XÁC ĐỊNH LIỀU LD50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI Streptococcus agalactiae KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG βGLUCAN

Đối với thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng sinh : Pn, Am, Ty, nhạy với các loại kháng sinh : Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx, Rf,Cx, Nr, Sp và ít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH LIỀU LD50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI Streptococcus agalactiae KHI SỬ

DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG β-GLUCAN

Ngành: Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên ngành: Ngư Y

Niên khóa: 2004-2008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TÙNG CHI NGUYỄN THỊ KIỀU TUYÊN

XÁC ĐỊNH LIỀU LD50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ

RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI Streptococcus agalactiae KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN

CÓ BỔ SUNG β-GLUCAN

Tác giả

NGUYỄN TÙNG CHI NGUYỄN THỊ KIỀU TUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Nuôi Trồng Thuỷ Sản

Giáo viên hướng dẫn TRẦN NGỌC THIÊN KIM

Tháng 9 năm 2008

CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt quá trình học tập

Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt

những kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập

Chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh, Cô Trần Ngọc Thiên Kim đã hướng dẫn chúng tôi hoàn thành tốt Luận văn này với tất cả trách nhiệm và lòng nhiệt thành

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 30 đã luôn ở bên chúng tôi, chia sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua

Chúng tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy

cô và các bạn

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định liều LD50 và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối

với Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β-glucan” Nội dung bao

Thử nghiệm kháng sinh đồ trên Streptococcus agalactiae với 15 loại kháng

sinh ampicilin, penicillin, ceftriaxone, cefaclor, gentamycin, kanamycin, spectinomycin, erythromycin, tylosin, tetracyclin, doxycyclin, oxytetracyclin, norfloxacin, nitrofurantoin, rifampin

Chọn ra các kháng sinh có kết quả nhạy với vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở thí nghiệm trên để tìm ra nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi thu được kết quả sau:

LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae đối với cá rô phi đỏ là 7,3 x

104cfu/mL (phương pháp tiêm)

Về thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ, β-glucan đã cho kết quả tốt trong việc đáp ứng miễn dịch trên cá trong thời gian nuôi 14 ngày Do đó

có thể sử dụng để tăng khả năng miễn dịch của cá trong phòng và trị bệnh

Đối với thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với

các loại kháng sinh : Pn, Am, Ty, nhạy với các loại kháng sinh : Cr, Ge, Kn, Te, Ox,

Dx, Rf,Cx, Nr, Sp và ít nhạy với kháng sinh: Er và Fr

Về thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh dao động từ 0,512µg/mL đến 8,192µg/mL tùy loại kháng sinh Kết quả này cũng phù hợp với thực

tế sử dụng thuốc của người dân trong việc điều trị bệnh cá rô phi đỏ do Streptococcus agalactiae gây ra

MỤC LỤC

Trang Trang tựa

Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt v

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 6

2.1.6 Đặc điểm sinh sản 6

2.2 Dinh Dưỡng của Đối Tượng Nghiên Cứu 7

2.2.2 Tính ăn 7

2.3 Liên Cầu Khuẩn Streptococcus sp 7

2.3.1 Đặc điểm phân loại 7

2.5.2 Miễn dịch thu được 11

2.6 Giới Thiệu về β-glucan và Nấm Men Saccharomyces cerevisiae 12

2.6.3 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 12

2.6.4 Ứng dụng 13

2.6.5.2 Cơ chế tác động của β-glucan 15

2.7 Kháng Sinh và Cơ Chế Tác Động 16

2.7.1 Khái niệm kháng sinh 16

2.7.2.1Theo khả năng diệt khuẩn 17

2.7.2.2Theo cấu tạo hoá học 18

2.7.3 Cơ chế tác động 19

2.7.3.1 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn 19

2.7.3.5 Tác động lên sự tổng hợp acid nucleic 21

2.7.4 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong thủy sản

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Nghiên Cứu 24

3.2 Vật Liệu, Trang Thiết Bị và Hoá Chất 25

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm 25

3.2.4 Hóa chất và môi trường

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 26

3.3.1Phương pháp bố trí thí nghiệm 27

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch

3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn

Streptococcus agalactiae 32

3.3.1.4 Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu(MIC)

trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae của một số loại kháng sinh 35

3.3.2 Một số phương pháp khác được sử dụng trong thí nghiệm 38

3.3.2.1 Phương pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích 38

3.3.2.2 Phương pháp phân lập định danh sơ bộ và giữ giống vi khuẩn

có trong mẫu bệnh phẩm 40

3.4 Phương Pháp Phân Tích và Xử Lý Số Liệu 41

3.4.1.1 Xác định LD50 của Reed và Muench (1938) 41

3.4.1.2 Xác định LD50 theo phương trình hồi quy 42

3.4.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch

của cá rô phi đỏ 42 3.4.3 Phương pháp xác định kháng sinh đồ 42

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Một Số Chỉ Tiêu Chất Lượng Nước Trong Quá Trình Thí Nghiệm 44

4.3.3 Tỷ lệ cá chết, dấu hiệu bệnh lý và kết quả tái phân lập 48

4.3.3.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả tái phân lập 49

4.4 Thí Nghiệm 2: Khảo Sát Ảnh Hưởng của β-glucan lên

4.4.1 Tăng trọng của cá thí nghiệm 54

4.5 Thí Nghiệm 3: Thử Nghiệm Kháng Sinh Đồ 58

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết Luận 69

5.2 Đề nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 73

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 2.1 Hình thái ngoài cá rô phi đỏ 3

Hình 2.2 Một số hình ảnh của vi khuẩn Streptococcus sp 8

Hình 2.3 Khả năng dung huyết của Stretococcus sp 8

Hình 2.4 Một số hình ảnh về tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 14

Hình 2.5 Công thức cấu tạo của β1,3–1,6 glucan 14

Hình 2.6 Sự gắn của β 1,3-1,6 glucan lên thụ thể bề mặt đại thực bào

Hình 2.7 Đại thực bào được hoạt hoá sau khi gắn β 1,3-1,6 glucan

(Engstad và Robertsen, 1993; 1994)Kháng Sinh và Cơ Chế Tác Động 17

Hình 2.8 Các thao tác làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby Bauer 23

Hình 3.1 Hệ thống bể thí nghiệm 25 Hình 3.2 Hệ thống bể bố trí thí nghiệm xác định LD50 27

Hình 3.3 Gây bệnh cho cá bằng phương pháp tiêm 29

Hình 3.4 Gây bệnh cho cá bằng phương pháp ngâm 30

Hình 3.8 Thao tác tráng vi khuẩn lên môi trường thạch 33

Hình 3.9 Các đĩa giấy tẩm kháng sinh của công ty Nam Khoa 33

Hình 3.12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định MIC 37

Hình 3.13 Thao tác trong thí nghiệm xác định MIC 37

Hình 3.14 Đường cắt giải phẫu xoang cơ thể cá 39

Hình 4.1 Hình thái ngoài của vi khuẩn 45

Hình 4.2 Bên ngoài và nội quan cá khoẻ 48

Hình 4.3 Cá thí nghiệm bị mù mắt và trương bụng sau 4 ngày gây bệnh 48

Hình 4.4 Cá có biểu hiện gan nhạt màu, lách sưng, thận sưng sau gây bệnh 49

Hình 4.5 Cá bị xuất huyết toàn thân sau 5 ngày gây bệnh nghiệm thức TI.1 55

Hình 4.6 Cá có biểu hiện bệnh tích gan nhạt màu sau khi gây cảm nhiễm 55

Hình 4.7 Vi khuẩn phân lập từ cá bệnh cấy thuần trên đĩa thạch

Hình 4.8 Vòng kháng khuẩn của các kháng sinh 61

Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của kháng sinh Rf, Ty 61

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản vách tế bào Saccharomyces cerevisiae 13

Bảng 2.2 Phân loại kháng sinh theo cấu tạo hoá học 18

Bảng 3.1 Liều vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức trong

Bảng 3.2 Sơ đồ hóa quá trình pha loãng vi khuẩn 28

Bảng 3.3 Khẩu phần thức ăn ở các nghiệm thức 30

Bảng 3.4 Sơ đồ hóa quá trình pha loãng kháng sinh 36

Bảng 4.1 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh lý 46

Bảng 4.2 Kết quả tỷ lệ cá chết và kết quả tái phân lập 49

Bảng 4.3 Kết quả LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae 51

Bảng 4.4 Quy đổi số liệu cho phương trình hồi quy 52

Bảng 4.5 Tăng trọng của cá thí nghiệm 54

Bảng 4.6 Kết quả cá chết và tái phân lập giữa các nghiệm thức

Bảng 4.7 Tỷ lệ cá chết giữa các nghiệm thức có và không có bổ sung

β-glucan trong thức ăn 57 Bảng 4.8 Tỷ lệ cá chết giữa các nghiệm thức cho ăn thức ăn

Bảng 4.9 Các chuẩn mực biện luận đường kính vòng vô khuẩn chuẩn

của nhóm cầu khuẩn 59 Bảng 4.10 Đường kính vòng vô khuẩn chuẩn trung bình 60

Bảng 4.11 Kết quả thử nghiệm xác định MIC của một số

kháng sinh trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae 62

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

TrangBiểu đồ 4.1 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh lý giữa các

Biểu đồ 4.2 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh lý giữa các

Biểu đồ 4.3 Số lượng cá chết theo ngày trong thí nghiệm gây cảm

Biểu đồ 4.4 Số lượng cá chết theo ngày trong thí nghiệm gây cảm

Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức của phương pháp tiêm 50

Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức của phương pháp ngâm 50

Biểu đồ 4.7 Phương trình hồi quy kết quả LD50 sau 14 ngày thí nghiệm 53 Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ cá chết giữa các nghiệm thức gây bệnh 57

Chương 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt Vấn Đề

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển

và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành thủy sản nói riêng và kinh tế đất nước nói chung, với kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2005 là 2,7 tỷ USD, năm 2006

là 3,36 tỷ USD và năm 2007 là 3,75 tỷ USD Trong đó, nghề nuôi thủy sản nước ngọt

mà cá rô phi đặc biệt là rô phi đỏ đã được Bộ Thủy Sản xác định là một trong những đối tượng nuôi quan trọng trong chương trình phát triển nuôi trồng thủy sản giai đoạn

1999 - 2010

Việt Nam là nước trong khu vực Đông Nam Á, có khí hậu ấm áp và có đủ điều kiện để sản xuất cá rô phi hướng tới xuất khẩu Tuy nhiên, do việc mở rộng khu vực nuôi không theo quy hoạch cùng với việc nuôi với mật độ cao làm cho nghề nuôi bị thiệt hại nhiều do dịch bệnh Tác nhân gây bệnh trên cá rô phi nói chung và rô phi đỏ nói riêng thường là vi khuẩn, virus, hoặc protozoa trong đó đáng chú ý nhất là bệnh do

vi khuẩn Streptococcus sp

Do đó việc tìm hiểu ảnh hưởng của bệnh gây ra bởi Streptococcus sp trên cá

rô phi đỏ nuôi đồng thời cải thiện sức khoẻ cá nuôi để cá có sức đề kháng tự nhiên tốt với dịch bệnh mà không cần sử dụng kháng sinh đang là một nhu cầu cấp thiết

Trước nhu cầu thực tiễn đó, được sự phân công của Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Xác định liều LD50 và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với

Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β-glucan”

- Thử nghiệm kháng sinh đồ trên Streptococcus agalactiae

- Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory

Concentration) trên Streptococcus agalactiae

Loài: Oreochromis spp (Trewavas, 1982)

Tên tiếng Anh: Red Tilapia

Tên Việt Nam: cá rô phi đỏ, cá điêu hồng

Hình 2.1: Hình thái ngoài cá rô phi đỏ

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Nguồn gốc cá rô phi đỏ là do đột biến gen, có 3 dòng nguyên gốc đều được mang tên Oreochromis (Popma và Masser, 1999; trích bởi Lê Thị Minh Nguyệt, 2004)

Dòng cá rô phi đỏ đầu tiên được sản xuất ở Đài Loan vào cuối những năm 1960

giữa cá cái Oreochromis mossambicus và cá đực Oreochromis niloticus được gọi là cá

rô phi đỏ Đài Loan

Dòng thứ 2 được phát triển ở Florida vào những năm 1970 lai tạo giữa cá cái

Oreochromis zanzibar và cá đực Oreochromis mossambicus màu đỏ vàng

Dòng thứ 3 được phát triển ở Israel do lai tạo giữa Oreochromis niloticus và cá

rô phi Oreochromis spp

Việc nhận dạng các cá thể trở nên phức tạp do việc lai tạp các loài tìm thấy trong tự nhiên

Cá rô phi đỏ lần đầu tiên được nhập vào nước ta năm 1975 từ Malaysia

Năm 1992, một công ty Đài Loan nhập cá rô phi đỏ vào Việt Nam để nuôi thử nghiệm ở Bình Dương Sau đó cá được đưa tới các nhà hàng ở thành phố Hồ Chí Minh với tên gọi khá hấp dẫn là cá điêu hồng

Hiện nay cá điêu hồng được nuôi phổ biến ở nước ta đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long

2.1.4 Đặc điểm sinh thái

Nhìn chung các loài cá rô phi ở nước ta có các đặc điểm sinh thái gần giống nhau Ngoài các đặc điểm cơ bản, cá rô phi đỏ còn có các đặc điểm nổi bật:

2.1.4.3 Ôxy hòa tan (DO)

Cá có thể sống được ở môi trường thiếu ôxy có hàm lượng chất hữu cơ cao trong nhiều giờ Có thể chịu được ngưỡng ôxy thấp tới 0,4 mg/L (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2005)

Theo Popma và Masser (1999), cá có thể sống được nước có lượng DO thấp hơn 0,1 mg/L, tuy nhiên các ao nuôi nên được quản lý và duy trì lượng DO khoảng 1mg/L Nếu để thấp hơn mức này lâu, sức đề kháng bệnh của cá sẽ giảm và chậm lớn, ngoài ra sự tăng trưởng cũng không được cải thiện hơn nếu lượng DO cao từ 2 - 2,5 mg/L

2.1.4.5 Amonia (NH 3 – N) và nitrite (NO 2 – N)

Amonia rất độc cho cá, nhưng một số nghiên cứu cho thấy cá rô phi có thể chịu

hàm lượng amonia bằng 0,2 mg/L Hàm lượng amonia bắt đầu gây bỏ ăn ở cá rô phi là 0,8 mg/L

Nitrite là chất độc với nhiều loài cá, chất này kết hợp với hemoglobin làm cản trở quá trình vận chuyển oxygen gây hiện tượng máu nâu Cá rô phi có khả năng chịu đựng tốt hơn các loài cá nước ngọt khác với nitrite (Popma và Masser, 1999)

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Do tính ăn tạp và khả năng bắt mồi lớn nên cá rô phi đỏ có tốc độ tăng trưởng nhanh trong điều kiện nuôi bình thường

Cá đực lớn nhanh hơn cá cái 2 - 5 lần Cá có thể đạt 120 - 200 g/con trong 4 tháng nuôi lồng (Balarin và Haller, 1982), đạt trọng lượng trên 500 g/con sau 5 - 6 tháng nuôi

Cá cái giữ cá con trong miệng đến khi cá bột tiêu hết noãn hoàng và tự kiếm được thức ăn bên ngoài Sau 4 - 5 ngày cá con tách khỏi mẹ, cá mẹ lại chuẩn bị cho chu kỳ sinh sản mới

Thời gian giữa hai lứa đẻ tùy thuộc vào tuổi cá, nhiệt độ, loại thức ăn… trung bình cá đẻ từ 1000 - 2000 trứng, cá cỡ lớn có thể đẻ số lượng trứng nhiều hơn

2.2 Dinh Dưỡng của Đối Tượng Nghiên Cứu

2.2.1 Cấu tạo cơ quan tiêu hóa

Cơ quan tiêu hóa cá rô phi gồm: miệng, hàm trên và hàm dưới có nhiều răng, hàm nhỏ, ngắn, sắp xếp thành hàng rõ rệt có tác dụng bắt mồi và làm tổ trong sinh sản, răng hầu có 2 tấm trên và 1 tấm dưới có tác dụng nghiền thức ăn, lược mang ngắn có khoảng 26 - 30 cái, thực quản ngắn, dạ dày dạng túi nhỏ và thành mỏng, ruột dài và xoắn thành nhiều vòng Ở cá rô phi tuyến mật rất phát triển, thuận lợi cho việc tiêu hóa thức ăn

2.2.2 Tính ăn

Tất cả các loài cá rô phi đều có tính ăn tạp Khi còn nhỏ cá ăn sinh vật phù du là chủ yếu, khi cá được 17 – 18 mm trở đi (sau khi nở 20 ngày) sẽ chuyển dần sang ăn nhiều loại thức ăn khác nhau như cá trưởng thành

Cá trưởng thành thức ăn là mùn bả hữu cơ lẫn tảo lắng ở đáy, ấu trùng côn trùng, giun và một phần thực vật thượng đẳng loại mềm, sinh vật phù du có khi ăn cả sinh vật bơi lội Trong điều kiện nuôi chúng còn có thể ăn thức ăn bổ sung như cám gạo, bột ngô, bánh dầu khô và các phế phẩm khác, đặc biệt chung có thể ăn cả thức ăn viên, đây là đặc điểm thuận lợi cho nghề nuôi cá

2.3 Liên Cầu Khuẩn Streptococcus sp

2.3.1 Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn Gram dương có dạng hình cầu, đứng riêng lẻ, thành từng đôi hay tạo thành chuỗi dài nên được gọi là liên cầu khuẩn, là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy

nghi, không di động, oxidase (-), catalase (-), không sinh bào tử Streptococcus iniae

lên men đường glucose (+), maltose (+), lactose (-)

Vi khuẩn có khả năng dung huyết, trên môi trường thạch máu tạo khuẩn lạc có vòng dung huyết β nhỏ, trong suốt, rìa không rõ

Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện pH 9,6; NaCl 6,5%; nhiệt độ 10 – 40oC (Nguyen và Kanai, 1999)

Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 25 – 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, hình tròn hơi lồi, một số chủng tạo khuẩn lạc trong suốt

có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy

Hình 2.2 : Một số hình ảnh về Streptococcus sp.dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn http://www.healthprotectionsystems.com/strep.html)

Hình 2.3: Khả năng dung huyết của Stretococcus sp

(Nguồn http://www.healthprotectionsystems.com/strep.html)

2.3.2 Triệu chứng bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus sp

Bệnh thường xảy ra trên cá cỡ lớn, tỷ lệ cá chết rất cao ở những khoảng thời gian nhiệt độ nước cao trong năm tập trung vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu

Ở những thời điểm khác trong năm cá chết rải rác Khi nhiệt độ nước xuống thấp vào những tháng mùa đông ở các nước ôn đới không thấy xuất hiện bệnh

Cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài với những biểu hiện bất thường như: cá lờ đờ, bơi xoay vòng mất định hướng (do vi khuẩn tấn công lên não), cơ thể cong gấp khúc (vi khuẩn xâm nhập tủy sống), giác mạc mờ đục, lồi 1 hay

cả 2 mắt, cá giảm ăn hay không ăn

Bệnh tích bên ngoài: bụng trướng to do tích dịch xoang bụng Có ổ mủ ở hàm dưới, gốc vây,ổ mủ vỡ ra thành loét Xuất huyết điểm ở gốc vây và quanh hậu môn

Bệnh tích bên trong: bóng khí phình to do dạ dày và ruột trống, do nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn theo máu gây nhiễm khắp nội quan, gan nhạt màu, thận và lách sưng

to, viêm phúc mạc nên viêm dính nội quan với nhau và viêm dính thành bụng, có hiện tượng xuất huyết não (Nguyễn Hữu Thịnh, 2006)

vi khuẩn xâm nhập qua niêm mạc (khứu giác)

Bệnh truyền từ cá thể này sang cá thể khác, từ cá chết sang cá hấp hối và cá khoẻ, có thể ở thể cấp tính tỷ lệ chết cao trên 50% trong 2 – 3 tuần Bệnh bộc phát vài lần sau đó trở nên mãn tính cá chết kéo dài trong nhiều tuần, mỗi ngày chết vài con Cá lớn hay mắc bệnh hơn cá giống

2.3.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh

Tại ao nuôi trước hết dựa vào dấu hiệu bệnh lý, tiến hành phết kính mẫu não, lách, thận, gan, nhuộm Gram rồi quan sát dưới kính hiển vi

Ở phòng thí nghiệm phân lập vi khuẩn bằng một số môi trường cơ bản, sử dụng

bộ test kit API20 để định danh vi khuẩn, sử dụng kỹ thuật PCR

Môi trường tăng sinh: Streptococcus sp sinh trưởng tốt trên môi trường TSA

(Tryptic Soy Agar) có thêm 0,5% glucose

Môi trường phân lập: sử dụng môi trường thạch máu kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn, môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar), THBA (Todd Hewitt Broth Agar), môi trường thạch máu ngựa (Horse Blood Agar) Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 20 – 30oC sẽ hình thành khuẩn lạc nhỏ đường kính 0,5 – 1 mm, màu hơi vàng, hình tròn hơi lồi ( Bùi Quang Tề, 2004)

2.3.5 Phương pháp phòng và trị bệnh

Áp dụng phương pháp phòng bệnh chung, giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn thừa, thường xuyên vệ sinh bể nuôi Giảm cho ăn và hạn chế đến mức tối đa các hoạt động chia đàn, phân cỡ chuyển đàn trong thời gian mà dịch bệnh thường xảy ra, vớt cá bệnh,

cá chết ra khỏi ao tránh lây lan bệnh…

Sử dụng các loại kháng sinh phổ rộng hay kháng sinh diệt khuẩn G+ như erythromycin, oxytetracyclin, doxycyclin …để trị bệnh Dùng phương pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như dùng erythromycin, ciprofloxacin, enrofloxacin liều 25 – 50 mg/L/kg cá/ngày sử dụng liên tục trong 4 – 7 ngày

Loại thuốc có độ độc mạnh khi LD50 = 100 mg/kg thể trọng

Loại thuốc có độ độc trung bình khi LD50 từ 100 đến 300 mg/kg thể trọng Loại thuốc ít độc khi có LD50 trên 300 mg/kg thể trọng

LC50 là kí hiệu nồng độ gây chết một nữa

2.5 Phân Loại Hệ Thống Miễn Dịch

Hệ thống miễn dịch trong cơ thể sinh vật được chia thành 2 nhóm là miễn dịch

tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu)

2.5.1 Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu )

Miễn dịch tự nhiên được quy định bởi đặc tính của giống, loài sinh vật Loại miễn dịch này đã có từ khi mới được sinh ra và nó được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác

Những yếu tố cấu thành miễn dịch tự nhiên gồm: các yếu tố cơ học ở biểu mô, surfactans, lactoferrin, lysozyme, tallow, acid được tiết ra trong dạ dày, transferrin, bổ thể, C.reactive protein, interferon, các tế bào thực bào,…

2.5.2 Miễn dịch thu được ( miễn dịch đặc hiệu )

Miễn dịch thu được hay còn được gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch

mà cơ thể tiếp thu được trong quá trình sống Miễn dịch thu được chia làm 2 loại là miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động

Miễn dịch chủ động

Là loại miễn dịch mà tự bản thân cơ thể sinh vật tạo ra khi tiếp xúc với kháng nguyên Nếu sự miễn dịch chủ động mà trong đó có sự tham gia của con người như trường hợp chủng ngừa vaccine để phòng bệnh, được gọi là miễn dịch chủ động nhân tạo Miễn dịch chủ động do cơ thể tiếp thu tự nhiên trong môi trường sống được gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên Trường hợp này xảy ra khi sinh vật qua khỏi sau đợt dịch bệnh, có khả năng không mắc lại bệnh đó khi bị tái nhiễm

Miễn dịch thụ động

Miễn dịch thụ động là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài còn miễn dịch thụ động có được do con người tạo ra như trường hợp tiêm huyết thanh để phòng

và trị bệnh, được gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo

Trong hệ thống miễn dịch tự nhiên cũng như miễn dịch thu được đều có cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào

2.6 Giới Thiệu về β-glucan và Nấm Men Saccharomyces cerevisiae

2.6.1 Phân loại nấm men

Loài: Saccharomyces cerevisiae thuộc

Ngành: Emycophyta Lớp: Ascomycetes

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa nhiều đường, có pH thấp chẳng hạn như trong rau quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả và trong loại đất nhiễm dầu mỏ

2.6.3 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae chiếm 15 - 30% vật chất khô

với đa phần là β 1,3-glucan, β 1,6-glucan, mannoprotein và kitin β 1,6-glucan giữ vai trò trọng tâm trong tổ chức vách tế bào, nó liên kết với β 1,3-glucan mannoprotein va kitin(Kollar và ctv, 1997 trích dẫn Hồ Thị Nga, 2007) Những thành phần này đã tạo nên một mắc xích với hình dáng đại phân tử phức tạp Trong thực tế, vì thành phần vách tế bào chỉ chiếm 10 - 20% thể tích vách, nó có thể so sánh như một lưới rào hơn

là một cấu trúc đặc (Lipke and Ovalle, 1998)

Bảng 2.1: Thành phần cơ bản vách tế bào Saccharomyces cerevisiae

(Lipke và Ovalle, 1998)

Loài Saccharomyces cerevisiae hiện đang được sử dụng như một công cụ đắc

lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho sản xuất các sản phẩm thế hệ của kỹ thuật di truyền (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2002)

2.6.4 Ứng dụng

Có rất nhiều loại nấm men được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất như: công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi và cao nấm men, lipid nấm men, các enzym như: amylase, invertase, lactase, uricase, polygalacturonase, sản xuất esgostrol, axit ribonucleic, riboflavin, các axit amin như: lysine, cistein, methionin…

Loài Saccharomyces cerevisiae hiện đang được sử dụng như một công cụ đắc

lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ của kỹ thuật di truyền (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2002)

Hình 2.4: Một số hình ảnh về tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Nguồn http://www.diwinetaste.com/dwt/en2007016.php)

2.6.5 Giới thiệu về β-glucan

2.6.5.1 Nguồn gốc của β-glucan

β-glucan là một đường đa phân tử, được sử dụng như một chất kích thích miễn dịch

Hợp chất đường đa này có nhiều trong các loại cây, nấm và vi sinh vật, nguồn

nhiều nhất là trong vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae), và

còn hiện diện với số lượng ít hơn trong lúa mạch yến mạch,…

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của β-1,3/1,6 glucan

(Nguồn http://www.bizpons.com/en/products/food/glucan/glucan1.htm)

2.6.5.2 Cơ chế tác động của β-glucan

Theo Nguyễn Như Pho (2004), phần β-glucan hấp thu trực tiếp qua ruột vào máu kết hợp với protein trong máu, tạo thành phức hợp có tính kháng nguyên

β-glucan kích thích tế bào đại thực bàotiết các men thực bào, diệt các vi khuẩn gây bệnh xâm nhập Nhờ đó β-glucan được coi như chất tăng cường miễn dịch

Phần β-glucan không hấp thu ở lại trong ruột có tác dụng cạnh tranh vị trí bám của vi khuẩn gây bệnh đường ruột, giúp phòng ngừa bệnh nhiễm trùng ruột

2.6.5.3 Vai trò của β-glucan trong đáp ứng miễn dịch

Tại châu Âu trong suốt những thập niên 40, một loại men thô ly trích từ vách tế

bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là zymosan có khả năng kích thích

và điều khiển hệ thống miễn dịch không đặc hiệu, bất kể nguồn bệnh xâm nhập (Fitzpatrik và Dicarlo, 1964)

Hoạt động dược động học của β-glucan là tăng cường sức đề kháng của vật chủ đối với sự xâm nhập của virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng,… β-glucan có khả năng ngăn cản chất phóng xạ gây ung thư và hiệu quả như chất bổ trợ (Diluzio, 1983; Bohn

và Bemiller, 1995 trích dẫn Nguyễn Văn Tươi, 2006)

β-glucan làm tăng đáp ứng miễn dịch thông qua việc kích thích tăng số lượng, kích thước và chức năng của đại thực bào, kích thích sự tiết lysozyme và TNF (tumor necrosis factor) của đại thực bào, tăng sự thực bào, tăng hoạt tính của tế bào lympho T

và B Thêm vào những tác động này, β-glucan là một chất chống oxy hoá hiệu quả và loại thải những chất cặn bã trong cơ thể β-glucan an toàn và có thể làm giảm cholesterol trong máu (Meira va ctv, 1996 trích dẫn Hồ thị Nga, 2007)

β-glucan được tìm thấy trong một số loài chân khớp Năm 1988, Soderhall và cộng sự đã xác định sự hiện diện của β-1,3 glucan (βGBP) có trọng lượng phân tử 90 kDal từ tế bào chất của gián, β-1,3 glucan của tôm nước ngọt (pacifastacus) Khi trộn vào thức ăn chúng có thể ngăn bệnh vibriosis, bệnh yersinosis và viêm khớp ở giáp xác Một số bệnh trên tôm như đốm trắng, taura gây chết 80%, khi tôm nuôi được ăn thức ăn có trộn β-1,3 glucan thì tỷ lệ sống đạt trên 90%

Hình 2.6: Sự gắn của β - 1,3/1,6 glucan lên thụ thể bề mặt đại thực bào

2.7.1 Khái niệm kháng sinh

Theo Nguyễn Như Pho (2004), kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết vi trùng trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể vì vậy kháng sinh thường dùng để điều trị trên cơ thể đã bị nhiễm trùng

Theo Hồ Huỳnh Quang Trí và Nguyễn Thị Thanh (1995): “Kháng sinh là những chất có nguồn gốc sinh học do các loài vi khuẩn và nấm sinh ra, hoặc tổng hợp Kháng sinh tác động một cách chuyên biệt, trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng ở các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), hay của các nấm (tác nhân kháng nấm)”

Theo Nguyễn Khắc Tuấn (1996): “Chất kháng sinh là chất đặc hiệu do vi sinh vật sinh ra trong quá trình sống mà ngay ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật một cách chọn lọc”

2.7.2 Phân loại kháng sinh

Theo Nguyễn Như Pho (2004) :

2.7.2.1 Theo khả năng diệt khuẩn

Kháng sinh tĩnh khuẩn: nhóm tetracyclines, nhóm macrolides, phenicol

Nhóm kháng sinh này làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn

Bạch cầu và đại thực bào diệt khuẩn giúp cơ thể có điều kiện tham gia chống bệnh sau khi ngưng kháng sinh

Nhóm này thích hợp với các bệnh có diễn biến chậm, các trường hợp phòng bệnh

Kháng sinh sát khuẩn: nhóm quinolones, aminosides, polypeptides, betalactam, sulfamid + trimethoprim

Nhóm kháng sinh này có tác dụng diệt vi khuẩn, thích hợp trong các bệnh nhiễm trùng cấp tính

Do cơ thể không tham gia chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng kháng sinh

2.7.2.2 Theo cấu tạo hoá học

Bảng 2.2: Phân loại kháng sinh theo cấu tạo hoá học

2.7.3 Cơ chế tác động

2.7.3.1 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn

Thành tế bào vi khuẩn có cấu tạo từ chất peptidoglycan gồm nhiều dây thẳng dọc và những đoạn ngang pentapeptid Peptidoglycan gồm nhiều phần tử đường mang amin: N-acetyl-glucosamine và N-acetyl-muramic (chỉ có ở vi khuẩn)

Tiến trình hình thành peptidoglycan bắt đầu bằng sự chuyển đổi L-alanin thành D-alanin Sau đó 2D-alanin kết hợp với nhau

Tiếp đến 2D-alanin nối với 3 acid amin khác và 1 đường N-acetyl muramic acid

để tạo thành pentapeptid

Pentapeptid kết hợp với isoprenyl phosphate rồi di chuyển từ tế bào chất ra ngoài màng tế bào Tại đây chúng kết hợp với nhau để kéo dài thành chuỗi peptidoglycan

Bacitracin gắn với isoprenyl phosphate tạo phức hợp

Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptid từ bên trong tế bào ra ngoài màng tế bào

Giai đoạn cuối là hình thành dây ngang giữa các dây peptidoglycan bằng cách nối D-alanin của một chuổi với diaminopimelic acid của chuỗi kế cận nhờ enzyme transpeptidase

B-lactamin ức chế giai đọan này do cấu trúc của nó giống D-alanin (1 vị trí trên peptidoglycan mà emzym gắn vào)

2.7.3.2 Tác động lên màng bào tương

Màng bào tương có nhiệm vụ bao bọc và ngăn cách dịch tương bào với vỏ tế bào Có tính thấm chọn lọc điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài

Kháng sinh thuộc nhóm polypeptid (colistin, polymycin) và polyens (chất kháng nấm) gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt và xáo trộn chức năng thẩm thấu khiến các chất trong bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài (tác động như một chất tẩy loại cation)

2.7.3.4 Tác động lên sự chuyển hóa

Sulfamides đối kháng cạnh tranh với PABA (p-aminobenzoic acid) một tiền

chất để tổng hợp dihydrofolat do có cấu trúc tương đổng

Trimethoprim ức chế dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolat thành tetrahydrofolat, chất này sẽ kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic acid để tạo thành pteroyglutamic acid (PGA)

PGA giống như một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin Là 2 baze hữu

cơ chứa nitơ, một thành phần của acid nhân

2.7.3.5 Tác động lên sự tổng hợp acid nucleic

Rifampin: ức chế men RNA polymerase

Nhóm quinolon: ức chế men DNA gyrase cần thiết cho sự nhân đôi phân tử DNA, ở liều cao còn ức chế RNA polymerase làm ức chế tổng hợp ARN thông tin

Nhóm Nitrofuran: bám vào các baze của DNA làm đứt đoạn chuỗi xoắn đôi DNA

2.7.4 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong thủy sản

Lựa chọn kháng sinh đúng với vi khuẩn gây bệnh, kháng sinh được dùng phải nhạy cảm với vi khuẩn gây bệnh

Lựa chọn kháng sinh theo vị trí nhiễm trùng

Dùng kháng sinh đúng liều quy định, theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Dùng kháng sinh đúng liệu trình

Tránh phối hợp các kháng sinh tương kỵ

Chấm dứt dùng kháng sinh 14 ngày trước khi thu tôm cá thương phẩm, để giảm lượng kháng sinh tồn đọng trong cơ thể vật nuôi, chỉ nên dùng kháng sinh khi thật sự cần thiết

2.8 Thử Nghiệm Kháng Sinh Đồ

2.8.1 Định nghĩa

Kháng sinh đồ là kỹ thuật nhằm tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh, hay xác định lượng tối thiểu của kháng sinh ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn

2.8.2 Nguyên lý

Các chủng vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức

độ khác nhau, chúng biểu hiện sự khác nhau ở đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh có chứa một nồng độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn và kháng sinh

2.8.3 Phương pháp

Có 2 phương pháp làm kháng sinh đồ

Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán kháng sinh (theo

Kirby Bauer): là phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ bằng đĩa giấy có tẩm kháng

sinh với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán trong thạch và ta sẽ xác định được vi khuẩn

nhạy cảm hay đối kháng với kháng sinh Phương pháp này chỉ có tính định tính

Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp: là phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh một cách chính xác dựa trên sự liên quan giữa độ pha loãng của kháng sinh ở các nồng độ khác nhau đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn

2.8.4 Môi trường cơ bản để thực hiện kháng sinh đồ

Thạch Mueller-Hinton (MH) là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh

đồ, các vi khuẩn dễ mọc là do các lý do sau :

Cho kết quả có tính lập lại cao khi thử nghiệm kháng sinh đồ đối với các loại môi trường

Ít ức chế với sufamides, trimethoprime và tetracycline

Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc

Một số lượng lớn các dữ liệu và kinh nghiệm là có từ kháng sinh đồ thực hiện trên môi trường này

Thử nghiệm kháng sinh đồ thường được thực hiện khi tác nhân gây bệnh (vi khuẩn) được coi là các loài có khả năng đề kháng được với các kháng sinh thông dụng

Ngoài ra nó còn được ứng dụng trong nghiên cứu dịch tể học kháng thuốc, nghiên cứu các kháng sinh mới

Tìm hiểu tính kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh giúp cho lâm sàng phương

hướng điều trị đúng và những kháng sinh đặc hiệu

Hình 2.8: Các thao tác làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby Bauer (Phạm Hùng

Vân, 2004)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Nghiên Cứu

Đề tài đã được thực hiện từ ngày 27/05/2008 đến ngày 27/08/2008 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu, Trang Thiết Bị và Hoá Chất

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng dùng trong thí nghiệm là cá rô phi đỏ cỡ cá 10 – 15 g/con Cá giống được chuyển về từ trại cá giống Tân Vạn (Biên Hoà- Đồng Nai) Cá sau khi mang về chọn những con có chất lượng tốt, kích cỡ đồng đều để bố trí vào các bể kính thí nghiệm

Vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm là vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân

lập từkhu vực nuôi cá rô phi ở Quận 9 Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm

Sử dụng hệ thống bể kính, mỗi bể có kích thước 0,4x0,3x0,3 m

Thí nghiệm 1: Xác định LD50 của cá rô phi đỏ được tiến hành trong 30 bể kính với mật độ 20con/bể

Thí nghiệm 2: Xác định khả năng miễn dịch của cá rô phi đỏ khi sử dụng thức

ăn có bổ sung β-glucan được tiến hành trong 24 bể kính với mật độ 20con/bể

Các bể được vệ sinh và sát trùng sạch sẽ sau đó cấp nước vào từng bể rồi mới chuyển cá vào thí nghiệm Hệ thống sục khí được sử dụng liên tục trong suốt quá trình thí nghiệm

3.2.4 Hóa chất và môi trường

Môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản giống vi khuẩn: môi trường NA (Nutrient Agar), MHA (Muller Hinton Agar), NB (Nutrient Broth) Hóa chất: cồn 70º,cồn 90o, thuốc mê MS222, crystal violet, lugol, fuchsin,

3.3 Phương Pháp Tiến Hành Thí Nghiệm

hưởng β-glucan lên đáp ứng

miễn dịch cá rô phi đỏ

Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ

Thí nghiệm 4: Thử nghiệm MIC