THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE VÀ NUCLEOTIDE LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, KHẢ NĂNG CHỊU ĐỰNG STRESS VÀ ĐỀ KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE VÀ NUCLEOTIDE LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, KHẢ NĂNG CHỊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN

OLIGOSACCHARIDE VÀ NUCLEOTIDE LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, KHẢ NĂNG CHỊU ĐỰNG STRESS VÀ

ĐỀ KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878)

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ NGỌC LINH

Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Niên khóa: 2004-2008

Tháng 9/2008

THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE

VÀ NUCLEOTIDE LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, KHẢ NĂNG CHỊU ĐỰNG

STRESS VÀ ĐỀ KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878)

Tác giả

TRẦN THỊ NGỌC LINH PHAN VĂN PHÚC

Khóa luận được trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư ngành Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn:

LÊ THANH HÙNG

Tháng 9 năm 2008

CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:

Ban Giám Hiệu Trường Đai Học Nông Lâm TP HCM đã tạo cho chúng tôi một môi trường tốt để học tập;

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thể quí thầy cô khoa Thủy Sản đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cũng như động viên về mặt tinh thần cho chúng tôi trong suốt khóa học;

Xin cảm ơn cô Võ Thị Thanh Bình, cô Nguyễn Thị Thanh Trúc, các bạn trong

và ngoài lớp đã quan tâm và động viên giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài;

Đặc biệt với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi đến thầy Lê Thanh Hùng đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này;

Các anh nhân viên Trại Thực Nghiệm Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh;

Ba, mẹ và anh chị đã hỗ trợ về vật chất lẫn tinh thần để hoàn thành đề tài nghiên cứu này;

Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Chúng tôi rất mong có sự đóng góp ý kiến của quí thầy cô và các bạn

để luận văn được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Thử nghiệm ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide

và Nucleotide lên sự tăng trưởng và đề kháng bệnh của cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus)”, được tiến hành từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008, tại trại thực

nghiệm và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Thí nghiệm được tiến hành nhằm đánh giá khả năng ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide và Nucleotide tự do có trong IMMUNO AID DRY lên sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn, sức chịu đựng stress và sức đề kháng bệnh của cá tra

Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Mannan Oligosaccharide và Nucleotide tự

do với 3 mức 0%; 0,1% và 0,2% trong thời gian 10 tuần Kết quả cho thấy thức ăn bổ sung Mannan Oligosaccharide kết hợp với Nucleotide tự do cho kết quả tăng trưởng có tốt hơn nhưng khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê Tỉ lệ sống trong 10 tuần không khác nhau về mặt thống kê Tuy nghiên kết quả giải phẩu mô học cho thấy có

sự khác biệt rõ rệt về cấu trúc mô học cũng như là số nếp gấp và độ dài vi nhung ruột: nghiệm thức bổ sung cho kết quả số nếp gấp và độ dài vi nhung ruột lớn hơn nghiệm thức đối chứng (thức ăn bổ sung 0,2% cho kết quả không khác so với thức ăn bổ sung 0,1%)

Sau thời gian gây stress bằng Ammonia tổng số cho thấy tỉ lệ sống cá thí nghiệm có sự khác biệt rõ rệt giữa nghiệm thức có bổ sung và nghiệm thức đối chứng Trong đó cá ở nghiệm thức bổ sung 0,2% có tỉ lệ sống cao nhất

Sau thời gian nuôi, việc gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cho

thấy khả năng kháng bệnh của cá nuôi ở nghiệm thức có bổ sung 0,1% và 0,2% cao hơn và khác nhau có ý nghĩa thống kê so với cá nuôi ở nghiệm thức đối chứng Trong

đó nghiệm thức bổ sung 0,1% và nghiệm thức bổ sung 0,2% cho kết quả như nhau

MỤC LỤC

Đề mục Trang

Trang tựa i

CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1: MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined 1.1Đặt Vấn Đề Error! Bookmark not defined 1.2 Mục Tiêu Đề Tài Error! Bookmark not defined Chương 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1 Nucleotide Error! Bookmark not defined 2.1.1 Cấu trúc của nucleotide Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vai trò của nucleotide đối với động vật thủy sản.Error! Bookmark not defined 2.1.3 Một số khảo nghiệm tác dụng của Nucleotide ở động vật thủy sản Error! Bookmark not defined 2.2 Mannan Oligosaccharide Error! Bookmark not defined 2.2.1 Vai trò của Mannan-oligosaccharide (MOS) đối với động vật thủy sản Error! Bookmark not defined 2.2.2 Một số nghiên cứu, khảo nghiệm MOS ở động vật thủy sản Error! Bookmark not defined 2.3 Tính Miễn Dịch Của Cá Error! Bookmark not defined 2.4 Edwardsiella ictaluri và Bệnh Gan Thận Mủ Error! Bookmark not defined 2.5 Ammonia Error! Bookmark not defined 2.6 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra 11

2.6.1 Phân loại 11

2.6.2 Phân bố Error! Bookmark not defined

2.6.3 Đặc điểm hình thái, sinh l ý Error! Bookmark not defined 2.6.4 Môi trường sống Error! Bookmark not defined 2.6.5 Đặc điểm dinh dưỡng Error! Bookmark not defined 2.6.6 Đặc điểm sinh trưởng Error! Bookmark not defined 2.6.7 Đặc điểm sinh sản Error! Bookmark not defined Chương 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined

3.1Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu Error! Bookmark not defined 3.2 Vật Liệu Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined 3.2.1Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.2.2 Dụng cụ và nguyên liệu Error! Bookmark not defined 3.2.3 Hệ thống giai và bể thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.2.4 Nguồn nước Error! Bookmark not defined 3.2.5 Thức ăn Error! Bookmark not defined 3.3 Bố Trí Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined 3.4 Các Chỉ Tiêu Theo Dõi Error! Bookmark not defined 3.4.1Các chỉ tiêu môi trường Error! Bookmark not defined 3.4.2 Lượng thức ăn Error! Bookmark not defined 3.4.3 Tăng trọng của cá Error! Bookmark not defined 3.4.4 Hệ số biến đổi thức ăn ( FCR) Error! Bookmark not defined 3.4.5 Hiệu quả sử dụng protein PER (protein efficiency ratio) Error! Bookmark not defined

3.4.6 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên cấu trúc mô ruột cá Error! Bookmark not defined

3.4.7 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên khả năng chịu đựng stress Error! Bookmark not defined

3.4.8 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên khả năng kháng bệnh Error! Bookmark not defined

3.5 Chế độ chăm sóc và quản lý thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.6 Phương Pháp Xử L ý Số Liệu Error! Bookmark not defined Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

4.1Thức Ăn Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined

4.2 Môi Trường Nuôi Cá Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined

4.2.1 Nhiệt độ Error! Bookmark not defined

4.2.2 Hàm lượng oxy hòa tan (DO) Error! Bookmark not defined

4.2.3 Độ pH .Error! Bookmark not defined

4.2.4 Hàm lượng Ammonia Error! Bookmark not defined

4.3 Sự Tăng Trưởng Của Cá Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined

4.4 Hiệu Quả Sử Dụng Thức Ăn Error! Bookmark not defined

4.4.1 Hệ Số Biến Đổi Thức Ăn Error! Bookmark not defined

4.4.2 Hiệu quả sử dụng protein trong thức ăn (PER) Error! Bookmark not defined

4.5 Kết quả đánh giá mô học Error! Bookmark not defined

4.6 Ảnh Hưởng Của Mannan-Oligosaccharide (MOS) và Nucleotide Lên Việc Cải

Thiện Sức Khỏe Ở Cá Tra Error! Bookmark not defined

4.6.1 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên việc đề kháng bệnh Error! Bookmark

not defined

4.6.2 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide trong việc chịu đựng stress Error!

Bookmark not defined

Chương 5:KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục

Phụ lục 1: Các thông số môi trường nuôi cá thí nghiệm

Phụ lục 2: Các chỉ tiêu tăng trưởng, lượng thức ăn và tỉ lệ sống của cá thí nghiệm

Phụ lục 3:Kết quả gây cảm nhiễm và gây stress cho cá tra

Phụ lục 4: Kết quả xử lý thống kê tăng trọng, lượng ăn, hệ số tăng trưởng đặc biệt , hệ

số thức ăn, hiệu quả sử dụng protein của cá giữa các nghiệm thức

Phụ lục 5: Kết quả xử lý thống kê tỉ lệ sống của cá tra đối với thí nghiệm gây stress

Phụ lục 6: Kết quả xử lý thống kê tỉ lệ sống của cá tra đối với thí nghiệm gây cảm

nhiễm.

TSA Trytone Soya Agar

EMB Eosine Methylene blue lactase Agar BHIA Brain heart infusion Agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 2.1 Các thành phần vách tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae 4

Bảng 3.1 Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng 21

Bảng 3.2 Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng 22

Bảng 4.1 Thành phần của thức ăn thí nghiệm 24

Bảng 4.2 Tăng trọng của cá sau 10 tuần thí nghiệm 31

Bảng 4.3 Hiệu quả sử dụng thức ăn 32

Bảng 4.4 Chiều cao nếp gấp ruột của cá ở các nghiệm thức 36

Bảng 4.5 Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm gây cảm nhiễm 38

Bảng 4.6 Tỉ lệ sống của cá sau 4 ngày và 6 ngày gây cảm nhiễm 40

Bảng 4.7 Kết quả phản ứng sinh hóa của khuẩn lạc được phân lập từ nội tạng cá tra gây cảm nhiễm 42

Bảng 4.8 Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm gây stress cho cá tra 42

Bảng 4.9: Tỉ lệ sống trung bình theo các giai đoạn sau khi gây stress cho cá tra 44

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Trang

Biểu đồ 4.1 Nhiệt độ của các bể thí nghiệm vào buổi sáng 25

Biểu đồ 4.2 Nhiệt độ của các bể thí nghiệm vào buổi chiều 26

Biểu đồ 4.3 Hàm lượng DO của các bể thí nghiệm vào buổi sáng 27

Biểu đồ 4.4 Hàm lượng DO của các bể thí nghiệm vào buổi chiều 27

Biểu đồ 4.5 pH của các bể thí nghiệm vào buổi sáng 28

Biểu đồ 4.6 pH của các bể thí nghiệm vào buổi chiều 29

Biểu đồ 4.7 Hàm lượng Ammonia của các bể vào buổi sáng 30

Biểu đồ 4.8 Hàm lượng Ammonia của các bể vào buổi chiều 30

Biểu đồ 4.9 Tăng trọng của cá ở các NT 31

Biểu đồ 4.10 Hệ số tăng trưởng đặc biệt SGR (%/ ngày) của cá ở các nghiệm thức 32

Biểu đồ 4.11 Hệ số biến đổi thức ăn ở các nghiệm thức 33

Biểu đồ 4.12 Hiệu quả sử dụng protein ở các nghiệm thức 34

Biểu đồ 4.13 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình sau khi gây cảm nhiễm cho cá tra 39

Biểu đồ 4.14 Tỉ lệ sống theo sau 4 và 6 ngày gây cảm nhiễm 40

Biểu đồ 4.15 Số cá chết trung bình tích lũy theo các ngày 43

Biểu đồ 4.16 Tỉ lệ sống trung bình theo các giai đoạn sau khi gây stress cho cá tra 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang

Hình 2.1 Mannan Oligosaccharide trích từ vách tế bào nấm men 4

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của Mannan Oligosaccharide 5

Hình 2.3 Cơ chế MOS gắn kết với mầm bệnh 6

Hình 2.4 Hình dạng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 9

Hình 3.1 Hóa chất NaHCO3 và NH4Cl 15

Hình 3.2 Hệ thống giai thí nghiệm 15

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 17

Hình 4.1 Cấu trúc mô học đường ruột của cá giữa các nghiệm thức 35

Hình 4.2 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm cho cá tra 37

Hình 4.3 Bố trí thí nghiệm gây stress cho cá tra .38

Xu thế hiện nay là sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học để làm tăng tăng trưởng, nâng cao sức đề kháng, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm hệ số thức

ăn Do đó, việc nghiên cứu các tác dụng của Mannan Oligosaccharide và Nucleotide đang ngày càng được các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất quan tâm

Xuất phát từ thực tế trên, được sự phân công của Ban Chủ Nhiệm khoa thủy sản trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên

cứu đề tài: "Thử nghiệm ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide và Nucleotide lên sự tăng trưởng, khả năng chịu đựng stress và đề kháng bệnh của cá tra"

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nucleotide

2.1.1 Cấu trúc của nucleotide

Cho đến nay, chúng ta biết rằng các Nucleic Acid, bao gồm Deoxyribonucleic Acid (DNA) và Ribonucleic Acid (RNA), là những đại phân tử sinh học có trọng lượng phân tử lớn với thành phần gồm các nguyên tố C, H, O, N và P; chúng được cấu thành từ nhiều đơn phân (monomer) là các Nucleotide

Về cấu trúc, mỗi Nucleotide gồm ba thành phần kết dính với nhau như sau: gốc đường pentose nối với một base tại C1' bằng một liên kết β-glycosid và nối với nhóm phosphate tại C5' bằng một liên kết Phosphomonoester (Trích bởi Colm A Moran,

2008)

2.1.2 Vai trò của nucleotide đối với động vật thủy sản

Việc cung cấp Nucleotide ngoại sinh đã được một số nhà nghiên cứu (Cosgrove, 1998); (Gyorgy,1971) công nhận khả năng làm tăng tăng trưởng ở một số loài động vật, cá và giáp xác; sự gia tăng tăng trưởng này là do một sự sao chép tế bào với tỉ lệ rất cao (Borda và ctv, 2003) (Trích bởi Colm A Moran, 2008)

Bên cạnh khả năng dẫn dụ, kích thích sự thèm ăn và sinh tổng hợp các acid amine không thiết yếu, Nucleotide ngoại sinh còn có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch Bên cạnh đó, Nucleotide tác động tích cực lên hệ vi khuẩn đường ruột, thúc đẩy chủng vi khuẩn có lợi phát triển và ức chế các chủng vi khuẩn gây hại cho cơ thể (Peng Li và Delberlt M.Gatlin, 2005) (Trích bởi Colm A Moran, 2008)

Một số nghiên cứu khác cho thấy, Nucleotide làm tăng tăng trưởng và cải thiện cấu trúc đường ruột Ngoài ra, Nucleotide còn làm tăng sức chịu đựng, tăng khả năng chống lại vi khuẩn, virus và các vi sinh vật có hại khác

2.1.3 Một số khảo nghiệm tác dụng của Nucleotide ở động vật thủy sản

Person- Leruyet và ctv (1983) (Trích bởi Colm A Moran, 2008) đã tiến hành thí nghiệm trên ấu trùng cá bơn trọng lượng 100 mg/con cho ăn thức ăn có bổ sung inosine (1,3% khẩu phần cho 6 ngày; 0,13% khẩu phần cho 45 ngày) kết quả thí nghiệm cho thấy tăng trưởng và tỉ lệ sống của cá gia tăng một cách đáng kể

Ramadan (1994) (Trích bởi Colm A Moran, 2008) lần đầu tiên quan sát rằng khẩu phần bổ sung Nucleotide có ảnh hưởng đến khả năng miễn dịch rõ ràng trên cá rô

phi sau khi tiêm trong cơ hoặc ngâm trực tiếp với tác nhân gây chết là Aeromonas hydrophila

Burrellls (2001) (Trích bởi Colm A Moran, 2008) đã báo cáo rằng sau khi tắm

với vi khuẩn Vibrio anguillarum, cá hồi được cho ăn khẩu phần có bổ sung Nucleotide

có hệ số chết tích lũy là 31%, trong khi cá ăn khẩu phần cơ bản và có bổ sung Glucan lần lượt là 49% và 43% Và cũng theo Burrells (2001) cho nuôi chung cá hồi

β-với vi khuẩn Piscirickettsia salmonis thì tỉ lệ chết của cá ăn khẩu phần thức ăn có bổ

sung Nucleotide là 46,9% trong khi đó ở cá ăn khẩu phần cơ bản đến 76,8%

Tỉ lệ chết của cá chẽm sau khi gây bệnh bằng Streptococus iniae đối với khẩu

phần ăn có bổ sung Nucleotide là 52% và khác biệt có ý nghĩa so với khẩu phần cơ bản là 83,8% (Li, 2004) (Trích bởi Colm A Moran, 2008)

2.2 Mannan Oligosaccharide

Đầu tiên, vào cuối thập niên 80, người ta quan tâm đến việc sử dụng đường mannose để giảm lượng vi sinh vật trong đường tiêu hóa Khi so với đường mannose tinh khiết, hợp chất chứa mannose phân nhánh (-1,3 và -1,6) có áp lực cao nhất đối với type 1 Vì vậy, hiện nay phức hợp Mannan oligosaccharides (MOS) trích từ thành tế

bào của dòng Saccharomyces cerevisiae rất được ưa chuộng

(Nguồn: Colm A Moran, 2008)

Hình 2.1: Mannan Oligosaccharide trích từ vách tế bào nấm men

Bảng 2.1: Các thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Thành phần Khối lượng phân tử trung

có vú Những chuỗi mannoprotein ở phía ngoài cùng trên tế bào nấm men còn có hơn 50-200 đơn vị liên manose, với một mạch chính dài có vị trí liên kết là 1,6 với các mạch bên ngắn ở vị trí -1,2 và -1,3 Những cấu trúc phức tạp này sẽ quyết định những thuộc tính bề mặt của tế bào nấm men Những thuộc tính này sẽ đặt cơ sở cho phương thức hoạt động chủ yếu của MOS đã được nghiên cứu trên gia súc và gia cầm

(Nguồn: Colm A Moran, 2008)

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của Mannan Oligosaccharide

2.2.1 Vai trò của Mannan-oligosaccharide (MOS) đối với động vật thủy sản

Nhìn chung, MOS có vai trò quan trọng đối với động vật thủy sản nói riêng và vật nuôi nói chung

Theo Colm A Moran (2008) vai trò của Bio-MOS như sau:

- Tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột

- Kết với những vi khuẩn gây bệnh chứa tiêm mao tuýp 1 và loại trừ trực tiếp từ ruột

- Cải thiện, nâng cao hình thái và cấu trúc đường ruột

- Cải thiện giá trị dinh dưỡng và tăng trưởng

- Điều chỉnh đáp ứng miễn dịch của cơ thể ký chủ

Trong đó vai trò tiêu biểu của Mannnan Oligosaccharide là sự kết dính của những vi khuẩn có fimbri thuộc tuýp với Bio-Mos Lectins (protein liên kết carbonhydrate) kết dính phân tử cacbonhydrate được bổ sung lên bề mặt tế bào biểu

mô của ký chủ và từ đó sẽ gắn kết với những tế bào vi khuẩn để khởi đầu quá trình sinh lý quan trọng của sự tương tác giữa tế bào với tế bào, trong trường hợp này đó là

sự khởi đầu của việc xâm nhập và gây bệnh Việc nhận dạng phân tử mầm bệnh là quan trọng phụ thuộc vào các mạch ngắn oligo của mannose trên các glycol liên hợp được trải dài khắp bề mặt của biểu mô Có thể chắc chắn rằng những mầm bệnh sẽ kết dính với những thụ thể tiếp nhận trên tế bào biểu mô bằng cách tạo ra các “đoạn mồi oligosaccharide” được biết như những tác nhân chống nhiễm trùng trong khẩu phần thức ăn chủ yếu là manno và polymano (Dawson và ctv, 2003)

( Nguồn: Colm A Moran, 2008)

Hình 2.3: Cơ chế MOS gắn kết với mầm bệnh

2.2.2 Một số nghiên cứu, khảo nghiệm MOS ở động vật thủy sản

Hiện nay một số công ty đã sử dụng Mannan Oligosaccharide làm thành phần chính trong một số sản phẩm bổ sung vào thức ăn cung cấp cho động vật thủy sản như sản phẩm Bio - Mos®

Staykow và ctv (2005 ) (Trích bởi Trần Hồng Cẩm, 2008) thí nghiệm trên cá hồi, bổ sung 0,2% Bio - Mos®, kết quả trọng lượng tăng 13,7% so với cá không cho

ăn thức ăn có Bio - Mos®, FCR giảm từ 0,91 xuống 0,83, tỉ lệ chết 1.68% lô đối chứng

và 0,58% lô cho ăn thức ăn có Bio - Mos® (p < 0,001)

Bổ sung Bio - Mos® vào thức ăn của một số loài cá nước ngọt như Silunus glanis (Bogut và ctv, 2006) (Trích bởi Trần Hồng Cẩm, 2008) chỉ ra sự tăng trưởng từ

22 g lên 76 g đối với lô đối chứng và tăng lên 83 g đối với lô cho thức ăn có Bio - Mos®, trung bình tăng trọng khoảng 9,7% FCR giảm 11,6% (p < 0.01), tỉ lệ chết giảm

từ 28,33 xuống 16,67%

Một thí nghiệm trên cá chép tại Đại học Osijek Croatia (Culjak và ctv, 2006) (Trích bởi Trần Hồng Cẩm, 2008) chế độ thức ăn được sử dụng 39,91% protein và 4,51% lipid, thêm và 0,6% Bio - Mos®, với chế độ này trọng lượng tăng 24% so với thức ăn không có Bio - Mos® FCR của cá ăn thức ăn có bổ sung Bio - Mos® là 1,6 và với đối chứng là 2,06

Thức ăn có Bio - Mos® cho thấy giảm tỉ lệ chết, cải tiến mức độ kháng thể và khả năng kháng vài loài vi khuẩn do hoạt đông của lysozyme tăng lên (Staykow, 2004)

Ngoài ra trên thị trường hiện nay một số sản phẩm bổ sung MOS vào thức ăn tôm được xem như là sản phẩm bổ sung kích thích hệ miễn dịch

Các nghiên cứu và khảo nghiệm MOS trên động vật thủy sản nói riêng và vật nuôi nói chung ngày càng nhiều vì các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất đã thấy được vai trò của MOS và khả năng ứng dụng to lớn của nó vào thực tiễn sản xuất

2.3 Tính Miễn Dịch Của Cá

Cá luôn bị đe dọa với một số lượng lớn những mầm bệnh gồm vi khuẩn, virus, nấm và những sinh vật kí sinh (Iwama và Nakanishi, 1996) (Trích bởi Trần Hồng

Cẩm, 2008) Hệ thống miễn dịch là một hệ thống phức tạp và rắc rối, đó là sự bảo vệ

cá từ những căn bệnh và ngăn ngừa sự lây lan của các bệnh nhiễm trùng

Hệ thống miễn dịch của hầu hết các loại cá đều giống nhau (Zelikoff và ctv, 2000), và có mối liên quan tương tự như ở động vật có vú (Zelikoff, 1998; Beaman và ctv, 1999) Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu gồm có những thành phần khác nhau

đó là cung ứng bẩm sinh sự bảo vệ chống lại sự nhiễm bệnh (Sunyer và Lambris, 1998) Cá luôn bị đe dọa với một số lượng lớn những mầm bệnh gồm vi khuẩn, virus, nấm và những sinh vật kí sinh (Iwama và Nakanishi, 1996) (Trích bởi Trần Hồng Cẩm, 2008) Hệ thống miễn dịch là một hệ thống phức tạp và rắc rối, đó là sự bảo vệ

cá từ những căn bệnh và ngăn ngừa sự lây lan của các bệnh nhiễm trùng

Lysozyme là một thành phần của miễn dịch bẩm sinh, tiêu diệt vi khuẩn qua hoạt động hydrolase, bẻ gãy chuỗi beta – (1, 4) trong nhánh peptidoglycan trong vách

tế bào vi khuẩn Vi khuẩn cũng bị tiêu diệt một cách trực tiếp hay bị xử lý bằng opxonni, giúp thực bào đến cùng

Ở động vật, vi khuẩn Gram(+) thì có mật độ lysozyme nhiều hơn vi khuẩn Gram(-), còn ở cá lysozyme có khả năng phản ứng lại cả ở vi khuẩn Gram(+) và Gram(-)

Lysozyme thường làm việc đồng thời với những cơ cấu khác của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu, như là hoạt động bổ sung và đại thực bào (Siwicki và ctv, 1998) Lysozyme thì được biểu diễn một cách liên tục bởi neutrophils, monocyte và đại thực bào, và hoạt động lysozyme hướng đến làm tăng sự kích thích hệ thống miễn dịch Ở cá sự thay đổi trong hoạt động lysozyme chống lại với mầm bệnh phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh (Siwicki và ctv, 1998) (Trích bởi Trần Hồng Cẩm, 2008)

2.4 Edwardsiella ictaluri và Bệnh Gan Thận Mủ

Bệnh mủ gan được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1998 Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng (61%) không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%) (Trần Anh Dũng, 2005) (Trích bởi Nguyễn Trọng Bình, 2008) Nhưng tỉ lệ chết là cao nhất (60 - 80%) (Crumlish và ctv, 2002) làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi

Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng trên gan, thận) trên cá tra, cá basa do nhóm vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Crumlish và ctv, 2002) (Trích bởi Nguyễn Trọng Bình, 2008) Vi khuẩn E ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm,

hình que, kích thước 1 x 2- 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose Có 1 - 3 Plasmid liên kết với E Ictaluri (Speyerer và Boyle, 1987;

Newton và ctv,1988) (Trích bởi Nguyễn Trọng Bình, 2008)

Edwardsiella ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau Vi khuẩn

trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb 1985; Shotts

và ctv,1986) Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da Edwardsiella ictaluri cũng có

thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv,1986) Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh ( Shotts và ctv, 1986) (Trích bởi Nguyễn Trọng Bình, 2008)

Hình 2.4: Hình dạng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Triệu chứng của bệnh:

* Mức độ nhẹ: Bên ngoài thân cá bình thường không biểu hiện xuất huyết, mắt hơi lồi nhưng khi mổ ra gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng (như đốm mủ) Đó là biểu

hiện bệnh lý đặc trưng nhất của bệnh mủ gan

* Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, cá thường nhào lộn và xoay tròn Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động Một số cá xuất huyết tất cả các vi hoặc xuất huyết toàn thân Có khi cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc lên khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang cá

2.5 Hàm lượng Ammonia

Ammonia là sản phẩm bài tiết chủ yếu của động vật thủy sản (Klinne, 1976) và

cơ chế gây độc cũng như nồng độ gây chết của nó trên nhiều loài cá và giáp xác quan trọng được thu thập khá phong phú (Tomasso, 1994) (Trích bởi Trần Hữu Lộc và Trương Thị Diệu Hòa, 2006)

Trong môi trường nước, Ammonia được tìm thấy ở dạng ion Ammonium (NH4+) và dạng phân tử không phân li (NH3), cả 2 cùng tồn tại bởi một phản ứng cân bằng thuận nghịch được điều tiết chủ yếu bởi pH (Emerson và ctv, 1975) (Trích bởi Trần Hữu Lộc và Trương Thị Diệu Hòa, 2006) pH cao thì nồng độ NH3 sẽ tăng lên so với (NH4+)

Công thức tính nồng độ Ammonia không phân li của Amstrong và ctv ( 1978) (Trích bởi Trần Hữu Lộc và Trương Thị Diệu Hòa, 2006):

[NH3]= [TAN]/(1-10 (pK - pH))

Trong đó:

[NH3]: Nồng độ Ammonia không phân li

[TAN]: Nồng độ Ammonia tổng số

pK: Hệ số phân li, pH: Giá trị pH trung bình

Dạng Ammonia không phân li khuếch tán 1 cách tự do trực tiếp qua màng tế bào dưới dạng hơi do chênh lệch áp suất hơi riêng phần (Fromm và Gilelette, 1988) (Trích bởi Trần Hữu Lộc và Trương Thị Diệu Hòa, 2006) Nếu nồng độ Ammonia trong nước tăng, sự bài tiết Ammonia của động vật sẽ giảm, dẫn đến hàm lượng Ammonia trong máu và mô tăng Kết quả có thể làm tăng pH máu, làm phá vỡ sự ổn định của màng tế bào do không điều khiển được quá trình trao đổi muối và nước trong

cơ thể làm thay đổi độ thẫm thấu của màng tế bào và các phản ứng được xúc tác bởi

enzyme và sẽ làm chết cá, tôm (Tomasso, 1994) (Trích bởi Trần Hữu Lộc và Trương Thị Diệu Hòa, 2006)

2.6 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra

2.6.1 Phân loại

Lớp: Osteichthyes

Bộ: Siluriformes

Họ: Pangasiidae Giống: Pangasius

Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage,1878)

Tên tiếng Anh: Tra Catfish

2.6.2 Phân bố

Cá tra nuôi P hypophthalmus xuất hiện khắp vùng hạ lưu sông Mê Kông (chủ

yếu ở khu vực 4 nước Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam) Cá bột sau khi nở trôi theo dòng chảy chính của sông tới Pnômpênh thì một phần theo sông Tonlesap vào biển Hồ, còn phần lớn đi theo sông Mê Kông xuống sông Tiền, một phần đi theo sông Bassac tới sông Hậu

2.6.3 Đặc điểm hình thái, sinh l ý

Cá tra có thân dài, dẹp ngang, không vảy bao phủ, da trơn, có màu hơi xanh nhạt trên thân lưng, màu xanh dần ở hai bên hông, bụng cá có màu trắng bạc Đầu nhỏ vừa phải, rộng và dẹp bằng, mắt tương đối to, miệng rộng phần sau hơi dẹp bên, có 2 đôi râu hàm trên ngắn hơn ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới ngắn

¼ chiều dài đầu, có răng lá mía và khẩu cái rất mịn tạo thành vòng cung Vây lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau Vây hậu môn tương đối dài

Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan

2.6.4 Môi trường sống

Cá tra phân bố ở các tầng nước nhưng thường phân bố ở tầng đáy, cá sống được ở thủy vực nước tĩnh và nước chảy

Nhiệt độ: Nhiệt độ sống thích hợp cho cá tăng trưởng dao động trong khoảng 26

- 30 0C (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001) Cá tra là loài chịu lạnh kém vì cá tra là một trong những loài đặc trưng cho loài phân bố ở vùng nhiệt đới Ở nhiệt độ 150C thì cường độ bắt mồi của cá giảm, nhưng cá vẫn sống, ở nhiệt độ 390C cá sẽ bơi lội không bình thường

pH: Cá có khả năng chịu đựng pH từ 5 - 11, nhưng pH thích hợp cho cá phát triển là 6,5 - 7,5 Ở pH = 5 cá có biểu hiện mất nhớt, các đôi râu teo dần, hoạt động chậm chạp, khi pH = 11 cá sẽ hoạt động lờ đờ và mất nhớt

Khả năng chịu mặn: Cá tra là loài sống chủ yếu ở nước ngọt, không sống được

ở vùng nước mặn Nhưng cá có khả năng sống trong vùng nước lợ, độ mặn cá có khả năng chịu đựng là 10‰ (Mai Đình Yên và ctv, 1992)

Oxy hòa tan: Cá tra chịu được hàm lượng oxy hòa tan thấp Do đó cá có thể nuôi trong các ao nước tù, nước bẩn, nơi có nhiều chất hữu cơ hay nuôi trong bè với mật độ dày

2.6.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra có miệng rộng, răng sắc nhọn trên các xương hàm, xương lá mía và xương khẩu cái Gai trên cung mang thưa và ngắn nên không có tác dụng lọc thức ăn như cá ăn phiêu sinh vật Dạ dày hình chữ U, ruột ngắn và không gấp khúc Trong thủy vực tự nhiên, cá tra là loài ăn tạp tuy nhiên tính ăn của chúng thiên về động vật

Cá tra ở giai đoạn cá bột và cá hương thích ăn mồi sống, nhưng theo quá trình phát triển thì chúng thích ăn mồi chết và phổ thức ăn rộng Trong điều kiện ao nuôi, cá tra

có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau có hàm lượng protein thấp do con người cung cấp Đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng đối với việc phát triển nuôi rộng rãi loài cá này (Phạm Văn Khánh, 1996)

2.6.6 Đặc điểm sinh trưởng

Trong tự nhiên đã bắt được cá nặng 18 kg hoặc có con dài tới 1m8, cá có thể sống trên 20 năm

Cá tra bột hết noãn hoàng có chiều dài 1 - 1,1 cm, sau 14 ngày ương đạt chiều dài 2 - 2,3 cm và đạt trọng lượng khoảng 0,52 gam Sau 1 năm nuôi cá đạt trọng lượng

từ 0,7 - 1,5 kg và cá từ 3 - 4 tuổi đạt trọng lượng từ 3 - 5 kg (Phạm Văn Khánh, 1996)

là 60 cm Cá tra cái cùng tuổi thì có trọng lượng lớn hơn cá tra đực 30 – 40%

Sức sinh sản của cá tra khoảng 139.000 – 150.000 trứng/kg cá cái Hệ số thành thục cá tra cái ngoài tự nhiên dao động từ 3,0 – 12,57%, cá tra đực 0,83 – 2,1%

Kích thước trứng tương đối nhỏ đường kính trung bình là 1 mm, sau khi trương

có thể tới 1,5 – 1,6 mm

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008

Đề tài được thực hiện tại Trại Thực Nghiệm và Phòng Bệnh Học Khoa Thủy

Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu Thí Nghiệm

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra thí nghiệm có nguồn gốc từ Đồng bằng sông Cửu Long Cá trước khi thí nghiệm được ương nuôi trong bể xi măng và cho ăn cùng loại thức ăn để cá thích nghi với điều kiện môi trường và sức khỏe ổn định, cá có chất lượng tốt, bơi lội nhanh nhẹn, kích cỡ đồng đều, màu sắc đặc trưng Sau 2-3 tuần cá sẽ được bố trí vào các giai trong bể xi măng

3.2.2 Dụng cụ và nguyên liệu

Hệ thống bể thí nghiệm gồm 4 bể xi măng có cùng kích thước (2,5 x 3 m);

12 giai (1 x 1 x 1 m);

Hóa chất NaHCO3, NH4Cl;

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri;

Hệ thống sục khí, ống xi phông, thau, xô, vợt, bộ test NH4+/NH3, DO, máy đo

pH, nhiệt kế;

Thùng xốp, bộ đồ tiểu phẩu, cân, kính, lam, đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm và một số dụng cụ khác…

Hình 3.1: Hóa chất NaHCO3 và NH4Cl

3.2.3 Hệ thống giai và bể thí nghiệm

Sử dụng trong hệ thống bể xi măng của trại, chọn 4 bể để tiến hành thí nghiệm Mỗi bể bố trí 3 giai (kích thước 1 m x 1 m x 1 m) Bể và giai được vệ sinh, khử trùng sạch sẽ bằng chlorine Sau đó, cấp nước và gây màu nước rồi mới thả cá Các giai chứa cá thí nghiệm được bố trí hệ thống sục khí

Hình 3.2: Hệ thống giai thí nghiệm

3.2.4 Nguồn nước

Nước sử dụng trong thí nghiệm là nước máy sinh hoạt được trữ trước 1 ngày mới cấp vào hoặc để khi thay nước

3.2.5 Thức ăn

Thức ăn được sản xuất bởi qui mô công nghiệp, dạng viên nổi, 3 công thức thức

ăn có hàm lượng protein và các khoáng chất như nhau, sản xuất bởi công ty Minh Quân

Thành phần bổ sung thức ăn mà chúng tôi nghiên cứu là sản phẩm Imuno Aid của công ty INVE (chứa cả hai thành phần là MOS và Nucleotide)

Theo nghiên cứu thí nghiệm đã được tiến hành với 3 mức bổ sung Immuno Aid như sau:

Thức ăn đối chứng: không bổ sung sản phẩm Immuno Aid

Thức ăn 0,1%: Bổ sung 1kg Immuno Aid / tấn thức ăn

Thức ăn 0,2%: Bổ sung 2 kg Imuno Aid/ tấn thức ăn

Thành phần trong thức ăn gồm: Bột cá, bột đậu nành, cám gạo, bột xương thịt, khoáng, vitamin…

3.3 Bố Trí Thí Nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức tương ứng với 3 loại thức ăn (đối chứng; 0,1% bổ sung; 0,2% bổ sung Immuno-Aid)

Mỗi nghiệm thức gồm 100 cá tra giống và được lập lại 4 lần (tương ứng 4 lô)

Sơ đồ bố trí các nghiệm thức được trình bày ở Hình 3.3

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

3.4 Các Chỉ Tiêu Theo Dõi

3.4.1 Các chỉ tiêu môi trường

DO: đo 1 tuần/lần vào buổi sáng và buổi chiều bằng test DO

pH: đo 1 tuần/lần vào buổi sáng và buổi chiều bằng máy đo pH

NH3:đo 1 tuần/lần vào buổi sáng và buổi chiều bằng test NH4+/NH3

Nhiệt độ: đo 1 tuần/lần vào buổi sáng và buổi chiều bằng nhiệt kế thủy ngân

3.4.2 Lượng thức ăn

Cho cá ăn mỗi ngày 2 lần sáng, chiều, cho ăn tối đa

Sau mỗi lần cho cá ăn, tiến hành đếm lượng thức ăn dư, từ đó suy ra lượng thức

ăn cá sử dụng hàng tuần và trong suốt quá trình thí nghiệm

3.4.3 Tăng trọng của cá

Trọng lượng của cá được đo lúc bắt đầu thí nghiệm và sau 10 tuần thí nghiệm bằng cân điện tử 1 số lẻ

NT I(3)

NT

II (3)

ĐC (3)

NT

II (4)

ĐC (4)

NT

I (4)

ĐC (1)

Tăng trọng của cá tính bằng công thức:

Tăng trọng (g) = Trọng lượng cuối - Trọng lượng đầu

Hệ số tăng trưởng đặc biệt tính bằng công thức:

SGR (%/ngày) = (lnw2 – lnw1)/ (T2 – T1) * 100 Trong đó :

SGR : Hệ số tăng trưởng đặc biệt

lnw1 : Logarit nepe trọng lượng trung bình bắt đầu thí nghiệm

lnw2 : Logarit nepe trọng lượng trung bình cuối thí nghiệm

T2 – T1: khoảng thời gian của thí nghiệm

3.4.4 Hệ số biến đổi thức ăn ( FCR)

Hệ số biến đổi thức ăn tính bằng công thức

FCR = Lượng thức ăn ăn vào / Tăng trọng

3.4.5 Hiệu quả sử dụng protein PER (protein efficiency ratio)

Hiệu quả sử dụng protein tính bằng công thức

PER= (Wt – W0) / protein trong thức ăn

3.4.6 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên cấu trúc mô ruột cá

Sau khi nuôi 10 tuần, chọn ở mỗi giai 5 con, đem giải phẩu lấy ruột, cắt lấy đoạn ruột giữa cách dạ dày 3 cm một đoạn 0,5 cm, đoạn ruột cắt được giữ trong hũ nhựa chứa dung dịch cố định có đánh dấu kí hiệu tương ứng với từng giai thí nghiệm, gửi mẫu tại khoa giải phẩu mô học bệnh viện Từ Dũ

3.4.7 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên khả năng chịu đựng stress

Sau 10 tuần nuôi (với chế độ thức ăn bổ sung 0%; 0,1%; 0,2%) bắt ngẫu nhiên

ở mỗi giai 20 con đem chuyển vào nuôi trong 12 thùng nhựa (0,8 x 0,6 x 0,6 m) được đánh dấu kí hiệu tương ứng ở mỗi giai đã pha sẵn môi trường nước có nồng độ ammonia tổng số 100 ppm

Hàng ngày theo dõi số cá chết và ghi nhận

3.4.8 Ảnh hưởng của MOS và Nucleotide lên khả năng kháng bệnh

Số cá còn lại sau 10 tuần nuôi chọn ngẫu nhiên mỗi giai 20 con, chuyển vào

thùng xốp có thể tích (0,4 x 0,6 x 0,4 m) đã được trữ nước máy 2 ngày và có đánh dấu

kí hiệu tương ứng ở mỗi giai

Sau 2 ngày trữ cá trong thùng xốp chuyển cá ra thau có đánh dấu kí hiệu tương ứng chứa 15 lít nước và bố trí hệ thống sục khí, cho 15 ml vi khuẩn vào ngâm với mật

độ vi khuẩn 1,45 x 106 CFU/ml, ngâm trong thời gian 1 giờ rồi vớt cá ra cho vào thùng xốp đã chuẩn bị trước

Các lô thí nghiệm nuôi trong cùng điều kiện như nhau: phòng thí nghiệm bệnh học khoa thủy sản, nhiệt độ môi trường nước 23-250C, chế độ thay nước, chăm sóc

► Chăm sóc và quản lí thí nghiệm gây bệnh

Sau khi tiêm vi khuẩn, định kì mỗi ngày thay nước một lần Trong suốt quá trình thí nghiệm, cá được cho ăn thức ăn tương ứng với các nghiệm thức thí nghiệm

► Phương pháp thu mẫu

Theo dõi thí nghiệm bằng cách ghi nhận cá chết trong 14 ngày

Phân lập vi khuẩn trên 3 cơ quan: gan, lá lách, thận

Trong quá trình thí nghiệm, cá chết được mổ để kiểm tra dấu hiệu bên trong như: có đốm trắng ở các nội quan Cá lờ đờ hay vừa mới chết tiến hành phân lập vi khuẩn

► Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm

Yêu cầu về mẫu vật: mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống hay vừa mới chết

Trước khi giải phẩu đặt cá trên khây sạch Quan sát bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện như: vết thương, điểm xuất huyết, và các triệu chứng của bệnh Quan sát bằng mắt thường màu sắc của các cơ quan bên trong và giải phẩu lấy gan, thận, lách

Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách Dùng cồn 70% để tránh nhiễm khuẩn ký sinh ở phần da cá Sau đó tiến hành cấy từng cơ quan vào đĩa petri môi trường TSA Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 27-30ºC Sau 24 giờ quan sát và ghi nhận các đặc điểm sinh lý

► Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý của vi khuẩn

Theo phương pháp của Bergey (1974)

Quan sát hình dạng màu sắc khuẩn lạc

Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặt điểm sau:

Hình dạng khuẩn lạc (rìa khuẩn lạc)

Bề mặt khuẩn lạc

Kích cỡ khuẩn lạc

Tạo sắc tố (đổi màu môi trường)

► Phương pháp làm thuần vi khuẩn

Vi khuẩn sau khi được phân lập thì tiếp tục được làm thuần bằng cách lựa chọn những khuẩn lạc riêng lẻ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria chúng vào một đĩa petri khác với môi trường tương tự như môi trường dùng để phân lập Tiến hành tiếp tục đến khi nào ta quan sát không thấy có khuẩn lạc khác biệt về hình dạng, kích cỡ, màu sắc

► Phương pháp định danh vi khuẩn

Tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ thử nghiệm IDS 14 GNR để định danh các loài trực khuẩn Gram (-) dựa trên 14 phản ứng sinh hóa: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thủy giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động

Mỗi bảng nhựa có 10 giếng được đánh số từ 1 - 10 Các đĩa giấy sinh hóa được gắn vào các đáy giếng theo thứ tự được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng

STT Đĩa giấy sinh hóa

1 Lên men Glucose

7 Thủy giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

c.Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa:

Pha huyền dịch vi khuẩn cần định danh: Lấy một khuẩn lạc có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ, cho vào trong 2,5 ml nước muối sinh lý Pha càng đục càng tốt Sau đó, cho vào máy vortex để khuấy đều lên

Tiếp đó cho vào mỗi giếng 1 ml huyền dịch Đậy nắp lại cho vào tủ ấm ở nhiệt

độ 30oC không quá 16 giờ ta phải đọc kết quả

Bảng 3.2: Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng

5 Phenyl Alanin Deaminnase

Xanh lá (+) Vàng lợt (-)

Vàng, xanh lá (-)

3.5 Chế độ chăm sóc và quản lý thí nghiệm

Cá được cho ăn một ngày hai lần vào buổi sáng và buổi chiều và cho ăn tối đa Thay nuớc 1 tuần/lần

Thường xuyên quan sát các hoạt động của cá để có những biện pháp xử lý kịp thời

3.6 Phương Pháp Xử L ý Số Liệu

Các giá trị trung bình về trọng lượng, lượng thức ăn, hệ số tăng trọng đặc biệt,

hệ số biến đổi thức ăn, hiệu quả sử dụng protein, tỉ lệ sống, tỉ lệ sống tích lũy được xử

lý bằng phần mềm Excel

Sự khác nhau về tăng trọng, lượng thức ăn, hệ số tăng trọng đặc biệt, hệ số biến đổi thức ăn, hiệu quả sử dụng protein, tỉ lệ sống, tỉ lệ sống tích lũy của cá thí nghiệm được phân tích bằng phương pháp phân tích biến Sử dụng phần mềm Minitab 14 để kiểm tra sự sai khác có hay không có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức

Sự khác biệt giữa các nghiệm thức và giữa các lần thí nghiệm được so sánh theo trắc nghiệm Tukey