[Luận văn]đánh giá hiệu lực của vacxin phòng bệnh cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh bắc giang

Thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, tự nhiên, kinh tế, nông nghiệp

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng: số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I

NGUYỄN HOÀNG ðĂNG

ðÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN ðỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: thú y

Mã só: 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS TÔ LONG THÀNH

HÀ NỘI - 2008

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………1

Tôi xin cam ñoan rằng: mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng 8 năm 2008

Tác giả

Nguyễn Hoàng ðăng

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………2

LỜI CẢM ƠN

Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cơ giáo, các cán bộ, nhân viên của Trường ðH Nơng nghiệp Hà Nội , Khoa Sau đại học và Khoa Thú y đã tạo điều kiện cho tơi được tiếp cận những kiến thức khoa học trong thời gian học tập tại trường

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Tơ Long Thành, người hướng dẫn khoa học trực tiếp đã tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này

Xin được cảm ơn các thầy, cơ giáo trong Khoa Thú y, đặc biệt là các thầy, cơ trong Bộ mơn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý đã truyền đạt kiến thức và cĩ nhiều ý kiến đĩng gĩp giúp tơi hồn thành luận văn

Tơi xin cảm ơn các cán bộ, nhân viên Trung tâm Chẩn đốn Thú y TW, đặc biệt là các cán bộ, nhân viên Phịng Virus đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập tại đây

Cám ơn sự động viên, giúp đỡ tạo điều kiện của lãnh đạo cùng tồn thể cán bộ, nhân viên và bạn bè đồng nghiệp ngành thú y tỉnh Bắc Giang

Nhân dịp hồn thành luận văn, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình và người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã luơn động viên, tạo mọi điều kiện cho tơi học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 8 năm 2008

Tác giả

Nguyễn Hồng ðăng

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………3

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Phần 2: Tổng quan tài liệu

2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm trên thế giới

2.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

2.2 Căn bệnh của cúm gia cầm

2.2.1 Cấu trúc chung của virus cúm type A

2.2.2 Kháng nguyên của virus cúm

2.5 Phương pháp chẩn đốn bệnh cúm gia cầm

2.5.1 Chẩn đốn dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích

2.5.2 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

2.6 Phịng chống bệnh cúm gia cầm

i

ii iii

vi vii viii

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ4

2.7 đáp ứng miễn dịch chống virus cúm ở gia cầm

2.7.1 đáp ứng miễn dịch không dặc hiệu

2.8.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới

2.8.3 Những ựiểm cần lưu ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm

2.9 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam

Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu và dụng cụ thắ nghiệm

3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

3.2.3 Phương pháp phát hiện virus

3.2.3.1 Phân lập virus trên trứng có phôi

3.2.3.2 Kiểm tra nước trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu -

4.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm và sử dụng vacxin cúm gia cầm tại

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ5

4.3.1 Giám sát huyết thanh học ựối với các ựàn gia cầm, thuỷ cầm

trên ựịa bàn tỉnh Bắc Giang năm 2007

48

4.3.2 Hiệu giá kháng thể kháng virus cúm subtype H5 của gà - vịt -

4.3.3 So sánh ựáp ứng miễn dịch chống cúm của 3 loài gà - vịt - ngan

4.4.1 Giám sát huyết thanh học ựối với các ựàn gia cầm, thuỷ cầm

4.4.2 Hiệu giá kháng thể kháng virus cúm subtype H5 của gà - vịt

ựược tiêm phòng năm 2008

4.7 đánh giá tắnh khả thi của chương trình sử dụng vacxin cúm gia

cầm trên ựịa bàn tỉnh Bắc Giang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt tiếng Việt

Tỷ lệ bảo hộ Dương tính

Haemagglutination Assay Haemagglutination Inhibition Assay Office International des Epizooties Ribonucleic acid

Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction Realtime RT-PCR

World Health Organization

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 4.1: Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Bắc Giang một số năm gần ñây

42

Bảng 4.3: Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm ñã tiêm phòng năm 2007

Bảng 4.7: Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 trong huyết thanh gia cầm,

Bảng 4.8a: Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 trong huyết thanh gà ñã

Bảng 4.11: So sánh ñáp ứng miễn dịch của gia cầm các ñịa phương trong

2 năm 2007 và 2008

69

Bảng 4.12: So sánh ðƯMD của gà - vịt trong 2 năm 2007 và 2008 71 Bảng 4.13: HGKT kháng cúm H5 ở các thời ñiểm 1, 2, 3 và 4 tháng sau tiêm phòng nhắc lại

73 Bảng 4.14: Giám sát huyết thanh thủy cầm chưa tiêm phòng năm 2007 77 Bảng 4.15: Kết quả giám sát virus học ñối với gia cầm tại chợ, ñiểm giết 78

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………8

mổ năm 2007

Bảng 4.16: Giám sát lưu hành virus ở cúm gia cầm năm 2008 80

DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ

Trang Biểu ñồ 1: HGKT kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh

Biểu ñồ 2: Tỷ lệ bảo hộ theo cá thể của ñàn gia cầm ñã tiêm

Biểu ñồ 3: So sánh HGKT kháng kháng nguyên H5 trong

huyết thanh gà - vịt - ngan ñã tiêm phòng năm 2007

58

Biểu ñồ 4: So sánh TLBH theo cá thể và theo ñàn của gà - vịt

- ngan ñã tiêm phòng năm 2007

59

Biểu ñồ 5: HGKT kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh

gia cầm, thủy cầm ñã tiêm phòng năm 2008

Biểu ñồ 9: So sánh về tỷ lệ bảo hộ cá thể giữa 2 năm 2007 -

Biểu ñồ 10: So sánh TLBH theo cá thể và theo ñàn của gà -

vịt trong 2 năm 2007 - 2008

72

Biểu ñồ 11: Diễn biến hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 tại

các thời ñiểm 1, 2, 3, và 4 tháng sau tiêm nhắc lại

75

Biểu ñồ 12: Diễn biến của tỷ lệ bảo hộ trong ðƯMD kháng

cúm H5 tại các thời ñiểm 1, 2, 3, và 4 tháng sau tiêm nhắc lại

76

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………9

là các bệnh dịch xảy ra trên quy mô khu vực và quốc tế thì không chỉ là vấn

ñề của riêng nước ta mà còn là mối lo ngại của toàn thế giới

Bệnh cúm gia cầm ñã từng ñược biết ñến từ lâu sau những vụ ñại dịch gây ra cho các ñàn gia cầm ở nhiều nước trên thế giới Trong mấy năm gần ñây, dịch cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (HPAI - Highly Pathogenic Avian Influenza) xuất hiện và ñã giết chết hàng chục triệu gia cầm trên thế giới, ñồng thời khiến hàng tỷ gia cầm khác phải tiêu huỷ bắt buộc ñể tránh lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi và kinh tế các nước có dịch

Nguyên nhân của HPAI là các loại virus cúm typ A - loại virus có khả năng biến chủng rất mạnh Bệnh lây lan nhanh chóng trong các ñàn gia cầm với tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết rất cao Không những thế, bệnh còn truyền sang các loài ñộng vật có vú khác, và ñặc biệt nguy hiểm là có thể lây sang người, gây tử vong hoặc ảnh hưởng lớn ñến sức khỏe Hiện nay cả thế giới ñang phải ñối mặt với nguy cơ xảy ra một vụ ñại dịch cúm ở người mà nguyên nhân là

do các chủng virus cúm gia cầm biến ñổi thành những loại mới thích nghi gây bệnh ở người [2]

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ10

Từ năm 2003 ựến nay, ựã có 6 ựợt dịch cúm gia cầm bùng phát ở Việt Nam, gây thiệt hại rất lớn về kinh tế, xã hội Các biện pháp phòng chống dịch như tiêu hủy hàng loạt; cấm buôn bán, vận chuyển; tiêu ựộc, sát trùng; thực hiện an toàn sinh họcẦ ựã góp phần dập tắt các ựợt dịch, song rất tốn kém, ô nhiễm môi trường và không mang ựến hiệu quả cao trong ựiều kiện chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ như ở Việt Nam Bệnh cúm không bị khống chế hoàn toàn và vẫn tái phát lẻ tẻ ở nhiều ựịa phương [14]

Hiện nay, sử dụng vacxin cúm tiêm phòng cho toàn bộ ựàn gia cầm là biện pháp ựược OIE, FAO khuyến cáo như là một công cụ hữu hiệu trong chiến lược phòng chống dịch cúm gia cầm Nhiều nước như Italia, Trung Quốc,Ầ ựã tiến hành và cho những kết quả khả quan [6], [25] Trên cơ sở ựó,

từ cuối năm 2005, Việt Nam ựã tiến hành tiêm phòng vacxin cúm cho ựàn gia cầm bằng các loại vacxin nhập ngoại và ựã thu ựược những kết quả tương ựối tắch cực trong phòng chống bệnh cúm gia cầm

Việc ựánh giá ựáp ứng miễn dịch của gia cầm ựối với vacxin cúm và khảo sát khả năng bảo hộ của vacxin trong ựiều kiện thực ựịa là yêu cầu quan trọng nhằm tìm hiểu hiệu quả sử dụng vacxin, từ ựó có thể giúp ựưa ra những chiến lược phù hợp trong phòng chống và tiến tới thanh toán dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Xuất phát từ tình hình và yêu cầu thực tế ựó, chúng tôi tiến hành thực

hiện ựề tài: "đánh giá hiệu lực của vacxin phòng bệnh Cúm gia cầm trên ựịa bàn tỉnh Bắc Giang"

1.2 MỤC TIÊU CỦA đỀ TÀI

- đánh giá ựược thiệt hại do dịch cúm ựối với ngành chăn nuôi gia cầm tỉnh Bắc Giang

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ11

- đánh giá ựược ựáp ứng miễn dịch của gia cầm ựối với vacxin cúm ựược sử dụng trong giai ựoạn 2007 - 2008 trên ựịa bàn tỉnh Bắc Giang

- đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phòng bệnh cúm gia cầm trong ựiều kiện thực ựịa tại Bắc Giang

- đánh giá tắnh khả thi của chương trình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại tỉnh Bắc Giang

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI

- Các kết quả ựiều tra nghiên cứu nhằm hoàn thiện các thông tin về dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

- đưa ra các số liệu về tình hình dịch Cúm gia cầm, các kết quả giám sát sau tiêm phòng của tỉnh Bắc Giang Các số liệu này có thể dùng làm tài liệu tham khảo

- Góp phần ựánh giá hiệu quả của vacxin cúm trong "Dự án sử dụng vacxin nhằm không chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm" của nước ta

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ12

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM

2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm trên thế giới

Bệnh cúm ựã xuất hiện từ cách ựây rất lâu và từng ựược Hippocrates

mô tả từ năm 412 trước Công nguyên Trong hơn 100 năm qua, ựã có 4 vụ ựại dịch cúm ở người xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957 và 1968 Năm 1918, ựại dịch cúm xảy ra ở châu Âu do virus cúm type A H1N1 gây ra, ựược gọi là dịch cúm Tây Ban Nha, khiến cho 20 - 40 triệu người chết đến năm 1957, virus H2N2 xuất hiện ở miền Nam Trung Quốc, gây ra bệnh cúm châu Á Năm 1968, ựến lượt virus H3N2 là nguồn gốc gây bệnh cúm Hồng Kông Năm 1977, virus H1N1 quay trở lại gây bệnh cúm Nga, nhưng không kinh hoàng như năm 1918

Năm 1878, tại Italia ựã xảy ra một bệnh gây tỷ lệ tử vong rất cao ở ựàn gia cầm, sau ựó ựược ựặt tên là bệnh dịch hạch gia cầm đến năm 1901, Centanni và Savonuzzi ựã ựề cập ựến ổ dịch này ựược gây ra bởi virus qua lọc Nhưng phải ựến năm 1955 mới xác ựịnh ựược virus ựó chắnh là virus cúm type A (H7N1 và H7N7) gây chết nhiều gà, gà tây và nhiều loài khác Những chủng virus ựặc biệt này ựã gây ra dịch cúm gia cầm ở nhiều vùng, nhiều quốc gia trên thế giới trong thời gian cuối thế kỷ XIX, ựầu thế kỷ XX như ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Nam Phi, Trung đông, Viễn đông, Anh, Liên Xô (cũ) [16]

Trước ựây người ta gọi bệnh này là bệnh dịch tả gà (fowl plague) hay bệnh dịch tả gà giả, nhưng từ Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ (1981) ựã thay thế tên này bằng tên Bệnh cúm truyền

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………13

nhiễm cao ở gia cầm hay Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (Highly

Pathogenic Avian Influenza - HPAI)

Từ khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học ñã tăng cường nghiên cứu và thấy virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi

ở những vùng khác nhau trên thế giới Bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra ở gia cầm là những chủng gây bệnh cao thuộc phân type H5 và H7, như ở Scotland năm 1950 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 - 1984 là H5N2

Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 thấy ở lợn và có liên quan ñến những

ổ dịch ở gà tây Mối liên quan giữa lợn - gà tây là những dấu hiệu ñầu tiên về virus cúm ở ñộng vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm Những nghiên cứu về phân type H1N1 ñều cho thấy rằng virus cúm type A ñã ở lợn

và truyền lây cho gà tây Ngoài ra phân type H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn Một số chủng virus cúm type A ñiển hình gây bệnh ở gia cầm ñã ñược phát hiện trong những ổ dịch ở ñộng vật có vú

Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm ñã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ñược công nhận khi xác ñịnh ñược tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú [1]

Dịch cúm gia cầm bùng nổ liên tục khắp các châu lục trên thế giới ñã thúc ñẩy các hiệp hội chăn nuôi gia cầm và các nhà khoa học tổ chức nhiều hội thảo chuyên ñề về bệnh Từ ñó ñến nay, trong các hội thảo về dịch tễ, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung ñược coi trọng ðiều này cho thấy bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm, gây nhiều thiệt hại

về kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên toàn cầu Càng ñặc biệt nguy hiểm hơn khi virus cúm gia cầm “vượt hàng rào về loài”, thích nghi gây bệnh

ở người với tỷ lệ tử vong rất cao [16]

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ14

Từ cuối năm 2003 - 2005 ựã có 11 nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hồng Kông và Việt Nam Ngoài ra có

7 nước và vùng lãnh thổ khác có dịch cúm gia cầm các chủng khác là Pakistan, Hoa Kỳ, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều Tiên và đài Loan Vào cuối tháng 3/2005 tại Myanmar ựã phát hiện hàng ngàn gà chết nghi bệnh cúm gia cầm Tắnh ựến nay, ựã có tổng cộng 55 nuớc và vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm làm 250 triệu con gia cầm bị chết hoặc tiêu hủy bắt buộc Bệnh cúm cũng lây sang người với 258 trường hợp nhiễm bệnh và 154 người ựã chết 18]

2.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm ở nước ta xuất hiện lần ựầu tiên vào cuối tháng 12/2003, sau ựó liên tục tái phát, và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là trong giai ựoạn ựông - xuân Theo Cục Thú y [5], tắnh ựến nay, ựã có 6 lần dịch cúm gia cầm bùng phát tại việt nam:

* đợt dịch thứ nhất từ 12/2003 ựến 30/3/2004: lần ựầu tiên dịch cúm

gia cầm xuất hiện vào cuối tháng 12/2003 ở tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng, ựến ngày 27/2/2004 dịch ựã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6% số xã, phường), 381 huyện, quận, thị xã (60%) thuộc 57 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương Các tỉnh xảy ra dịch nặng là Long An, Tiền Giang, đồng Tháp, Hà Tây, Hải Dương Tổng số gà và thuỷ cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,79% tổng ựàn, trong ựó gà là 30,4 triệu con, thuỷ cầm là 13,5 triệu con; ngoài ra, còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu huỷ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………15

* ðợt dịch thứ 2 từ tháng 4 ñến tháng 11/2004: trong giai ñoạn này, dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ ở các hộ gia ñình chăn nuôi gia cầm; bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7, sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ trong giai ñoạn này là 84.078 con, trong ñó 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút

* ðợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005: trong khoảng thời

gian này dịch ñã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Số gia cầm tiêu huỷ là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút Dịch xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ðồng bằng Sông Cửu Long; những tỉnh bị dịch nặng là Long

An, Tiền Giang, Bạc Liêu, ðồng Tháp

* ðợt dịch thứ 4 từ tháng 10/2005 ñến 01/2006: dịch xảy ra ở cả 3

miền với 24 tỉnh, thành tái phát trong ñó miền Nam có 3 tỉnh (Bạc Liêu, ðồng Tháp, Long An), miền Trung có 3 tỉnh (Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị) và 18 tỉnh thuộc miền Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Thái Bình, Hưng Yên, Hải Dương, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Sơn La, Quảng Ninh, Yên Bái, Thái Nguyên, Ninh Bình, Cao Bằng và Hà Giang) Tổng số gia cầm tiêu hủy là 3.972.763 con, trong ñó 1.338.378 gà, 2.135.081 thuỷ cầm và loài khác

* Trong 10 tháng ñầu năm 2006 ở Việt Nam không xảy ra dịch, do sự chỉ ñạo phòng dịch quyết liệt của Chính phủ, Ban chỉ ñạo quốc gia và hiệu quả của chiến dịch tiêm phòng ðến cuối năm lại xuất hiện các ổ dịch trên ñàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, chưa tiêm phòng vacxin ðợt dịch thứ 5 bắt ñầu và kéo dài trong suốt năm 2007 Dịch không tập trung mà rải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và

có thể chia nhiều ñợt Từ ngày 6/12/2006 ñến 7/3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………16

phường của 33 quận, huyện thuộc 11 tỉnh, thành gồm Cà Mau, Bạc Liêu, Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang, Sóc Trăng, Hà Nội, Hải Dương và Hà Tây Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 103.094 con, trong ñó có 13.622 gà; 89.472 ngan, vịt Từ 1/5/2007 ñến 23/8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành là Nghệ

An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam ðịnh, ðồng Tháp, Bắc Giang, Hỉa Phòng, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Quảng Nam, Thái Bình, Phú Thọ, Hà Tĩnh, Cao Bằng, Cà Mau, ðiện Biên, Quảng Bình, Thái Nguyên và Trà Vinh Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 294.894 con (21.525 gà; 264.549 vịt và 8.775 ngan) Sau khi bị khống chế trong vòng 1 tháng, ñến tháng 10/2007, dịch lại tái phát trên ñịa bàn các tỉnh Trà Vinh, Quảng Trị, Nam ðịnh, Cao Bằng, Hà Nam và Bến Tre [14]

* Từ ñầu năm 2008 ñến nay, ñợt dịch thứ 6 xảy ra rải rác với 74 ñàn gia cầm tại 57 xã, phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy là 60.090 con, trong ñó có 23.498 gà, 36.592 thủy cầm [14] 2.2 CĂN BỆNH CỦA CÚM GIA CẦM

Nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A, một trong 4

nhóm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm các nhóm virus cúm A, nhóm

virus cúm B, nhóm virus cúm C và nhóm Thogovirus

2.2.1 Cấu trúc chung của virus cúm type A

Hạt virus có dạng hình khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối kéo dài, ñường kính khoảng 80 - 120 nm, phân tử lượng khoảng 250 triệu Dalton

Vỏ virus có bản chất là protein, lipid và hydrocarbon Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA

(hemagglutinin), protein enzym cắt thụ thể NA (neurominidase) và protein

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ17

ựệm MA (matrix) đó là những gai, mấu có ựộ dài 10 - 14 nm, ựường kắnh 4 -

6 nm

Nucleocapsid bao bọc nhân của virus là tập hợp nhiều protein phân

ựoạn, có cấu trúc ựối xứng xoắn, ựộ dài 130 - 150 nm Hệ gen của virus chỉ chứa duy nhất axit ribonucleic (ARN) một sợi, có cấu trúc là sợi âm, chia thành 8 phân ựoạn, mã hóa cho các loại protein của virus là HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1 và NS2 [16]

2.2.2 Kháng nguyên của virus cúm

Yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin, viết tắt là HA hoặc H) và enzym trung hoà (Neuraminidase, viết tắt là NA hoặc N) là những kháng

nguyên có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ Có tất cả 16 biến thể

HA (ký hiệu từ H1 ựến H16) và 9 biến thể NA (ký hiệu từ N1 ựến N9)

Hemagglutinin ựược coi là yếu tố vừa quyết ựịnh tắnh kháng nguyên, vừa

quyết ựịnh ựộc lực của virus cúm A [9]

Mỗi một hợp thể kháng nguyên HA và NA tạo nên một subtype Về huyết thanh học, giữa các subtype không hoặc rất ắt có phản ứng chéo đây là trở ngại cho việc nghiên cứu vacxin

Các chủng virus cúm ựược ký hiệu theo danh pháp với trật tự: tên serotype/1oài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/1oại hình

subtype HA(H) và NA(N) Vắ dụ: virus cúm có ký hiệu 9/99/H5N1, có nguồn thông tin là: Virus cúm A; loài nhiễm là ngỗng (Gs =

A/Gs/HongKong/437-Goose); phân lập tại Hồng Kông (HK); số hiệu 437; thời gian phân lập: 9/1999; subtype H5N1

Các kháng nguyên của virus có thể khắch thắch cơ thể sinh ra nhiều loại kháng thể, nhưng chỉ có loại kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác, có tác dụng kìm hãm số

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ18

lượng virus nhân lên Vắ dụ kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản virus giải phóng, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng của M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra Nhưng thông thường ựộng vật và người chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể [16]

2.2.3 độc lực của virus

đánh giá ựộc lực của virus cúm bằng phương pháp gây bệnh cho gà 3 -

6 tuần tuổi: tiêm vào tĩnh mạch cánh 0,2 ml nước trứng ựã ựược gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau ựó ựánh giá mức ựộ bệnh của gà ựể cho ựiểm (chỉ số IVPI) điểm tối ựa là 3 và ựó là virus có ựộc lực cao nhất Theo quy ựịnh của OIE, virus cúm nào có chỉ số IVPI > 1,2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất cứ virus cúm nào thuộc subtyp H5 hoặc H7 có trình tự axit amin trùng với trình tự axit amin của chủng ựộc lực cao, ựều thuộc loại ựộc lực cao

Biến chủng virus cúm gây bệnh ở loài chim ựược phân chia theo tắnh gây bệnh với 2 mức ựộ ựộc lực khác nhau Loại virus có ựộc lực cao gọi là HPAI (Highly pathogenic avian influenza) thường gây chết 100% gia cầm bị nhiễm bệnh, sau vài giờ ựến vài ngày gây nhiễm Người ta ựã phân lập ựược

19 chủng cúm A thuộc loại HPAI từ loài lông vũ, trong ựó, một số ựã lây nhiễm và thắch ứng gây bệnh trên người Loại thứ hai có ựộc lực thấp, gọi là LPAI (Low pathogenic avian influenza) thường nhiễm ở gia cầm, nhưng không hoặc có rất ắt biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết cũng rất thấp Sự bội nhiễm vi khuẩn hoặc các bệnh khác cùng với cúm gà làm cho LPAI trở nên có ựộc lực hơn và gây bệnh ác liệt hơn Bằng chứng cho thấy các chủng có ựộc lực thấp LPAI trong quá trình lưu cữu trong thiên nhiên và ựàn gia cầm, sẽ ựột biến nội gen, hoặc biến ựổi tái tổ hợp trở thành các chủng HPAI [16]

Theo Mary J Pantin-Jackwood và cộng sự (2008) [19], tất cả các virus cúm phân lập ựược của Việt Nam trong năm 2005 - 2007 không chỉ có ựộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………19

lực cao với gà, mà còn gia tăng ñáng kể ñộc lực ñối với vịt so với các virus phân lập trước ñó Sự tăng ñộc tính này là hệ quả của sự gia tăng virus nhân lên trong các cơ quan nội tạng và sự tăng thích nghi ở diện rộng hơn của virus ñối với các cơ quan nội tạng Sự thay ñổi ñộc tính của các virus ñang lưu hành

có ảnh hưởng lớn tới dịch tễ học của virus và công tác khống chế

2.2.4 Khả năng biến chủng của virus

ðột biến ñiểm (hay hiện tượng lệch lạc về kháng nguyên - antigenic drift) là kiểu ñột biến thường xảy ra, ñặc biệt với kháng nguyên H và kháng

nguyên N, tạo ra những thay ñổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hóa Kết quả là tạo ra các phân typ cúm khác với phân typ ở giai ñoạn ñầu của ổ dịch

ðột biến do tái tổ hợp di truyền (hay ñột biến thay ñổi bản chất kháng nguyên - antigenic shift) là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra ñịnh kỳ trong ñó có

sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau ðiều ñó ñã tạo ra những sai khác cơ bản về bộ gen của virus ñời con so với virus bố mẹ Do kiểu gen 8 phân ñoạn mà từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện

256 tổ hợp của các virus thế hệ sau [9]

Từ ñợt dịch cúm ñầu tiên tại Việt Nam, virus cúm typ A H5N1 vẫn luôn tồn tại trong môi trường và ñã có những biến ñổi về mặt kháng nguyên [36] Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004, 2008) [8[, [10], virus cúm gây bệnh từ cuối năm 2003 ñến nay chỉ là một loại duy nhất, có nguồn gốc từ virus cúm lưu hành ở Trung Quốc, là virus A/Gs/Guangdong/1/96/H5N1 Sự xâm nhập của subtyp virus H5N1 genotyp Z - ñược WHO ký hiệu là nhánh 1 (clade 1) - từ Trung Quốc ñã gây nên các ổ dịch lan tràn chưa từng thấy tại Việt Nam suốt từ Bắc ñến Nam Tuy nhiên, ñến năm 2005, một nhánh mới của subtyp H5N1 là clade 2.3.2 (genotyp G) ñã ñược nhận biết tại nước ta,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………20

dần thay thế cho clade 1 tại miền Bắc Trong khi ñó virus cúm thuộc clade 1 vẫn tiếp tục gây bệnh tại các tỉnh phía Nam

Ken Inui (2008) [12], [13] cũng cho biết, trong vòng 10 năm, virus cúm H5N1 (Gs/GD/1/96) ñã biến ñổi và tạo ra 9 clade HA trong dòng này Trung Quốc có tất các các clade này còn các nước láng giềng chỉ có một số Tại Việt Nam, các clade 3,5 và 8 khó "bám rễ" nhưng các clade 1 và 2 có thể tồn tại và gây thành dịch lớn Tuy nhiên, các loại vacxin cúm ñược sử dụng ở Việt Nam hiện vẫn có hiệu quả ñối với các clade này

ðối với người, những vụ ñại dịch cúm xảy ra trong thế kỷ 20 ñều do virus cúm A gây ra Hầu như tất cả các biến chủng virus cúm A gây ra các vụ ñại dịch này ñều là sản phẩm tái tổ hợp của các subtype có nguồn gốc ñộng vật, trước hết là từ chim và gia cầm Nguồn cung cấp gen cho quá trình tái tổ hợp virus cúm A là các loài gia cầm gần người Tính thích ứng lan truyền nội loài (ví dụ, gà - gà) và ngoại loài (ví dụ, gà - lợn - người; gà - người) tạo cơ hội cho sự trao ñổi và tái tổ hợp gen, khiến virus cúm gia cầm có thể “vượt hàng rào về loài” Những ví dụ ñiển hình là virus cúm A subtype HlNl có quan hệ lây nhiễm từ lợn sang người và ngược lại; H3N2 từ người sang lợn; H5N1 và H9N2 từ gà sang người [16]

2.2.5 Sức ñề kháng của virus

Virus cúm type A tương ñối nhạy cảm với các chất hoá học như

formalin, axit pha loãng, ête, Sodium Desoxycholat, Hydroxylamon… Cồn

70% diệt virus nhanh chóng

Virus không bền với nhiệt ñộ, ở 50 - 600C chỉ vài phút là virus mất ñộc tính ðiểm ñẳng ñiện của virus tương ứng pH 5,3 nên ở môi trường axit, ñộc tính của virus giảm nhanh hơn ở môi trường kiềm Dưới ánh nắng mặt trời

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………21

chiếu trực tiếp virus chỉ sống ñược 40 giờ Tia cực tím có thể diệt virus dễ dàng

Virus H5N1 còn có khả năng gây nhiễm sau 35 ngày sống trong phân, nước và ñất ở chuồng gia cầm Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24 - 39 ngày Trong máu và thịt gia cầm ñông lạnh, virus sống ñược tới 3 tuần [1]

2.2.6 Nuôi cấy và lưu giữ virus

Có thể nuôi cấy virus cúm gia cầm trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi; trên tế

bào xơ phôi gà CEF (Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào thận chó MDCK

(Madin-Darby-Canine-Kidney) với ñiều kiện môi trường nuôi cấy không chứa

Trypsin Virus ñược bảo quản ở -70oC hoặc ñông khô giữ ñặc tính gây bệnh

rất lâu [16]

2.3 DỊCH TỄ HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM

2.3.1 Loài vật mang virus

Virus cúm ñã ñược phân lập ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim họ sẻ Tuy nhiên, tần suất và số lượng virus phân lập ñược ở loài thủy cầm ñều cao hơn các loài khác ðiều tra thủy cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp ñàn trước khi di trú

Trong các loài thủy cầm thì vịt trời có tỷ lệ nhiễm virus cao hơn cả Những virus này không gây bệnh cho vật chủ, mà ñược nhân lên trong ñường ruột và bài thải ra ngoài, trở thành nguồn reo rắc virus cho các loài khác, ñặc biệt là gia cầm [1]

Cuối tháng 10/2004, OIE, FAO và WHO ñã lưu ý các nước ñã trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 rằng vịt nuôi có thể ñóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thể ñộc lực cao cho các gia

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………22

cầm khỏe và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho con người vì vịt nuôi và

gà nhiễm bệnh cùng bài thải lượng virus như nhau, nhưng vịt nuôi thường không thể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý Hiện FAO và OIE ñang phối hợp ñánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm ñưa ra chiến lược lâu dài với mục ñích khống chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á

Virus cúm H5N1 lưu hành ở một số khu vực châu Á có ñộc lực với gà chuột ñã ñược tăng lên và ñã mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loài mèo Một số ñộng vật có vú như cầy vằn, chồn hay chó cũng nhiễm bệnh và bài

thải virus [1], [24]

2.3.2 ðộng vật cảm nhiễm

Bệnh cúm ñược phát hiện ở tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm, thủy cầm) hoặc chim hoang dã Gà, gà tây, chim cút, bồ câu, vịt, ngan ñều mắc bệnh Hiện ñã phân lập ñược virus từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà Nhật,

gà gô, gà lôi Vịt nuôi nhiễm virus cúm nhưng khó phát hiện triệu chứng do vịt có sức ñề kháng với virus gây bệnh, kể cả với chủng có ñộc lực cao Các loài dã cầm cũng có thể bị bệnh nhưng khó có thể phát hiện ñược do cách sống hoang dã và ñặc tính di trú của chúng ðây là nguồn tàng trữ và reo rắc virus nguy hiểm nhất [16]

Gà, ngan, vịt, chim cút mọi lứa tuổi ñều mắc cúm nhưng bệnh thường ở

4 - 6 tuần tuổi Gia cầm dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao nhất ở nơi bệnh phát ra lần ñầu và trong tuổi sắp ñẻ hoặc thời kỳ ñẻ cao nhất Gia cầm có khả năng sản xuất càng cao thì càng mẫn cảm với virus Gia cầm mái dễ bị nhiễm hơn trống Con non và già mẫn cảm với mầm bệnh hơn con trưởng thành

Không chỉ ñối với loài chim, virus có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật có vú khác như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi và cả con người Nhiều

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23

nghiên cứu mới ñây cho thấy loài mèo, vốn ñược coi là không cảm nhiễm với

cúm, cũng mắc bệnh và chết [24]

2.3.3 Sự truyền lây

Khi gia cầm nhiễm cúm, virus nhân lên trong ñường tiêu hóa và ñường

hô hấp Sự truyền lây ñược thực hiện theo 2 phương thức: trực tiếp và chủ yếu

là gián tiếp Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung ñược bài tiết từ ñường hô hấp hoặc qua phân, thức

ăn và nước uống bị nhiễm Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo,

xe vận chuyển

ðối với gia cầm nuôi, nguồn dịch ñầu tiên thường thấy là:

- Từ các loài gia cầm nuôi trong cùng trang trại hoặc trang trại liền kề

- Lây truyền qua trứng

Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ ñến 3 ngày Thể quá cấp tính (hay gặp): xảy

ra từ vài giờ ñến 24 giờ Thể cấp tính từ 1 ñến 4 ngày Thể á cấp tính (ít gặp)

có thể tới 7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, gây chết ác tính, chết nhanh và nhiều giống ngộ ñộc Tỷ lệ chết từ 20% ñến 100% Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm rất khác nhau do các yếu tố sau: chủng virus, loài cảm nhiễm, tuổi,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24

giới tính, liều gây nhiễm, môi trường, chế ñộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ và sự cộng nhiễm các loại vi khuẩn, virus khác

Triệu chứng ñiển hình của bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm là:

- Chết ñột ngột, tỷ lệ tử vong cao, có khi ñến 100%

- Có các biểu hiện ở ñường hô hấp như hắt hơi, thở khò khè, viêm xoang, chảy nhiều nước mắt, nước mũi, dịch nhày màu xám hoặc ñỏ xám

- Sưng phù ñầu và mặt; mào, tích sưng phù mầu tím sẫm

- Xuất huyết dưới da (ñặc biệt dưới da chân); tím tái

- Triệu chứng tiêu hóa: ỉa chảy

- Triệu chứng thần kinh: run rẩy, chệch choạng, co giật, mất thăng bằng, vận ñộng xoay tròn

Trong một số trường hợp, bệnh bùng phát nhanh, trước khi gia cầm chết không thấy có biểu hiện lâm sàng [7]

Gia cầm bị nhiễm các chủng virus cúm có ñộc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự, với mức ñộ nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Các loài thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng ) ít khi biểu hiện triệu chứng ngay

cả khi nhiễm các chủng gây bệnh ở gà, nhưng nếu phát bệnh thì viêm xoang viêm mí mắt, viêm ñường hô hấp, tỷ lệ chết cao Các loài dã cầm bị nhiễm virus thường không có triệu chứng rõ ràng

Triệu chứng ở người mắc bệnh cúm gia cầm:

Các triệu chứng giống bệnh cúm ñiển hình ở người (sốt, ho, ñau họng, ñau cơ) cộng thêm các triệu chứng viêm mắt, viêm phổi, suy hô hấp cấp và có thể có những biến chứng nguy hiểm gây tử vong nhanh [16]

2.4.2 Bệnh tích

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………25

Khi mổ khám gia cầm chết do cúm cĩ thể thấy các bệnh tích đặc trưng:

- Mào, tích sưng to tím sẫm; phù mí mắt Phù keo nhày và xuất huyết dưới da đầu, cơ đùi Xuất huyết thành dải, vệt dưới da chân

- Viêm cata và viêm tơ huyết niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêu hố Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy

- Tăng sinh túi khí, viêm tơ huyết tương mạc của các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng ruột Xuất huyết mỡ vành tim

- Ruột viêm Cata và xuất huyết Nội tạng xuất huyết, cĩ thể hoại tử

- Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử Viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non

Bệnh gây ra do các chủng virus cĩ độc lực mạnh thì thấy tụ huyết, xuất huyết ở da, gan, thận, tim, lách, phổi Nhưng gia cầm chết đột ngột khơng cĩ các bệnh tích này [16]

Bệnh tích vi thể do virus gây bệnh HPAI thường khác nhau tuỳ theo độc lực Bệnh ở thể nặng thường thấy tụ huyết, xuất huyết, hoại tử ở các cơ quan nội tạng Một số chủng virus gây ra các triệu chứng thần kinh thì thấy hoại tử các tế bào thần kinh, ít thấy tụ huyết, xuất huyết ở các mơ thần kinh 2.5 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ðỐN BỆNH CÚM GIA CẦM

2.5.1 Chẩn đốn dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích

Bệnh xảy ra dồn dập, nhanh chĩng thành dịch Gà mọi lứa tuổi đều mắc nhưng hay gặp nhất là gà từ 4 đến 66 tuần tuổi Triệu chứng điển hình: thở khĩ, viêm tịt mũi; sưng đầu, phù mặt; thủy thũng, xuất huyết, hoại tử ở mào, tích; xuất huyết dưới da thành vệt đỏ Bệnh tích điển hình: thịt thâm; viêm dính phúc mạc; cơ quan nội tạng bị teo, viêm xuất huyết và hoại tử Buồng trứng, ống dẫn trứng viêm, vỡ trứng non

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ26

2.5.2 Chẩn ựoán trong phòng thắ nghiệm

- Chẩn ựoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà có phôi

ấp 9 - 11 ngày hoặc trên môi trường tế bào thận chó MDCK Giám ựịnh virus trong dịch nuôi cấy bằng các phản ứng HA, HI

- Giám ựịnh virus bằng kỹ thuật RT - PCR

- Chẩn ựoán huyết thanh học: dùng phản ứng HI ựể phát hiện và xác ựịnh hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm

- Ngoài ra có thể dùng phản ứng ELISA ựể phát hiện kháng thể

2.6 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM

Phòng chống dịch cúm gia cầm là chương trình tổng hợp của công tác giám sát, chẩn ựoán bệnh; kiểm dịch vận chuyển, giết mổ gia cầm kết hợp với các biện pháp an toàn sinh học tăng cường; tiêu hủy, tiêu ựộc, khử trùng các ổ dịch; ựồng thời tuyên truyền, giáo dục người dân về dịch bệnh Tiêu hủy toàn ựàn gia cầm bị bệnh và ựàn gia cầm có tiếp xúc với ựàn bị bệnh là biện pháp bắt buộc ựể tránh bệnh lây lan [7]

Hiện nay, việc sử dụng vacxin ựược coi là cách ựể làm giảm thiệt hại

do bệnh cúm gia cầm gây ra ựối với ngành chăn nuôi gia cầm ở châu Á Song ựiều này có thể dẫn ựến sự tiến hóa của các chủng virus ựang lưu hành thành các chủng mới [16] Do ựó, sử dụng vacxin phải kết hợp chặt chẽ với giám sát sau tiêm phòng, giám sát lưu hành virus ở các ựàn ựã ựược tiêm ựể có biện pháp xử lý kịp thời

2.7 đÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS CÚM Ở GIA CẦM

2.7.1 đáp ứng miễn dịch không dặc hiệu

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ27

Hệ thống miễn dịch không ựặc hiệu là hàng rào phòng thủ ựầu tiên chống lại bất cứ vật ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể Chức năng này ựược thể hiện qua các cơ chế:

* Các hàng rào vật lý, hóa học: gồm da, màng nhầy, khu hệ sinh vật thường trú, các lông mao, axit trong dạ dày và các men tiêu hoá protein

* Các yếu tố kháng khuẩn có trong dịch tiết của cơ thể: gồm các Enzym, Interferon γ, các yếu tố gây hoại tử mô bào, các tế bào thực bào [22]

2.7.2 đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu

2.7.2.1 đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, có sự tham gia của các tế bào lympho T, B và các ựại thực bào Tế bào T nhận biết kháng nguyên lạ sau khi

nó ựã ựược các tế bào trình diện kháng nguyên xử lý và trình diện Tế bào B thành thục trong túi Fabricius nhận biết các kháng nguyên hòa tan và trình diện chúng trên bề mặt Các tế bào TCD4 nhận biết các tế bào có kháng nguyên gắn với MHC lớp II, tiết ra các lymphokin kắch thắch các tế bào B hoạt hoá thành tương bào sản xuất kháng thể tiêu diệt kháng nguyên Các

tế bào TCD8 (T gây ựộc) có tác dụng gây dung giải các tế bào có mang kháng nguyên gắn với MHC lớp I Các tế bào T diệt tự nhiên có khả năng nhận biết nhiều loại kháng nguyên ngoại lai và kháng nguyên của chắnh cơ thể vật chủ

ựã bị biến ựổi, ựóng vai trò quan trọng trong tuần tra miễn dịch và tiêu huỷ các tế bào lạ [22]

2.7.2.2 đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các globulin miễn dịch (Immuno globulin-Ig) hay kháng thể ựược tiết

ra bởi các tế bào lympho B (sau khi ựược hoạt hóa trở thành tương bào) là thành phần chắnh của miễn dịch dịch thể Kháng thể có trong các dịch của cơ

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ28

thể và ựược ựịnh lượng trong huyết thanh hoặc huyết tương Ở gà có các lớp

Ig chắnh là IgM, IgY, IgG và IgA

Một ựáp ứng miễn dịch ựiển hình của gia cầm bắt ựầu bằng sự sản xuất

ra IgM Sau ựó ựáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG đây là kháng thể chắnh sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu của gia cầm Kháng thể liên kết một cách ựặc hiệu với kháng nguyên và trung hoà kháng nguyên, ựặc biệt ựối với các kháng nguyên là virus Những virus bị trung hoà không thể bám vào ựiểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào ựắch và bởi vậy bị ngăn cản tái tổ hợp đối với mầm bệnh là vi khuẩn, có thể nhân lên ngoài tế bào, nếu mầm bệnh bị bao bọc bởi kháng thể thì có thể bị nuốt vào trong tế bào và bị phá hủy bởi thể thực bào Kháng thể bao quanh bề mặt mầm bệnh cũng có thể hoạt hóa bổ thể và sản xuất protein bổ thể mới Protein

bổ thể gắn với receptor của thể thực bảo, kắch thắch cho sự thực bào phân hủy mầm bệnh [22]

* Trắ nhớ miễn dịch và ựáp ứng miễn dịch thứ phát

đáp ứng miễn dịch tiên phát xuất hiện khi tiếp xúc lần ựầu với kháng nguyên, có ựộ dài miễn dịch ngắn, kết quả là tạo ra một nhóm các tế bào lympho T nhớ có tác dụng làm cho ựáp ứng miễn dịch khi phơi nhiễm lần sau với cùng loại kháng nguyên ựược tăng cường mạnh hơn đáp ứng miễn dịch thứ phát xuất hiện khi tiếp xúc với kháng nguyên cùng loại lần sau đáp ứng miễn dịch này có sự tham gia ngay từ ựầu của các tế bào T nhớ Kháng thể ựược sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và ựáp ứng miễn dịch kéo dài hơn so với ựáp ứng miễn dịch tiên phát Cơ thể gia cầm tạo ựược trạng thái miễn dịch ựối với kháng nguyên ựó và trắ nhớ miễn dịch ựược duy trì đây chắnh là cơ

sở của việc tiêm phòng vacxin cúm và nhắc lại sau một thời gian ở gia cầm

* Các yếu tố ảnh hưởng ựến sự hình thành kháng thể:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………29

- Bản chất kháng nguyên

- ðường xâm nhập của kháng nguyên

- Liều lượng kháng nguyên

- Số lần ñưa kháng nguyên vào cơ thể

- Chất bổ trợ kháng nguyên

- Trạng thái sức khỏe, dinh dưỡng, cân ñối axit amin trong khẩu phần,

các yếu tố stress có hại [27]

* Vacxin vô hoạt ñồng chủng

Hiệu lực của vacxin này trong việc ngăn ngừa bệnh và giảm thải lượng virus ra ngoài môi trường ñã ñược chứng minh qua các thử nghiệm Tuy nhiên nhược ñiểm của loại vacxin này là không phân biệt ñược gia cầm ñã tiêm vacxin với những con tiếp xúc với mầm bệnh tự nhiên, trừ những con chưa tiêm phòng ñược nhốt riêng ở trong chuồng Ví dụ: Vacxin H5N1 của hãng Weike (Trung Quốc)

* Vacxin vô hoạt dị chủng

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ30

Loại vacxin này có ựặc ựiểm là chủng virus vacxin có kháng nguyên H giống với chủng virus trên thực ựịa nhưng có kháng nguyên N dị chủng đáp ứng miễn dịch sinh ra bởi nhóm kháng nguyên H ựồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh ra bởi virus thực ựịa có thể coi như chất ựánh dấu

sự lây nhiễm trên thực ựịa Vắ dụ: Vacxin vô hoạt dị chủng H5N2 của Intervet (Hà Lan), vacxin H5N2 của Weike (Trung Quốc)

Trong hai loại vacxin ựồng chủng và dị chủng, mức ựộ bảo hộ lâm sàng

và việc làm giảm thải trừ virus ra môi trường của vacxin ựồng chủng cải thiện hơn do cùng một khối lượng vacxin thì vacxin ựồng chủng có nhiều kháng nguyên hơn Việc lựa chọn vacxin dị chủng cho phép áp dụng chiến lược DIVA nhằm phân biệt con nhiễm bệnh tự nhiên với con tiêm vacxin [20],[26]

2.8.1.2 Vacxin tái tổ hợp

Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa ựộng vật nhiễm bệnh và ựộng vật ựược tiêm vacxin, vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gà Chỉ những ựộng vật nhiễm bệnh trên thực ựịa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kết tủa ngưng kết kép trên thạch hoặc phản ứng ELISA Việc sử dụng các vacxin này cũng ựược giới hạn với những loài mà virus ựắch sẽ nhân lên hoặc chỉ giới hạn trong ựàn

gà có huyết thanh âm tắnh ựối với virus ựắch Vắ dụ: Vacxin sống TROVAC (virus ựậu tái tổ hợp cúm H5) của Merial và H5N1 của Weike (Trung Quốc)

2 8.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù có một số loại vacxin ựã ựược nghiên cứu và thử nghiệm trong phòng thắ nghiệm về khả năng ứng dụng ngoài thực ựịa nhưng chỉ có 2 loại vacxin ựược cấp giấy phép và ựược sử dụng ựối với gia cầm: các loại vacxin cúm toàn thân vô hoạt và

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ31

vacxin vector ựậu gà tái tổ hợp với gen AI H5 nhận từ virus cúm của gà tây (A/turkey/Ireland/83)

Số lượng vacxin ựã ựược sử dụng trên thực ựịa chưa ựược các nước thông báo

cụ thể, nhưng một số nguồn thông tin cho rằng Mexico ựã sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều virus vô hoạt và 850 triệu liều vacxin tái tổ hợp ựậu gà trong chương trình sử dụng vacxin chống bệnh cúm từ ựầu tháng 1/1995 và ựã thanh toán ựược bệnh cúm gia cầm thể ựộc lực cao do virus H5N2 và tháng 6/1995, mặc dù virus H5N2 chủng ựộc lực thấp vẫn lưu hành Indonexia cũng sử dụng vacxin AI H5 vô hoạt Từ năm 1995, Pakistan cũng sử dụng vacxin phòng cúm ở cá ổ dịch H7N3 thể ựộc lực cao Các vacxin cô hoạt chế từ chủng virus H9N2 ựộc lực thấp ựã và ựang ựược sử dụng ở một

số nước châu Á, vùng Cận đông và đông Âu Gần ựây, vacxin vô hoạt nhũ dầu H7

ựã ựược dùng cho các vùng nguy cơ cao ở phắa Bắc Italia và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi ở Mỹ

Trung Quốc là nước sử dụng nhiều vacxin cúm nhất với 2 tỷ 830 triệu liều (tắnh từ tháng 12/2003 ựến tháng 4/2005) Trung Quốc ựã có bản tường trình về kết quả của 3 loại vacxin ựang ựược sử dụng tại nước này, bao gồm:

- Vacxin vô hoạt chủng H5, N-28: ựược phê chuẩn từ tháng 12/2003 và ựược

sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể ựộc lực cao vào ựầu năm 2004

- Vacxin vô hoạt virus cúm tái tổ hợp (subtyp H5N1, chủng Re-1): ựược phê chuẩn tháng 1/2005 Vacxin ựược ựánh giá là rất có hiệu qủa trong tạo miễn dịch chống cúm với hiệu giá kháng thể cao và thời gian bảo hộ dài hơn Thủy cầm ựược tiêm vacxin này không bị nhiễm và bài thải virus cúm

- Vacxin sống virus ựậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm H5: ựược phê chuẩn tháng 1/2005 và ựược nhiều nước sử dụng như Trung Quốc, MêhicôẦ Sử dụng loại

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………32

vacxin này cĩ thể phân biệt được miễn dịch do tiêm phịng vacxin hay bị nhiễm tự nhiên [31], [34]

2 8.3 Những điểm cần lưu ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm

* Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vacxin phịng chống cúm gia cầm:

Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vacxin nên được sử dụng trong một chiến lược tồn diện phịng chống bệnh cúm gia cầm, bao gồm 5 cơng đoạn là

an tồn sinh học, nâng cao nhận thức người dân, chẩn đốn và giám sát, loại

bỏ gia cầm nhiễm bệnh và sử dụng vacxin [18]

* Trước khi sử dụng vacxin cần phải lưu ý những vấn đề sau:

- Vacxin sử dụng phải cùng subtype H và phải được chứng minh trên bản động vật là cĩ đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực địa

- Vacxin cần phải được sản xuất theo cơng nghệ đã tiêu chuẩn hố để đảm bảo cĩ một vacxin hiệu quả và phù hợp về chủng virus

- Cần cĩ các hoạch định trước về bảo quản tốt vacxin, phân phối và sử dụng vacxin hợp lý

- ðảm bảo được việc giám sát huyết thanh học và virus học để xác định virus cường độc cĩ lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vacxin hay khơng

- Phải cĩ một kế hoạch loại trừ (exit strategy) để phịng tránh việc sử dụng vĩnh viễn vacxin

* Ưu điểm của tiêm chủng:

- Giám đáng kể virus bài xuất trong đàn gia cầm nhiễm bệnh

- Giảm thiểu nhu cầu loại thải những đàn gia cầm khỏe mạnh

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………33

- Là phương án thay thế khả thi đối với những đàn gia cầm cĩ giá trị cao và gia cầm chăn nuơi gia đình, chim cảnh

- Giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuơi gia cầm cơng nghiệp[20]

* Nhược điểm của tiêm chủng:

- Khơng phù hợp với quy định thương mại quốc tế Tiêm chủng được chấp nhận như một biện pháp khống chế dịch cúm gà của OIE

- Những đàn gia cầm được tiêm phịng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh cúm, khĩ phát hiện dịch và khống chế dịch sớm [20]

* Chiến lược DIVA:

DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) là một chiến

lược dùng để "Phân biệt động vật nhiễm bệnh với động vật đã được chủng vacxin" Sử dụng vacxin chứa một chủng virus cĩ kháng nguyên nhĩm H tương đồng và kháng nguyên nhĩm N khơng tương đồng với virus gây bệnh thực địa nhằm "đánh dấu" con vật cĩ kháng thể do tiêm phịng với con vật cĩ kháng thể do nhiễm bệnh tự nhiên Lựa chọn vacxin tương đồng khơng hồn tồn để cho thấy khơng cĩ virus mơi trường đang lưu hành trong đàn gia cầm dùng vacxin Nhĩm H tương đồng đảm bảo tính bảo hộ, cịn khả năng phân biệt gà tiêm phịng và gà nhiễm bệnh dụa vào đáp ứng huyết thanh nhĩm N bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Gà đã tiêm phịng chỉ dương tính với nhĩm N trong vacxin, cịn nếu dương tính với nhĩm N của virus mơi trường cho thấy đã nhiễm bệnh [6]

Trong kế hoạch dự phịng tiêm chủng vacxin phải dự đốn trước được ngân hàng vacxin đã cấp phép, cho phép bắt buộc thực hiện được chiến lược

"phân biệt con vật bị nhiễm với con vật tiêm chủng vacxin" [26]

2.9 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VACXIN CÚM GIA CẦM TẠI VIỆT NAM

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………34

Từ tháng 7/2005, "Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm" ñã ñược triển khai tại Việt Nam Nước ta ñã tiến hành tiêm phòng thử nghiệm các loại vacxin cúm gia cầm ngoại nhập trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh và Tiền Giang Sau ñó ñã triển khai tiêm phòng trên ñịa bàn cả nước và thực hiện liên tục qua các năm Mỗi năm có 2 ñợt tiêm phòng vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10, trước thời ñiểm dịch cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát cao nhất

Trong giai ñoạn I của Dự án (2005 - 2006), ñối tượng tiêm phòng là gà giống cụ kị, ông bà, bố mẹ; gà trứng thương phẩm; gà thịt ñược nuôi từ 70 ngày trở lên; vịt giống, vịt ñẻ trứng thương phẩm; gà chọi Loại vacxin ñược

sử dụng gồm vacxin chết chủng H5N2 của hãng Intervet (Hà Lan) và của Trung Quốc, tiêm cho gà lần ñầu từ 8 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần ñầu 4 tuần và sau ñó 6 tháng tiêm nhắc lại; và vacxin chết chủng H5N1 của Trung Quốc, tiêm cho vịt lần ñầu từ 15 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần ñầu 3 tuần và sau 4 tháng tiêm nhắc lại Năm 2006 sử dụng thêm vacxin sống tái tổ hợp ñậu gà - cúm H5 (vacxin TROVAC của hãng Merial) tiêm cho gà con 1 ngày tuổi ấp nở công nghiệp trước khi xuất bán

Giai ñoạn II của dự án (2007 - 2008), ñối tượng tiêm phòng ñược mở rộng thêm với ngan Loại vacxin có thay ñổi so với giai ñoạn trước: vacxin chết chủng H5N1 của Trung Quốc dùng chung cho gà và vịt; vacxin chết chủng H5N2 của hãng Intervet (Hà Lan) dùng cho gà; vacxin chết chủng H5N9 của hãng Merial (Pháp - Mỹ) dùng cho ngan; vacxin TROVAC dùng cho gà con 1 ngày tuổi [5]

Theo một số kết quả giám sát huyết thanh học năm 2005 - 2006 ñã ñược công bố, tỷ lệ bảo hộ theo ñàn gia cầm sau khi tiêm vacxin 1 - 2 tháng ñạt mức 53,8 - 56,2%, và sau 3 - 4 tháng ñạt mức 33,3 - 44,9% Năm 2007,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35

sau khi tiêm vacxin 1 tháng, tỷ lệ bảo hộ theo ñàn ñạt mức 72% Các ñánh giá cho rằng chiến lược sử dụng vacxin phòng chống bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam ñã ñạt ñược những kết quả khả quan trong thực tế [17] Tuy nhiên vẫn còn một số ñiểm cần bổ sung, hoàn thiện ñể công cuộc khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm thành công như mong ñợi

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ36

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- điều tra tình hình dịch cúm gia cầm trên ựịa bàn tỉnh Bắc Giang qua các năm 2007 - 2008

- đánh giá ựáp ứng miễn dịch kháng virus cúm ở gia cầm sau tiêm phòng trong 2 năm 2007 và 2008

- Giám sát huyết thanh học với các ựàn thủy cầm không tiêm phòng các năm 2007 và 2008

- Giám sát lưu hành virus cúm ở các ựàn gia cầm của tỉnh Bắc Giang năm 2007 và 2008

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Thu thập số liệu về tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Bắc Giang qua các năm 2007 - 2008

- Thực hiện các quy trình chẩn ựoán phát hiện virus cúm gia cầm trong các mẫu bệnh phẩm gửi từ tỉnh Bắc Giang trong ựợt dịch năm 2007

- Làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) ựể xác ựịnh hàm lượng kháng thể kháng virus cúm subtype H5 trong mẫu huyết thanh của gia cầm ựã ựược tiêm phòng vacxin năm 2007 và 2008

- Giám sát huyết thanh năm 2007 và 2008: Làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) ựể phát hiện kháng thể kháng virus cúm subtype H5 trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm không tiêm phòng

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………37

- Giám sát lưu hành virus cúm năm 2007 và 2008: Làm phản ứng PCR phát hiện virus cúm subtype H5 trong mẫu dịch ngốy (swab) hầu họng

RRT-và ổ nhớp của gia cầm, thủy cầm

3.2.1 Nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm

Các nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm là các trang thiết bị và cơ sở vật chất của Phịng Virus - Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương

Thành phần và cách pha nguyên liệu xin xem Phụ lục 1

3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Với gia cầm thuỷ cầm chim và động vật cĩ vú cịn sống, mẫu bệnh phẩm được lấy là: dịch ngốy mũi; dịch ngốy họng; dịch ngốy khí quản; dịch ngốy ổ nhớp; mẫu phân; máu

ðối với gia cầm thuỷ cầm chim động vật cĩ vú đã chết mẫu cần lấy là: khí quản, dịch khí quản; dịch rửa phế nang của phế quản; khí quản, phổi; các

tổ chức phủ tạng khác: não, gan, lách, thận, tuyến tuỵ… Việc lấy mẫu phải được tiến hành đúng lúc, đúng vị trí, đúng kỹ thuật Các mẫu dùng để phân lập virus tốt nhất được lấy trong vịng 3 ngày đầu sau khi gia cầm cĩ biểu hiện triệu chứng bệnh cúm

Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu Nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì phải giữ ở nhiệt độ -700C

Xử lý bệnh phẩm

a) Bệnh phẩm là dịch ngốy khí quản, hậu mơn và phân:

Bệnh phẩm được làm ấm, thêm kháng sinh, lắc, trộn đều, để nhiệt độ phịng 30 phút, dịch ngốy hậu mơn và phân cĩ thể lọc qua màng lọc, sau đĩ dùng để tiêm truyền

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38

b) Bệnh phẩm là tổ chức:

Nghiền mẫu bệnh phẩm (phổi, khí quản, não…) trong PBS pH 7,2 thành huyễn dịch 10% Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi Bổ xung lượng kháng sinh 10x (ñặc 10 lần) gồm Kanamycin, Penicillin, Streptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, ñể trong tủ lạnh 40C ít nhất trong vòng 2 giờ ñể kháng sinh diệt các tạp trùng Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu không ñược xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua màng lọc 0,45µm hoặc 0,22µm Huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý, nếu chưa dùng phân lập virus ngay thì có thể giữ ở -700C

c) Bệnh phẩm là máu

Máu gia cầm ñược ñựng trong ống ly tâm nhỏ (ống Eppendorf), ly tâm với tốc ñộ 1500 vòng trong 5 phút ñể tách riêng huyết thanh Dùng pipette hút huyết thanh ở trên ñưa sang ống khác Huyết thanh này bảo quản ở +4oC và ñược dùng trong phản ứng HI, sau ñó có thể lưu giữ ở - 30oC

3.2.3 Phương pháp phát hiện virus

3.2.3.1 Phân lập virus trên trứng có phôi

- Chọn trứng có phôi 9 - 10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/bệnh phẩm

- Lau trứng bằng cồn 70% và ñục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi

- Dùng syringe 1 ml hút dịch bệnh phẩm (ñã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng

- Gắn vết tiêm bằng keo dán

- Ấp trứng tiếp 2 - 3 ngày ở nhiệt ñộ 37oC

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39

- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần, trứng chết ñược cất vào tủ lạnh 4oC ñể kiểm tra Sau thời gian ấp, trứng chết hoặc sống ñược cất vào tủ lạnh 4oC qua ñêm hoặc ít nhất 4 giờ trước khi thu hoạch

- Lau trứng bằng cồn 70% Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên

- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm Thu riêng trứng sống và chết

3.2.3.2 Kiểm tra nước trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu - HA

- Nhỏ 25 µl PBS 0,01M vào ñĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 ñến giếng 12 của mỗi hàng

- Cho 25 µl dịch niệu mô vào giếng thứ 1

- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 µl dịch niệu mô từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự ñến giếng 11 thì bỏ ñi 50 µl

- Nhỏ thêm 25 µl PBS vào các giếng

- Nhỏ 25 µl hồng cầu gà 1% (v/v) vào tất cả các giếng trên

- Lắc ñĩa bằng máy hoặc bằng tay

- Ủ ñĩa phản ứng ở nhiệt ñộ phòng, thời gian khoảng 40 phút

ðọc kết quả: Hiệu giá HA của virus ñược tính ở ñộ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn hiện tượng ngưng kết hồng cầu

Ví dụ: ở ñộ pha loãng 1/128 còn có ngưng kết thì hiệu giá HA là 1/128

- Nếu HA dương tính, chứng tỏ có virus Tiếp tục giám ñịnh bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus Cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle ñể xác ñịnh loại virus phân lập