vi khuẩn xuất hiện rất sớm ở đường ruột của người và động vật sơ sinh

khoảng 2 giờ sau khi đẻ E.coli thường ở ruột già, ít khi ở dạ dày và ruột non Trong đường ruột động vật, E.coli chiếm khoảng 80% quần thể các vi khuẩn

hiếu khí

Khi nghiên cứu về bệnh lợn con phân trắng Đào Trọng Đạt và cs

(1996) [4] cho rằng khi sức đề kháng của cơ thể giảm sút, E.coli thường

xuyên cư trú trong đường ruột của lợn thừa cơ sinh sản rất nhanh gây tình trạng loạn khuẩn

Theo Radostits và cs (1994) [61], E.coli gây bệnh cho lợn là các chủng

có kháng nguyên pili và sản sinh độc tố đường ruột là nguyên nhân chủ yếu trong quá trình tiêu chảy ở lợn

Hồ Văn Nam và cs (1997) [17], sau khi xét nghiệm các mẫu phân

của lợn khoẻ và lợn bị tiêu chảy đã cho biết: trong 140 mẫu phân lợn khoẻ

ở các lứa tuổi khác nhau khi xét nghiệm đều thấy sự có mặt của E.coli Trong 170 mẫu phân lợn bị tiêu chảy ở các lứa tuổi cũng đều có E.coli và

các tác giả thấy có sự bội nhiễm của vi khuẩn đường ruột Trong phân lợn không bị tiêu chảy số lượng vi khuẩn là 150,70 triệu/1 gam phân nhưng trong phân lợn bị tiêu chảy, số lượng vi khuẩn tăng rất cao là 196,35 triệu/1

gram phân Trong hệ vi khuẩn hiếu khí ở đường ruột, ngoài E.coli,

Salmonella chiếm tỷ lệ khá cao và vai trò của nó trong hội chứng tiêu chảy

ở gia súc đã được nhiều tác giả đề cập đến

Bằng phương pháp nghiên cứu định type kháng nguyên O, Nguyễn Thị

Nội (1985) [24] đã nghiên cứu 5430 chủng E.coli phân lập ở lợn của 8 tỉnh,

thành phố trong cả nước và đưa ra nhận định các serotype gây bệnh phổ biến

ở lợn là O141, O149, O117, O147, O138 và O139 Ngoài các chủng này, ở mỗi địa phương lại có những serotype gây bệnh khác nhau

Salmonella là một loại vi khuẩn sống hoại sinh trong đường tiêu hoá,

chứa đựng các yếu tố gây bệnh phong phú gồm độc tố và yếu tố gây bệnh không phải là độc tố

Theo Niconxki V.V (1986) [22], Salmonella có thể xâm nhập vào cơ

thể thông qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn hoặc có sẵn trong đường tiêu hoá của gia súc Khi sức đề kháng của con vật giảm, chúng sinh sôi trong ruột, sản sinh độc tố tác động vào niêm mạc ruột gây viêm nhiễm Từ ruột,

Salmonella sẽ xâm nhập vào máu được truyền khắp cơ thể gây nhiễm trùng

huyết làm cho tỷ lệ tử vong ở gia súc bị tiêu chảy tăng cao

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O, các nhà khoa học cho rằng hiện

tượng này có khoảng 2200 serotype Salmonella và chia làm 67 nhóm huyết

thanh (Radostits O.M và cs, 1994) [61]

Khi nghiên cứu sự biến động tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn các lứa tuổi,

Hồ Văn Nam và cs (1997) [17] cho biết: ở lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi

tỷ lệ nhiễm Salmonella là 64,13% Sau đó, tỷ lệ nhiễm tăng dần lên 80 – 88% theo độ tuổi, tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn nái là 40% Ở lợn bị tiêu chảy tỷ lệ

Salmonella tăng rất cao, tỷ lệ nhiễm chiếm đến 94%, số lượng vi khuẩn trong

phân tăng 29,9 triệu/1gram phân của lợn từ 1 – 6 tuần tuổi

Theo tác giả Nguyễn Thị Ngữ (2005) [19], khi nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở lợn tại Hà Tây cho rằng: ở trong phân của lợn không bị tiêu chảy

có 61% - 70,5% số mẫu xét nghiệm thấy có mặt Salmonella; 83,3% - 88,29%

số mẫu có mặt vi khuẩn E.coli Còn ở các mẫu phân của lợn bị tiêu chảy, số lượng mẫu xét nghiệm có sự có mặt của Salmonella và E.coli tăng lên, cụ thể: 75,0% - 78,6% số mẫu phân lợn phân lập có Salmonella và 93,7% - 96,4% số mẫu phân lợn phân lập có E.coli

Ngoài hai loại vi khuẩn E.coli và Salmonella là 2 loại vi khuẩn chủ yếu

gây tiêu chảy ở lợn còn rất nhiều loại vi khuẩn khác cũng có vai trò là nguyên nhân gây bệnh nguyên phát hoặc kế phát Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [25],

xác định nguyên nhân gây tiêu chảy cho lợn ngoài Salmonella và E.coli còn

có sự tham gia của các vi khuẩn như Streptococcus, Proteus, Pseudomonas,

Klebsiella và Clostridium perfingens

Trịnh Văn Thịnh (1985) [39] cũng xác định tác nhân chính gây tiêu

chảy ở lợn con là E.coli và Salmonella Ngoài ra còn có một số loại vi khuẩn khác như Proteus, trực trùng sinh mủ, song liên cầu khuẩn cũng gây

là virus chưa được để ý nhiều Trong những năm gần đây, đã có rất nhiều nghiên cứu về vấn đề này

Khoon Teng Hout (1995) [11] đã thống kê được ở lợn có 11 loại virus

có tác động làm tổn thương đường tiêu hoá và gây viêm ruột ỉa chảy như Adenovirus type IV, Enterovirus, Coronavirus, virus gây bệnh dịch tả lợn, Rotavirus,

Theo Bergeland H.U và cs (1992) [50], ở lợn trước và sau cai sữa bị tiêu chảy, ngoài tác nhân gây bệnh là vi khuẩn còn phân lập được rất nhiều loại virus khác nhau như: 29% lợn bệnh phân lập được Rotavirus; 11,2% phân lập được virus viêm dạ dày - ruột truyền nhiễm (TGE); 2% phân lập được Entero virus và 0,7% phân lập được Pavovirus

2.1.2.2 Do điều kiện bất lợi của ngoại cảnh

Ngoại cảnh có tác động rất lớn trong chăn nuôi Điều kiện khí hậu thay đổi đột ngột: quá nóng, quá lạnh, ẩm ướt, kết hợp với chuồng trại không hợp

vệ sinh, điều kiện nuôi nhốt, vận chuyển gia súc không đúng phương pháp như vận chuyển gia súc quá chật chội trong điều kiện thời tiết nắng nóng… chính là các yếu tố stress tác động trực tiếp vào gia súc, đặc biệt là ở gia súc non do cấu tạo và chức năng sinh lý của các hệ cơ quan chưa ổn định và hoàn thiện Vì vậy, gia súc non chính là đối tượng chịu ảnh hưởng nhiều nhất của điều kiện ngoại cảnh (Nguyễn Xuân Tịnh và cs, 1996) [44]

Hồ Văn Nam và cs (1997) [18], Phạm Khắc Hiếu và cs (1998) [9], đã xác định các yếu tố lạnh, ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến lợn sơ sinh, lợn con vài ngày tuổi Nếu nuôi lợn con trong điều kiện lạnh, chuồng trại ẩm ướt rất dễ dẫn đến bệnh lợn con phân trắng

Sự thay đổi yếu tố khí hậu, thời tiết, mật độ chuồng nuôi, phương thức chăn nuôi, vận chuyển gia súc là những tác nhân stress làm giảm sức đề

kháng của vật nuôi, từ đó làm tăng nguy cơ mắc bệnh ở vật nuôi, đặc biệt là bệnh tiêu chảy Ở lợn, bệnh phân trắng lợn con có liên quan mật thiết đến trạng thái stress (Sử An Ninh và cs, 1981) [23]

2.1.3 Cơ chế sinh bệnh

Tiêu chảy thường diễn ra theo hai quá trình, ban đầu là rối loạn tiêu hoá, sau đó là quá trình nhiễm trùng Các tác nhân stress có hại tác động làm rối loạn cơ năng tiêu hoá ở ruột, thức ăn không tiêu hóa được bị lên men, các chất hữu cơ bị phân giải sinh các sản phẩm độc như Indol, Scatol, H2S,CH4… làm thay đổi pH đường ruột, trở ngại quá trình tiêu hoá hấp thu, làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá Từ đó, vi khuẩn đường ruột có điều kiện thuận lợi, phát triển tăng nhanh về số lượng, sản sinh ra độc tố Một số loại vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô, ở đây chúng phát triển nhanh về số lượng kích thích các tế bào gây viêm, dịch viêm tiết ra đi vào khoang ruột làm tăng áp lực kích thích gây tiêu chảy Ngoài ra, một số vi khuẩn có khả năng tiết độc tố kích thích các AMP vòng nội bào, chất này làm tăng tiết Cl- và giảm hấp thu Na+ Áp lực thẩm thấu hút nước vào trong xoang ruột gây ra áp lực lớn trong ống tiêu hoá Hậu quả là một lượng nước lớn cùng các chất điện giải mất đi theo phân

2.2 Một số vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong đường ruột

Tất cả các vi sinh vật có mặt ở ống tiêu hoá được gọi bằng cụm từ “vi khuẩn chí đường ruột” (Vũ Văn Ngữ, 1979) [20]

Theo Nguyễn Bá Hiên (2001) [6], trong đường tiêu hoá của gia súc khoẻ mạnh và gia súc bị tiêu chảy thường xuyên có mặt 6 loại vi khuẩn hiếu

khí là E.coli, Salmonella, Staphylococcus sp, Streptococus sp, Klebsiella và

Bacillus subtilis

2.2.1 Vi khuẩn E.coli

Trực khuẩn ruột già E.coli còn có tên là Baterium Coli commune,

Bacillus, Colicommunis được Echerich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em

E.coli thường xuất hiện rất sớm ở đường ruột của người và động vật sơ sinh

sau khi đẻ 2 giờ, chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ruột non Trong nhiều trường hợp còn tìm thấy ở niêm mạc của những bộ phận khác trong cơ thể (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [37]

* Hình thái và tính chất bắt màu

Theo Lê Văn Tạo và cs (1995) [33], E.coli là nguyên nhân chính gây

bệnh phân trắng lợn con, thường gặp ở lợn từ 1 – 20 ngày tuổi, đặc biệt bệnh xảy ra nặng ở giai đoạn 1 – 10 ngày tuổi

E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 - 3 x 0,6µm Trong

cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn

E.coli có lông ở xung quanh thân nên có khả năng di động, không sinh nha

bào, có thể có giáp mô

Vi khuẩn bắt mầu Gram (-), có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở 2 đầu, khoảng giữa nhạt hơn

* Đặc tính nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là

trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 5 –

400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 – 7,4

- Trong môi trường thạch thường: sau khi cấy 24 giờ, bồi dưỡng trong tủ

ấm 370C hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3mm Nếu nuôi cấy lâu, khuẩn lạc mọc rộng ra và gần như màu nâu nhạt, có thể thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M

- Trong môi trường nước thịt: sau khi cấy 24 giờ, bồi dưỡng trong

tủ ấm 370C, vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối

- Trên môi trường Macconkey: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn nhỏ hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Trên môi trường thạch máu: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to, ướt,

viền không gọn màu xám nhạt, đa số các chủng E.coli không gây dung huyết

- Trên môi trường thạch Brilliant green agar (BGA): vi khuẩn hình thành khuẩn lạc không màu trên nền lục xanh

- Môi trường SS: E.coli hình thành những khuẩn lạc màu hồng

- Môi trường Endo: E.coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim

* Đặc tính sinh hoá

E.coli lên men sinh hơi các loại đường fructose, glucose, levulose,

galactose, xylose, ramnose, mannit, lactose Tất cả các E.coli đều lên men

đường lactose nhanh và sinh hơi

Phản ứng sinh hoá: Phản ứng H2S: (-), phản ứng VP: (-), phản ứng MR: (+), phản ứng Indon (+), có khả năng khử nitrat thành nitrit

* Sức đề kháng

E.coli bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, đun sôi

1000C chết ngay Các chất sát trùng thông thường như axit phenic, biclorua thuỷ ngân, formol, hydro peroxit 1% diệt vi khuẩn sau 5 phút

Ở môi trường bên ngoài, các chủng E.coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng

* Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm

kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K, kháng nguyên bám dính F

- Kháng nguyên thân O (Somatic)

Là thành phần chính của thân vi khuẩn và được coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn Được cấu tạo bởi 2 lớp chính, lớp polysaccharid có nhóm hydro nằm ở vòng ngoài mang tính đặc trưng cho kháng nguyên từng

giống Lớp polysaccharid nằm ở phía trong không có nhóm hydro không mang tính đặc trưng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc Kháng nguyên O chịu được nhiệt độ, các chất cồn, axit HCl 1N trong 20 giờ, rất độc, bị phá huỷ bởi formol 0,5%

- Kháng nguyên K (Capsular)

Còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và

có bản chất hoá học là polysaccharid

E.coli có 3 loại kháng nguyên K (L, A, B) làm nhiệm vụ:

+ Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác dụng ngoại lai và hiện tượng thực bào

- Kháng nguyên F (Fimbriae hay Pilus)

- Có bản chất là protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt tế bào Pili có cấu trúc rỗng giữa, đường kính ngoài từ 7 – 9nm, đường kính trong từ 2 – 2,5nm,

số lượng có thể lên tới 250 – 300 sợi /1 tế bào

Chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể – màng nhày của đường tiêu hoá Theo Vũ Khắc Hùng và cs (2005) [12], phần lớn các kháng nguyên bám dính đều sản sinh độc tố

* Các yếu tố gây bệnh của E.coli

- Khả năng bám dính

Bám dính là 1 khái niệm chỉ mối quan hệ của sự liên hệ vững chắc thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào vật chủ Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính được gọi là yếu tố bám dính (Jones G.W và cs,

1981) [58] E.coli gây bệnh bám dính trên niêm mạc ruột nhờ 1 hay nhiều yếu

tố bám dính Có 4 loại yếu tố bám dính quan trọng là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và F41

- Khả năng xâm nhập

Là khái niệm dùng để chỉ khả năng vi khuẩn E.coli qua được hàng rào

bảo vệ lớp mucosa trên bề mặt niêm mạc ruột non vào tế bào biểu mô, đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này, tránh các tế bào đại thực bào

- Khả năng gây dung huyết

Vi khuẩn đường ruột phát triển trong các tổ chức cơ quan, sắt là nguyên

tố cần thiết cung cấp cho quá trình dinh dưỡng vi khuẩn Khả năng sản sinh ra

Haemolysin của E.coli có thể coi là một yếu tố độc lực quan trọng nhằm mục

đích dung giải hồng cầu, giải phóng Fe trong nhân Hem và transferin để cung cấp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn

Hlyplasmid di truyền khả năng sản sinh Haemolysin gây dung huyết,

đây là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn E.coli gây bệnh đường tiết niệu

và các chủng E.coli phân lập từ cơ quan ngoài ruột thường có khả năng gây

dung huyết cao hơn 8 – 18%

Có 4 kiểu dung huyết nhưng quan trọng nhất là hai kiểu α và β

- Khả năng tạo Colicin V (yếu tố kháng khuẩn)

Trong đường ruột, để phát triển, tồn tại, vi khuẩn E.coli thường cộng

sinh với các vi khuẩn đường ruột khác để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phát triển của mình và trở thành vi khuẩn chiếm ưu thế trong đường ruột

E.coli thường sản sinh ra một loại chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc

tiêu diệt các loại vi khuẩn khác gọi là yếu tố kháng khuẩn Colicin V Colicin

V được coi là một bacteriocin có tác dụng độc với các vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae Có khoảng 40% các chủng E.coli của người và động vật

có đặc tính sản sinh Colicingenic hay còn gọi là các E.colicol

- Tính kháng kháng sinh

Trong những nghiên cứu gần đây, các tác giả đều có một nhận định

chung là E.coli là vi khuẩn có khả năng tăng tính kháng kháng sinh nhanh nhất Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong plasmid, các plasmid có trong E.coli có khả năng tồn tại nhân lên và chuyển

giao giữa các chủng vi khuẩn Đây chính là cơ sở làm tăng tính kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 1996) [40] Cũng theo tác giả này,

thường khi E.coli kháng lại với 1 kháng sinh nào hay kèm theo sự kháng chéo

với 2, 3 hoặc 5 loại kháng sinh khác

Theo Phạm Khắc Hiếu (1998) [8], có 5% số chủng E.coli kháng lại 7 loại kháng sinh, 25% kháng lại 4 loại kháng sinh và tác giả cho rằng E.coli có

khả năng truyền tính kháng kháng sinh cho nhiều loại vi khuẩn khác

- Khả năng sản sinh độc tố

Khả năng sản sinh ra độc tố được coi là một yếu tố gây bệnh quan

trọng của vi khuẩn E.coli Chúng có thể tạo ra 2 loại độc tố là ngoại độc tố

và nội độc tố

+ Ngoại độc tố là một chất không chịu nhiệt, bị phá huỷ ở 560C trong vòng 10 – 30 phút Ngoại độc tố có hướng thần kinh và gây hoại tử Khả năng tạo độc tố sẽ mất đi khi các chủng được lưu giữ lâu dài hay được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường dinh dưỡng

+ Nội độc tố: là yếu tố gây bệnh chủ yếu của E.coli Có thể chiết xuất

nội độc tố bằng nhiều phương pháp: phá vỡ tế bào bằng cơ học; chiết xuất bằng axit trichlocetic, phenol hoặc các enzyme Nội độc tố có cấu trúc

polysaccharid – protein - lipid thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao với các chủng của mỗi serotype Hai lớp chính của một độc tố ruột là độc tố chịu nhiệt ST (Stable toxin) và độc tố không chịu nhiệt LT (Lable toxin)

Độc tố chịu nhiệt ST: chịu được nhiệt độ 1210C/15 phút Dựa vào đặc tính hoà tan trong Methanol và hoạt tính sinh học người ta chia độc tố ST thành 2 nhóm là STa và STb

STa là độc tố có khả năng gây ỉa chảy Cơ chế gây ỉa chảy của STa được Gyles G.L và C.O.Thoen (1993) [56] đưa ra là: STa tác động vào hệ thống men có trong tế bào biểu mô ruột, men Guanylate cyclase làm chuyển GTP thành cGMP Khi mà lượng cGMP trong tế bào tăng cao dẫn đến làm tăng hàm lượng Ca2+; Ca2+ ngăn cản quá trình hấp thu Na+, Cl-; ngăn cản hấp thu nước vào xoang ruột làm cho hàm lượng nước và chất điện giải trong xoang ruột tăng lên gây nên hiện tượng ỉa chảy

STb là một protein có tính kháng nguyên yếu không liên quan đến STa STb được cấu tạo bởi chuỗi protein gồm 48 axit amin với 2 cầu nối disunfua STb kích thích bài xuất các muối bicarbonate làm cho nước từ tế bào vào xoang ruột nhiều, STb kích thích vòng Nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột Tuy nhiên, phương thức của nó chưa được làm sáng tỏ

Độc tố không chịu nhiệt LT (Lable toxin)

Độc tố không chịu nhiệt bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C/15 phút Độc tố này

có phân tử lượng lớn, có 2 tiểu phần A và B Tiểu phần A mang hoạt tính sinh học Tiểu phần B có 5 phần nhỏ, tiểu phần này có khả năng gắn với thụ thể trong tế bào biểu mô ruột Trong vi khuẩn, tiểu phần A, B được tổng hợp trong tế bào và được dịch chuyển đến gần màng tế bào vi khuẩn, chúng kết hợp với nhau để tạo thành độc tố hoàn chỉnh, sau đó được thải ra bên ngoài Khi tác động vào tế bào, tiểu phần B sẽ gắn vào recepter của màng

tế bào biểu mô ruột Tiểu phần A sẽ có chức năng hoạt hoá hệ thống enzym Adenylate cyclaza chuyển ATP thành cAMP Khi hàm lượng cAMP tăng cao gây hiện tượng tăng bài xuất nước và các chất điện giải từ

mô bào vào trong xoang ruột, cản trở sự hấp thu nước từ xoang ruột vào

mô bào, làm cho nước trong xoang ruột tăng cao gây hiện tượng ỉa chảy

2.2.2 Vi khuẩn Salmonella

Chủng Salmonella được phát hiện đầu tiên vào năm 1885 là Salmonella

cholera suis bởi Salmon và Smith Năm 1934, theo đề nghị của Hội nghị sinh

vật học quốc tế, để kỷ niệm người đầu tiên tìm ra vi khuẩn, tên chính thức của

loại vi khuẩn này được đặt là Salmonella Giống Salmonella gồm trên 600

type huyết thanh học chia làm 35 nhóm Đa số vi khuẩn sống hoại sinh ở đường tiêu hoá, bình thường không gây bệnh Khi sức đề kháng trong cơ thể giảm sút, vi khuẩn sẽ sinh sôi, phát triển, sản sinh ra độc tố gây hiện tượng tiêu chảy (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [37]

Các bệnh do Salmonella gây ra ở động vật gọi với tên chung là

Salmonellosis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [28]

Hiện nay người ta đã phân lập được trên 2000 chủng Salmonella nhưng

trên thực tế chỉ có khoảng 5% trong số đó gây bệnh cho người và động vật

Salmonella thường gây bệnh cho lợn ở lứa tuổi 45 – 90 ngày tuổi, lợn ở các

lứa tuổi khác cũng mắc nhưng với tỷ lệ thấp

* Hình thái và tính chất bắt màu

Là vi khuẩn hình gậy ngắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,4 – 0,6µm x 1 -

3µm, không hình thành giáp mô và nha bào Đa số các loài Salmonella đều

có khả năng di động mạnh do có từ 7 – 12 lông xung quanh thân trừ

Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum

Vi khuẩn bắt màu Gram (-), có thể bắt màu toàn thân hoặc hơi

đậm ở 2 đầu

* Đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Salmonella là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, có thể

phát triển được ở nhiệt độ 6 – 420C, pH = 6 - 9 nhưng nhiệt độ thích hợp nhất

là 370C, pH thích hợp = 7,6

Đối với Salmonella gây bệnh ở gia súc sinh trưởng tốt trong điều kiện

hiếu khí và kém hơn ở điều kiện kỵ khí

- Môi trường nước thịt: sau khi cấy vài giờ đã đục nhẹ, sau 18 giờ đục đều, nuôi lâu ở đáy ống nghiệm có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng

- Môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám hơi lồi ở giữa, đường kính bằng 1 – 1,5mm

- Môi trường Macconkey: sau cấy 18 – 24 giờ, vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc tròn, không màu, nhẵn bóng

- Môi trường BGA: hình thành khuẩn lạc màu đỏ, bao bọc xung quanh bởi môi trường màu hồng nhạt

- Môi trường TSI: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu hồng trên mặt thạch nghiêng, môi trường màu đỏ, khi sinh sản ra H2S làm môi trường chuyển thành màu đen

* Đặc tính sinh hoá

Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi đường glucose, manit, galactose, levulose, arabinose Một số loài Salmonella cũng lên men các đường trên nhưng không sinh hơi như: Salmonella typhi suis, Salmonella

typhi, Salmonella cholerae suis Tất cả các loài Salmonella đều không lên

men đường lactose và saccharose

Đa số các Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải ure

Các phản ứng sinh hoá: phản ứng H2S (+), phản ứng VP (-), phản ứng Indon (-)

* Sức đề kháng

Salmonella có sức đề kháng yếu với nhiệt độ: 500C bị diệt sau 1giờ,

700C trong 20 phút, đun sôi trong 5 phút Trong nước đá, xác động vật chết chôn ở bùn, cát có thể sống 2 – 3 tháng Trong nước thường, vi khuẩn có thể tồn tại một tuần

Các chất sát trùng thông thường có thể tiêu diệt vi khuẩn dễ dàng, phenol 5%, HgCl 1/500, formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 – 20 phút

* Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella hết sức phức tạp Vì thế, ngoài

phản ứng huyết thanh đặc hiệu của từng vi khuẩn, còn có hiện tượng ngưng kết chéo giữa kháng nguyên của vi khuẩn với kháng nguyên của loài khác, thậm chí giữa nhóm này với nhóm khác trong giống

Cấu trúc kháng nguyên Salmonella gồm 3 loại:

- Kháng nguyên O:

Được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nằm ở lớp màng ngoài của màng tế bào vi khuẩn, được đặc trưng bởi lipopolysaccharid và được giải phóng ra môi trường nuôi cấy ở trạng thái thuần khiết

Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, hiện nay người ta đã tìm ra 65 yếu tố khác nhau Một Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố

trong số các yếu tố đó Mỗi một yếu tố, người ta đánh số bằng các số La mã hoặc số Ả rập

- Kháng nguyên H:

Là kháng nguyên chỉ có ở các loài Salmonella có lông, có bản chất là

protein Kháng nguyên H được chia làm 2 pha: pha 1 có tính chất đặc hiệu gồm 28 loại kháng nguyên; pha 2 không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại khác, pha 2 gồm 6 loại kháng nguyên

- Kháng nguyên K:

Kháng nguyên K của Salmonella không phức tạp, có một kháng nguyên

vỏ đã biết là kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh là Salmonella typhi

và Salmonella para typhi Bản chất của kháng nguyên Vi là một phức hợp

glucid – lipid – polypeptid Kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh

* Đặc tính gây bệnh

- Khả năng bám dính: theo Jones G.W và Richardson A L (1981) [58],

khả năng bám dính của Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước đầu

tiên và quan trọng quyết định quá trình gây bệnh của nó Để thực hiện được

chức năng này, Salmonella sản sinh ra yếu tố đặc trưng cho kết cấu phức hợp

giữa cấu trúc của nó với cấu trúc của điểm tiếp nhận xác định trên tế bào nhung mao, đó là yếu tố bám dính type I (Fimbriae type I)

- Khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào: theo Frost A.J và cs

(1997) [55], sau khi đã tiếp cận được với tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella

tác động làm biến đổi bề mặt màng tế bào bằng cách thay đổi hình dạng các sợi actin dẫn tới hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Cơ chế làm biến dạng các sợi actin màng tế bào vật chủ là do tác động của vi khuẩn làm tăng hàm lượng Ca2+ nội bào, tín hiệu đó hoạt hoá actin depolime rizing enzymes dẫn tới sắp xếp lại cấu trúc sợi actin

Sau khi đã hoàn thành các không bào chứa vi khuẩn, Salmonella được hấp thu

vào trong tế bào dưới hình thức hấp thu nội bào Ở trong tế bào, vi khuẩn tiếp tục tồn tại trong không bào sẽ nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ

- Tính kháng kháng sinh: giống như E.coli, khả năng kháng kháng sinh là một trong những yếu tố độc lực của Salmonella Hiện nay, có nhiều tác giả cho rằng hiện tượng vi khuẩn Salmonella kháng thuốc đang ngày càng tăng, tỷ lệ đa kháng của Salmonella với 2, 3 loại thuốc là phổ biến (Bùi Thị Tho, 2003) [41]

- Khả năng sản sinh độc tố:

Khả năng sản sinh độc tố chính là yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi

khuẩn Salmonella Salmonella có thể sản sinh ra 3 loại độc tố chính là độc tố

đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) với độc tố tế bào (Cytotoxin)

+ Enterotoxin: đây là loại độc tố thường xuyên được vi khuẩn tiết vào môi trường Enterotoxin tạo ra sự rút nước từ cơ thể vào lòng ruột gây

nên hiện tượng tiêu chảy Độc tố đường ruột của Salmonella gồm 2 thành

phần: độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability Factor – RPF) và độc

tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability Factor – DPF)

Độc tố thẩm xuất chậm có thành phần cấu trúc giống độc tố không chịu

nhiệt của E.coli và được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella (Heat

Labletoxin – LT) Độc tố LT bị phá huỷ ở 700C trong vòng 30 phút và ở 560C trong 4 giờ, thẩm xuất chậm từ 18 – 24 giờ, có thể kéo dài tới 36 – 48 giờ

Độc tố thẩm xuất nhanh có thành phần cấu trúc giống độc tố chịu nhiệt

của E.coli nên được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella (Heat Stabletoxin

– ST) có khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ Độc tố ST thẩm xuất nhanh sau 1 – 2 giờ, có thể kéo dài tới 48 giờ

+ Cytotoxin: thành phần không phải là lipopolysacharid (Non – LPS)

nằm ở màng ngoài vi khuẩn Salmonella Cytotoxin có khả năng ức chế tổng

hợp protein của tế bào Eukaryotic, làm tổn thương tế bào biểu mô Đa phần độc tính của chúng bị phá huỷ bởi nhiệt độ

+ Endotoxin: Thành phần chủ yếu là lipopolysacharid – LPS, là một

thành phần cơ bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn Salmonella giữ vai trò

là một yếu tố độc lực quan trọng của chúng Endotoxin được giải phóng từ tế bào vi khuẩn trong quá trình phát triển hoặc do tế bào vi khuẩn bị phân giải

* Cơ chế gây tiêu chảy của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella gây tiêu chảy thường qua các bước: xâm nhập vào

ruột, xâm nhiễm tế bào biểu mô ruột và kích thích tiết dịch

Vi khuẩn bám dính vào đoạn giữa của ruột non, các vi khuẩn hình thoi có sẵn trong biểu mô ruột già thường xuyên tiết ra các loại axit hữu cơ

bay hơi kìm hãm sự phát triển của Salmonella Một số yếu tố như kháng

sinh dùng trong thức ăn và điều trị, sự mất nước, stress do vận chuyển làm

tăng nhanh sự xâm nhiễm của Salmonella Sự xâm nhiễm vào tế bào biểu

mô xảy ra ở riềm bàn chải nhung mao hồi tràng

Vi khuẩn tiếp xúc một cách ngẫu nhiên với từng phần bề mặt của niêm mạc ruột nhờ bản chất di động hoặc những thuận lợi khác của bề mặt niêm mạc Ban đầu vi khuẩn hấp thụ lên niêm mạc ruột Sau đó bám dính vào tế bào biểu mô ruột nhờ sự phối hợp giữa hai cấu trúc phân tử Fimbriae type 1 và cấu trúc phân tử của điểm tiếp nhận Sau khi tiếp nhận tế bào vật

chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm lượng Ca2+ nội bào, hoạt hóa actin depolinerizing enzymes làm thay đổi cấu trúc hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi

khuẩn Hơn nữa, Salmonella xâm nhập vào trong tế bào tiếp tục phát triển

nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh enterotoxin làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ Nhiễm độc huyết trong bệnh Salmonellosis xuất hiện có liên quan đến sự giải phóng nội độc tố từ tế bào

Vi khuẩn bắt màu Gram (+)

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [37], chỉ có khuẩn lạc của

Staphylococcus aureus có màu vàng thẫm là có độc lực và có khả năng gây

bệnh cho động vật, còn khuẩn lạc màu vàng chanh và màu trắng không có độc lực và không gây bệnh

- Môi trường thạch máu: sau 24 giờ vi khuẩn hình thành nhiều khuẩn lạc dạng S Nếu là khuẩn lạc của tụ cầu gây bệnh sẽ xuất hiện hiện tượng dung huyết

- Môi trường thạch Chapman: đây là môi trường đặc biệt dùng để nuôi cấy và phân lập tụ cầu Nếu là tụ cầu gây bệnh khi cấy vào môi trường sẽ lên men đường manit làm pH thay đổi (pH = 6,8): môi trường có màu vàng Nếu

là tụ cầu không gây bệnh sẽ không lên men đường manit (pH = 8,4): môi trường có màu đỏ

Kháng nguyên polysaccharid ở vách là một phức hợp mucopeptid – acid teichoic Kháng nguyên này khi gặp kháng thể tương ứng sẽ gây nên phản ứng ngưng kết

Kháng nguyên protein A: là thành phần ở vách và ở phía ngoài

* Các độc tố của Staphylococcus

Staphylococcus có khả năng tiết ra 3 loại độc tố: độc tố dung huyết (Haemolyzin), nhân tố diệt bạch cầu (Leucocidin) và độc tố ruột (Enterotoxin)

- Độc tố dung huyết: Có 4 loại chính: dung huyết tố α β, , delta ( )δ và gamma (γ) Trong đó dung huyết tố α là một ngoại độc tố, có bản chất là protein bền với nhiệt độ Đây là đặc điểm cần thiết của các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh

- Nhân tố diệt bạch cầu: giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu Dưới tác động của nhân tố này, bạch cầu mất tính di động, mất hạt

và nhân bị phá huỷ

- Độc tố ruột: do một số chủng tụ cầu tiết ra, nó gây nên các bệnh đường tiêu hoá như nhiễm độc do thức ăn, viêm ruột cấp Độc tố ruột là những ngoại độc tố bền với nhiệt độ và không bị phá huỷ bởi dịch vị

Độc tố ruột có 4 loại, trong đó có 2 loại đã biết là độc tố ruột A tạo ra

do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm độc thức ăn và độc tố ruột B tạo

ra do một chủng phân lập trong các bệnh nhân bị viêm ruột

2.2.4 Streptococcus

* Hình thái và tính chất bắt màu

Streptococcus có hình cầu hoặc hình bầu dục, đường kính có khi đến

1µm, thường xếp thành từng chuỗi, không di động

Streptococcus bắt màu Gram (+)

* Đặc tính nuôi cấy

Là vi khuẩn sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, thích hợp ở nhiệt độ 370C

- Môi trường nước thịt: vi khuẩn hình thành hạt hoặc những bông rồi lắng xuống đáy ống Sau nuôi cấy 24 giờ môi trường trong đáy ống có cặn

- Môi trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc dạng S nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám

- Môi trường thạch máu: dựa vào tính chất dung huyết người ta thấy

Streptococcus có 3 type khuẩn lạc

+ Tuyp α: khuẩn lạc được bao quanh 1 vòng hồng cầu còn nguyên hình nhưng màu xanh, xa khuẩn lạc một chút có vòng tan máu Độc lực của nhóm này không cao

+ Typ β: bao quanh khuẩn lạc là 1 vòng tan máu hoàn toàn trong suốt

có bờ rõ ràng Độc lực của vi khuẩn nhóm này là cao nhất

+ Typ γ: xung quanh khuẩn lạc không có sự thay đổi nào, hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt Thuộc nhóm này thường là những vi khuẩn không gây bệnh

* Đặc tính sinh hoá

- Streptococcus có khả năng lên men đường glucose, lactose, saccarose,

salixin, không lên men đường manit, inulin

- Các phản ứng sinh hoá: Indon: (-), H2S (-), không làm đông vón huyết tương

* Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của liên cầu rất phức tạp và có nhiều loại

- Kháng nguyên polyozid (chất “c”): là một kháng nguyên thân do Lancefield phát hiện vào năm 1928

- Kháng nguyên protein M: kháng nguyên này của các liên cầu nhóm A

có những đặc điểm khác nhau, có khoảng 42 type, trong đó có 12 type quan trọng vì hay gây bệnh

- Các mucopeptid: làm cho vách tế bào của liên cầu cứng rắn, nó có khả năng gây độc

* Các độc tố do Streptococcus tiết ra

Streptococcus có khả năng tiết ra một số loại độc tố sau:

+ Streptolyzin O: là 1 kháng nguyên mạnh kích thích cơ thể hình thành kháng thể antistreptolyzin O Hầu hết các loại liên cầu làm tan máu đều sản sinh ra Streptolyzin O

+ Streptolyzin S: do nhiều chủng liên cầu sản sinh ra, không bị mất hoạt tính bởi oxy, có khả năng làm tan máu ở cả trên bề mặt môi trường

- Liên cầu nhóm A: có khả năng sản sinh ra một loại độc tố bản chất là protein, độc tố này tạo nên các nốt ban đỏ

2.2 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn

2.2.1 Khái niệm

Kháng sinh là một trong những phát hiện quan trọng nhất đối với sức khoẻ con người trong thế kỷ XX Nhờ có kháng sinh, nhiều bệnh tật đã bị đẩy lùi giúp cứu nhiều mạng sống Tuy nhiên cũng chính do con người đã sử dụng kháng sinh vào nhiều mục đích khác nhau: phòng trị bệnh nhiễm khuẩn, kích thích sinh trưởng, xử lý môi trường, bảo quản nông sản…đã dần dần tạo ra nhiều chủng loại vi khuẩn kháng thuốc

Theo Hoàng Tích Huyền (2001) [13], một cá thể hoặc một nòi vi khuẩn thuộc một loài nhất định được gọi là đề kháng nếu có thể sống và sinh sản trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sự sinh sản

và phát triển của phần lớn những cá thể khác trong cùng một canh khuẩn hoặc những nòi khác cùng loài

2.2.2 Phân loại hiện tượng kháng thuốc

Dựa vào nguồn gốc chia hiện tượng kháng thuốc làm 2 loại:

2.2.2.1 Kháng thuốc tự nhiên

Là hiện tượng kháng thuốc bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh hoặc có thể loại vi khuẩn đó không có vị trí công kích, điểm tác động của chất kháng sinh Ví dụ như Penicillin chỉ tác dụng lên lớp vỏ tế bào nên không có hiệu quả đối với những vi sinh vật không có vỏ tế bào

2.2.2.2 Kháng thuốc thu được

Là hiện tượng kháng thuốc phát sinh do sự tiếp xúc nhiều lần với chất kháng sinh hoặc lây truyền từ vi khuẩn đề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm Kháng thuốc thu được có 2 loại:

+ Đột biến kháng: là sự đột biến xuất hiện dưới ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc Ở đây tác nhân gây đột biến là các thuốc hoá học trị liệu Các tác nhân này đã gây nên những biến đổi ở bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn

+ Kháng thuốc lây lan: hiện tượng kháng thuốc này do các đơn vị di truyền plasmid tạo nên Các plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể, trong tế bào chất và có thể truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

2.2.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Trước đây, cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn được giải thích là do hiện tượng đột biến gen trong cấu trúc di truyền của vi khuẩn Qua quá trình chọn lọc sẽ hình thành các nòi vi khuẩn kháng thuốc Khả năng kháng thuốc do đột biến xảy ra rất ít, thường chỉ là 10-9, 10-10 trường hợp Các gen đột biến được

di truyền theo chiều dọc từ bố mẹ cho con cái Tuy nhiên trong thực tế lâm sàng, hiện tượng kháng thuốc lại xảy ra rất nhanh, tính kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu được truyền theo chiều ngang giữa các vi khuẩn trong cùng một thế hệ hoặc giữa các loài vi khuẩn khác họ với nhau trong cùng một quần thể Theo Đỗ Trung Cứ (2003) [3] đây là sự thay đổi trình tự xắp xếp các bazơ nitơ trong phản ứng ADN đã dẫn đến hàng loạt các sự kiện khác nhau

- Làm thành tế bào có khả năng giữ lại chất kháng sinh ngoài tế bào vi khuẩn, không cho chúng xâm nhập vào tế bào

- Làm tăng cường tổng hợp các men phân huỷ chất kháng sinh, kháng sinh không kịp tác động lên vi khuẩn gây bệnh

Có 3 phương thức giúp cho vi khuẩn có thể truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang

Tải nạp (Transformation): sự truyền đạt 1 đoạn ADN từ tế bào cho sang

tế bào nhận thông qua thực khuẩn thể (Bacteriophage)

Sự biến nạp (Transdution): là hiện tượng 1 đoạn ADN trần từ tế bào cho được một tế bào khác nhận thông qua các lỗ hổng trên màng tế bào vi khuẩn

Sự tiếp hợp (Conjugation): sự truyền đạt 1 đoạn ADN từ tế bào này sang tế bào khác do sự liên kết của 2 tế bào vi khuẩn

Trong 3 phương thức trên thì phương thức sinh sản tiếp hợp là quan trọng nhất Sự truyền kháng bằng con đường tiếp hợp liên quan đến sự truyền một đoạn plasmid từ tế bào này sang tế bào khác Plasmid là một ADN dạng vòng, nằm trong tế bào chất của vi khuẩn có khả năng tái bản độc lập với vật chất di truyền của tế bào vật chủ Trong plasmid có chứa nhân tố chuyển hoán (transposoms) là một đoạn ADN có thể di chuyển bên trong nhiễm sắc thể, giữa các nhiễm sắc thể, nó có thể di chuyển bên trong tế bào, giữa các plasmid của tế bào cũng như tự chèn vào ADN của thực khuẩn thể Các gen kháng thuốc nằm trên plasmid làm lan rộng gen kháng thuốc trong quần thể vi sinh vật: một plasmid có thể mang nhiều gen kháng thuốc, người ta dùng ký hiệu R (Resistance) để chỉ tập hợp các xác định thể di truyền ngoài nhân mang tính kháng thuốc Theo Luca Guardabassi và cs (2004) [59], sự kháng thuốc của vi khuẩn có thể được truyền từ vật chủ này sang vật chủ khác chỉ nhờ một lượng nhỏ vi khuẩn Đôi khi chỉ một tế bào vi khuẩn cũng có thể truyền gen kháng thuốc cho hệ vi khuẩn đường ruột của vật chủ khác

2.2.4 Sự kháng thuốc của vi khuẩn E.coli

Theo tác giả Bùi Thị Tho (2003) [41] cho thấy yếu tố quy định khả

năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E.coli

nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi

khuẩn E.coli có thể truyền yếu tố kháng thuốc cho các vi khuẩn khác qua

cầu nối nguyên sinh chất

Sự lan tràn tính kháng thuốc không chỉ phụ thuộc vào tế bào cho mà

còn phụ thuộc vào đặc tính tế bào nhận E.coli có thể cho và nhận sức kháng nhanh hơn Salmonella Do vậy, khả năng kháng kháng sinh, đặc biệt là hiện tượng đa kháng cũng như sự lan tràn tính kháng thuốc của E.coli cao hơn

Salmonella rất nhiều E.coli là nguồn cung cấp chủ yếu tính kháng thuốc lan

tràn trong các chủng vi khuẩn có ở đường tiêu hóa động vật

Jacob C.O và cs (1986) [57] cho biết E.coli có khả năng kháng thuốc rất mạnh Tính kháng thuốc của E.coli do các gen nằm trên plasmid qui định

E.coli độc có thể chứa một hay nhiều gen kháng thuốc Trong quá trình di

truyền của vi khuẩn, các plasmid kháng thuốc này có thể được trao đổi cho nhau theo phương thức tải nạp hoặc tiếp hợp, quá trình trao đổi này có thể thực hiện theo phương thức truyền dọc hay ngang làm cho hiện tượng kháng thuốc ngày càng tăng

Lê Văn Tạo và cs (1993) [31], cho biết có 12 chủng E.coli đa kháng với

7 loại thuốc kháng sinh, 32% đa kháng với 6 loại thuốc, 40% đa kháng với 5 loại thuốc, 10% đa kháng với 4 loại thuốc và 6% đa kháng với 3 loại thuốc

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cs (1996) [7] tính

mẫn cảm và tính kháng thuốc của E.coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng cho thấy có 40% E.coli kháng với Streptomycin, 50% kháng với Sulfamid,

12% kháng với Chlotetracyclin

2.2.5 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella

Salmonella là một trong những vi khuẩn đường ruột có các gen kháng

thuốc nằm trong plasmid Vì vậy, chúng cũng góp phần làm cho số lượng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng

Theo CJ Teale và cs (2002) [53] tại Anh năm 2002 khi làm thí nghiệm

với 3425 chủng Salmonella có tới 61,1% chủng mẫn cảm với 16 loại kháng

sinh; 15,1% kháng Ampicillin; 19,4% kháng SXT; 14,8% kháng Chloramphenicol; 16,6% kháng Streptomycin Trong số các chủng

Salmonella kháng thuốc, đáng kể nhất là Salmonella typhymurium: khi phân

lập 533 chủng Salmonella typhymurium chỉ có 14,5% mẫn cảm với 16 loại

kháng sinh thí nghiệm Còn tỷ lệ kháng kháng sinh là rất cao, có 44,1% kháng SXT; 61% kháng Streptomycin; 70% kháng Ampicillin; 62,1% kháng Chloramphenicol

Những nghiên cứu của Alaine Douart (2004) [1] cũng cho thấy các chủng đa kháng chủ yếu là serovar typhymurium Các loại kháng sinh bị kháng nhiều nhất là Ampicillin, Streptomycin, Dehydrochlotetracyclin và Sulfamid

Theo Bùi Thị Tho (1996) [40], có 44,45% chủng Salmonella kháng lại

Chloramphenicol; 44,45% kháng lại Ampicillin; 63,64% kháng lại Streptomycin; 72,73% kháng lại Sulfonamid

Theo tác giả Đinh Bích Thúy và cs (1995) [42], có 37,4 – 68,1% số

chủng Salmonella kháng lại Chloramphenicol; 33,4 – 59,6% kháng lại

Tetracyclin; 74,6 – 89,24% kháng lại Streptomycin; 27,65 – 34,7% kháng lại

Furazolidon Với Gentamycin chỉ có 4,26% số chủng Salmonella kháng lại

2.2.6 Phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh đối với một số thuốc kháng sinh và thuốc hóa học trị liệu

Việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừa bãi không theo nguyên tắc đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát triển Nó

đã gây khó khăn cho công tác điều trị lâm sàng trong nhân y cũng như trong thú y Trong lâm sàng để lựa chọn thuốc điều trị thích hợp là không dễ dàng Một trong những hướng lựa chọn thuốc là thí nghiệm xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh với một số thuốc kháng sinh hay còn gọi là kháng sinh

đồ

Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu và đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh, qua đó định hướng cho thầy thuốc sử dụng kháng sinh một cách khoa học; nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc của vi khuẩn

Có nhiều cách để đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh như phương pháp đặt ống trụ, khuếch tán trên thạch,… Trong đó, phổ biến nhất là kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán dựa theo nguyên lý của Kirby Bauer (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2005) [38] Ưu điểm của kỹ thuật này là

có thể cùng một lúc thử tác dụng của nhiều loại kháng sinh trên cùng một loại

vi khuẩn Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý khuếch tán kháng sinh từ khoanh giấy vào môi trường thạch Mức độ khuếch tán phụ thuộc vào phân tử lượng của từng loại kháng sinh và vào độ dày của thạch trên đĩa Petri Do đó, nồng

độ kháng sinh càng gần khoanh giấy thì càng cao, càng xa khoanh giấy càng thấp Những vùng xung quanh khoanh giấy là vùng ức chế Đường kính của vòng vô khuẩn càng lớn thì chứng tỏ khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó càng cao, vi khuẩn đó nhạy cảm với kháng sinh Ngược lại, nếu đường kính nhỏ hay vi khuẩn mọc sát vào mép khoanh giấy chứng tỏ vi khuẩn đó không nhạy cảm với kháng sinh tẩm trong giấy

3 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lợn con theo mẹ ỉa phân trắng ở trại lợn Thành Đồng - Mê Linh – Hà Nội

Lợn thí nghiệm được chia làm 3 nhóm tuổi khác nhau:

+ Nhóm 1: Lợn con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi

+ Nhóm 2: Lợn con từ 8 đến 14 ngày tuổi

+ Nhóm 3: Lợn con từ 15 đến 21 ngày tuổi

Lợn thí nghiệm đều được chọn từ những lợn mẹ đã được tiêm các loại vacxin phòng bệnh do virus gây ra theo quy trình chuẩn

3.2 Nguyên liệu

* Môi trường nuôi cấy

Các môi trường phổ thông tự chế biến trong phòng thí nghiệm để nuôi cấy mẫu nghiên cứu bao gồm: nước thịt, thạch thường

Các môi trường chuyên dụng để phân lập và giám định vi khuẩn do hãng Oxoid của Anh sản xuất: Macconkey Agar, Brilliant Green Agar (BGA), Chapman Agar, Edwards Medium, thạch máu, thạch kháng sinh

* Giấy tẩm kháng sinh:

Giấy tẩm kháng sinh do Oxoid sản xuất bao gồm các loại: Norfloxacin, Tetracyclin, Kanamycin, Enrofloxacin, Colistin, Neomycin, Penicillin, Amoxicillin/Clavulanic acid (AMC), Sulfamethoxazol – Trimethoprim (SXT), Gentamycin

* Thuốc kháng sinh

Sử dụng 4 loại kháng sinh: Amoxycillin, Colistin, Gentamycin và Enrofloxacin

Chúng tôi sử dụng 4 loại kháng sinh này để điều trị bệnh lợn con phân trắng tại trại Thành Đồng dưới dạng các chế phẩm: Amox 10%, Belcomycin

S, Genta – Dox và Enrovet 10%

* Dụng cụ thí nghiệm:

- Dụng cụ trong phòng thí nghiệm: đĩa lồng, ống thí nghiệm, kính hiển

vi, tủ sấy, tủ hấp ướt,

- Các dung dịch và thuốc nhuộm: cồn đỏ fucxin, tím gentian, lugol, cồn axeton,

3.3 Nội dung thí nghiệm

3.3.1 Xác định sự biến động của một số vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân lợn con theo mẹ khoẻ mạnh bình thường và khi bị ỉa phân trắng

3.3.2 Kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli, Salmonella phân lập từ phân

lợn con theo mẹ bị ỉa phân trắng với các thuốc kháng sinh và hoá học trị liệu thường dùng trong điều trị

3.3.3 Kiểm tra tính kháng thuốc của E.coli, Salmonella phân lập từ

phân lợn con theo mẹ bị ỉa phân trắng với các thuốc kháng sinh và hoá học trị liệu thường dùng trong điều trị

3.3.4 Xác định hiệu quả điều trị của một số thuốc sau khi làm kháng sinh

đồ trong điều trị bệnh lợn con phân trắng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

* Phương pháp lấy mẫu:

Tất cả các mẫu phân được lấy ngay tại hậu môn hoặc ngay sau khi lợn mới thải ra Mẫu phân lấy được chứa trong syringe vô trùng (trường hợp mẫu phân loãng chứa nhiều nước) hoặc bằng lọ thuỷ tinh vô trùng có nút bông (trường hợp mẫu phân bình thường)

* Phương pháp xử lý mẫu:

Mẫu lấy về nếu chưa kịp xử lí ngay sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 40C

3.4.2 Phương pháp xác định số loại và số lượng vi khuẩn trong phân lợn

* Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn:

Cân 1 gram phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát với 9 ml nước sinh lí ta được độ pha loãng 10-1, dùng syringe vô trùng trộn đều nhiều lần Sau

đó hút 1ml dung dịch này sang ống thứ 2 đựng 9ml nước sinh lí vô trùng, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến nồng độ pha loãng thích hợp để nuôi cấy

* Cách nuôi cấy: dùng syringe vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng ở các nồng độ đã chọn vào 1 đĩa môi trường Mỗi nồng độ ở mỗi môi trường cấy trên ba đĩa lồng Cấy bằng phương pháp láng đều dịch pha loãng trên bề mặt thạch Sau đó để các đĩa thạch vào tủ ấm 370C/24 giờ

* Xác định số lượng vi khuẩn

Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: cấy vi khuẩn trong môi trường thạch cứng rồi đếm số lượng khuẩn lạc (CFU) Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn

a: số lượng CFU trung bình trên 1 đĩa petri b: nồng độ pha loãng

* Xác định số loại vi khuẩn thường gặp trong phân lợn

Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trên môi trường thạch thường có đặc tính mọc khác nhau Trên cơ sở đó có thể phân loại và xác định được số lượng của từng loại Thông qua việc phân loại CFU qua hình thái, kích thước, màu sắc,