KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG DA TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ SỰ BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU, BẠCH CẦU TRÊN CÁ BỆNH TRONG AO NUÔI TẠI ĐBSCL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG DA TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus VÀ SỰ BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU, B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG DA TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) VÀ SỰ BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG

HỒNG CẦU, BẠCH CẦU TRÊN CÁ BỆNH TRONG

AO NUÔI TẠI ĐBSCL

Ngành: Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên ngành: Ngư Y

Niên khóa: 2004-2008 Sinh viên thực hiện: Hoàng Minh Thắng

Tháng 10/2008

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG DA TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) VÀ SỰ BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG HỒNG

CẦU VÀ BẠCH CẨU TRÊN CÁ BỆNH TRONG AO NUÔI TẠI ĐBSCL

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm tạ đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Cùng tất cả quí thầy cô trong Khoa Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này cũng như tận tâm giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Con xin cảm ơn cha mẹ đã nuôi dạy con khôn lớn, chăm sóc và tạo điều kiện thuận lợi cho con học tập đến ngày hôm nay

Xin cảm ơn: Bạn bè trong và ngoài lớp, đặc biệt là bạn Nguyễn Thảo Sương và bạn Nguyễn Quốc Huy đã đồng hành, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Gia đình chú Trần Văn Hải đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Xin cảm ơn: Anh Trần Văn Leo đang làm việc tại công ty TNHH Phương Tâm, Long Hồ, Vĩnh Long cùng các chị Đinh Ngọc Trang và chị Nguyễn Thị Ri đang làm việc tại phòng thí nghiệm công ty Vĩnh Thịnh, Vĩnh Long đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Đặc biệt, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Lưu Thị Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành đề tài này

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với số mẫu cá tra là 130 mẫu (17 mẫu cá khỏe và 113 mẫu cá trong ao bệnh vàng da) đã được thu ngẫu nhiên ở 3 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre) để phân tích chỉ tiêu máu (số lượng hồng cầu, bạch cầu, ), kí sinh trùng, phân lập, định danh hệ vi khuẩn cộng sinh trên bệnh vàng

da đồng thời thử độ nhạy của một số kháng sinh đối với hệ vi khuẩn của 3 vùng thu mẫu trên

Kết quả thu được

Về chỉ tiêu máu: Ở cá vàng da thì số lượng hồng cầu giảm rất nhiều (khoảng 90%) so với cá khỏe Ngược lại số lượng bạch cầu trung bình ở cá vàng da lại tăng so với cá khỏe

Về chỉ tiêu vi khuẩn trên cá: Đa số các mẫu phân lập từ cá vàng da không lên vi khuẩn Khuẩn lạc thu được là những khuẩn lạc được thu trên cá vàng da nhưng bội nhiễm một số bệnh khác như: gan thận mủ, xuất huyết, …

Bến Tre: Đa số các vi khuẩn phân lập tại đây nhạy cảm với 3 loại kháng sinh

Am (Ampicillin), Nr (Norfloxacin), Te (Tetracyclin) Nhạy cảm vừa hoặc kháng với các loại kháng sinh còn lại

Đồng Tháp: Các vi khuẩn phân lập nhạy cảm với 2 loại kháng sinh là Am (Ampicillin) và Nr (Norfloxacin), các kháng sinh còn lại ít nhạy cảm hoặc không có tác dụng đối với vi khuẩn

Vĩnh Long: Vi khuẩn nhạy cảm với 4 loại kháng sinh Te (Tetracyclin), Nr (Norfloxacin), Dx (Doxycylin), Flo (Flophenicol), 2 loại kháng sinh còn lai ít có tác dụng với vi khuẩn

MỤC LỤC

Trang Trang tựa

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.4.1 Bệnh nhiễm khuẩn 7

2.4.3 Bệnh do thiếu hoặc mất cân đối về dinh dưỡng 9

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.2 Vật Liệu và Trang Thiết Bị Dùng Trong Nghiên Cứu 14

3.2.3 Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn 14

3.1.10 Phương pháp xác định hàm lượng hồng cầu, bạch cầu 27 3.1.11 Phương pháp xác định tế bào tiểu cầu và bạch cầu 29

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.4 Kết Quả Phân Lập Hệ Vi Sinh Vật Trên Cá Bệnh 44

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Bệnh vàng da đã xuất hiện trên nhiều loại cá

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng của test Nam Khoa

Bảng 3.2: Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng của test Nam Khoa Bảng 3.3: Đọc kết quả bộ định danh API 20 – E

Bảng 4.1: Tóm tắt dấu hiệu bệnh lý của cá khỏe và cá vàng da

Bảng 4.2: Số lượng tế bào hồng cầu của cá tra khỏe, cá không vàng và cá vàng da Bảng 4.3: Số lượng bạch cầu tổng cộng của cá khỏe và cá trong ao bị vàng da

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 4.1: Cá bị bệnh vàng da và gan thận mủ

Hình 4.2: Biểu hiện bên ngoài của cá bệnh vàng da

Hình 4.3: Biểu hiện bên trong của cá bệnh vàng da

Hình 4.4: Tế bào hồng cầu cá khỏe ở vật kính 40X

Hình 4.5: Tế bào hồng cầu của cá vàng da quan sát ở vật kính 40X

Hình 4.6: Mẫu máu của cá khỏe và cá bệnh vàng da

Hình 4.7: Tế bào hồng cầu trong buồng đếm Neubauer quan sát ở vật kính 40X Hình 4.8: Quá trình tạo bilirubin

Hình 4.9: Tế bào Lymphocyte ở cá bệnh vàng da

Hình 4.10: Hình dạng một số khuẩn lạc phân lập được sau 24h

Hình 4.11: Hình nhuộm gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri định danh được

Hình 4.12: Kết quả bộ test api 20 – E

Hình 4.13: Kết quả định danh bằng test Nam Khoa

Hình 4.14: Vi khuẩn kháng với 1 loại kháng sinh

Hình 4.15: Vi khuẩn kháng với 2 loại kháng sinh

Hình 4.16: Vi khuẩn kháng với 3 loại kháng sinh

Hình 4.17: Vi khuẩn nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Số lượng tế bào hồng cầu của cá khỏe và cá trong ao vàng da

Biểu đồ 4.2: Số lượng bạch cầu tổng cộng của cá khỏe và cá trong ao bệnh vàng da Biểu đồ 4.3: Phần trăm hệ vi khuẩn trên cá kháng với mỗi loại kháng sinh

Biểu đồ 4.4: Phần trăm vi khuẩn trên cá kháng với mỗi loại kháng sinh ở Đồng Tháp

đã làm cho sản lượng nuôi không ngừng tăng lên Tính đến hết quí I/2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt trên 2 tỉ USD, trong đó xuất khẩu cá tra, ba sa của Việt Nam đạt 115,6 nghìn tấn với kim ngạch đạt 265,2 triệu USD, tăng 43,4% về lượng và 28,2% về kim ngạch so với quý I/2007 Sự phát triển của ngành đã góp phần quan trọng vào công tác xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống nhân dân đồng thời làm chuyển dịch

cơ cấu nông thôn và giải quyết việc làm cho nhiều người

Bên cạch đó, vấn đề dịch bệnh trên động vật thủy sản đang là một trở ngại lớn cho người nuôi Ở cá tra, bên cạnh những bệnh đã được nghiên cứu và biết được

nguyên nhân như bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh phù mắt do Aeromonas spp thì bệnh vàng da vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu nguyên

nhân và cách phòng trị Theo báo cáo của Vương Học Vinh (2006) thì bệnh vàng da trên cá tra hiện nay được các nhà khoa học và người nuôi cá rất quan tâm và tác giả nhận định rằng, nguyên nhân làm cho cá tra bị vàng là có rất nhiều yếu tố chủ quan và khách quan tác động trong suốt quá trình nuôi Ngày nay những nghiên cứu về huyết học và những phản ứng huyết thanh được dùng nhiều trong lĩnh vực nghiên cứu, công tác chuẩn đóan bệnh ở cá cũng như chỉ ra được tình trạng bệnh lí của cá (Shaperclaus, 1992) Ví dụ với nghiên cứu của Johnson (1993) về bệnh thiếu máu ở cá nheo Mỹ, kết quả cho rằng bệnh này không có tác nhân gây ra mà nguyên nhân có thể là do thức ăn

và môi trường nuôi không tốt Hơn nữa trong nghiên cứu huyết học còn có nhiều

phương pháp khác nhau như Phạm Xuân Tiến (1999) áp dụng phương pháp điện di protein SDS – PAGE thì tác giả cho biết hệ miễn dịch của cá trắm cỏ bị đốm đỏ với cá khỏe có sự khác nhau về số vạch protein trong phổ điện di, còn cá trắm cỏ không bị bệnh có phổ diện di cơ bản như nhau (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Trung Truân, 2002), Phạm Thanh Hương (2006) phân tích những chỉ tiêu máu - số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu – để so sánh và đánh giá khả năng phản ứng miễn dịch của cá tra khỏe và

cá tra bị bệnh vàng da Được sự phân công của Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm

Tp.HCM, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát tình hình bện vàng da trên cá tra

(Pangasius hypophthmus) và sự biến đổi số lượng hồng cầu, bạch cầu trên cá bệnh

trong ao nuôi tại ĐBSCL”

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát tình hình bệnh vàng da trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Xác định sự biến đổi số lượng hồng cầu, bạch cầu trong máu cá tra bị vàng da Phân lập hệ vi sinh vật trên cá bệnh

Thử kháng sinh đồ đối với vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra

A = 31 – 33 Lược mang 29 – 38, bóng hơi chỉ có một ngăn nằm duỗi thẳng trong xoang bụng (Phạm Văn Khánh, 1996; trích bởi Dương Thu Cúc (2004))

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

Cá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh Cá sống chủ yếu ở thủy vực nước ngọt, cũng có thể sống ở nước lợ với nồng độ muối thấp

Oxy hòa tan: số lượng hồng cầu trong máu cá tra nhiều hơn trong máu các loài

cá khác Chúng có cơ quan hô hấp phụ, có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu

đựng được môi trường thiếu oxy hòa tan Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho cá là 3– 6mg/L

Nhiệt độ: 26 – 30oC (ở 15oC cường độ bắt mồi giảm nhưng cá vẫn sống Ở 39oC

cá bơi lội không bình thường)

pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo hoạt động chậm chạp, khi pH =

11 cá lờ đờ có biểu hiện mất nhớt (Dương Tấn Lộc, 2004))

Độ mặn: Cá có thể chịu đựng được độ mặn từ 8 – 10o/oo, tuy nhiên cá chủ yếu sống ở nước ngọt

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá sau khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống Vì vậy, chúng có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và trong quá trình ương nuôi nếu không được cho ăn đầy

đủ Trong quá trình ương giống, chúng ăn động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệng và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn, chúng có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như: mùn bã hữu

cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật Trong ao nuôi, cá tra có thể thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vật đáy, …

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản

trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có màu hồng chuyển dần sang trắng sữa Hệ số thành thục của cá tra trong tự nhiên (P = 8 – 11kg) được khảo sát vào khoảng 1,76 đến 12,74 (cá cái) và từ 0,73 đến 2,1 (cá đực) (Nguyễn Văn Trọng, 1989) Trong bể nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5%

Trong tự nhiên cá tra không sinh sản ở Việt Nam Đến mùa sinh sản chúng di cư ngược dòng sông Mê Kông đến bãi đẻ nằm trên sông Mê Kông từ Sanbo đến Campuchia (Krana trích bởi Phạm Văn Khánh, 1996)

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch Cá

có tập tính di cư, đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở vùng sông của Việt Nam (VINAFIS, 2004)

Cá đẻ trứng dính vào các giá thể thường là rễ của loài cây ven sông Gimenila aiatica, sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn

Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu trứng (sức sinh sản tuyệt đối) Sức sinh sản tương đối của cá tra có trọng lượng 3,2kg là 139.000 trứng/kg thể trọng (Dương Tấn Lộc, 2004) Cá đẻ trứng dính, trứng sắp đẻ có đường kính 1mm, sau khi trương nước có thể đạt 1,5 – 1,6mm (VINAFIS, 2004)

và môi trường sống (Bùi Quang Tề, 2000)

Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thi mắc bệnh và chết Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoăc một bộ phận cơ quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật được goi là bệnh

Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia làm 2 loại bệnh: bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm

Bệnh truyền nhiễm do: vi khuẩn, nấm, virus Tính chất lây truyền mạnh và có thể thành những ổ dịch lớn gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm độc hóa học

Bệnh không truyền nhiễm do: môi trường, dinh dưỡng, độc tố (Dung, 2001)

2.3 Tình Hình Nghiên Cứu Bệnh ở Cá Tra Nuôi Thương Phẩm

Trong vài năm gần đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn ngoại tệ rất lớn Thế nhưng, do phát triển quá nhanh và không theo qui hoạch nên bệnh cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại không có hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá và cả những nhà chuyên môn

Qua thực tế sản xuất, cần có một số giải pháp nhằm hạn chế tình hình dịch bệnh này Nguồn dịch bệnh này chủ yếu dến từ một vài nguyên nhân cơ bản như: nguồn giống, môi trường sống, chế độ dinh dưỡng và quản lí, … Khi kiểm soát được những nguy cơ này thì xem như phần nào kiểm soát được dịch bệnh

2.3.1 Nguồn giống

Trước đây giống cá tra nuôi là nguồn giống tự nhiên kết hợp với môi trường nuôi còn tốt nên cá có sức sống cao và bệnh trên cá nuôi giai đoạn này rất ít khi xảy ra Tuy nhiên, từ năm 1999 thì việc sản xuất giống nhân tạo cá tra phát triển, sản lượng giống nhân tạo ngày một tăng nhanh để đáp ứng nhu cầu người nuôi, nhưng mặt trái của sự gia tăng sản lượng giống là chất lượng giống ngày càng giảm do nhiều nguyên nhân như: cá bố mẹ quá già, chọn cá bố mẹ từ các ao nuôi cùng đàn gây ra hiện tượng đồng huyết, …

Chính vì vậy cần làm cho nguồn giống cá tra đảm bảo chất lượng để cung cấp cho người nuôi Muốn làm được điều đó thì các ngành chức năng phải tăng cường kiểm soát chất lượng tại các cơ sở sản xuất giống, đảm bảo trại sản xuất giống phải đạt tiêu chuẩn ngành mới được tham gia hành nghề, hơn hết là phải có giấy chứng nhận của của

cơ quan quản lí khi xuất bán cá giống

2.3.2 Môi trường

Hầu hết các trại nuôi đều không có ao lắng mà cho nước ao nuôi thải trực tiếp ra sông và cấp nước thẳng vào ao điều này làm cho nguy cơ lây nhiễm bệnh rất cao Hiện nay, môi trường nước bị ô nhiễm khá nghiêm trọng do nhiều nguyên nhân như:

Nước thải công nghiệp chưa qua xử lý mà thải trực tiếp ra sông rạch là mối nguy

cơ lớn do nước chứa nhiều chất độc hại, kim loại nặng…

Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu từ ruộng vườn chảy ra sông rạch Thải trực tiếp nguồn nước bẩn từ ao nuôi ra sông rạch như: nước ao nuôi, bún đáy ao chưa xử lý, nước từ các ao cá bệnh,…

Môi trường nuôi ngày càng biểu hiện xấu kết hợp với việc nuôi cá tra phát triển nhanh mà không theo qui hoạch nên cá nuôi ngày càng phải chịu đựng môi trường sống khắc nghiệt, dễ bệnh hơn rất nhiều lần Chính vì vậy, hiện nay người nuôi phải thực hiện việc phát triển bền vững thân thiện với môi trường bằng việc áp dụng quy trình kỹ thuật nuôi tiên tiến, nuôi trong vùng qui hoạch, có ao lắng, sử dụng hóa chất, kháng sinh hợp lí,…

+ Thiếu oxi làm cho cá luôn trong tình trạng yếu

+ Cạnh tranh không gian sống dẫn đến phân đàn cao, cạnh tranh thức ăn

+ Tăng lượng mùn bã hưu cơ do thức ăn thừa và chất thải từ cá làm cho nước giàu dinh dưỡng, tích tụ dáy ao sinh khí độc như NH3, H2S,…

Vi khuẩn có mặt bình thường trong nước, nhất là trong nước có nhiều chất hữu

cơ Cả cá tra và cá basa đều dễ nhiễm các khuẩn trên Cá con mẫn cảm với bệnh hơn cá trưởng thành, có thể gây chết đến 80%

Triệu chứng, bệnh tích

Cá bệnh sẽ bị sẫm màu từng vung ở bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi mờ đục và sưng phù, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử

Phòng trị

Tránh tạo ra các tác nhân cơ hội như nhiễm kí sinh trùng, tránh làm cá bị sây sác, vệ sinh không đúng qui định, môi trường nuôi nhiễm bẩn, mật độ nuôi quá dày, quản lí tốt các chỉ tiêu nước như O2, NH3, DO,…

Dùng thuốc tím KMnO4 tắm cá, liều dùng là 4 ppm (4 g/m3 nước) đối với cá nuôi trong ao và 10 ppm đối với cá nuôi trong bè Xử lý trong 3 ngày liên tục Định kì tắm cho cá một tuần, hai tuần hay 1 tháng/lần tùy tình trạng sức khỏe của cá

Dùng thuốc trộn vào thức ăn:

Oxytetracyline: 55 – 57 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 – 7 ngày

Streptomycin: 50 – 75 mg/kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày

Kanamycin: 50 mg/kg thể trọng, cho ăn 7 ngày

Nhón sulfamid: 150 – 200 mg/kg thể trọng, cho ăn 7 - 10 ngày

2.4.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas (bệnh đốm đỏ)

Pseudomonas spp Khi xâm nhập vào cơ thể sẽ phá hủy các mô, các chức năng trong

cơ thể, khi các cơ quan bị phá hủy có thể gây chết đến 70 - 80% Pseudomonas spp

thường xâm nhập vào cơ thể qua các thương tổn ở mang, da, vây do các tác nhân cơ học, thả nuôi với mật độ quá cao, dinh dưỡng kém, hàm lượng ôxy thấp, …

Phòng trị

Dùng vaccin phòng bệnh, giảm mật độ nuôi, quản lí nguồn nước và chất lượng nước tốt

Tắm KMnO4 3 – 5 ppm không qui định thời gian, có thể dùng kháng sinh để trị

như ở bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas

2.4.1.3 Bệnh trắng da

Nguyên nhân

Bệnh do Pseudomomas dermoalba gây ra, bệnh dễ xuất hiện khi cá bị sây sác

hoặc bị sốc do đánh bắt, vận chuyển hoặc do môi trường quá xấu

Tắm cá bệnh bằng Streptomycin 25 mg/l nước trong 30phút

Trộn sunfaguadin vào thức ăn với liều 2 – 5 g/100 g cá bệnh, trị liên tục trong 5 ngày

2.4.2 Bệnh do giun tròn nội kí sinh

Nguyên nhân

Do giun tròn (Nematoda) gây ra, thường gây thành dịch, bệnh không làm chết cá

hàng loạt nhưng ảnh hưởng tới tăng trưởng của cá

Triệu chứng, bệnh tích

Cá chậm lớn, gầy yếu, bụng trương to

Kí sinh bên trong hệ tiêu hóa của cá hoặc xoang cơ thể có thể nhìn thấy bằng mắt thường biểu hiện sưng cuống mật hoặc cuộn lại thành búi

Phòng trị

Tẩy giun định kì cho cá nhất là cá nuôi lồng bè

2.4.3 Bệnh do thiếu hoặc mất cân đối về dinh dưỡng

Nguyên nhân

Do trong thức ăn thiếu các acid amin

Do thức ăn thiếu các khoáng chất cần thiết

Thức ăn thiếu vitamin cũng ảnh hưởng nhiều đến cá nuôi

Thức ăn thiếu vitamin C, B1, B6, B12 cá bị tóp nắp mang, dị hình cột sống, thịt

cá bị vàng, chất lượng thịt kém, hàm lượng đạm giảm

Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra Hiện nay gây thiệt hại lớn cho

người nuôi cá tra thâm canh ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Tỉ lệ cá chết do nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90% Cá tra thường mắc bệnh vào những tháng cuối năm (từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau) Tuy nhiên hiện nay bệnh xảy ra vào những thời điểm khác trong năm do việc tăng diện tích và mức độ thâm canh cũng như việc không sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước khi thải ra môi trường

Bệnh này thường khó được phát hiện sớm do cá bệnh ít có biểu hiện bên ngoài

Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh nhẹ hay nặng Quan sát bên ngoài có thể thấy bụng hơi sưng to, mắt bị đục Cá bệnh thường bơi lờ đờ gần bề mặt ao Khi mổ bụng cá ta thường thấy những đốm trắng nhỏ trên bề mặt của một số cơ quan như gan, thận và lách

Sau khi dùng thuốc sát trùng 2 - 3ngày, dùng NB - 25 for Fish hoặc Nova-pro vs

fish để tạo hệ vi sinh vật có lợi trong ao nuôi trước khi tiến hành thả giống

Thả nuôi với mật độ vừa phải để duy trì chất lượng nước tốt trong ao, giúp cá lớn nhanh, khỏe mạnh, hạn chế bệnh xảy ra Sử dụng thức ăn có chất lượng tốt để giúp

cá luôn khỏe mạnh

Nếu sử dụng thức ăn tự chế biến thì cần nấu chín trước khi cho ăn để ngăn ngừa mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể cá qua đường thức ăn

Thường xuyên trộn thuốc bổ như Probio fish, Novitol, Nova-anti shock fish,

Nova-c vào thức ăn để cá lớn nhanh, khỏe mạnh và tăng sức kháng bệnh

Định kỳ 7-14 ngày dùng men vi sinh như NB - 25 for fish hoặc Nova - Pro VS Fish để phân hủy lượng phân cá và thức ăn thừa trong ao nuôi, giúp duy trì chất lượng nước, đồng thời ức chế mầm bệnh xâm nhập vào ao nuôi qua nguồn nước

Sát trùng nguồn nước ao nuôi một cách định kỳ (10 - 14 ngày/lần) bằng Avaxide hoặc Sundine 57 nhằm tiêu diệt mầm bệnh trong ao Cần lưu ý không sử dụng thuốc sát trùng và men vi sinh cùng một lúc mà chỉ dùng men vi sinh sau khi dùng thuốc sát trùng 2 - 3 ngày

Định kỳ dùng thuốc trị ngoại ký sinh trùng (trùng bánh xe, sán lá mang, rận cá, trùng mỏ neo) và nội ký sinh trùng (sán ký sinh trong ruột, túi mật) như Novalan for

fish, Nova-prazi fish để giúp cá khỏe mạnh, tăng sức kháng bệnh

Trị bệnh

Bệnh gan thận mủ là bệnh do vi khuẩn gây ra nên dùng 1 trong các sản phẩm

sau để trị bệnh Nova-flor 500, Cotrimin, Flor 2000, Nova-thiacol, Nova-flordox, Nova-flor 5000 Cần quan sát hoạt động và sức ăn của cá hàng ngày nhằm phát hiện

bệnh sớm (khi cá còn ăn được nhiều thức ăn) Có như vậy hiệu quả điều trị bệnh mới cao.Không nên sử dụng cùng một loại kháng sinh trong thời gian dài để tránh hiện tượng kháng thuốc

Khi trộn kháng sinh vào thức ăn phảo trộn thật đều và cho cá ăn ít hơn bình thường để cá ăn hết lượng thức ăn có trộn thuốc

Sử dụng đúng liều, đúng thời gian ghi trên nhãn thuốc

Dùng một số thuốc bổ sung kết hợp với kháng sinh

Có thể kết hợp với thuốc sát trùng để diệt mầm bệnh trong ao

2.5 Sơ Lược Về Bệnh Vàng Da

Năm 1993, Kamonporn Tonguthai đã nghiên cứu một số bệnh trên cá trê, trong

đó có nói đến bệnh vàng da và theo tác giả thì bệnh có nguyên nhân từ chế độ dinh dưỡng, cụ thể là do cho cá ăn phế phẩm từ nhà máy chế biến thủy sản, thức ăn này có hàm lượng dinh dưỡng thấp và có khi bị phân hủy hoặc cho cá ăn thức ăn viên dã cũ,

đã có nấm phát triển, …

Sakai và ctv (1998) đã nghiên cứu bệnh vàng da trên cá trác bằng phương pháp

mô học mỗi nơi thu mẫu gồm 8 mẫu cá bệnh (trọng lượng trung bình 5,39 kg/con), và 5 mẫu cá khỏe (trọng lượng trung bình 5,4 kg/con) Về mô học khảo sát trên gan, tỳ tạng, phương pháp huyết học khảo sát thành phần huyết tương Kết quả là ở cá bệnh, tế bào

tỳ tạng có hiện tượng phì đại, tế bào gan bị hoại tử và thành phần huyết tương có thay đổi so với cá khỏe

Theo Phan Thị Hừng (2004) nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng

tế bào hồng cầu trên cá tra bị vàng da, kết quả là cấu trúc mô của các cơ quan gan, thận, tỳ tạng ở 55 mẫu ở cá bệnh không thay đổi so với cá khỏe (số mẫu là 55 cá bệnh,

26 cá khỏe) Kết quả nghiên cứu huyết học trên 41 mẫu cá bệnh cho thấy số lượng tế bào hồng cầu giảm đi hơn 50% so với cá khỏe

Theo Từ Thanh Dung (2006), bệnh vàng da trên cá xuất hiện cao điểm vào mùa mưa và các tháng trời lạnh Bệnh gây mất máu, giảm hồng cầu dẫn đến lấy oxi kém, sức đề kháng giảm làm cá dễ nhiễm các bệnh khác, chết hàng loạt và nhanh chóng

Thường ban đêm ở đáy ao, đặc biệt là ao sâu 3m đến 4m cá nhiều chất phân hủy thải ra làm giảm lượng ôxy trong nước Cá bệnh vàng da thường chết nhiều vào buổi sáng, nhất là những ao nuôi với mật độ dày (trên 40 con/m2) và cho cá ăn bằng thức ăn

tự chế lâu ngày sẽ làm tích tụ nhiều chất phân hủy độc hại đẫn đến thiếu ôxi nghiêm trọng về ban đêm Đây là nguyên nhân sẽ làm bùng phát bệnh dữ dội

Theo kết quả nghiên cứu trước đây có nhiều ý kiến khác nhau về nguyên nhân bệnh vàng da như: Sakai và ctv (1987, 1988, 1990) cho rằng nguyên nhân bệnh vàng

da trên các loài cá tác giả phân tích (cá trác, cá vền, cá hồi) là do sự tồn tại bilirubin kết hợp trong túi mật và năm 1989 tác giả cho rằng sự gia tăng quá trình ôxy hóa lipid trong cơ thể cá là nguyên nhân chủ yếu của bệnh vàng da Theo Từ Thanh Dung (2006) thì nguyên nhân chủ yếu là do thiếu ôxy, thức ăn thiếu dinh dưỡng hoặc do khi độc sinh ra nhiều trong ao Ngoài ra con nhiều ý kiến khác cho rằng nguyên nhân của bệnh vàng da là do tích lũy sắc tố mật trong hệ tuần hoàn và trong mô (Turnbull, 1998) và do

kí sinh trùng kí sinh trong cuốn mật

Bảng 2.1: Bệnh vàng da đã xuất hiện trên nhiều loại cá

Cá hồi Oncorhynchus mykis

Cá hồi O keta

Cá trác Seriola quiqureadiata

Cá hồi O mason

Cá hồi Salmo salar

Lươn Anguilla japonica

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện Đề Tài

3.1.1 Thời gian

Đề tài đã được thực hiện từ ngày 28/3/2008 đến ngày 28/8/2008

3.1.2 Địa điểm

Địa điểm thu mẫu:

 Các trại nuôi cá tra tại Đồng Bằng Sông Cửu Long như: Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre

 Phòng thí nghiệm bệnh học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.3 Vật Liệu và Trang Thiết Bị Dùng Trong Nghiên Cứu

3.3.1 Dụng cụ nghiên cứu

Đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, hộp đựng bông, lame, lamelle, cốc thủy tinh, khay inox, …

Bộ tiểu phẩu gồm kéo, kẹp, dao mổ,…

Cồn sát trùng, đền cồn, khay, que cấy, …

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn, parafin, …

3.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Gồm: tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, tủ sấy, máy ảnh, tủ hấp môi trường, kính hiển vi,…

3.3.3 Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn

Môi trường thạch: Nutrient Agar (NA), Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Braid Paker (BP)

Môi trường canh: Nutrient Broth (NB)

3.3.4 Định danh vi khuẩn

Sử dụng bộ định danh Api - 20E để định danh trực khuẩn Gram (-) đã phân lập

Sử dụng bộ định danh Nam Khoa cho những vi khuẩn nghi ngờ là Edwarsiella

ictaluri

3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.4.1 Phương pháp điều tra

Các trại nuôi được chọn ngẫu nhiên và thu mẫu, phỏng vấn các chủ trại bằng bảng câu hỏi soạn sẵn Nội dung bản câu hỏi gồm các vấn đề: thông tin chung về trại, chế độ chăm sóc và quản lí ao nuôi, tình hình dịch bệnh ở trại nuôi, cách phòng ngừa

và điều trị bệnh

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu

Việc thu mẫu, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại ao nuôi

Thu mẫu máu và phân lập vi khuẩn

Dùng ống tiêm 1cc lấy máu cá (động mạch chủ dưới cột sống) cho vào ống nhựa

đã tráng sẵn chất kháng đông EDTA, lắc đều, trữ lạnh

Cho một giọt máu vào đĩa thạch NA đã chuẩn bị sẵn

Cho một giọt máu nữa lên lame để phết mẫu máu

Mổ cá quan sát nội quan bên trong, mô tả biểu hiện của nội tạng cá (quan sát thật kỹ và ghi nhận biểu hiện)

Vô trùng khoang bụng bằng cách xịt cồn sát trùng (cồn 70o) vào khoang bụng Dùng kéo cắt mẫu gan, thận, lách, cơ cho vào tăm bông đã ướt cồn

Dùng kéo, kẹp cắt lớp ngoài từng bộ phận chấm vào đĩa thạch NA đã chuẩn bị trước

Dùng que cấy đã xác trùng cấy ria ra đĩa thạch (từ vệt chấm)

Quấn parafin các đĩa đã cấy vi khuẩn, mang về phòng thí nghiệm để làm thuần

và định danh

3.4.3 Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn

Vi khuẩn phân lập được cấy chuyền một ngày trước khi tiến hành nhuộm Gram

3.3.2.1 Dụng cụ

Lame sạch

Thuốc nhuộm gồm: Crystal-violet, Lugol, thuốc tẩy màu, Fuchsin

Que cấy, đèn cồn, nước muối sinh lí đã tiệt trùng

3.3.2.2 Cách tiến hành

Nguyên tắc

Do sự khác nhau về cấu trúc vách tế bào Ở vi khuẩn Gram (+) có một vách tế bào peptidoglucan dày, vách này sẽ giữ lại thuốc nhuộm Crystal violet trong quá trình rửa mẫu bằng cồn 95% và sẽ bắt màu tím Còn ở vi khuẩn Gram (-) chỉ có vách peptidoglucan ở một phía của tế bào nên dưới tác động của cồn 95%, thuốc nhuộm Crystal violet bị tẩy sạch tạo điều kiện cho vi khuẩn bắt màu hồng với loại thuốc nhuộm thứ hai là Fuchsin

Tiến hành

Nhỏ một giọt nước muối sinh lí lên lame

Dùng que cấy lấy 1 khuẩn lạc rời trong đĩa petri được cấy từ 18 – 24h

Trang khuẩn lạc trên lame theo hình ovan từ trong ra ngoài

Để khô tự nhiên

Ngâm trong Crystal-violet 1phút sau đó rửa bằng nước, để khô tự nhiên

Ngâm trong Lugol 1 phút cũng rửa bằng nước, để khô tự nhiên

Tẩy màu bằng thuốc tẩy màu, rửa nước để ráo

Ngâm trong Fuchsin 30 giây, rửa nước để khô tự nhiên

Quan sát hình dạng vi khuẩn và và đọc kết quả nhuộm Gram dưới vật kính 100X

có dầu

Kết quả

Đọc Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng

Khi quan sát kính hiển vi cần xem hình dáng, cách sắp xếp các vi khuẩn

Một số nguyên nhân gây sai lệch kết quả nhuộm Gram

Vi khuẩn quá già: các sản phẩm của quá trình trao đổi chất làm sai lệch kết quả Vết bôi quá dày không thể tẩy màu hết

Thời gian tẩy quá lâu

Thời gian bảo quản và cách pha hóa chất nhuộm Gram

Cố định trên ngọn lửa quá lâu làm biến dạng tế bào

Qui trình nhuộm gram vi khuẩn đã phân lập:

Nhuộm crystal violet

Sau 01 phút, rửa bằng nước sạch

Sau 01 phút, rửa bằng nước sạch

Tẩy màu Tẩy sạch màu

Sau 30 giây, rửa bằng nước sạch

Để mẫu khô tự nhiên và quan sát

Quan sát mẫu vi khuẩn nhuộm Gram dưới kính hiển vi ở vật kính 100X

3.3.4 Thử nghiệm Oxidase

Nguyên tắc

Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của enzym oxidase Đây là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyển e- đến oxy phân tử để tạo thành nước trong chuỗi hô hấp

Phát hiện oxydase bằng cơ chất chỉ thị màu như p-phenylenediamin dihydrochloride làm chất điện tử nhân tạo thay thế oxygen Ở thế khử, cơ chất này không có màu nhưng với sự hiện diện của oxydase và oxygen trong không khí làm cho

cơ chất bị ôxy hóa và có màu tím đen

Kết quả

Trong vòng 60 giây nếu giấy thử oxidase chuyển sang màu tím đen thì kết quả

là dương tính (+), nếu không thấy đổi màu thì âm tính (-)

3.3.5 Thử nghiệm catalase

Nguyên tắc

Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi khuẩn hô hấp kị khí tùy ý Catalase giúp vi khuẩn kị khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy không khí bởi sự hình thành chất H2O2 Catalase xúc tác phản ứng:

Phương pháp thực hiện

Nhỏ một nước muối sinh lý lên lame, dùng pipet Pasteur chạm vào khuẩn lạc của chủng vi khuẩn có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ, trộn đều trên giọt nước muối sinh lý, đậy lamelle lên giọt nước và quan sát di động ở vật kính dầu x100

3.3.7 Định danh vi khuẩn

Tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ thử nghiệm IDS 14 GNR để định danh

các loài trực khuẩn Gram (-) nghi ngờ là Edwardsiella ictaluri dựa trên 14 phản ứng

sinh hóa: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thủy giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động

Mỗi bảng nhựa có 10 giếng được đánh số từ 1 - 10 Các đĩa giấy sinh hóa được gắn vào các đáy giếng theo thứ tự được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng của test Nam Khoa

Số thứ tự giếng Đĩa giấy sinh hóa

1 Lên men Glucose

7 Thủy giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

Đọc kết quả:

LDC: (+) vi khuẩn mọc, môi trường giữ màu tím (-) vi khuẩn mọc, môi trường chuyển màu vàng

Di động: (+) vi khuẩn mọc và lan nhòe đường cấy

(-) Vi khuẩn mọc chỉ trên đường cấy

Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa

Pha huyền dịch vi khuẩn cần định danh: Lấy một khuẩn lạc có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ, cho vào trong 2,5 mL nước muối sinh lý Pha càng đục càng tốt Sau đó, cho vào máy vortex để khuấy đều lên

Tiếp đó cho vào mỗi giếng 1 mL huyền dịch Đậy nắp lại cho vào tủ ấm ở nhiệt

độ 30oC không quá 16 giờ ta phải đọc kết quả (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng của test Nam Khoa Giếng Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Kết quả

1 Lên men Glucose Không Vàng (+), Tím (-)

2 Khử Nitrate 1 đĩa giấy tìm nitrate Đỏ (+), Vàng lợt (-)

3 Beta-Galactosidase

5 Phenyl Alanin

Deaminnase (PAD) 1 giọt FeCl3 Xanh lá (+), Vàng lợt (-)

6 Sử dụng Citrate Không Xanh biển (+), Xanh lá (-)

7 Thủy giải Esculin Không Đen (+), Không đen (-)

8 Sinh Indol và sinh H 2 S 1 giọt Kovacs Vòng đỏ (+), Vàng (-)

9 Voges-poskauer (VP) 1 giọt KOH+1 giọt α-napthol Đỏ (+), Vàng nhạt (-)

Vàng, xanh lá (-)

Nguyên tắc các phản ứng

 Thử nghiệm lên men glucose

Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định của vi khuẩn để tăng trưởng Khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy phương thức lên men mà các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau bao gồm: rượu, acid hữu cơ,

Còn trường hợp trở thành Nitơ phân tử, nếu phản ứng có màu đỏ thì kết quả là dương tính (+), nếu phản ứng cho màu vàng thì ta tiếp tục cho một ít bột kẽm vào và đọc kết quả:

Nếu phản ứng vẫn có màu vàng tức là nguồn Nitrate đã cạn kiệt, vậy phản ứng này là dương tính (+)

Nếu phản ứng đổi sang màu đỏ nghĩa là nguồn Nitrate vẫn còn và đã tác dụng với kẽm, vậy phản ứng này âm tính (-)

 Thử nghiệm ONPG (O - Nitrophenyl β – D Galactopyrannoside)

Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sử tổng hợp trong tế bào của 2 enzyme

là beta -galactosidae có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và permerase có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào Hoạt tính của enzyme beta-galactosidae có thể được xác định dựa vào một cơ chất tổng hợp là O-nitrophenyl -D-galactopiranoside (ONPG) Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi beta - galactosidae sẽ phóng thích O-nitrophenol có màu vàng

 Thử nghiệm Citrate

Một vài vi khuẩn có khả năng sử dụng citrae là nguồn carbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vận chuyển Việc sử dụng citrate là nguồn carbon tạo thành carbonate và biocarbonate có tính kiềm và làm kiềm hóa môi trường

Mọi vi khuẩn có khả năng dùng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có thể dùng amonium như là nguồn nitrogen duy nhất (và ngược lại)

Nếu như trong môi trường chỉ có ammonium thì bị thủy phân thành amonia làm kiềm hóa môi trường

 Thủy giải Esculin

Thử nghiệm này phân biệt vi khuẩn dựa trên khả năng liên kết glucoside trong esculin tạo thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật

Esculetin phản ứng với muối sắt trong môi trường tạo thành phức hợp màu đen hay nâu đen

 Sinh H2S

Một số vi khuẩn tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kỵ khí các amino acid chứa lưu huỳnh như: Cysteine, Cystin, Methionine và giải phóng H2S

Khí H2S sinh ra sẽ tạo màu đen với chỉ thị sulfite chứa trong môi trường nuôi cấy ( FeSO4, amonium sulfate sắt II hoặc III )

- Thử nghiệm Voges-poskauer

Thử nghiệm này xác định khả năng tạo acetone (acetyl methylcarbinol), một sản phẩm cuối trung tính hình thành do lên men glucose

Glucose trong quá trình biến dưỡng tạo ra acetone, trong điều kiện kiềm acetone

bị oxy hóa bởi oxy không khí tạo thành diacetyl Diacetyl dưới tác động của - Napthtol

sẽ kết hợp với nhân guanidine của arginine có trong pepton tạo nên phức hợp pepton có màu đỏ

Dấu hiệu của sự tăng pH được thể hiện ở sự biến đổi màu của chất chỉ thị pH

Kết quả phản ứng âm tính: 0 điểm

Kết quả phản ứng dương tính thứ nhất của nhóm dương tính: 1 điểm

Kết quả phản ứng dương tính thứ hai của nhóm dương tính: 2 điểm

Kết quả phản ứng dương tính thứ ba của nhóm dương tính: 4 điểm

Cuối cùng tổng kết các nhóm phản ứng ta được mã định danh gồm 5 chữ số, sau

đó tiến hành tra bảng mã để xác định tên loài vi khuẩn

Những vi khuẩn gram (–) khác được định danh bằng bộ định danh API - 20E

1

Số:………

Tên mẫu:………

ONPG URE OXI GLU NIT PAT CIT ESC H 2 S IND VP MLO LDC MOB

2

Kết quả định danh:

IDS 14 GNR

3.3.7.2 Qui trình định danh bằng bộ định danh API - 20E

Vật liệu và thuốc thử

1 hộp ủ dùng cho 20 phản ứng, một bảng nhựa

1 giấy ghi kết quả

1 ống chứa 5ml nước muối sinh lý 0.85% để pha dịch huyền phù

1 bộ thuốc thử gồm: TDA; JAMES; VP1+ VP2; NT1+ NT2

Thuốc thử Zn

Oxidase

Dầu khoáng

Phần mềm định danh

Pipettes, đầu típ, pipette Paster

Dụng cụ bảo vệ ống chứa dịch huyền phù, Giá đỡ ống nghiệm

Một số trang thiết bị phòng thí nghiệm: khay inox, đèn cồn, hộp đựng gòn tẩm cồn 700, khẩu trang, bao tay, ly đựng dụng cụ, bút, 2 que cấy tròn, que cấy thẳng, …

2 ống Môi trường API O/F: kiểm tra khả năng lên men hoặc oxidase

1 ống Môi trường API M : kiểm tra tính di động của vi khuẩn yếm khí tùy nghi Mẩu thử: Vi khuẩn định danh phải được nuôi trong môi trường phù hợp với môi trường nuôi cấy vi khuẩn đường ruột, hoặc vi khuẩn có roi gram âm, dễ mọc

Cách tiến hành

Khuẩn lạc định danh phải được cấy từ 18 h – 24 h để có kết quả tốt nhất

Đổ nước muối cất đầy các giếng trong hộp ủ Đặt bảng nhựa vào hộp

Pha dịch huyền phù:

+ Mở ống chứa 5 ml NaCl 0,85%

+ Hơ đầu que cấy tròn trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy chọn 1 khuẩn lạc mới cho vào ống chứa 5 ml nước muối sinh lí

+ Hơ đầu que cấy trên lửa đèn cồn

+ Dùng pipette trộn hổn hợp cho đều, pha càng đục càng tốt (dùng đầu típ hút 200µl, bơm ngược lại, vài lần Nếu dùng máy lắc càng tốt)

Sử dụng cùng 1 pipet hút huyền dịch cho vào các giếng (hình đế giày) với giếng bình thường thì chỉ làm đầy tube, với test có hình | | (CIT, GEL, VP) thì đổ đầy tube

và ổ hình chén Với test có hình (ADH, LDC, ODC, H2S, URE) thì đổ đầy tube, sau

đó phủ dầu khoáng cho kính ổ hình chén Đóng nắp hộp và đem ủ ở 300C +/_ 20C trong 18-24 giờ

Đĩa khuẩn lạc đã cấy chuyền trước 1 ngày

Que cấy, giá đỡ, máy lắc, …

H2S Không màu/ hơi xám cặn đen/ đường mỏng

nhạt/vàng

Hồng

OX

Giảm nitrat/ GLU Vàng (NO2)

Đỏ Cam (N2)

Đỏ Vàng

Cách tiến hành

Quá trình được thực hiện trong điều kiện vô trùng vì vậy tất cả các dụng cụ phải dược vô trùng trước khi đưa vào tủ cấy vi sinh Chọn những chủng có thời gian phát triển từ 18 – 24 giờ

Lấy 5ml nước muối sinh lí cho vào ống nghiệm thủy tinh Dùng que cấy vòng lấy 1 ít khuẩn lạc thuần cho vào ống nghiệm trên, lắc đều bằng máy votex được huyền phù có độ đục đồng nhất Độ đục của huyền dịch này phải tương đương với độ đục chuẩn McFarland 0,5 Ta so sánh bằng mắt thường như sau: đưa ống nghiệm chứa huyền phù vi khuẩn và ống chuẩn McFarland 0,5 trước ánh sáng để so sánh, phương pháp này dễ cho sai số Vì vậy SFM đưa ra phương pháp điều chỉnh sau: McFarland chuẩn 0,5 có OD (mật độ quang) có giá trị là 0,125 cho phép xê dịch trong khoảng 0,12 – 0,13 Có thể dùng nước muối sinh lí để điều chỉnh độ đục của huyền phù và đo lại OD lần nữa để đạt được độ đục tương đương chuẩn 0,5 McFarland

Lần lượt cho vào hai đĩa petri có chứa môi trường MHA mỗi đĩa 2ml dung dịch vừa pha, trang vi khuẩn đều trong đĩa

Cuối cùng khi đĩa vừa ráo nước (huyền phù) ta đặt đĩa kháng sinh (đĩa giấy tẩm kháng sinh có bán trên thị trường) bằng dụng cụ đóng kháng sinh, kháng sinh sẽ khuếch tán ngay sau khi đã đặt lên mặt thạch

Sau khi đặt xong lật úp mặt đĩa mang đi ủ trong tủ ấm trong 20 – 24 giờ ở 30oC

Đọc kết quả

Sau khi ủ 20 – 24 giờ, đọc kết quả các đĩa thạch Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách, và nếu huyền dịch đúng độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ mọc thành những thảm vi khuẩn và vòng vô khuẩn sẽ trở thành 1 vòng tròn đồng nhất Nếu vi khuẩn mọc được thành những khúm riêng lẽ thì có nghĩa là mầm cấy quá loãng, phải làm lại thử nghiệm

Đo đường kính vòng vô khuẩn là một vòng tròn, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường

Đo đường kính vòng vô khuẩn theo mi-li-met bằng cách áp thước kẻ lên mặt sau của đáy hộp thạch Chỉ đo đường kính vòng vô khuẩn đến bờ rõ nét nhất của nó

Biện luận đường kính vòng vô khuẩn dựa theo tiêu chuẩn SFM đưa ra, sau đó ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy cảm, trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm

3.3.9 Phương pháp nghiên cứu huyết học

Cách lấy mẫu máu

Cá được bắt lên khỏi ao nuôi bằng vợt hoặc chài (cá vẫn còn sống)

3.3.10 Phương pháp xác định hàm lượng hồng cầu, bạch cầu

Theo nguyên tắc các tế bào hồng cầu, bạch cầu phải được đếm trong vòng 24h sau khi lấy mẫu máu

Dụng cụ:

Buồng đếm hồng cầu

Thuốc nhuộm bạch cầu Lazarus

Kính hiển vi xem được ở độ phóng đại 100X

Cách tiến hành

Lắc đều mẫu máu trước khi hút máu vào ống nhuộm

Lấy 0,01 ml máu cho vào ống nhuộm hồng cầu (ống nhựa đỏ), tiếp đó lấy thuốc nhuộm Marcano cho đến vạch 1,01 ml

Lắc đền ống đếm trong 2 phút

Đặt một miếng lamele lên buồng đếm hồng cầu NeuBauer Sau đó nhỏ dung dịch từ ống pha loãng vào buồng đếm sao cho dung dịch lan ra đều các khu vực đếm

Cấu trúc buồng đếm gồm 9 khu vực, chọn 1 khu vực ở giữa trong đó chia làm

25 ô sơ cấp và mỗi ô sơ cấp chia làm 16 ô thứ cấp

Đếm 5 ô sơ cấp (4 ô ở góc và 1 ô ở giữa), đếm những tế bào ở giữa và mép trên

và mép bên phải các ô cần đếm để tránh sai lệch giá trị đếm

Đối với bạch cầu cũng tiến hành tương tự chỉ khác là sử dụng thuốc nhuộm Lazarus và sử dụng ống nhuộm bạch cầu (ống nhựa màu trắng)

Công thức tính mật độ tế bào hồng cầu, bạch cầu:

A: số tế bào bạch cầu đếm được ở 5 ô sơ cấp

20: hệ sồ pha loãng tế bào bạch cầu

Thể tích của 1 ô sơ cấp là: 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm

3.3.11 Phương pháp xác định tế bào tiểu cầu và bạch cầu

Nhuộm mẫu

Ngâm lame mẫu trong dung dịch Methanol trong 15 phút

Để khô tự nhiên

Tiếp tục nhuộm bằng dung dịch Giêmsa trong 5 phút

Rửa sạch bằng nước, để khô tự nhiên

Không cần dán mẫu

Đọc kết quả

Lấy vi trường bằng vật kính 4X hoặc 10X (quan sát tiêu bản)

Nhỏ giọt dầu lên tiêu bản

Xoay sang vật kính 100X, điều chỉnh vi cấp

Nhận diện và đếm liên tục 1.500 tế bào gồm bạch cầu, hồng cầu theo dường Zíc Zắc

3.5 Sơ Đồ Qui Trình Nghiên Cứu:

Định danh

Kháng sinh đồ Đếm chỉ

tiêu máu