PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ THỐNG QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ CÁ CHẼM (Lates calcarifer Bloch)

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Những Bước Tiếp Cận Trong Việc Phòng Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản Theo Bùi Quang Tề 2003, công tác phòng bệnh cho động vật thủy sản cần phải sử dụng c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ

THỐNG QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus

monodon) VÀ CÁ CHẼM (Lates calcarifer Bloch)

Họ và tên sinh viên: DƯƠNG THỊ THU VẤN

Ngành: Nuôi Trồng Thuỷ Sản Chuyên gành Ngư Y Niên khóa: 2004 – 2008

Tháng 10/2008

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ THỐNG

QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ CÁ CHẼM

(Lates calcarifer Bloch)

Tháng 10 năm 2008

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của sự học tập và rèn luyện qua bốn năm học đại học Để có được kết quả này, ngoài sự cố gắng học tập của bản thân còn có sự chỉ bảo hết sức to lớn của quý thầy cô Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy cô trong Khoa Thủy sản nói riêng, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Bệnh đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu

Em cũng xin chân thành cám ơn Cô TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, là người đã tận tình hướng dẫn giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Do kiến thức của em còn hạn chế, không thể tránh khỏi những sai sót nên em rất mong các thầy cô thông cảm và chỉ dẫn thêm cho em

Em xin chân thành cảm ơn !

TP Hồ Chí Minh, ngày 22/09/2008 Sinh viên thực hiện

DƯƠNG THỊ THU VẤN

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập và định danh vi khuẩn phân hủy hệ thống quorum

sensing trên tôm sú (Penaeus monodon) và cá chẽm (Lates calcarifer Bloch)” được

tiến hành tại Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản

II, thời gian từ ngày 05/05/2008 đến ngày 31/08/2008 Các quần thể vi sinh vật thu thập từ hệ tiêu hóa tôm sú (tôm post giai đoạn PL15), tôm thương phẩm và cá chẽm hương (giai đoạn 30 ngày tuổi), được nuôi trong hỗn hợp ba loại phân tử AHLs: N –

butyryl - homoserine lactone (phân tử tín hiệu của V harveyi); N – hexanoyl –

homoserine lactone; N – octanoyl homoserine lactone Sau mỗi chu kỳ, mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang và phương pháp đếm trên đĩa môi trường Marine Agar (MA)

Qua sáu đợt nuôi cấy, chúng tôi đã thu và giữ được 78 mẫu vi khuẩn Trong đó

có 48 vi khuẩn gram âm và 30 vi khuẩn gram dương có khả năng phát triển trong môi trường chứa phân tử AHL Vi khuẩn gram dương chủ yếu gồm các dạng đơn cầu

khuẩn như: Micrococcus, tụ cầu khuẩn như Staphylococcus; trực khuẩn dài dạng Bacillus Vi khuẩn gram âm chủ yếu là trực khuẩn ngắn Không thấy xuất hiện phẩy khuẩn Vibrio spp

Chúng tôi đã tiến hành định danh các trực khuẩn gram âm và thu được kết quả

như sau: Xanthomonas maltophilia (100%); Flavimonas oryzihabitans (81,9%); Yersinia aldovae (58,25%); Weeksellsa viroca (72,89%); Sphingomonas paucimobilis (100%); Enterobacter cloacae (100%); Chryseomonas luteola (100%); Cedecea neteri (70,42%); Serratia marcescens biogroup 1 (100%)

MỤC LỤC

Trang Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii

2.1 Những Bước Tiếp Cận Trong Việc Phòng Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản 3

2.2.2.9 Tác động lên hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh 15

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu 23

4.1 Sự phát triển của các hỗn Hợp Vi Khuẩn Trong Quá Trình Phân Lập 30

4.1.1 Mật độ vi khuẩn xác định bằng mật độ quang 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio harveyi 18

Hình 2.2 Sơ đồ phân hủy quorum sensing của vi khuẩn 18

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL 25

Hình 3 2: Các bình erlen và đĩa thạch trước khi ủ và đặt trong tủ ấm lắc 26

Hình 3.3: Các erlen được đặt trong tủ ấm lắc 26 Hình 3 4: Kết quả kiểm tra LCD và di động của trực khuẩn gram âm đợt 6 28

Hình 4.1 Mật độ vi khuẩn qua các chu kỳ thông qua đo mật độ quang 30

Hình 4.2 Mật độ vi khuẩn trên MA qua các chu kỳ 32

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Mật độ quang (logCFU/ml) trung bình của các nghiệm thức 31

Bảng 4.3 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 1) 36

Bảng 4.4 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 2) 37

Bảng 4.5 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 3) 38

Bảng 4.6 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 4) 39

Bảng 4.7 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 5) 40

Bảng 4.8 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 6) 41

Bảng 4.9 Kết quả định danh vi khuẩn 43 Bảng 1 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 1 14

Bảng 2: Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 2 14

Bảng 3 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 3 14

Bảng 4 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 4 15

Bảng 5 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 5 15

Bảng 6 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 6 16

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề

Theo FAO (2007), 40% sản phẩm thủy sản trên thế giới có nguồn gốc từ nuôi trồng thủy sản Đó là kết quả của việc khai thác quá mức mọi nguồn nước và đáp ứng nhu cầu tăng tiêu thụ hải sản tăng của con người Ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản

là vấn đề dịch bệnh Dịch bệnh tiềm ẩn nguy cơ mất đi nguồn giống tự nhiên và gây tỉ

lệ chết cao trong quá trình sản xuất giống, chủ yếu là do Vibrio spp và Aeromonas

sử dụng vẫn thấy xuất hiện trong các sản phẩm ở Châu Á như Việt Nam, Thái Lan, Malaysia

Cùng với kháng sinh, vaccin cũng khá hiệu quả trong quá trình hỗ trợ phòng bệnh Một ví dụ cho thấy hiệu quả của vaccin là nền công nghiệp cá hồi của Nauy đã tăng gấp 10 lần từ 5500 tấn lên 55000 tấn khi sử dụng vaccin vào trong nuôi trồng Sử dụng vaccin hạn chế ở một số đối tượng có giá trị kinh tế cao và có khả năng gây được đáp ứng miễn dịch của vật chủ, nhưng trên tôm sú thì không có được khả năng này

Do đó, việc tìm ra chất thay thế khắc phục những nhược điểm của kháng sinh cũng như vaccin đang đặt ra yêu cầu cho các nhà nghiên cứu và probiotic là một lĩnh vực mang lại nhiều hứa hẹn

Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của khoa Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm, Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn phân hủy

hệ thống quorum sensing trên tôm sú (Penaeus monodon) và cá chẽm (Lates calcarife)”

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những Bước Tiếp Cận Trong Việc Phòng Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

Theo Bùi Quang Tề (2003), công tác phòng bệnh cho động vật thủy sản cần phải sử dụng các biện pháp tổng hợp như: cải tạo và vệ sinh môi trường, tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể chủ yếu thông qua quản lí con giống và môi trường nuôi Những sinh vật sống dưới nước không được thừa hưởng vi khuẩn có lợi ban đầu do cơ thể mẹ đẻ trứng vô trùng vào môi trường nước, điều này cho phép những vi khuẩn từ môi trường xung quanh bám vào bề mặt trứng và

ấu trùng, do chúng không có một hệ tiêu hóa được phát triển đầy đủ và không có quần thể vi sinh vật bảo vệ trong ống tiêu hóa, trên mang hoặc trên da (Cahill et al 1990, Hagiwara et al 1994, Ringø et al 1999) Đây là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn bám vào bề mặt cơ thể để gây bệnh (Wilson và Horne 1986; Bruno 1988) Tôm cá sống trong môi trường nước rất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nhiệt độ, độ trong, độ mặn, O2, pH, NH3, NO2,…Các yếu tố này thay đổi làm tôm bị stress và dễ mắc bệnh (Bùi Quang Tề, 2003) Nếu oxy hòa tan thấp hơn 2mg/lít tôm cá bị stress rất nặng có thể nhiễm vi khuẩn gây bệnh cơ hội Nếu DO duy trì dưới 1mg/lít trong một khoảng thời gian hầu như cá bị chết (Tucker, 1985)

2.1.1 Giữ vệ sinh trại giống

Công tác vệ sinh trại, bể, đường ống và các dụng cụ khác trước mỗi đợt sản xuất giống phải đặc biệt quan tâm để bảo đảm các loại mầm bệnh không lan truyền từ đợt sản xuất này sang đợt sản xuất khác Các loại vi khuẩn, vi rút, nấm, bào tử nhỏ và nguyên sinh động vật có khả năng sống sót và sinh sôi nảy nở rất nhanh từ những mầm rất nhỏ còn rơi rớt lại trong thành bể nuôi, bể chứa nước, các dụng cụ, đường ống nước, ống khí…Sát trùng và sử dụng dụng cụ riêng cho từng bể; vệ sinh tay chân khi vào trại Trại sản xuất giống phải được thiết kế hợp lí với các khu vực riêng biệt cho các hoạt động sản xuất khác nhau và ngăn cách tối đa các khu vực bằng rào chắn và

kiểm soát cẩn thận việc giữa các khu cũng như hạn chế người ra vào Mỗi bể nên có riêng một bộ dụng cụ và nên kiểm soát chặt chẽ việc sát trùng tay chân trước khi vào trại Ngoài ra, giữ vệ sinh cơ thể tôm cá bố mẹ và trứng thu được đóng vai trò rất quan trọng trong vấn đề phòng bệnh Mỗi cá thể bố mẹ phải được xét nghiệm các loại mầm bệnh trước khi mang về trại và được nuôi dưỡng riêng rẽ Đối với tôm sú, cố gắng cho

đẻ mỗi con một bể để đánh giá lượng trứng của từng con và hạn chế mầm bệnh cũng như thực hiện nghiêm chỉnh trình tự các bước rửa và tẩy trùng cho trứng và nauplius Theo kinh nghiệm trong các trại thực hiện thử nghiệm BMP ở Việt Nam cho thấy đã

loại trừ được vi khuẩn gây hại Vibrio sp., giảm thiểu vi rút đốm trắng và MBV trong

cả đàn nauplius Các hóa chất sử dụng xử lý nước và sát trùng khi thao tác trên cơ thể

bố mẹ, trứng, thức ăn artemia, luân trùng, tảo và ấu trùng cũng đóng vai trò không nhỏ

trong việc phòng bệnh (Chanratchakool et al., 2005)

2.1.2 Sử dụng kháng sinh, chất diệt khuẩn

Theo Nguyễn Như Pho (2007), kháng sinh là những chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết mầm bệnh trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể, vì vây kháng sinh dùng để điều trị trên cơ thể đã bị nhiễm trùng Việc kiềm chế bệnh do vi khuẩn theo thông lệ là dựa vào kháng sinh (Cabello, 200)

Tế bào động vật đa bào, tế bào virus không có các receptor kết hợp với kháng sinh Dựa vào tính chất diệt khuẩn mà có thể chia kháng sinh làm hai loại là kháng sinh sát khuẩn và kháng sinh tĩnh khuẩn Kháng sinh sát khuẩn có tác dụng diệt khuẩn, thích hợp để sử dụng trong các bệnh nhiễm trùng cấp tính, cơ thể không tham gia chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng kháng sinh Kháng sinh tĩnh khuẩn làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn, bạch cầu và đại thực bào tham gia diệt khuẩn có nghĩa là cơ thể cùng tham gia diệt khuẩn với kháng sinh nhờ đó bệnh khó tái phát sau khi ngưng kháng sinh, thích hợp đối với các bệnh có diễn tiến chậm, các trường hợp phòng bệnh Liều phòng bệnh cũng phải có tác dụng diệt khuẩn và liều điều trị thường cao hơn nhiều so với liều phòng bệnh

Ngày nay người ta lạm dụng kháng sinh như là một phương pháp phòng ngừa bệnh Điều này đã dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh đối với một số loài vi khuẩn

và dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản Để ngăn cản vấn đề trên, hướng phát triển sắp tới là giảm lượng kháng sinh sử dụng, chỉ dùng kháng sinh cho mục đích điều trị Tuy nhiên việc sử dụng những hợp chất này thường xuyên, thậm chí sử dụng khi mầm bệnh không biểu hiện rõ ràng, dẫn đến việc phát triển nhanh chóng những dòng

vi khuẩn kháng kháng sinh (Karunasagar et al., 1994; Teo et al., 2000; Teo et al., 2002; Cabello, 2006) (theo Kesarcodi – Watson, 2007)

Thuốc khử trùng (disinfectants) là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hoặc các vi sinh vật nhiễm khác Khác với kháng sinh, những chất khử trùng phá hủy nguyên sinh chất của vi khuẩn và luôn cả vật chủ nên chỉ dùng cho những đồ vật vô sinh

Thuốc sát trùng (antiseptics) là những chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật hoặc giết chết vi khuẩn ở một nồng độ mà không làm ảnh hưởng đến mô bào vật chủ Do đó thuốc sát trùng được sử dụng cho các mô nhiễm khuẩn để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật

Ranh giới giữa chất sát trùng và chất khử trùng cũng không rõ rệt, một hóa chất có thể

là chất sát trùng hoặc chất khử trùng tùy theo nồng độ sử dụng và các điều kiện áp dụng

Cơ chế tác dụng của các chất diệt khuẩn trên là tác động lên thành tế bào làm thay đổi tính cực hoặc phân giải thành tế bào, tác động lên màng bào tương làm hủy tính thấm của màng tế bào làm cho nước khuếch tán vào bên trong làm vỡ tế bào, tác động lên nguyên sinh chất của tế bào làm đông đặc nguyên sinh chất hoặc ức chế chuỗi hô hấp bằng cách tách cặp sự oxy hóa và phosphoryl hóa

Người ta sử dụng các chất sát khuẩn trên nhằm mục đích khử trùng nguồn nước

ao lắng, phòng ngừa sự phát sinh các bệnh do vi rus, vi khuẩn, nguyên sinh động vật

và nấm, dùng xử lí nguồn nước khi tôm cá mắc bệnh hay người ta dùng chất sát trùng

để ức chế sự phát triển của tảo khi mật độ quá dày đặc

Tuy nhiên khi sử dụng thuốc sát trùng người ta phải chấp nhận các tác hại của thuốc đối với môi trường ao nuôi Diệt tất cả các vi sinh vật có lợi trong nước là nguồn thức ăn tự nhiên cho tôm cá, diệt mái nhà che chở cho tôm cá là tảo, làm ức chế quá trình phân giải chất hữu cơ trong ao nuôi, từ đó làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm

cá, nếu sử dụng thường xuyên có thể gây chậm lớn, giảm khả năng sinh sản

Theo OIE (2001), ba giai đoạn sát trùng có thể có trong trại ương nhằm mục đích phòng bệnh gồm những xử lý ban đầu như sử dụng lưới lọc kích thước 1µm và 0,2 µm hoặc dùng hóa chất để sát trùng, kế đến là xử lí trang thiết bị trong khu vực nuôi đặc biệt là toàn bộ quy trình và xử lí nguồn nước xả để bảo vệ môi trường (Nguyễn Như Pho, 2007)

2.1.3 Sử dụng chất kích thích miễn dịch, vaccine

Trong nuôi trồng thủy sản, chất gây đáp ứng miễn dịch chủ yếu được sử dụng

là ß - glucan và mannan Chúng có nguồn gốc từ vách tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae ß - glucan là đại phân tử, khi vào tế bào được xem như là

một ngoại vật, bị tế bào đại thực bào tấn công, làm chuyển dạng tế bào đại thực bào sang dạng hoạt động mạnh và gia tăng số lượng tế bào đại thực bào Mannan che lấp những vị trí vi khuẩn gây bệnh xâm nhập trên màng tế bào thành ruột, làm vi khuẩn không bám vào được Đồng thời kết hợp với vi khuẩn có lợi làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi và ngăn cản vi khuẩn có hại xâm nhập (Nguyễn Hữu Thịnh, 2006)

Tiêm ngừa bằng vaccin là một cách làm hiệu quả để hạn chế đến mức thấp nhất những rủi ro do bệnh tật trên cá nuôi và giá trị của những sản phẩm thu được Vaccin kích thích hệ miễn dịch của cá sản suất ra kháng thể bảo bệ cá khỏi bệnh Một lần được tiếp xúc với vaccin, hệ miễn dịch của cá hoạt động sản xuất ra kháng thể để liên kết với mầm bệnh là vi khuẩn và phân hủy nó Đáp ứng được học hỏi này có nghĩa là

hệ thống miễn dịch đã được học cách làm thế nào để bảo vệ chính nó từ kháng nguyên hay tạo thành những kháng thể đặc hiệu Khi dịch bệnh bùng phát những kháng thể này sẽ giúp bảo vệ cá thoát khỏi sự nhiễm bệnh Vaccin không phải là rào chắn vĩnh cửu, dư lượng tồn đọng có thể bị phá hủy nếu như các yếu tố rủi ro khác không được xem xét (Ohene et al.,2007)

Có ba phương pháp chung để sử dụng vaccin là ngâm tắm, tiêm và cho ăn Những phương pháp này thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của nhiều loài cá, cách

sử dụng, giá trị của vật nuôi, tình trạng sức khỏe của cá, tỉ lệ sống, liều đối chứng, số lượng phòng thí nghiệm có liên quan và thời gian duy trì sự bảo vệ Quyết định phương pháp sử dụng dựa trên sự kết hợp thực tế và rủi ro quan sát được, tuổi của cá (Hugh, 1995) Nhìn chung người ta nhận thấy rằng vaccin dạng tiêm thì bảo vệ hiệu quả hơn so với vaccin dạng ngâm tắm và trộn vào thức ăn, vì chúng cho phép liều

kiểm soát lớn hơn với hiệu quả thu được và thời gian bảo vệ dài hơn.Tuy nhiên vaccin dạng tiêm thì đắt hơn và sử dụng nhiều sức lao động chuyên sâu, và có thể nguy hiểm đến cá nếu không quản lý và chăm sóc cẩn thận Vaccin dạng tiêm gây ra sự bám dính vào cơ thể cá Những sự bám dính này đặt ra yêu cầu cho đáp ứng miễn dịch Nhưng chúng không ảnh hưởng đến sức sống của cá hoặc ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa thức ăn Tuy nhiên sẽ làm giảm giá trị của sản phẩm (FAO, 2005)

2.1.4 Sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic)

Theo Nguyễn Hữu Phúc (2003), các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm đối kháng hoặc cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh và cải thiện chất lượng môi trường Gồm những vi sinh vật sống như các vi khuẩn thuộc

giống Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces,…người ta thường trộn vào thức ăn hoặc qua thức ăn tự nhiên như Artemia, Rotifer Vi khuẩn nhóm Bacillus và Streptococcus sử dụng các chất hữu cơ như thức ăn thừa, phân ở đáy ao hình thành

sinh khối vi khuẩn có lợi với số lượng lớn, chiếm ưu thế trong hệ vi sinh đáy ao, ức chế các vi khuẩn lên men thối sinh H2S (H2S > 0,03 mg/lít làm thối nước ao) Nhóm vi

khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter chuyển hoá nhóm NH3 từ sự phân giải Protein trong phân và thức ăn thừa thành Nitrat làm nguồn dinh dưỡng cho các phiêu sinh và tảo, giúp giảm khí NH3 trong ao

Việc sử dụng Probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích ổn định chất lượng nước đáy ao, hạn chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn có hại, phân giải thức

ăn, chất hữu cơ tích tụ đáy ao, phân giải khí độc tạo thành từ nền đáy và cải thiện hệ tiêu hoá Từ đó, giảm nhu cầu thay nước cho ao nuôi, ổn định và duy trì sự phát triển của tảo, tăng sự phát triển của phiêu sinh động và làm giảm thiểu sự biến động pH trong môi trường nuôi

2.2 Probiotic Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

học về cơ chế tác động cho thấy rằng những thành phần vi sinh vật không chỉ tác động theo cách thức có lợi, và lợi ích này không chỉ giới hạn trong đường ruột (Salminen et al., 1999) Probiotic là một lĩnh vực nhiều hấp dẫn và được nghiên cứu trong 30 năm qua Ý tưởng ban đầu có thể được hình thành bởi Metchnikoff vào đầu thập niên 1900s Ông đưa ra giả thuyết là sức khỏe con người có thể được cải thiện thông qua việc ăn vào sản phẩm sữa được lên men Tác động của probiotic được biết đến lần đầu tiên thông qua quá trình biến đổi trong hệ tiêu hóa như sản xuất chất đối kháng chống lại mầm bệnh, giúp phát triển hệ thống miễn dịch, cung cấp những lợi ích về mặt dinh dưỡng, hỗ trợ cho hàng rào chất nhày đường ruột (Vaughan et al., 2002)

Khi phân lập probiotic dùng cho nuôi trồng thủy sản điều quan trọng là xem xét

sự khác nhau cơ bản với probiotic sử dụng cho động vật trên cạn Động vật thủy sản có mối quan hệ gần gũi với môi trường xung quanh Mầm bệnh nguy hiểm có thể tồn tại

tự do trong môi trường nước chung quanh và tăng trưởng độc lập với vật chủ (Hansen

và Olafsen, 1999; Verschuere et al., 2000), được động vật thủy sản ăn vào liên tục thông qua quá trình điều tiết thẩm thấu và bắt mồi Từ đó cho thấy tác động của môi trường xung quanh và thức ăn lên tình trạng vi sinh vật trong cơ thể Bên cạnh đó, ấu trùng có khả năng duy trì hệ vi sinh vật đặc hiệu bên trong động vật thủy sản vào bất

kỳ thời gian cho phép Khả năng này thì không phù hợp với ấu trùng hai mảnh vỏ do thời gian tồn lưu vi khuẩn trong ấu trùng hai mảnh vỏ khá ngắn để hình thành hệ vi khuẩn khác với môi trường nước xung quanh (Jorquera et al., 2001) Dựa trên mối quan hệ phức tạp mà một sinh vật nước có với môi trường xung quanh, định nghĩa probiotic dùng cho nuôi thủy sản cần được thay đổi Verschuere (2000) đã đề nghị một định nghĩa bổ sung có kế thừa với định nghĩa của Fuller “Probiotic là chất bổ trợ vi khuẩn sống có tác động có lợi trên vật chủ thông qua tác động làm thay đổi hệ vi khuẩn của môi trường xung quanh hoặc hệ vi khuẩn liên quan đến vật chủ, đảm bảo việc cải thiện chất lượng thức ăn hoặc làm tăng giá trị dinh dưỡng của nó, nâng cao đáp ứng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng nước” Xuất phát từ yêu cầu probiotic phải chứa vi khuẩn sống, định nghĩa này khá dài dể mô tả probiotic Ngày nay không phải chỉ có vi sinh vật sống mới là probiotic mà còn có chuỗi peptidoglycan và lipopolysaccharide cũng là probiotic bằng khả năng gây đáp ứng miễn dịch Vì thế hai tác giả Irianto và Austin (2002) cho ra đời một định nghĩa mới

ngắn hơn và không yêu cầu đối với vi sinh vật sống “probiotic là một phần hay toàn bộ

vi sinh vật có ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe của vật chủ” Định nghĩa sau này phù hợp với điều mà Salminen (1999) đưa ra Mặc dù ngày nay vẫn còn một vài tranh luận

về probiotic cho nuôi thủy sản, tất cả định nghĩa trên khác với định nghĩa của Fuller ở chỗ là probiotic không nhất thiết phải hoạt động trong ống tiêu hóa Do đó các cơ chế tác động như sự cạnh tranh dinh dưỡng và sản xuất chất ức chế có thể xuất hiện trong môi trường nước nuôi

Ngày nay probiotic cũng khá phổ biến trong thực phẩm chức năng cải thiện sức khỏe cho con người nhằm mục đích điều trị, phòng bệnh, và chất bổ trợ tăng trưởng (Mombelli và Gismondo, 2000; Ouwehand et al., 2002; Sullivan và Nord, 2002; Senok

et al., 2005) Cụ thể, vi khuẩn sinh acid lactic (lactic acid bacteria (LAB)) được sử dụng một cách rộng rãi trong nghiên cứu cho con người và đề nghị nghiên cứu cho động vật trên cạn LAB được biết là cũng có mặt trong đường tiêu hóa của cá khỏe mạnh (Ringø và Gatesoupe, 1998; Hagi et al., 2004) Sự thật là LAB có nguồn gốc cư trú tự nhiên trong ống tiêu hóa của con người với khả năng chịu đựng môi trường acid

và mật của ống tiêu hóa LAB cũng có chức năng biến đổi đường lactose thành acid lactic do đó làm giảm pH của ống tiêu hóa và ngăn cản một cách tự nhiên sự bám dính của nhiều vi khuẩn (Mombelli và Gismondo, 2000; Klewicki và Klewicka, 2004) Hai nhóm vi khuẩn được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất là lactobacilli và bifidobacteria (Corcoran et al., 2004; Ross et al., 2005; Senok et al., 2005) (Theo

Ohene et al., 2007)

Probiotic được nghiên cứu thông thường nhất là hình thức bào tử Bacillus spp

và nấm men Bacillus spp có khả năng bám dính, sản xuất bacteriocin và gây kích

thích miễn dịch (Cherif et al., 2001; Cladera – Olivera et al., 2004; Duc et al., 2004;

Barbosa et al., 2005) Nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng gây kích thích

miễn dịch và sản xuất ra các hợp chất ức chế (Castagliuolo et al., 1999; Dahan et al., 2003; Van der Kühle et al., 2005) (Theo Ohene et al., 2007)

Nhiều cơ chế phức tạp tồn tại bên trong probiotic có thể có lợi, những cơ chế này có thể hoạt động đơn lẽ hoặc nằm trong sự liên kết với những probiotic đơn giản khác Những cơ chế này bao gồm: ức chế mầm bệnh thông qua việc sản xuất hợp chất

ức chế, cạnh tranh vị trí bám, cạnh tranh về mặt dinh dưỡng, thay thế hoạt động của

enzyme của mầm bệnh, sản xuất chất gây kích thích miễn dịch và những tác động có lợi về mặt dinh dưỡng cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và sử dụng thức ăn (Fuller, 1989; Fooks et al., 1999; Bomba et al., 2002) (Theo Ohene et al., 2007)

2.2.2 Cơ chế tác động

Mặc dù nhiều công bố về probiotic trong nuôi trồng thủy sản nổi lên trong thời suốt thời gian qua, nhưng các phương pháp nghiên cứu dường như còn theo kinh nghiệm và mọi sự tranh cãi thường tập trung vào cơ chế tác động một cách chi tiết Cơ chế tác động chính xác của probiotic hiếm khi được làm sáng tỏ hoàn toàn Những cơ chế tác động của probiotic gồm có: khả năng bám dính trên biểu mô ruột, sản suất hợp chất ức chế, cạnh tranh hợp chất hoặc năng lượng có sẵn, cạnh tranh vị trí bám, tăng cường đáp ứng miễn dịch, cải thiện chất lượng nước, tương tác với tảo, nguồn dinh dưỡng đa - vi lượng và đóng góp hệ enzym cho quá trình tiêu hóa (Theo Ohene et al., 2007)

2.2.2.1 Sản xuất hợp chất ức chế

Quần thể vi sinh vật tiết ra các chất hóa học có tác dụng diệt khuẩn hoặc kiềm hãm sự phát triển lên quần thể vi sinh vật khác, nhằm cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có thể, làm thay đổi mối quan hệ cân bằng trong quần xã Sự xuất hiện vi khuẩn sản xuất chất ức chế trong đường ruột của vật chủ hoặc trên bề mặt da hoặc trong môi trường nuôi được xem như là một hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại những vi khuẩn

gây bệnh cơ hội

Nhìn chung, tác dụng kháng khuẩn của vi khuẩn là do những yếu tố sau: sản xuất kháng sinh, bacteriocin, siderophore, lysozyme, protease, H2O2, acid hữu cơ, NH3

và diacetyl

Vi khuẩn sinh acid lactic sản xuất bacteriocin ức chế lên quá trình tăng trưởng của vi sinh vật khác Có nhiều báo cáo về hoạt động ức chế của vi khuẩn sinh acid lactic thông qua bacteriocin, hầu hết không loại trừ sự ức chế trên vi khuẩn gram dương Tuy nhiên, gần như tất cả vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản là gram âm (Verstraete at al., 2000)

Kháng sinh được đề nghị đóng một vai trò trong mối quan hệ hội sinh, có thể xuất hiện giữa nhiều loài vi khuẩn Nair et al (1979) cho biết phần lớn vi khuẩn nước

mặn sản xuất ra enzyme bacteriolytic chống lại V parahaemolyticus Imada et al

(1985) đã phân lập và kiểm tra đặc tính của chủng Alteromonas sp B – 10 – 31 ,

chủng này sản xuất chất ức chế kiềm protease (alkaline protease inhibitor) được gọi là

monastatin Trong một kiểm chứng in vitro, monastatin được tinh sạch và cô đặc đã chứng tỏ có hoạt động ức chế chống lại protease của Aeromonas hydrophila và một thiol protease của V anguillarum, cả hai vi khuẩn này đều gây bệnh trên cá (Theo

Verschuere et al., 2000)

Nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn trong môi trường nước sản suất chất ức

chế chống lại mầm bệnh đã biết in vitro Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào chứng minh có sự sản xuất hợp chất ức chế in vivo cũng như mối liên quan của chúng đến

môi trường sinh thái

Sản xuất hợp chất ức chế in vitro thường được xem xét ở những loài vi khuẩn

được lựa chọn với mục đích làm probiotic nhưng không có một nghiên cứu nào được công bố nhằm mục đích cho thấy rõ ràng hợp chất ức chế là nguyên nhân của hoạt

động probiotic in vivo của nhiều chủng Từ đó, những nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh

vực này được đặt ra Ở thực vật, sự sản xuất hợp chất ức chế do những loài

Pseudomonas spp phát huỳnh quang được công nhận như là một yếu tố quan trọng

trong việc ngăn ngừa khả năng gây bệnh của những chủng này (Theo Verschuere et al., 2000)

2.2.2.2 Sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có sẵn

Sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có thể giải thích rõ lý do tại sao những quần thể vi sinh vật khác nhau có thể sống chung trong cùng một hệ sinh thái Về mặt

lý thuyết, dường như sự cạnh tranh chất dinh dưỡng sẽ có hiệu quả trong đường ruột của động vật hữu nhũ, nhưng bằng chứng xuất hiện chúng trên người và những động vật trên cạn thì không đủ sức thuyết phục Sự cạnh tranh dinh dưỡng theo lý thuyết có thể đóng một vai trò hết sức quan trọng trong sự hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hoặc hệ vi sinh vật của môi trường nước nuôi thủy sản Nhưng đến nay vẫn chưa có những nghiên cứu bao hàm toàn diện về vấn đề này Từ đó cho thấy, sự ứng dụng thành công nguyên lý cạnh tranh vào thực tế thì không dễ dàng (Theo Verschuere et al., 2000)

Sự điều hòa hệ sinh thái vi sinh vật trong môi trường nuôi thủy sản nhìn chung

bị chi phối bởi những sinh vật dị dưỡng tiêu thụ chất hữu cơ như cacbon và các nguồn

năng lượng Rico – Mora et al (1998) đã lựa chọn một chủng vi khuẩn có khả năng hoạt hóa sự tăng trưởng trong môi trường nghèo chất hữu cơ, và đưa nó vào môi

trường nuôi tảo khuê, ở đó vi khuẩn này kềm chế số lượng chủng Vibrio alginolyticus thêm vào, điều này có thể là do nó có khả năng cạnh tranh với V alginoliticus do có

khả năng tận thu các dịch tiết từ tảo khuê

Verschuere et al (1999) đã chọn lọc nhiều chủng vi khuẩn có ảnh hưởng tích

cực trên sức sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia Khi kiểm tra chất đối kháng

trong phòng thí nghiệm thì xác định không có hóa chất ức chế ngoại bào nào có liên

quan đến hoạt động bảo vệ của những chủng này chống lại Vibrio proteolyticus CW8T2, nhưng những chủng vi khuẩn sống đó lại có khả năng bảo vệ Artemia chống

lại mầm bệnh Điều này cho thấy rằng những chủng vi khuẩn chọn lọc đưa vào có khả năng bảo vệ là cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng có sẵn với vi khuẩn gây bệnh

2.2.2.3 Cạnh tranh sắt

Hầu như tất cả vi sinh vật đều cần đến sắt để tăng trưởng (Reid, 1993) Siderophores là tác nhân bắt lấy sắt một cách đặc hiệu (Neilands, 1981), có trọng lượng phân tử thấp (<1,500) có thể hòa tan kết tủa sắt và làm cho sắt trở thành có sẵn cho vi sinh vật sử dụng Ý nghĩa về mặt sinh thái của siderophores là khả năng tìm đến những sinh vật chết trong môi trường để ăn những chất dinh dưỡng cần thiết Vi khuẩn gây bệnh thường chiếm ưu thế là do chúng có thể cạnh tranh ion sắt trong điều kiện môi trường dịch mô bào, dịch cơ thể của vật chủ (Wooldridge, 1993) (Theo

Verschuere et al., 2000)

Sự thiếu hụt sắt trong khẩu phần ăn của cá chẽm mới nở không gây thiệt hại trên sức sống cũng như sự tăng trưởng của ấu trùng nhưng có ý nghĩa giới hạn vật mang vi khuẩn trên ấu trùng và làm tăng mật độ vi sinh vật (Gatesoupe, 1997) Nhu

cầu sắt của vi khuẩn gây bệnh khá cao Trong một mẫu kiểm tra với vi khuẩn Vibrio anguillarum, tỉ lệ chết của cá hồi gia tăng một cách rõ nét với chế độ ăn có chứa sắt

(Gatesoupe, 1997; Rørvik, 1991) Tất cả những quan sát trên đều biểu thị tầm quan trọng và vai trò sinh học của ion sắt trong sự hình thành hệ vi sinh vật trên vật nuôi thủy sản

Vi khuẩn vô hại sản suất siderophore được sử dụng làm probiotic không chỉ để cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh (mà đặc tính gây bệnh được biết là do sự sản suất siderophore và cạnh tranh ion sắt), mà còn cạnh tranh với tất cả vi sinh vật cần đến ion sắt hòa tan Tác động tích cực của vi khuẩn probiotic sản xuất siderophore được mô tả rất rõ trong nghiên cứu của Gatesoupe, 1997, trong đó bổ sung vi khuẩn sản xuất siderophore vào luân trùng làm gia tăng sức đề kháng của cá hồi khi được gây nhiễm

với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P

Pybus et al (1994) đã kiểm tra 30 chủng V anguillarum được xem như là probiotic tiềm năng chống lại vi khuẩn gây bệnh trên cá hồi V ordalii bằng những mẩu

kiểm tra chất đối kháng được làm chậm lại (deferred- antagonism test) Chỉ có một

chủng V anguillarum VL4335 ức chế chủng V ordalii in vitro, và tác dụng này bị

chặn lại khi cho thêm muối sắt vào trong môi truờng, cho thấy sự ức chế quá trình tăng trưởng có liên quan mật thiết với ion sắt Khi sử dụng phương pháp “chrome- azurol

sulfat” để đo lường sự sản xuất siderophore, chủng V anguillarum VL4335 sản xuất giá trị siderophore cao có ý nghĩa hơn các chủng V anguillarum khác

Smith và Davey (1993) đã công bố rằng chủng Pseudomonas huỳnh quang F19/3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của chủng Aeromonas salmonicida trong môi

trường nuôi và sự ức chế này là do cạnh tranh sắt tự do Chủng F19/3 cũng có khả

năng bài xuất Aeromonas salmonicida ra khỏi cá hồi Thái Bình Dương (Salmo salar)

trước giai đoạn biến thái, bị nhiễm bệnh do stress

Do đó, phát hiện sự sản xuất siderophore in vitro không có ý nghĩa quyết định

mà việc chúng sản xuất một số lượng lớn siderophore in vivo để có tác dụng kiểm soát

sinh học mới thật sự có ý nghĩa Tương tự với việc sản suất hợp chất ức chế, sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng chủ yếu là sắt tự do hay siderophore là một trong những cơ chế tác động của probiotic còn tùy thuộc vào từng hoàn cảnh

2.2.2.4 Cạnh tranh vị trí bám

Một cơ chế tích cực để ngăn ngừa quá trình định cư của mầm bệnh là sự cạnh tranh vị trí bám trong ruột hoặc trên bề mặt biểu mô Điều này cho thấy rằng khả năng bám dính vào chất nhày đường ruột và bề mặt vách tế bào thì rất cần thiết để vi khuẩn hình thành số lượng cần thiết trong ống tiêu hóa của cá (Onarheim, 1990) Sự cạnh tranh những thụ thể bám dính với mầm bệnh có thể là tác động probiotic đầu tiên khi

vi khuẩn bám vào bề mặt biểu mô trong suốt giai đoạn đầu của sự gây nhiểm (Montes, 1993)

Sự bám dính có thể đặc hiệu dựa trên vị trí bám trên bề mặt vi khuẩn và phân tử tiếp nhận trên tế bào biểu mô hoặc không đặc hiệu dựa vào các yếu tố lý hóa học (Salminen, 1996)

2.2.2.5 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Chất kích thích miễn dịch là những chất hóa học hoạt hóa hệ thống miễn dịch của động vật và kích thích cơ thể phản kháng nhiều hơn khi bị nhiễm do vi rút, vi khuẩn, nấm hay kí sinh trùng (Raa, 1996) Ấu trùng cá, tôm và những động vật không xương sống khác có hệ thống miễn dịch ít phát triển hơn cá trưởng thành và chủ yếu là dựa vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (Söderhall, 1998)

Vi khuẩn probiotic được bổ sung vào thức ăn có thể làm tăng tính đối kháng khi đường ruột động vật máu nóng bị nhiễm (Holzapfel, 1998) Trong nuôi thủy sản có một số chủng vi khuẩn hoạt động như chất gây đáp ứng miễn dịch, nhưng chỉ có những thành phần tế bào đặc hiệu hoặc không đặc hiệu được sử dụng (Sakai, 1999) Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ có hay không vi khuẩn probiotic tác động gây đáp ứng miễn dịch trên những loài thủy sản được nuôi, nhưng cơ chế tác động này không thể loại trừ (Verschuere, 2000)

2.2.2.6 Cải thiện chất lượng nước

Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng nước được cải thiện trong suốt quá trình bổ

sung probiotic, đặc biệt là Bacillus spp Bacillus là vi khuẩn gram dương có hiệu quả

trong việc phân giải hợp chất hữu cơ trở về CO2 hơn là vi khuẩn gram âm, có thể chuyển hóa một tỉ lệ rất lớn cacbon hữu cơ để tạo sinh khối vi khuẩn hoặc bùn (Stanier, 1963) Đó là lý do để duy trì mức độ cao vi khuẩn gram dương trong ao nuôi thương phẩm, người nông dân có thể hạn chế đến mức thấp nhất sự tích lũy hợp chất cacbon hữu cơ trong suốt chu trình nuôi trong khi vẫn duy trì tính ổn định của tảo, thông qua việc tăng cường sản xuất CO2 (Scura, 1995) (trích dẫn bởi Verschuere et al., 2000)

2.2.2.7 Tác dụng của nước xanh

Vi tảo có tác dụng lên thành phần vi khuẩn của môi trường nước nuôi và lên sự sống sót và tăng trưởng của ấu trùng cá, vừa là tác nhân kháng khuẩn, vừa là yếu tố

dinh dưỡng Bổ sung tảo vào môi trường có thể đóng góp vào sự thành lập hệ vi khuẩn đường ruột có lợi (Reitan et al., 1997), tỉ lệ sống cá chẽm được nâng cao khi bổ sung

tảo Isochrysis galbana vào nước nuôi do vi tảo kích thích enzyme tiêu hóa ở tuyến tụy

và đường ruột Ngoài ra, tảo vô trùng Tetraselmis suecica cũng ức chế được in vivo Vibrio sp trên tôm thẻ chân trắng Ấn Độ Fenneropenaeus indicus (Regunathan và

Wesley, 2004)

2.2.2.8 Đóng góp về mặt dinh dưỡng

Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò quan trọng trong sự dinh dưỡng của vật chủ thông qua cải thiện sự tăng trưởng và khả năng tiêu hóa của vật chủ (Burr et al., 2005) như rotifer và ấu trùng hai mảnh vỏ Riquelme et al và Verschuere et al đã

đánh giá ảnh hưởng của 11 chủng vi khuẩn ức chế mầm bệnh V anguillarum (in vitro) lên sức sống của ấu trùng sò điệp Chile, chỉ có hai chủng Vibrio 11 và 334 thể hiện tác

dụng bảo vệ ấu trùng sò điệp, trong khi những chủng khác cho kết quả tỉ lệ chết khá

cao Khi kiểm tra in vivo, Vibrio 11 có tác động bảo vệ chống lại mầm bệnh Vibrio anguillarum Theo Verschuere et al (1999) tính đối kháng in vivo của chín chủng với mầm bệnh V proteolyticus CW8T2 đã được giải thích rõ trong những thí nghiệm gây

nhiễm và cho thấy có sự bảo vệ ở nhiều mức độ khác nhau Những kết quả này chứng

tỏ rằng hai khía cạnh kiểm soát mầm bệnh và dinh dưỡng phải được giải thích tách biệt nhau, nhưng có thể hiểu rằng sự kết hợp cả hai mặt dinh dưỡng và kiểm soát bệnh cùng một lúc là cơ chế tác động tốt nhất của probiotic (trích dẫn bởi Kesarcodi – Watson, 2007)

2.2.2.9 Tác động lên hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

a Giới thiệu về Quorum sensing

Quorum sensing là một cơ chế truyền tín hiệu dựa vào năng lực của vi khuẩn đáp ứng lại một loại phân tử hóa học được gọi là autoinducer Khi một nồng độ autoinducer đạt đến một ngưỡng cụ thể nào đó, vi khuẩn phát hiện được và đáp ứng với phân tử này bằng việc thay đổi sự biểu hiện của gen Quorum sensing được mô tả

lần đầu tiên có liên quan đến vi khuẩn gây bệnh phát sáng là Vibrio fischeri và Vibrio harveyi (Nealson et al, 1970; Nealson và Hasting, 1979) Từ đó chứng tỏ quorum

sensing là một cơ chế rộng rãi trong sự biểu hiện gen của nhiều loài vi khuẩn Có nhiều hệ thống quorum sensing mà vi khuẩn sử dụng: hệ thống LuxR/I chủ yếu dược

sử dụng cho vi khuẩn gram âm Trong đó phân tử tín hiệu là một acyl-homoserine lactone (AHL) Hệ thống phân tử oligopeptide chủ yếu được sử dụng cho vi khuẩn gram dương Hệ thống phân tử tín hiệu LuxS/AI – 2 được sử dụng cho những giao tiếp khác loài Hệ thống phân tử tín hiệu AI – 3 /epinephrine/norepinephrine được sử dụng cho những giao tiếp khác giới (theo Reading et al., 2006)

Sự biểu hiện của gen gây độc trong nhiều mầm bệnh vi khuẩn được báo cáo là

do sự điều hòa của quorum sensing (Defoirdt et al., 2004) Nồng độ của autoinducer

là yếu tố then chốt để phát hiện sự biểu hiện của gen gây độc trong nhiều vi khuẩn gây bệnh, có thể phát triển chiến lược kiểm soát bệnh bằng việc kiềm chế sự sản suất autoinducer hoặc loại bỏ autoinducer do vi khuẩn gây bệnh sản xuất ra (Dong et al., 2000) Phân tử tín hiệu, quorum sensing AHL (N – acyl homoserine lactone) và AI – 2 (autoinducer 2) được tìm thấy có liên quan đến yếu tố gây độc trong nhiều vi khuẩn gây bệnh, bao gồm những mầm bệnh trên cá (Federle và Basler, 2003; Morohoshi et al., 2004; Bruhn et al., 2005) Phân hủy quorum sensing được đề nghị là một chiến lược chống lại sự nhiễm khuẩn mới trong nuôi trồng thủy sản (Defoirdt et al., 2004)

Furanone được halogen hóa sản xuất từ tảo đỏ nước mặn Delisea pulchra (Manefield

et al 1999) hứa hẹn là một chất đối kháng lại Quorum sensing Những hợp chất này

khi được bổ sung với nồng độ thích hợp bảo vệ được Brachionus, Artemia và cá hồi chống lại tác động bất lợi của những mầm bệnh Vibrio (Rasch et al., 2004; Defoirdt et

al., 2006; Tinh et al., 2007)

b Hệ thống Quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi

Vibrio harveyi là vi khuẩn phát sáng trong nước mặn, sống trong nhiều môi

trường khác nhau: nó có thể tồn tại tự do trong nước biển, bám chặt vào bề mặt vô sinh, là thành phần của màng sinh học và gây bệnh trên vật chủ nước mặn (Henke và

Bassler, 2004) Đặc tính gây bệnh của V harveyi trên cá có liên quan đến sự dung

huyết và phân giải phospho do các hợp chất ngoại bào của vi khuẩn (Zhang và Austin, 2000; Zhang et al., 2001; Zhong et al., 2006; Sun et al., 2007) (trích dẫn bởi Reading et al., 2006)

V harveyi có ba hệ thống autoinducer điều khiển bởi quorum sensing Hệ

thống autoinducer đầu tiên được gọi là Harveyi, autoinducer 1 (HAI-1) là một chuỗi acyl được gắn với homoserine lactone, N – butyryl homoserine lactone (Cao và

Meighen, 1989) Autoinducer thứ 2 là Autoinducer 2 (AI – 2), là một furanosyl borate diester (Chen et al.,2002) Autoinducer thứ 3 là một Cholerae Autoinducer 1 (CAI – 1) và cấu trúc của nó thì vẫn chưa được biết (Henke và Bassler, 2004) Tất cả

ba autoindcer điều khiển sự biểu hiện của gen đích bằng một cơ chế truyền tín hiệu

phospho hóa và dephospho hóa Quorum sensing của V harveyi sử dụng cả ba hệ

thống tín hiệu tế bào, chức năng của nó cùng song song điều khiển sự phát sáng sinh học (Bassler et al., 1993; Bassler et al., 1994; Henke và Bassler, 2004) và nhiều yếu

tố gây độc khác như là metalloprotease (Mok et al., 2003), siderophore, sản phẩm exopolysaccharide (Lilley và Bassler, 2000) và chất bài tiết loại 3 (Henke và Bassler,

2004) theo cách thức lệ thuộc vào mật độ tế bào Vibrio harveyi là mầm bệnh của

nhiều động vật thủy sản (Gomez – Gil et al 2004) Gần đây, hệ thống mã hóa AI – 2

được khám phá là quy định yếu tố gây độc của Vibrio harveyi đối với Artemia franciscana (Defoirdt et al., 2005) Trong khi đó cả hai hệ thống HAI – 1 và hệ thống

AI – 2 có liên quan đến tác động làm chậm lại sự tăng trưởng của Brachionus plicatilis

(Tinh et al 2007)

Thêm vào đó, furanon được halogen hóa, một hợp chất phân hủy quorum sensing, chứng tỏ khả năng trung hòa tác động bất lợi của những chủng vi khuẩn

thuộc loài V harveyi và nhiều Vibrio phát sáng khác (Defoirdt et al., 2005; Tinh et

al., 2007) Defoirdt và cộng sự (2007) đã tìm thấy furanone được halogen hóa làm trở

ngại sự biểu hiện của gen có liên quan đến quorum sensing trên V harveyi bằng cách

làm giảm hoạt động kết nối của gen quy định quorum sensing với yếu tố điều chỉnh LuxRvh (trích dẫn bởi Reading et al., 2006)

Hình 2.1: Quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio harveyi (Reading và Sperandio, 2006)

c Các phương pháp tác động lên hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

Hình 2.2: Sơ đồ phân hủy quorum sensing của vi khuẩn (Defoirdt et al., 2004)

Quá trình tổng hợp phân tử tín hiệu AHL cần có protein mang chuỗi C, S – adenosylmethionine là chất nền và enzyme xúc tác (là đồng đẳng của protein LuxI) (Whitehead et al., 2001) Người ta nhận thấy hợp chất tương tự như S –

adenosylmethionine là S – adenosylcysteine khi thay thế tại vị trí nối với S – adenosylmethionine thì quá trình tổng hợp AHL không xảy ra và cũng không ảnh hưởng đến chức năng sống của sinh vật đó (trích dẫn bởi Defoirdt et al., 2004)

Tảo đỏ Delisea pulchra tiết ra hợp chất furanone được halogen hóa chống lại

phân tử AHL Hợp chất này có khả năng liên kết với yếu tố điều chỉnh quorum sensing (LuxR) nhưng không làm hoạt hóa chúng, làm cho quá trình tổng hợp AHL không diễn ra được vì cấu trúc của chúng tương tự với cấu trúc của AHL Ngoài ra nó có khả

năng ngăn chặn sự biểu hiện của gen phát sáng do V harveyi và làm nâng cao tỉ lệ

sống của tôm sú đối với bệnh phát sáng lên 50% (Defoirdt et al., 2004)

AHL có khả năng bị biến đổi hóa học qua sự thủy phân trong môi trường kiềm tạo thành acyl – homoserine cùng nguồn gốc Gần như sự cân bằng động có liên quan đến pH của hỗn hợp phản ứng Tại pH = 6, một phân tử 3 – oxo AHL tương tác nhanh chóng với hai phân tử HBr hoặc HCl tạo thành một phân tử 2,2 – dihalo – 3 – oxo AHL Sau đó chuỗi C bị thủy phân tạo thành một acid béo và một phân tử 2,2 – dihalo

– N – ethanoyl – L – homoserine lactone Tại pH = 3, phản ứng dừng lại sau bước halogen hóa Tại pH = 8, vòng lactone của 2,2 – dihalo – N – ethanoyl – L – homoserine lactone bị thủy phân tạo thành 2,2 – dihalo – N – ethanoyl – L –

homoserine Điều này cho thấy rằng, khi bổ sung vào môi trường nước những chất oxi hóa mạnh với nồng độ thấp có thể có lợi như là hóa chất chống lại sự nhiễm khuẩn bằng sự biến đổi phân tử tín hiệu của vi khuẩn gây bệnh (Defoirdt et al., 2004)

Tác động lên hệ thống tín hiệu quorum sensing còn có 2 loại enzyme AHL lactonase và AHL acylase Enzyme lactonase điều kiển bởi gen AiiA có khả năng phân

hủy một cách đặc hiệu phân tử AHL Enzyme này được sinh ra từ vi khuẩn Bacillus gồm các chi sau: B mycoides, B thuringiensis, B cereus bằng cách xúc tác phản ứng

mở vòng lactone (Dong et al., 2000, 2001; Wang et al., 2004; Lee et al., 2002) Enzyme acylase có khả năng bẻ gẩy mạch cacbon, phân hủy AHL thành acid béo và

homoserine lactone Ngoài ra, hai vi khuẩn Variovorax paradoxus và Pesodomonas aeruginosa đã sinh trưởng được trong môi trường chỉ chứa AHL là nguồn năng lượng

duy nhất chứa cacbon và nitơ Trong môi trường này, vi khuẩn sản xuất ra một loại men amino acylase bẻ gẩy mạch cacbon của phân tử tín hiệu Phần chuỗi được sử dụng như là nguồn cacbon Nitơ từ liên kết amide được chuyển sang dạng hoạt động NH4+

thông qua tác dụng của men lactonase (Huang et al., 2003; Leadbetter và Greenberg, 2000) (trích dẫn bởi Defoirdt et al., 2004)

2.3 Tình Hình Nghiên Cứu Probiotic Trên Thế Giới Và Ở Việt Nam

Trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu về sử dụng probiotic trong nuôi thuỷ sản Maeda và Nagami (1989) đã trình bày phương pháp kiểm soát sinh học trong nuôi thủy sản Maeda và Liao (1992) đã trình bày hiệu quả của giống vi khuẩn tách từ bùn

trong bể nuôi ấu trùng tôm sú Penaeus monodon Tỉ lệ lột xác và sống sót của ấu trùng

cao hơn trong các lô thí nghiệm so với đối chứng

Garriques và Wyban (1993) cho rằng các thí nghiệm sử dụng probiotic đầu tiên trong nuôi tôm do các nhà nuôi tôm giống thực hiện nhằm tìm cách cải thiện mức độ

Vibrio có lợi trong các bể nuôi gọi là “sucrose fermentor” Để thực hiện mục tiêu này

người ta sử dụng đường ăn cho vào các bể nuôi tôm giống để kích thích sự phát triển

của Vibrio có lợi (các chủng lên men đường saccharose) Tiếp theo các chủng vi khuẩn Vibrio có lợi được nuôi cấy tương tự như phương pháp nuôi tảo để cho vào các bể nuôi

tôm giống

Austin và cộng sự (1992) cho biết tảo Tetraselmis suecica có thể kìm hãm các chủng vi khuẩn gây bệnh ở cá như Aeromonas hydrophila, Aeromonas salonicida, Serratia liquefaciens, Vibrio anguillarum

Austin và cộng sự (1995) cho biết chủng Vibrio alginolyticus không gây ra bất

kỳ hậu quả tai hại nào cho cá hồi Sử dụng phương pháp điều trị chéo, probiotic được

thừa nhận là kìm hãm tác nhân gây bệnh trên cá như V ordalii, V anguillarum, Aeromonas salmonicida và Yersnia ruckeri

Garrique và Arevado (1995) cho biết nhờ việc đưa probiotic vào nuôi ở Ecuador trong năm 1992 mà các trại nuôi giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng còn 21 ngày trong một năm, sản lượng tôm giống tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% (trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Phúc, 2003)

Ở châu Á có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm đặc

biệt ở Thái Lan Jiravanichpaisal và cộng tác viên (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Ở Trung Quốc nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản được tập trung vào vi khuẩn quang dưỡng sử dụng cho tôm (Penaeus

chinensis) bằng cách cho vào thức ăn hoặc cho vào nước nuôi tôm cho thấy có sự gia

tăng khả năng phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH3-N, H2S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lượng nước và cân bằng pH (trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Phúc, 2003)

Nấm men và nấm mốc cũng được sử dụng để cải thiện tỉ lệ sống và năng suất

ấu trùng tôm chân trắng Penaeus vannamei (Intriago et al.,1998) Nấm men có sắc tố

đỏ Rhodotorula và nấm mốc phân hủy chitin đã được tách từ môi trường biển để sử

dụng, tuy nhiên có rất ít thông báo về kết quả ứng dụng

Bai và cộng sự (2007) nghiên cứu sự phá vỡ hệ thống quorum sensing trong vi

khuẩn Vibrio harveyi bằng protein AiiA của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và ứng dụng protein AiiA trong việc ngăn cản mầm bệnh V harveyi Trong nghiên cứu này, gen AiiA từ Bacillus thuringiensis BF1 được dòng hóa vào vector biểu hiện pET - 24d(+), protein tái tổ hợp được chuyển vào và nhân bản vô số trong E coli BL21(DE3) Dịch chiết của E coli tái tổ hợp không chỉ kiềm chế việc tổng hợp sắc

tố tím của vi khuẩn chỉ thị quorum sensing Chromobacterium violaceum CV026, mà còn làm yếu đi cường độ phát sáng của V harveyi VIB391 khoảng 85% Nghiên cứu

này là một bước đệm khá quan trọng cho những nghiên cứu sâu hơn trong việc tiêu

trừ sự nhiễm bệnh gây ra do V harveyi

Kesarcodi – Watson và cộng sự (2007) với probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản:

sự cần thiết, nguyên lý, cơ chế tác động và các phương pháp lựa chọn vi khuẩn probiotic Nghiên cứu có cái nhìn toàn diện về probiotic trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới trong 30 năm qua

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cộng sự (2007) với nghiên cứu phân lập vi khuẩn phân hủy N – acyl homoserine lactone lần đầu tiên từ đường ruột tôm thẻ chân trắng

Penaeus vannamei nhằm mục đích tìm ra vi khuẩn phân giải phân tử tín hiệu của vi

khuẩn gây bệnh để kiểm soát dịch bệnh bằng probiotic được sản xuất từ các chủng vi khuẩn thu được

Lio – Po (2005) phân lập yếu tố chống lại vi khuẩn phát sáng Vibrio trong mô hình nuôi tôm tôm sú Penaeus monodon nước xanh cải tiến

Tại Việt Nam những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh để cải thiện môi trường nuôi hoặc có tác dụng probiotic tương đối còn ít Nguyễn Hữu Phúc

(2003) nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm phân bón vi sinh đến chất lượng nuớc nuôi tôm Nguyễn Việt Thắng (1996) nghiên cứu lọc sinh học trong sản xuất giống và nuôi tôm Nguyễn Thị Lê và cộng sự (2003) nghiên cứu với “Probiotic- Tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản”, nêu rõ tiềm năng của Probiotic đối với dinh dưỡng cho thủy sản có tác dụng rất tốt đến sức khỏe con người Đây là một hướng nghiên cứu cần được quan tâm và phát triển đưa vào ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

- Thời gian thực hiện đề tài: 05/05/2008 – 31/08/2008

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

- Địa điểm thu mẫu: Các trại sản xuất giống tôm sú và cá chẽm ở Bà Rịa – Vũng Tàu, ao nuôi tôm thương phẩm ở Bạc Liêu

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

- Các quần thể vi sinh vật thu thập từ hệ tiêu hóa tôm sú (tôm post giai đoạn PL15, tôm thương phẩm và cá chẽm hương (giai đoạn 30 ngày tuổi)

- Hỗn hợp ba loại phân tử AHLs : N – butyryl – homoserine lactone (phân tử

tín hiệu của V harveyi); N – hexanoyl – homoserine lactone; N – octanoyl

homoserine lactone

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu vi sinh vật

Tất cả các mẫu tôm post, tôm thương phẩm và cá chẽm hương, cá được ngâm trong dung dịch BenzalKonium Chloride (BKC) 0,1% trong một phút trước khi thao tác để loại bỏ hệ vi sinh vật trên bề mặt

Đối với tôm sú post: 50 con cho vào túi nhựa vô trùng cùng với 10ml nước muối sinh lý (0,9%) vô trùng

Đối với cá chẽm hương: 10 con cho vào túi nhựa vô trùng cùng với 10ml nước muối sinh lý (0,9%) vô trùng

Đối với tôm thương phẩm: Mẫu gan tụy và ruột cho vào túi nhựa vô trùng cùng với 10ml nước muối sinh lý (0,9%) vô trùng

Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (Seward Stomacher 400 Circulator, Anh) (tốc độ 240 vòng/phút) Sau khi đồng nhất, rút 500µl dịch trong cho vào eppendorf

cùng với 500µl glycerol 40% Sau đó bảo quản các eppendof trên trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ - 800 C

Những hỗn hợp vi khuẩn này được sử dụng làm vật liệu cho quá trình phân lập chủng vi khuẩn phân hủy AHL

3.3.2 Quy trình phân lập

Nuôi cấy các hỗn hợp vi khuẩn trong môi trường nước muối sinh lý 0,9% chứa hổn hợp ba phân tử AHLs như là nguồn cacbon và nitơ Sau sáu chu kỳ nuôi cấy sẽ phân lập được những vi khuẩn phân hủy phân tử AHL Một đợt nuôi cấy gồm có sáu hổn hợp vi khuẩn thu được ở bước 3.3.1 và một mẫu đối chứng (chứa AHL, không

chứa vi khuẩn)

Đầu chu kỳ 1 của mỗi đợt, 500µl hỗn hợp vi khuẩn từ tủ lạnh sâu được cho vào bình erlen cùng với 20 ml nước muối sinh lý 0,9% vô trùng và 5 mg/l hổn hợp AHL Sau đó đem đặt các erlen trong tủ ấm lắc (120 vòng/ phút) ở 300C

Đầu chu kỳ 2, 200µl hỗn hợp vi khuẩn trong bình erlen cũ được chuyển sang bình erlen mới có chứa lượng nước muối sinh lý 0,9% vô trùng và nồng độ AHL giống như ban đầu Đo mật độ quang (lặp lại 3 lần), cấy trang 50µl dịch vi khuẩn trên MA (3 đĩa) vào đầu chu kỳ và cuối mỗi chu kỳ Đo pH vào cuối mỗi chu kỳ

Tiếp tục các thao tác giống như chu kỳ 2 cho đến cuối chu kỳ 6 trên tất cả các mẫu của tất cả các đợt

Cuối chu kỳ 6, chọn khuẩn lạc đặc trưng dựa vào hình dạng và màu sắc, cấy ria trên Marine Agar (MA) Mỗi loại khuẩn lạc được cấy tăng sinh vào 1 ml môi trường Marine Broth, đặt trong tủ ấm lắc 120 vòng/phút Sau hai ngày tiến hành giữ 500 µl dịch vi khuẩn cùng với 500 µl glycerol 40% trong tủ lạnh sâu – 800C và nhuộm Gram với 20µl dịch vi khuẩn từ môi trường Marine Broth Xem kính hiển vi xác định hình thái vi khuẩn

h 3.1: Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL

3.3.3 Phương pháp nhuộm gram

3.3.3.1 Hóa chất

Crystal violet, Lugol, Safranine, cồn 960 Nước máy, giấy thấm, đèn cồn, que cấy Tất cả các hóa chất trên được cung cấp bởi công ty Nam Khoa

3.3.3.2 Quy trình nhuộm gram

Rút 20µl dịch vi khuẩn từ môi trường Marine Broth cho vào lam kính sạch, dàn mỏng, để khô tự nhiên, cố định nhẹ trên lửa đèn cồn

Cho 1- 3 giọt Crystal violet vào phết nhuộm dàn đều trong 1-2 phút

Rửa bằng nước máy

Cho 1-3 giọt Lugol vào phết nhuộm dàn đều trong 1 phút

3.3.4.1 Vật liệu và thuốc thử

Hộp ủ dùng cho 11 phản ứng,

Giấy ghi kết quả 14 phản ứng

Ống chứa 5ml nước muối sinh lý 0,85%

Bộ thuốc thử gồm: Kovac, FeCl3, thử nitrite, KOH + α – napthol (Các thuốc

thử này chỉ sử dụng khi đã cho vi khuẩn vào test kit và ủ sau 48h.)

Lọ thử oxidase

Ống sinh hoá thử LCD và di động

Micropipettes, đầu típ 200µl

Các dụng cụ kèm theo: đèn cồn, hộp đựng gòn tẩm cồn 700, kéo, bút, 1 que cấy tròn, que cấy thẳng, đĩa thủy tinh, nhíp, nước muối sinh lý, máy vortex

Yêu cầu đối với vi khuẩn: cấy ria vi khuẩn từ khuẩn lạc thuần trước khi định danh 2 ngày trong môi trường MA Ủ đĩa cấy ở 300C sau 48h trong tủ ấm

3.3.4.2 Quy trình định danh

Làm thử nghiệm Oxidase bằng cách quệt một vòng cấy vi khuẩn lên đĩa giấy Oxidase đã tẩm ướt bằng nước muối sinh lý Đọc kết quả trong 10 giây đến 1 phút đầu Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ đĩa cấy ria, cấy thẳng đứng vào giữa ống môi trường LDC, đậy nắp lại

Pha dịch huyền phù trong 4ml nước muối sinh lý đã hấp vô trùng

Rút 200µl cho vào mỗi giếng Đậy nắp lại

Đem ủ bảng nhựa và ống môi trường LDC ở 300C trong 48 giờ

Đọc kết quả dựa vào hướng dẫn kèm theo bộ định danh

Hình 3 4: Kết quả kiểm tra LCD và di động của trực khuẩn gram âm đợt 6