KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PREMIX VITAMIN LÊN TỶ LỆ SỐNG, SỰ TĂNG TRƯỞNG, HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PREMIX VITAMIN LÊN TỶ LỆ SỐNG, SỰ TĂNG TRƯỞNG, HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus Thực hiện bởi: NGUYỄN THỊ TH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HOC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PREMIX VITAMIN LÊN TỶ

LỆ SỐNG, SỰ TĂNG TRƯỞNG, HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC

ĂN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PREMIX VITAMIN LÊN TỶ LỆ SỐNG,

SỰ TĂNG TRƯỞNG, HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN VÀ KHẢ NĂNG

KHÁNG BỆNH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Thực hiện bởi:

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

BÙI ĐỨC TÂM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Thanh Hùng

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10 năm 2008

CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo cho chúng tôi một môi trường tốt để học tập

Ban chủ nhiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thể quí thầy cô Khoa Thủy Sản đã tận tình giảng dạy chúng tôi trong suốt khóa học

Cha, mẹ đã hộ trợ cho chúng tôi về vật chất lẫn tinh thần để chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này

Đặc biệt xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Thanh Hùng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài này

Cám ơn cô Võ Thị Thanh Bình đã tận tình giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời cũng xin cảm ơn các bạn trong lớp và ngoài lớp đã tận tình giúp đỡ chúng tôi thực hiện tốt đề tài này

Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót Chúng tôi rất mong có sự đóng góp ý kiến của quí thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu:” Khảo sát ảnh hưởng của premix vitamin lên tỷ lệ sống,

sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và sức đề kháng của cá tra (Pangasianodon hypophthamus)” được thực hiện tại Trại Thực Nghiệm Khoa Thủy Sản trường Đại

Học Nông Lâm TP.HCM từ ngày 07/04/2008 đến ngày 18/06/2008

Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung premix vitamin lên tỷ lệ

sống, sự tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã được tiến hành trong 56 ngày, gồm năm nghiệm thức đựợc thiết kế

với khẩu phần thức ăn có cùng mức protein là 28% với mức bổ sung premix lần lượt là: 0; 1; 1,5; 2; 2,5 kg/tấn thức ăn và được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Cá thí nghiệm có trọng lượng ban đầu là 13,67g/cá thể Mật độ nuôi 60 con/giai Sau 56 ngày nuôi kết quả cho thấy: giữa các nghiệm thức không có sự sai khác về mặt thống kê

Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của premix vitamin lên khả năng đề kháng bệnh của cá Tra đối với vi khuẩn Edwardsiella Cá được được lấy từ thí nghiệm

1, mỗi nghiệm thức lấy 20 con Kết quả cho thấy: các nghiệm thức không có sự sai khác về mặt thống kê

Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của premix vitamin lên khả năng chịu đựng của cá đối với NH3 Cá được lấy từ thí nghiệm 1, mỗi nghiệm thức 10 con Kết quả sau khi ngâm cá trong dung dịch ammonia 10 ngày cho thấy: sự khác biệt giữa các nghiệm thức cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê

Như vậy, ở điều kiện thí nghiệm việc bổ sung premix vitamin vào thức ăn cho cá tra thì không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức

ăn cũng như khả năng kháng bệnh của cá Tra Có thể nói sự hiện diện của thức ăn tự nhiên trong môi trường nuôi và lượng vitamin sẵn có trong nguyên liệu đã giải thích được việc bổ sung premix vitamin là không có tác dụng

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Danh sách các đồ thị ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một Số Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 5

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng 5

2.1.7 Đặc điểm sinh sản 5

2.2 Thành Phần Dinh Dưỡng Của Thức Ăn 6

2.3 Vitamin Trong Thức Ăn Thủy Sản 6

2.4 Vai Trò Của Vitamin C Đối Với Sức Khỏe của Cá 8

2.4.1 Vitamin C như là yếu tố dinh dưỡng 8

2.4.2 Chức năng của vitamin C 9

2.4.3 Nhu cầu vitamin C của cá 10

2.5 Các Nguồn Cung Cấp Vitamin 11

2.5.1 Thức ăn tự nhiên 11

2.5.2 Nguyên liệu thức ăn 12

2.5.3 Premix vitamin 13

2.6 Một Số Thông Tin về Bệnh Mủ Gan trên Cá Tra và Tác Nhân Gây Bệnh 16

2.6.1 Một số thông tin về bệnh mủ gan trên cá Tra 16

2.6.2 Một số thông tin về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra 16

2.6.3 Dấu hiệu bệnh lý 17

2.6.4 Chẩn đoán bệnh 17

2.6.5 Phòng và trị bệnh 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1.Thời gian và địa điểm 19

3.2 Vật liệu 19

3.2.1 Đối tượng 19

3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 19

3.2.3 Nguồn nước 20

3.2.4 Thức ăn 20

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 20

3.3.1 Thí Nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của premix vitamin lên sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá Tra 20

3.3.1.1 Hệ thống bể thí nghiệm 21

3.3.1.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21

3.3.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi môi trường 22

3.3.1.4 Phương pháp thu thập số liệu 22

3.3.1.5 Các chỉ tiêu theo dõi cá 22

3.3.2 Thí nghiệm 2: khảo sát sự ảnh hưởng của premix vitamin đến khả năng đề kháng của cá Tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 23

3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm 23

3.3.2.2 Phương pháp thu mẫu 23

3.3.2.3 Phương pháp gây bệnh 23

3.3.2.4 Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn 24

3.3.2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn 24

3.3.2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn 25

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của premix vitamin đến khả năng chịu đựng của cá Tra đối với NH3 28

3.3.3.1 Bố trí thí nghiệm 28

3.3.3.2 Phương pháp thu thập số liệu 29

3.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Thí Nghiệm 1: Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Việc Bổ Sung Premix Vitamin Lên Tỷ Lệ Sống, Sự Tăng Trưởng, Hiệu Quả Sử Dụng Thức Ăn Của Cá Tra 30

4.1.1 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và hàm lượng vitamin trong thức ăn.30 4.1.2 Các thông số môi trường 31

4.1.2.1 Nhiệt độ 32

4.1.2.2 Oxy hòa tan trong nước (DO) 33

4.1.2.3 pH 34

4.1.2.4 Ammonia (NH3) 35

4.1.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung premix vitamin lên tỷ lệ sống và sự tăng trưởng của cá thí nghiệm 36

4.1.3.1 Tỷ lệ sống 36

4.1.3.2 Tăng trưởng của cá thí nghiệm 36

4.1.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung premix vitamin lên lượng ăn và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá thí nghiệm 38

4.1.4.1 Lượng ăn tuyệt đối và lượng ăn tương đối của cá thí nghiệm 38

4.1.4.2 Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá thí nghiệm 39

4.2 Thí Nghiệm 2: Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Premix Vitamin Đến Khả Năng Đề Kháng Của Cá Tra Đối Với Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri 42

4.2.1 Ảnh hưởng của premix vitamin lên ký sinh trùng 42

4.2.2 Ảnh hưởng của premix vitamin lên sức đề kháng 43

4.2.3 Kết quả phân lập và định danh 44

4.2.4 Tỷ lệ sống của cá khi gây bệnh thực nghiệm 46

4.3 Thí Nghiệm 3: Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Premix Vitamin Đến Khả Năng Chịu Đựng Của Cá Tra Đối Với NH3 .47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết Luận 50

5.2 Đề Nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên theo D.Menon và

P.I.Cheko 5

Bảng 2.2 Chức năng của một số vitamin 7

Bảng 2.3: Nhu cầu vitamin của một số loài cá 8

Bảng 2.4: Thành phần vitamin của phiêu sinh động được thu thập từ ao nuôi cá da trơn Mỹ vào mùa hè ở Mississippi 11

Bảng 2.5: Thành phần vitamin chứa trong tảo Chlorella 12

Bảng 2.6: Thành phần và hàm lượng vitamin được tìm thấy trong nguyên liệu thức ăn 13

Bảng 2.7 : Sản phẩm premix của công ty NUTRWAY………14

Bảng 2.8 : Sản phẩm premix của công tu DSM………15

Bảng 2.9 : Sản phẩm premix của công ty BAYER……… 16

Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa trong bộ dịnh danh 26

Bảng 3.2: Đọc kết quả cho các giếng 27

Bảng 4.1: Thành phần dinh dưỡng của thức ăn 30

Bảng 4.2: Hàm lượng vitamin trong thức ăn theo tính toán so với nhu cầu 31

Bảng 4.3: Kết quả theo dõi nhiệt độ 32

Bảng 4.4: Kết quả theo dõi DO 33

Bảng 4.5: Kết quả theo dõi pH 34

Bảng 4.6: Kết quả theo dõi NH3 35

Bảng 4.7: Tăng trưởng của cá thí nghiệm 37

Bảng 4.8: Lượng ăn tuyệt đối của cá thí nghiệm qua 56 ngày nuôi 38

Bảng 4.9: Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá 40

Bảng 4.10: Tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm sán của cá ở các nghiệm thức 42

Bảng 4.11: Tỷ lệ chết (%) tích lũy theo ngày khi gây bệnh thực nghiệm 44

Bảng 4.12:Tỷ lệ sống của các nghiệm thức sau khi gây bệnh 7,14 ngày 46

Bảng 4.13: Tỷ lệ chết tích lũy qua 10 ngày test NH3 48

Bảng 4.14: Tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức sau khi test NH3 49

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Hình dạng ngoài của cá Tra 4

Hình 2.2:Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dưới kính hiển vi 17

Hình 3.1: Thức ăn thí nghiệm 20

Hình 3.2: Hệ thống giai và bể thí nghiệm 21

Hình 3.3: Bảng ghi kết quả của bộ định danh IDS 14 GNR 28

Hình 4.1: Cá tra bị bệnh gan thận mủ 45

Hình 4.2: Khuẩn lạc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau 48 giờ ở 300C 45

Hình 4.3: Kết quả phản ứng sinh hóa của mẫu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 45

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Trang

Đồ thị 4.1: Sự biến động nhiệt độ theo thời gian sáng chiều qua các tuần 33

Đồ thị 4.2: Sự biến động DO theo thời gian sáng chiều qua các tuần 34

Đồ thị 4.3: Sự biến động pH theo thời gian sáng chiều qua các tuần 35

Đồ thị 4.4: Sự biến động NH3 theo thời gian sáng chiều qua các tuần 36

Đồ thị 4.5: Lượng ăn và tăng trưởng của cá thí nghiệm 37

Đồ thị 4.6: Tăng trưởng đặt biệt của cá thí nghiệm 38

Đồ thị 4.7: Lượng ăn tuyệt đối và lượng ăn tương đối của cá thí nghiệm 39

Đồ thị 4.8: Hệ số biến đổi thức ăn (FCR) 40

Đồ thị 4.9: Hiệu quả sử dụng Protein trong thức ăn (PER) 40

Đồ thị 4.10: Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày khi gây bệnh 43

Đồ thị 4.11: Tỷ lệ cá sống giữa các nghiệm thức khi gây bệnh 14 ngày 46

Đồ thị 4.12: Số lượng cá chết tích lũy qua 10 ngày thí nghiệm 48

Đồ thị 4.13: Tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức sau 10 ngày test NH3 49

là trong quá trình chế biến, gia nhiệt, bảo quản thì một số thành phần dinh dưỡng sẽ bị mất đi mà tiêu biểu nhất là vitamin Như chúng ta đã biết thì đối với con người, động vật trên cạn hay dưới nước thì vitamin đóng một vai rất quan trọng, tuy chỉ chiếm từ 1-2% trong khẩu phần ăn nhưng nó đóng vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, động vật thủy sản không có khả năng hay khả năng tổng hợp rất ít không đủ cho nhu cầu nên việc cung cấp vitamin vào thức ăn cho động vật thủy sản là rất cần thiết Động vật thủy sản ăn thức ăn không được cung cấp đầy đủ vitamin sẽ sinh trưởng chậm, tỉ lệ sống thấp, khả năng chịu đựng với biến động môi trường kém và dễ bị bệnh Mặt khác, cho đến nay thì nhu cầu vitamin của một số loài cá vẫn chưa được xác định

Từ những vấn đề trên mà các nhà sản xuất thường bổ sung một lượng lớn vitamin vào thức ăn để phòng ngừa sự hao hụt trong quá trình chế biến, gia nhiệt, bảo quản cũng như độ tan rữa của vitamin trong môi trường nước Nhưng việc bổ sung premix vitamin vào thức ăn này với liều lượng bao nhiêu là thích hợp? Để kiểm chứng lại điều này chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:” Khảo sát ảnh huởng của việc bổ sung premix vitamin lên tỷ lệ sống, sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn

và sức đề kháng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” tại trại thực nghiệm

Khoa Thủy Sản truờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Khảo sát ảnh huởng của việc bổ sung premix vitamin lên sự tăng truởng, tỷ lệ sống, hiệu quả sử dụng thức ăn và sức đề kháng của cá Tra nhằm tìm ra mức độ thích hợp nhất để áp dụng vào sản xuất

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một Số Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá Tra là cá da trơn có thân dài, dẹp ngang, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to, miệng rộng có răng lá mía và khẩu cái rất mịn tạo thành vòng cung, có 2 đôi râu dài, vây lưng và vây ngực có gai cứng, mang răng cưa ở mặt sau Lưng màu xám đen, thân

có màu xám nhạt, bụng hơi bạc, vây lưng và vây bụng màu xám đen, vây hậu môn tương đối dài (trích bởi Lê Ngọc Hoan, 2006)

Hình 2.1: Hình dạng ngoài của cá Tra 2.1.4 Đặc điểm sinh thái

 Oxy hòa tan:

Cá Tra có cơ quan hô hấp phụ nên chịu được hàm lượng oxy hòa tan thấp Do

đó cá có thể nuôi trong các ao nước tù, dơ bẩn, nơi có nhiều chất hữu cơ hay nuôi trong bè với mật độ dày (www.fistenet.gov.vn)

 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho cá tăng trưởng dao động trong khoảng 26 - 300C Cá Tra

là loài chịu lạnh kém vì cá Tra là một trong những loài đặc trưng cho loài phân bố ở vùng nhiệt đới Ở nhiệt độ 150C thì cường độ bắt mồi của cá giảm, nhưng cá vẫn sống,

ở nhiệt độ 390C cá sẽ bơi lội không bình thường (trích bởi Lê Ngọc Hoan, 2006)

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá Tra là loài háu ăn, ăn tạp thiên về động vật Thức ăn chủ yếu trong tự nhiên

của cá hương và cá giống là côn trùng có kích thước vừa cỡ miệng, động vật thân

mềm, cá nhỏ, mùn bã hữu cơ Khi trưởng thành ở trong điều kiện nuôi thức ăn chủ yếu

là thực vật (trích bởi Lê Thanh Hùng, 2006)

Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá Tra ngoài tự nhiên theo D.Menon và

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá Tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh Cá nuôi trong ao 1 năm có thể

đạt 1 - 1,5 kg/con, những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt 5 – 6 kg/con

và cũng tùy thuộc vào môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn

có hàm lượng đạm nhiều hay ít (www.fistenet.gov.vn)

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

Cá thành thục sinh dục, con đực 3 năm tuổi và con cái 3 - 4 năm tuổi Khi thành

thục sinh dục, cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện

sinh thái phù hợp và có đầy đủ thức ăn tự nhiên cho sự phát triển tuyến sinh dục và đẻ

trứng Cá đẻ trứng dính vào giá thể thường là rể của cây cỏ thủy sinh

Sức sinh sản tuyệt đối của cá Tra từ vài trăm ngàn đến vài triệu trứng Sức sinh

sản tương đối có thể tới 135000 trứng/ kg cá cái

Hệ số thành thục của cá đực là 1 - 3 % và cá cái có thể đạt 20%

(www.fistenet.gov.vn)

2.2 Thành Phần Dinh Dưỡng Của Thức Ăn

Thức ăn luôn chứa 6 thành phần chính và thay đổi tùy theo loại thức ăn gồm có: nước: 10 - 80%, protein: 10 - 60%, chất béo: 1 - 25%, bột đường: 0 - 90%, khoáng:

2 - 30%, vitamin: 0 - 1% (trích bởi Lê Thanh Hùng, 2006)

2.3 Vitamin Trong Thức Ăn Thủy Sản

Theo Funk có định nghĩa về vitamin đó là nhóm hóa học chứa amin ảnh hưởng đến sự sống Nhóm chất hữu cơ này hiện diện trong thức ăn với một lượng rất nhỏ mà

cơ thể sinh vật không tổng hợp được hay tổng hợp không đủ cho nhu cầu mà sự thiếu hụt lâu dài các dưỡng chất này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các bệnh lý

Vitamin trong thức ăn thủy sản được quan tâm khi thức ăn công nghiệp ra đời

và khuynh hướng người sản xuất thường bổ sung một lượng lớn vitamin vào thức ăn

để phòng ngừa sự thiếu hụt hay sự thay đổi, biến chất các vitamin trong thức ăn trong quá trình bảo quản

Các loại vitamin dùng trong thức ăn thủy sản cũng tương tự như vitamin cho gia súc, gia cầm bao gồm các loại như vitamin B1 (thiamin), vitamin B2 (riboflavin), vitamin B6 (pyridoxine), pantothenate, vitamin PP, folic acid, vitamin B12, inositol, choline, biotin, vitamin C, vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K và chúng có những chức năng cụ thể như sau:

Bảng 2.2 Chức năng của một số vitamin (trích bởi Lê Thanh Hùng, 2006)

Vitamin Chức năng

Thiamin(B1) Liên quan đến sự biến dưỡng năng lượng từ carbohydrates

Ripoflavin(B2) Là coenzyme cho nhiều phản ứng oxy hóa khử và trao đổi ion Pyridoxine(B6) Liên quan đến sự biến dưỡng protein và các phản ứng khử

Pantothenate Cấu tạo nên acetyl coenzyme A, liên quan đến biến dưỡng

carbohydrate, lipid, protein Vitamin PP

Liên quan đến các phản ứng oxy hóa và khử trong quá trình chuyển vận hydrogen và biến dưỡng của carbohydrate, lipid và amino acid

Vitamin B12 Cần cho quá trình thành thục và phát triển phôi, tham gia vào quá

Vitamin E Ngăn cản quá trình oxy hóa chất béo cao phân tử không no

(HUFA) của lipid trong màng tế bào sinh học, có vai trò trong quá trình tổng hợp và hoạt động của các hormone sinh dục

Vitamin k Có vai trò quan trọng trong quá trình đông máu

Vitamin A Cần thiết cho mắt, vận chuyển Ca qua mang tế bào, thành thục và

phát triển phôi

Việc xác định nhu cầu vitamin ở cá cũng giống như những động vật khác thường là rất khó vì nhu cầu vitamin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tập tính dinh dưỡng, khả năng sinh tổng hợp vitamin của vi sinh vật trong ống tiêu hóa của cá, điều kiện môi trường, điều liện sinh lý…và cho đến nay nhu cầu vitamin của nhiều loài cá

nuôi còn chưa được xác định Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu về nhu cầu vitamin của một số loài cá như: cá hồi, cá chép, cá da trơn thường được áp dụng cho các loài cá khác (trích bởi Lại Văn Hùng, 2006)

Để xác định nhu cầu vitamin của cá, các nhà nghiên cứu tiến hành nuôi cá trong

hệ thống nước trong và sau đó tiến hành xác định nhu cầu vitamin bằng các phương pháp tương tự như phương pháp xác định nhu cầu amino acid hay đo lượng vitamin tích lũy trong gan và sau đây nhu cầu vitamin của một số loài cá:

Bảng 2.3: Nhu cầu vitamin của một số loài cá (mg/ kg thức ăn) (trích bởi Lê Thanh

Hùng, 2006)

Tây Dương

Cá hồi Thái Bình Dương Cá chép

2.4 Vai Trò Của Vitamin C Đối Với Sức Khỏe của Cá

2.4.1 Vitamin C như là yếu tố dinh dưỡng

Vitamin C tên khác là biệt dược: Acid ascorbic, Ascorvic, Cebione, Celaskon, Laroscorbine, Redoxon, Vitascorbol

Vitamin C (Vit C) và khoáng vi lượng chiếm tỷ lệ thấp trong cơ thể cá nhưng lại rất cần thiết cho sự hoạt động sống của cơ thể, trong đó vitamin là không thể thiếu trong cơ thể sinh vật, nếu thiếu sẽ dẫn đến tình trạng rối loạn các hoạt động sinh hóa trong cơ thể, tế bào và các biểu hiện bất thường khác của cơ thể Phạm Khắc Hiếu (1997) cho rằng vitamin C đảm bảo tổng hợp acid hyaluronic và acid chondroitinsufurid là 2 acid tạo thành thể dính liền các liên bào sụn Khi thiếu vitamin

C các chất này không được hình thành, làm ảnh hưởng đến cấu tạo xương, xương dễ gẫy vết gẫy lâu liền Việc cung cấp thức ăn thiếu vitamin C hay do tình trạng cơ thể bị stress vì điều kiện môi trường hay cơ thể bị mất bệnh hậu quả dẫn đến tình trạng cơ thể

bị suy giảm hệ thống miễn dịch làm cơ thể cá bị nhiễm bệnh và không có khả năng phục hồi lại những chức năng bình thường của cơ thể Theo Trần Thị Thanh Hiền

(2004), cá trê phi (Clarias gariepinus) khi thiếu vitamin C có thể có biểu hiện rạn nứt

hộp sọ, xuất huyết ở đầu ăn mòn vây, mõm và mang; trên cá trắm cỏ

(Ctenopharyngodon idella) vây và mắt bị xuất huyết

Vitamin C có dạng tinh thể màu trắng dễ tan trong nước dể hấp thụ qua niêm mạc ruột, không tích lũy trong cơ thể, thải trừ qua nước tiểu Vitamin C rất cần cho hoạt động cơ thể, tham gia vào quá trình oxy hóa khử, cần thiết để chuyển acid folic thành acid folinic tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid ảnh hưởng đến sự thẩm thấu mao mạch và đông máu Nhưng vitamin C dễ bị phân hủy mất tác dụng dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và sự oxy hóa Vai trò của vitamin C đối với sức khỏe của sinh vật đã được phát hiện từ rất lâu Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), vitamin không những được biết đến trong việc sử dụng nhằm để tăng cường sức đề kháng của người và động vật trên cạn mà còn được sử dụng phổ biến trong thủy sản

Gan và thận trước là 2 cơ quan dự trữ vitamin C quan trọng ở cá Thận sau và lách dự trữ 1 lượng lớn vitamin C (Verlhac et al, 1998, trích dẫn bởi Huỳnh Ngọc

Châu, 2007)

2.4.2 Chức năng của vitamin C

Vitamin C đặt biệt cần thiết cho động vật thủy sản như cá, tôm…, vì chúng là một trong số ít động vật không có khả năng tổng hợp vitamin C từ acid Glucurpnic, do không có enzym Gulonolactone oxidase, cần thiết cho quá trình tổng hợp vitamin C Vitamin C tham gia vào quá trình tổng hợp collagen là thành phần quan trọng ở da,

xương, sụn và lớp màng trong của mạch máu Vì vậy những mô này sẽ bị hư hại nếu thiếu vitamin C Vitamin C còn có vai trò trong các quá trình sinh lý khác như là: Tyrosine trao đổi chất làm giảm độc tính của một số kim loại như cadimi, niken, chì Ở

cá bơn (Scophthalmus maximus), khi cơ thể thiếu Vitamin C sẽ dẫn đến tình trạng tăng

acid uric huyết và sự bài tiết của trao đổi Tyrosin (Verlhac et al, 1998, trích dẫn bởi Huỳnh Ngọc Châu, 2007)

2.4.3 Nhu cầu vitamin C của cá

Nhu cầu vitamin C cần cho sự phát triển của cá dao động trong khoảng 10 - 15 mg/kg thức ăn.Tuy nhiên các loại thức ăn khác nhau thì nhu cầu về vitamin C cũng

khác nhau cho sự đề kháng của cơ thể cá đối với bệnh tật như cá rô phi (Tilapia nilotica x Tilapia aurea) là 79 mg/kg thức ăn, cá trê (Clarias gariepinus) là 69 mg/kg

thức ăn (trích dẫn bởi Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Việc nghiên cứu về tác dụng của vitamin C lên chức năng miễn dịch và sức đề kháng của cá đang được quan tâm Vitamin C rất cần thiết cho các hoạt động sống của

cơ thể (Wilson and Poe, 1973; Lim and Lovell, 1978, trích Huỳnh Ngọc Châu, 2007) Các mức vitamin C cao hơn nhu cầu dinh dưỡng cực đại đảm bảo sự sinh trưởng bình thường của cơ thể cá giống, cá da trơn Mỹ đã làm tăng sức đề kháng của cá thí nghiệm

đối với bệnh do vi khuẩn E tarda và E ictaluri đặc biệt ở nhiệt độ dưới 23°C (Durve

and Lovell, 1982, trích dẫn bởi Huỳnh Ngọc Châu, 2007)

Khi cho cá da trơn Mỹ ăn thức ăn có bổ sung vitamin C (30 – 300 mg/kg thức

ăn) sẽ cho đáp ứng kháng thể đề kháng E ictaluri cao hơn đối với cá cho ăn thức ăn

không có bổ sung vitamin C Theo Li and Lovell (trích Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004), thiếu hụt vitamin C sẽ làm suy giảm khả năng thực bào của các thực bào tuần hoàn

trong máu cá da trơn Mỹ đối với vi khuẩn E ictaluri, nhưng thức ăn chứa vitamin C

liều cao không tăng khả năng thực bào so với nhóm cá đối chứng cho ăn liều vitamin thông dụng Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh như: tăng hiệu quả kháng thể,

chức năng của bổ thể và sự thực bào tăng sức đề kháng chống lại E ictaluri (trích dẫn

bởi Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy ở cá da trơn Mỹ, liều vitamin C được khuyến cáo trong các lọai thức ăn thông dụng là nhân tố hạn chế chức năng cực thuận

của đáp ứng miễn dịch và cơ chế đề kháng không đặc hiệu, đăc biệt là ở nhiệt độ thấp

việc bổ sung vitamin C cần được tăng cường (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Kha, 2006)

2.5 Các Nguồn Cung Cấp Vitamin

Nhiều kết quả nguyên cứu cho thấy, động vật thủy sản không có khả năng hay

khả năng tổng hợp rất ít không đủ cho nhu cầu nên chúng chỉ có thể sử dụng vitamin

từ các nguồn thức bên ngoài như từ thức ăn tự nhiên, từ các nguyên liệu thức ăn hay từ

các chế phẩm premix vitamin để thoa mãn nhu cầu sinh trưởng và phát triển

2.5.1 Thức ăn tự nhiên

Do việc cho ăn thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao nên ao nuôi cá thường rất

màu mỡ và đó cũng là môi trường để các vi sinh vật phát triển hay còn gọi là thức ăn

tự nhiên gồm phiêu sinh thực vật, phiêu sinh động vật, động vật không xương sống

(côn trùng và giáp xác) Những vi sinh vật này chứa hàm lượng protein, Vitamin và

các dưỡng chất khác khá cao Người ta nhận thấy rằng sự đóng góp của những sinh vật

này đối với nhu cầu protein và năng lượng của cá da trơn thì hơi thấp nhưng các sinh

vật này có thể cung cấp một lượng vitamin đáng kể cần thiết cho cá

Bảng 2.4: Thành phần vitamin của phiêu sinh động được thu thập từ ao nuôi cá da

trơn Mỹ vào mùa hè ở Mississippi (trích bởi Edwin H Robinson và ctv,1997)

Bảng 2.5: Thành phần vitamin chứa trong tảo Chlorella (trích bởi Đậu Thị Như

2.5.2 Nguyên liệu thức ăn

 Các nguyên liệu chế biến thức ăn tự chế nuôi cá Tra, Basa gồm có:

Cá tạp các loại (cá biển hay cá nước ngọt) cung cấp protein thức ăn

Cám gạo cung cấp năng lượng

Các loại rau (rau muống, bí) chủ yếu cung cấp vitamin cho cá

 Các nguyên liệu chế biến thức ăn công nghiệp:

Nhóm cung cấp đạm: Bột cá, bột đậu nành, bánh dầu bông vải

Nhóm cung cấp năng lượng: cám, tấm, bột mì…

Nhóm cung cấp chất khoáng: bột xương, bột sò, premix khoáng

Nhóm cung cấp vitamin: Bao gồm nhiều loại vitamin có thể có trong nguyên

liệu hoặc premix vitamin

Nhóm chất bổ sung: Nhóm chất hỗ trợ dinh dưỡng, nhóm chất bảo quản và duy

trì giá trị dinh dưỡng, nhóm chất hỗ trợ tiêu hóa, tăng trưởng….(trích bởi Lê Thanh

Hùng, 2006)

Theo Edwin H Robinson và ctv, 1997 Trong một công thức thức ăn cá da trơn

có thành phần và hàm lượng như sau: bột đậu nành 34%, bột bông vải 10%, bột bắp

25%, bột lúa mì 20%, bột cá mòi dầu 4%, bột xương thịt hay bột huyết 4%, dầu cá

1,5%, Canxi phosphate 1%, khoáng chất thì hàm lượng vitamin được tìm thấy qua

bảng sau

Bảng 2.6: Thành phần và hàm lượng vitamin được tìm thấy trong nguyên liệu thức ăn

(trích bởi Edwin H Robinson và ctv, 1997)

là nguồn cung cấp vitamin tốt nhất cho cá để bổ sung các vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh trưởng và phát triển

Premix vitamin ra đời cùng với sự ra đời của thức ăn công nghiêp và hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm premix vitamin và sau đây là một số sản phẩm premix của các công ty:

Bảng 2.7 Sản phẩm premix của công ty NUTRIWAY

Bảng 2.8 Sản phẩm premix của công ty DSM

BASAFISH TILAPIA

Thành phần Đơn vị Hàm

lượng/1kg Thành phần Đơn vị

Hàm lượng/1kg

2.6 Một Số Thông Tin về Bệnh Mủ Gan trên Cá Tra và Tác Nhân Gây Bệnh

2.6.1 Một số thông tin về bệnh mủ gan trên cá Tra

Bệnh mủ gan được ghi nhận đầu tiên xuất hiện trên cá Tra nuôi ở ĐBSCL vào

cuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacillacy Necrosis of Pangasius) Bệnh này gây hại

nghiêm trọng về kinh tế trên cá nuôi thâm canh

Theo Lê Thị Bé (2002) cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ, chất lượng

nước biến động, nước chảy mạnh cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm Khả năng đề kháng đối

với mầm bệnh giảm vì thế bệnh dễ dàng bộc phát, trong một vụ nuôi bệnh mủ gan có

thể xuất hiện 3 - 4 lần Tỉ lệ hao hụt lên đến 10 - 50% tùy thuộc vào chế độ chăm sóc

và vệ sinh ao (Từ Thanh Dung, 2004)

2.6.2 Một số thông tin về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra

Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra được phân lập đầu tiên

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) bởi Hawke (1979) (trích bởi Huỳnh Ngọc Châu,

2007)

Theo Lê Thị Bé (2002) phân lập tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá Tra

đã xác định vi khuẩn E ictaluri

Theo Cedie Komas và Zilong Tan, 2003 (trích bởi Từ Thanh Dung, 2005) cũng

phân lập được vi khuẩn E ictaluri trên cá Tra nuôi bè ở Việt Nam với dấu hiệu bệnh

nhiều đốm trắng trên gan, thận, tụy tạng

Vi khuẩn E ictaluri là vi khuẩn Gram âm không di động hoặc di động yếu, lên

men, không oxy hóa Cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính thuộc nhóm Enterobacteriaceae Vi khuẩn này phát triển trên môi trường TSA trong 48 giờ tạo thành những khuẩn lạc có màu trắng đục, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất

(Từ Thanh Dung, 2004) Vi khuẩn E ictaluri có dạng que thẳng nhỏ với kích thước 1µm x 2 – 3 µm (Plumb, 1993) trong khi đó vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá Tra

trong nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2004) có một số đặc điểm khác với mô tả của

Plumb (1993) như có dạng que và có kích thước biến đổi, E ictaluri phát triển tốt ở

2.6.4 Chẩn đoán bệnh

Dựa vào dấu hiệu bệnh và phân lập mẫu bệnh trên một số môi trường thông

thường như BHIA, TSA Trên các môi trường này, khuẩn lạc của Edwarsiella spp

thường nhỏ, phát triển sau khi nuôi cấy 24 - 48h ở nhiệt độ 30 - 350C

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài đã được tiến hành từ ngày 7 tháng 4 đến ngày 18 tháng 6 năm 2008

Đề tài đã được thực hiện tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng

Cá thí nghiệm được chuyển về trại thực nghiệm nuôi trong bể xi măng và cho

ăn cùng loại thức ăn để cá thích nghi với điều kiện môi trường và sức khỏe ổn định Sau đó, lựa chọn những con có chất lượng tốt bơi lội nhanh nhẹn, kích cỡ đồng đều có trọng lượng trung bình là 13,67g để bố trí thí nghiệm

- Thuốc gây mê MS222

- Cân điện tử và một số dụng cụ cần thiết khác

- Kính hiển vi, dụng cụ tiểu phẩu, cân điện tử, lam, lammell, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, vợt, xô, bình tam giác, pipet, kim tiêm (1ml)

- Bộ kit định danh Nam Khoa của công ty TNHH Nam Khoa

-Hóa chất: cồn 900C, cồn 700C, cristol violet, lugol, dung dịch tẩy màu, fucshin, nước muối sinh lý, NH4Cl, NaHCO3, môi trường BHIA, nước muối sinh lý và các hóa chất cần thiết khác

Pre 0: Thức ăn đối chứng (không có bổ sung premix vitamin)

Pre 1: Thức ăn có bổ sung premix vitamin với nồng độ 1 kg/tấn thức ăn Pre 1,5: Thức ăn có bổ sung premix vitamin với nồng độ 1,5 kg/tấn thức ăn Pre 2: Thức ăn có bổ sung premix vitamin với nồng độ 2 kg/tấn thức ăn Pre 2,5: Thức ăn có bổ sung premix với nồng độ 2,5 kg/tấn thức ăn

Hình 3.1: Thức ăn thí nghiệm 3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.3.1 Thí Nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của premix vitamin lên sự tăng trưởng,

tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá Tra

Pre2(1,5) Pre1(2,5)

Pre1(1,1) Pre3(2)

Pre2(2,5) Pre 3(0)

Pre1(1,5)

Pre2(2) Pre 3(1)

Pre3(1,5) Pre 2(1) Pre 2(0) Pre1(2) Pre 1(0) Pre3(2,5)

3.3.1.1 Hệ thống bể thí nghiệm

Hình 3.2: Hệ thống giai và bể thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên hệ thống 4 bể xi măng (2 x 3 x 1m) Trước khi

bố trí thí nghiệm, bể được vệ sinh sạch sẽ sau đó tiến hành phân bố 15 giai (1 x 1 x 1m) vào trong 4 bể xi măng Mỗi giai ứng với 1 nghiệm thức và có bố trí sục khí (mỗi giai 1 dây sục khí)

3.3.1.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

+ Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức tuơng ứng với 5 tỷ lệ premix vitamin trong thức ăn là: 0; 1; 1,5; 2; 2,5 kg/tấn Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần tương ứng với 15 giai phân bố trong 4 bể xi măng khác nhau Mỗi giai bố trí 60 con cá, cá được nuôi trong 8 tuần, ngày cho ăn 2 lần (8 giờ sáng và 4 giờ chiều) và cho ăn tối đa

+ Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

3.3.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi môi trường

- Nhiệt độ: được đo lúc 6 giờ sáng và 3 giờ chiều

- pH : được đo lúc 6 giờ sáng và 3 giờ chiều

- DO : được đo lúc 6 giờ sáng và 3 giờ chiều

- NH3 : được đo lúc 6 giờ sáng và 3 giờ chiều

Các chỉ tiêu trên được đo vào ngày thứ 4 mỗi tuần

3.3.1.4 Phương pháp thu thập số liệu

Cá thí nghiệm được cân vào ngày đầu bố trí thí nghiệm Mỗi tuần cân lượng thức ăn dư để tính lượng thức ăn sử dụng cuối thí nghiệm Vì cá Tra rất dễ bị sốc và bỏ

ăn sau mỗi lần kéo cá nên chúng tôi chỉ cân cá khi kết thúc thí nghiệm và có sử dụng thuốc mê MS222 Trước khi cân cá một ngày thì cá không được cho ăn

3.3.1.5 Các chỉ tiêu theo dõi cá

+ Lượng ăn tuyệt đối (g) = (Tổng thức ăn sử dụng)/( Tổng số cá * Tổng số ngày nuôi) +Lượng ăn tương đối (g) = (Lượng ăn tuyệt đối)/ (Trọng lượng trung bình của cá) + Tỷ lệ tăng trưởng đặc biệt (specific growth rates) (SGR)

SGR = (Lnw2 - Lnw1) / T x 100

W1: Trọng lượng trung bình bắt đầu thí nghiệm

W2: Trọng lượng trung bình cuối thí nghiệm T: Khoảng thời gian thí nghiệm

+ Hệ số biến đổi thức ăn: Food conversion ratio (FCR)

FCR = (Lượng thức ăn sử dụng )/ (Tăng trọng cá thí nghiệm ) + Tỷ lệ sống (%) (Survival Rate) (SV)

SV = (Số lượng cá sau thí nghiệm)/(Số lượng cá đầu thí nghiệm) x 100

Số lượng cá chết được theo dõi mỗi ngày để tính tỷ lệ sống

+ Tăng trọng (g) - Weight Gain

+ Hiệu quả sử dụng Protein - Protein Efficiency Ratio

PER = (W2 - W1)/ (Protein trong thức ăn)

3.3.2 Thí nghiệm 2: khảo sát sự ảnh hưởng của premix vitamin đến khả năng đề

kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm

Cá sau 8 tuần nuôi ở thí nghiêm 1, bắt ngẫu nhiên ở mỗi giai thí nghiệm 20 con

có đánh dấu nghiệm thức tương ứng ở mỗi giai, được trữ trong thùng xốp Thí nghiệm

gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Trước khi gây cảm nhiễm bệnh, cá được trữ trong thùng xốp 2 ngày để đảm bảo

cá thí nghiệm khỏe mạnh, cá thích nghi với điều kiện nuôi mới, mỗi ngày cho ăn 2 lần

như thí nghiệm 1 với thức ăn tương ứng, cho cá ăn vừa đủ tránh thức ăn dư thừa làm

bẩn nước

Nước trong thùng được thay 2 ngày 1 lần, thay 1/3 thể tích nước trong thùng kết

hợp với siphong đáy

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Pre 1(0) Pre 1(1) Pre 1(1,5) Pre 1(2) Pre 1(2,5) Pre 2(0) Pre 2(1)

Pre 3(2,5) Pre 3(2) Pre 3(1,5) Pre 3(1) Pre 3(0) Pre 2(2,5) Pre 2(2)

3.3.2.2 Phương pháp thu mẫu

Theo dõi thí nghiệm bằng cách ghi nhận số cá chết hàng ngày

Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách của cá trên môi trường BHIA

Trong quá trình thí nghiệm, cá chết được mổ để kiểm tra dấu hiệu bên trong

như: có đốm trắng ở các nội quan Cá lờ đờ hay vừa mới chết tiến hành phân lập vi

khuẩn

3.3.2.3 Phương pháp gây bệnh

+ Phương pháp pha huyền phù vi khuẩn

Vi khuẩn được giữ giống trong tủ đông ở phòng bệnh học 309 của Khoa Thủy

Sản, trường Đại Học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh

Vi khuẩn được cấy ra đĩa thạch BHIA, 2 ngày sau kiểm tra tính thuần của đĩa cấy, nếu chưa thuần thì tiếp tục cấy ra đĩa khác

Khi được chuẩn vi khuẩn thuần, ta cho khuẩn lạc vào bình tam giác đựng nước muối sinh lý cho đến khi độ đục tương đương với ống macfalang 109 Sau đó pha loãng xuống theo hệ số 10 cho đến nồng độ 106, lấy huyền phù ở nồng độ này tiêm cho

3.3.2.4 Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn

Chúng tôi tiến hành đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp gián tiếp đếm khuẩn lạc trên đĩa môi trường thạch

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số tế bào vi khuẩn còn sống hiện diện trong mẫu

Nguyên tắc: cấy trang 0,1 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau lên đĩa thạch và đếm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ Đếm những đĩa mà có số khuẩn lạc từ 25 - 250

Cách tính số lượng vi khuẩn:

X (cfu/mL) = (a + b)/ 2 x D / V

Với: cfu/mL (Colony Forming Unit): đơn vị khuẩn lạc

a, b: số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa thạch

D: nồng độ pha loãng

V: thể tích dung dịch huyền phù cấy vào đĩa

3.3.2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Cá mới chết hoặc lờ đờ được bắt mổ phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách Trước khi mổ ta quan sát triệu trứng bên ngoài cũng như bệnh tích bên trong.Trong quá trình phân lập phải đảm bảo điều kiện vô trùng, cá được sát trùng bên ngoài bằng cồn 700rồi mổ

3.3.2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn

+ Xác đinh tính di động của vi khuẩn

Được xác định bằng cách nhỏ một giọt nước muối sinh lý vào để xác định xem

vi khuẩn đó di động hay không

+ Nhuộm Gram

Nguyên tắc:

Do sự khác biệt về cấu trúc vách của tế bào vi khuẩn Gram dương (G+) và vi khuẩn Gram âm (G-) Do đó, khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm Crystal violet và glugol, rồi khi tẩy màu ta cho thuốc nhuộm fuchsin vào Khi quan sát dưới kính hiển vi

có 2 trường hợp xảy ra: vi khuẩn bắt màu tím đậm là vi khuẩn Gram G+ và vi khuẩn bắt màu hồng vi khuẩn Gram G-

Thao tác:

Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame

Dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vi khuẩn (phát triển từ 18 - 24 giờ) trang mỏng đều với giọt nước cất trên lame

Để khô tự nhiên, cố định vết khô bằng cách hơ lame vài lần qua ngon lửa đèn cồn thật nhanh

+ Kiểm tra phản ứng Oxidase

Nguyên tắc:

Nhằm xác định sự có mặt của enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn (Vương Thị Việt Hoa, 2003) Hoạt tính của cytochrome được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine, trong điều kiện có sự hiện diện của cytochrome, thuốc thử này bị oxy hoá thành một hợp chất indolphenol có màu xanh dương (Trần Linh Thước, 2005)

Thao tác và ghi nhận kết quả: Dùng pipet pasteur vô trùng lấy một ít khuẩn lạc

vi khuẩn cho lên đĩa giấy oxidase đã tẩm ướt bằng nước muối sinh lý Nếu đĩa giấy chuyển sang màu đen hay xanh dương là dương tính , không chuyển màu là âm tính

+ Kiểm tra phản ứng Catalase

Nguyên tắc:

Theo Vương Việt Hoa (2003), phản ứng catalase nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi sinh vật hô hấp kỵ khí tùy ý Catalase giúp vi sinh vật

kỵ khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy không khí bởi sự hình thành hợp chất

H2O2 Catalase xúc tác phản ứng sau:

Catalase

H2O2 H2O + 1/2 O2 Thao tác và đọc kết quả: Dùng pipet Pasteur lấy 1 ít khuẩn lạc vi khuẩn cho lên đĩa Petri nhựa Sau đó, cho 1 giọt thuốc thử catalase lên trên quệt vi khuẩn Nếu có bọt khí xuất hiện thì phản ứng dương tính (+), không có bọt khí xuất hiên thì âm tính (-)

+ Định danh vi khuẩn bằng bộ test Nam Khoa

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ 14 thử nghiệm sinh hoá định danh trực khuẩn Gram (-) (IDS 14GNR) Đây là hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hoá dùng để định danh các trực khuẩn Gram (-) bằng cách sử dụng hệ thống mã định danh và phần mềm định danh Bộ định danh này bao gồm các phản ứng: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thuỷ giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges - Poskauer (VP), Malonate, LDC, di động

Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa trong bộ dịnh danh

Số thứ tự giếng Đĩa giấy sinh hóa

7 Thủy giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

10 Sử dụng Malonate Cách thực hiện

Tạo vi khuẩn thuần không quá 24 giờ

Dùng que cấy thẳng đã khử trùng chạm vào vi khuẩn thử nghiệm, cấy đâm thẳng đứng vào chính giữa chai môi trường LDC, sau đó đậy chặt nắp chai

Làm huyền dịch vi khuẩn trong 3 - 5 ml nước muối sinh lý vô trùng, pha càng đục càng tốt Dùng pipet với đầu tips vô trùng, hút huyền dịch vi khuẩn cho vào khoảng 2/3 giếng Đậy nắp bảng nhựa lại

Bảng nhựa đã nhỏ huyền dịch vi khuẩn và chai môi trường LDC được ủ trong

tủ ấm ở 35 - 370C Đọc kết quả sau khi ử khoảng 12 - 16 giờ

 Đọc kết quả cho các giếng

Bảng 3.2: Đọc kết quả cho các giếng

Kết quả Giếng Phản ứng Thuốc thử thêm vào

(+) (-)

Sau đó ta điền kết quả ghi nhân được của các phản ứng vào tờ giấy định danh kèm theo, cho điểm theo bảng và tra bảng định danh (kèm theo) để xác định tên vi khuẩn định danh được