BIẾN nạp GEN ở mô sẹo mía (saccharum officinarum l ) BẰNG VI KHUẨN agrobacterium tumefaciens và tái SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN

Công nghệ sinh học thực vật trong TK XXI: -Chọn giống và nhân giống cây trồng là ngành khoa học xuất hiện từ rất lâu đời, từ khi con người biết trồng trọt.. -Ngày nay cùng với những tiế

BIẾN NẠP GEN Ở MÔ SẸO MÍA (Saccharum officinarum L.) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN

Các nội dung chính

1 CNSHTV VÀ CÔNG NGHIỆP

1.1 Công nghệ sinh học thực vật trong TK XXI:

-Chọn giống và nhân giống cây trồng là ngành khoa học xuất hiện từ rất lâu đời, từ khi con người biết trồng trọt

-Ngày nay cùng với những tiến bộ của công nghệ gene, công nghệ tế bào, những thiết bị hiện đại, khoa học nhân giống và chọn giống đã phát triển vượt bậc, tiến lên một vị thế mới đó là khoa học công nghệ sinh học về thực vật

-Công nghệ sinh học thực vật đã có những bước chuyển biến quan trọng trong nhiều lĩnh vực và thành tựu vượt xa mong đợi, mang lại nhiều hứa hẹn

1.2 Quang cảnh của nền công nghiệp:

Trên Thế giới: đang có sự biến động sâu sắc về nhiều mặt và đặt ra những thách

thức mới đối với nền kinh tế của các quốc gia

Tại Việt Nam:

NGA

NHẬT BẢNĐỨC

CÁC NƯỚC KÉM PHÁT

TRIỂN

2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng: Cây mía – Saccharum officinarum L.

- Nguồn gốc: Xuất hiện từ lâu trên Trái Đất, khi châu Úc và châu Á chưa tách rời.Chúng vốn là

các loài cỏ, có thân cao từ 2-6 m, chia làm nhiều đốt, bên trong có chứa đường Tất cả các giống

mía trồng đều là các giống mía lai nội chi hoặc nội loại phức tạp.

- Giá trị kinh tế

+ Xét về mặt công nghiệp: Trong thế kỷ 21, cây mía còn là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, hóa phẩm, dược phẩm, chế biến cồn sinh học (ethanol) … Ngoài sản phẩm chính là đường, các sản phẩm phụ của mía đường nếu được khai thác triệt để, giá trị còn có thể gấp 3-4 lần chính phẩm

+ Xét về mặt sinh học:

Khả năng tạo ra sinh khối lớn

Khả năng tái sinh mạnh

Khả năng thích ứng rộng

Cây mía được coi là một trong sáu cây nhiên liệu sinh học tốt nhất của thế giới

trong tương lai

2.2 Ngành công nghiệp mía đường

+ Bước sang thế kỷ 21, do độc canh cây mía với diện tích lớn, lạm dụng hóa học (phân hóa học, thuốc trừ sâu bệnh, thuốc trừ cỏ,…), sử dụng máy móc

cơ giới lớn đã dẫn đến xói mòn, thoái hóa đất, ô nhiễm môi trường, tăng cao giá thành sản xuất

Do vậy một số nước đã và đang nghiên cứu áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật để thiết lập chế độ canh tác mía bền vững thay thế cho chế độ canh tác cũ

- Thực trạng ở Việt Nam:

+ Từ năm 2001 trở lại đây, diện tích trồng mía trên cả nước giảm so với năm 2000 do không cạnh tranh nổi với một số cây trồng có thu nhập cao hơn khiến tình trạng thiếu nguyên liệu thường xuyên xảy ra

+ Dù khoảng cách đã được rút ngắn nhưng năng suất mía Việt Nam (bình quân chỉ 60 tấn/ha) vẫn thấp hơn bình quân thế giới (70 tấn/ha) và chất lượng kém hơn.

+ Hiệu suất đường của Việt Nam là 4-5 tấn đường/ha, trong khi Thái Lan 7-8 tấn/ha, Brazil 9-21 tấn/ha

=> Cần áp dụng kỹ thuật sinh học trong sản xuất mía để nâng cao năng suất và chất lượng cho ngành sản xuất mía đường ở Việt Nam.

3 BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

3.1 Agrobacterium

- Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử

dụng như vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật

- A tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là

Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây

Vi khuẩn A tumefaciens

3.2 Cơ chế gây bệnh của A tumefaciens

- Sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.

- Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn

3.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo (Callus)

- Là khối mô phát triển mạnh mẽ vô tổ chức trên hoặc xung quanh

bề mặt vết thương hay vết cắt; hoặc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Thông thường, môi trường tạo mô sẹo cần bổ sung auxin ở nồng

độ cao, auxin có thể sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với cytokinin Tuy

nhiên, đối với mẩu có nồng độ auxin nội sinh cao, khi không có sự bổ

sung của auxin ngoại sinh, mẫu cũng có thể phát sinh mô sẹo

4 BIẾN NẠP GEN Ở MÔ SẸO MÍA BẰNG VI KHUẨN

A Tumefaciens VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN

4.1 Vật liệu:

- Chồi mía POJ (Proefstation Oast Java) in vitro thuộc loài Saccharum

officinarum L do Công ty Cổ phần đường Quảng Ngãi cung cấp được dùng làm

nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm

- Môi trường: Môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) bổ sung đường

sucrose (20 g/L), agar (8 g/L), nước dừa 10% và các chất khác nhau tùy theo từng

thí nghiệm

Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%)

+ Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy, các khúc cắt thân bắt đầu hình thành sẹo tại vị trí cắt gần với gốc (Bảng 1).

+ Sau 4 - 6 tuần, các mẫu mô sẹo trở nên rắn chắc và ngả sang màu vàng (Hình 1) Các mẫu thân không tạo sẹo thì đen dần và cuối cùng chết đi

4.2.2 Thí nghiệm khảo sát môi trường thích hợp cảm ứng tạo chồi từ sẹo

Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / mẫu (chồi)

Bảng 2 Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh chồi của sẹo mía Hình 2 Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi từ sẹo sau 5 tuần nuôi cấy

- Sau 10 ngày, sẹo đặt trên các môi trường bắt đầu cảm ứng tạo chồi

- Sau 5 tuần nuôi cấy, các nghiệm thức có sự khác biệt về số chồi phát sinh từ một mẫu mô ban đầu

4.2.3 Thí nghiệm khảo sát nồng độ PPT tối thiểu gây chết 100% cho mô mía

- Bố trí thí nghiệm:

Để trong tối(22 - 25oC)

Môi trường cho thí nghiệm 3

20 ml YEP lỏng

rifampicin 50 mg/l

kanamycin 50 mg/L

Vi khuẩn A tumefaciens

Thu sinh khối

Dịch tạo sẹo ở nghiệm thức D3

OD600 = 0,6–0,8

+ AS đến nồng độ 100μM và

150μM

Lắc đều và để yên trong 30 phút

4.2.4 Thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh chồi sau chuyển gen

- Bố trí thí nghiệm

+ Chuẩn bị dịch khuẩn:

+ Ủ mẫu với dịch khuẩn:

Mô sẹo D3 ở TN1(2-3 mm) Ngâm vào dịch

khuẩn đã chuẩn bị

Thấm khô bằng giấy thấm vô trùng trong 15’ hoặc 30’

Môi trường D3 của TN1

15’ hoặc 30’

Chiếu sáng 16h/ngày

5-6 tuần

Cắt là và thân

Thử GUS

- Kết quả:

Tiến hành trên 8 nghiệm thức kết hợp sự thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen

- Sẹo sau khi đồng nuôi cấy mang kiểm tra đều không biểu hiện GUS.

Tỉ lệ mẫu cảm ứng chồi (%) 0,00 25,00 0,00 0,00 0,00 8,33 25,00 0,00

Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ AS, thời gian ủ mẫu với dịch khuẩn, thời gian phơi khô mẫu lên hiệu quả chuyển gen và tái sinh chồi

- Theo quan sát thấy, nghiệm thức T2 và T7 đều có chung tỉ lệ cảm ứng chồi là 25% Các mẫu khác sức sống yếu dần rồi chết đi Tuy khác nhau về nồng

độ AS, thời gian ủ mẫu và thời gian phơi khô mẫu nhưng 2 nghiệm thức T2 và T7 lại cho kết quả giống nhau

Hình 3 Các chồi phát triển trên môi trường có PPT sau 6 tuần

- Cụm chồi ở nghiệm thức T2 và T7 sau 40 ngày qua 5 lần cấy chuyền trên môi trường bổ sung PPT 5 mg/L vẫn phát triển rất tốt

Hình 4 Kết quả điện di PCR gen bar chồi mía

(Giếng M: Thang 100 bp;Giếng 1, 2: mẫu đối chứng âm (nước cất);Giếng 3, 4: mẫu đối chứng dương (sản phầm PCR gen bar của plasmid pGII0229); Giếng 5, 6, 7: sản phẩm PCR gen bar chồi mía

T2;Giếng 8, 9, 10: sản phẩm PCR gen bar chồi mía T7)

- Cụm chồi T2 và T7 được chuyển sang môi trường nhân chồi BG (môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/L, GA3 0,1 mg/L) không bổ sung PPT để tạo nguồn vật liệu tách DNA và kiểm tra gen bar

- Sau khi tách chiết DNA chồi mía T2, T7 và chạy PCR gen bar với cặp mồi đặc hiệu BAR3/BAR4

- Theo kết quả điện di, DNA chồi mía T2, T7 có chứa gen bar có khả năng kháng PPT, tuy nhiên lại không biểu hiện GUS.

- Như vậy, việc sử dụng nồng độ AS 100 μM (nghiệm thức T2) và 150 μM (nghiệm thức T7) đều có thể chuyển gen thành công với tỉ lệ giả định là 25%

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Tạp chí phát triển KH & CN, tập 16, số tháng 1 / 2013

2 Tạp chí phát triển KH & CN, tập 50, số tháng 6 / 2012

3 TS Phạm Thị Minh Thu, Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, ĐH Nha Trang

4 B.T.Roach, Origin and improvement of the genetic base of sugarcane, 1989