Nghiên cứu, điều tra bệnh virus khảm lá (POTATO virus x PXX và POTATO virus y PVY) trên khoai tây nhập khẩu tại trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu i vụ đông xuân năm 2007 2008

Cây khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ, ñược trồng ñầu tiên ở vùng núi Andes, sau ñó ñược ñem ñến Châu Âu vào thế kỷ 16. ðến thế kỷ 19, thời kỳ ñang diễn ra cuộc cách mạng công nghiệp tại Anh, cây khoai tây là một cứu tinh cho con người. Nó chính là nguồn cung cấp calo rẻ và rất dễ trồng, giải phóng ñáng kể sức lao ñộng của con người, giúp các nhà máy sản xuất công nghiệp có ñủ nhân lực. Khi nhắc ñến khoai tây, người Mỹ nghĩ ngay ñến Idaho, nơi trồng hơn 1/4 số khoai tây của nước này. Người Ailen sẽ nghĩ ngay ñến nạn ñói do mất mùa khoai tây năm 1845, còn người Ba Lan thì nghĩ ñến rượu Vodka làm từ khoai tây. Nhưng tự hào về loài cây này nhất là ở Peru, nơi ñã trồng khoai tây từ cách ñây hơn 7.000 năm. Theo tổ chức khoai tây Quốc tế, ñất nước Nam Mỹ này là nơi cư ngụ của hơn 3.500 giống khoai tây khác nhau. Và bình quân mỗi người dân Peru tiêu thụ 90 kg khoai tây một năm. Tuy nhiên, một ñiều ñáng ngạc nhiên là con số ñó mới chỉ bằng 1/4 lượng khoai tây tiêu thụ của Belarus, quốc gia ñược coi là ăn nhiều khoai tây nhất trên Thế giới.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ðỖ THỊ THU HUYỀN

¬

NGHIÊN CỨU, ðIỀU TRA BỆNH VIRUS KHẢM LÁ (POTATO VIRUS

X - PVX VÀ POTATO VIRUS Y - PVY) TRÊN KHOAI TÂY NHẬP

KHẨU TẠI TRUNG TÂM KIỂM DỊCH THỰC VẬT

SAU NHẬP KHẨU I VỤ ðÔNG XUÂN NĂM 2007 - 2008

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : BẢO VỆ THỰC VẬT

Người hướng dẫn khoa học : GS.TS VŨ TRIỆU MÂN

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

ðỗ Thị Thu Huyền

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ của Thầy giáo, Giáo sư- Tiến sĩ Vũ Triệu Mân Xin gửi tới Thầy lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng

Xin chân thành cám ơn tới các Thầy giáo, Cô giáo, các cán bộ nhân viên khoa Sau ñại học và khoa Nông học ñã tạo ñiều kiện tốt nhất ñể chúng tôi có

cơ hội nâng cao kiến thức

Xin chân thành cám ơn các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới, Trung tâm nghiên cứu cây có củ ñã nhiệt tình giúp ñỡ trong thời gian tôi thực tập và hoàn thành luận văn

Xin bày tỏ lời cám ơn chân thành tới Ban giám ñốc và cán bộ Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I ñã tạo mọi ñiều kiện tốt nhất về vật chất cũng như tinh thần ñể tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự ñộng viên, khích lệ, giúp ñỡ của các thầy

cô, bạn bè và ñồng nghiệp

Tôi cũng xin ñược cảm ơn những người thân trong gia ñình, ñã dành nhiều tình cảm và ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tác giả luận văn

ðỗ Thị Thu Huyền

3 ðối tượng, ñịa ñiểm, vật liệu, nội dung và phương pháp

4.1 Bệnh virus khảm lá khoai tây trên khoai tây nhập khẩu 35 4.1.1 Tình hình nhập khẩu giống khoai tây năm 2007 35 4.1.2 Kết quả kiểm tra PVX và PVY trên khoai tây nhập khẩu trước

4.1.3 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên khoai tây nhập khẩu ñược trồng

trong nhà kắnh tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I 38 4.2 Tình hình bệnh virus khảm lá khoai tây trên khoai tây vụ đông

4.2.1 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên khoai tây nhập khẩu tại Trung

4.2.2 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên giống khoai tây Diamant (Hà

Lan) vụ đông Xuân 2007- 2008 tại đặng Xá- Gia Lâm- Hà Nội 44 4.2.3 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên giống Solara (đức) vụ đông

Xuân 2007- 2008 tại Hà Hồi- Thường Tắn- Hà Nội 46 4.2.4 Kết quả kiểm tra PVX,PVY trên giống VT2 (Trung Quốc) vụ

đông Xuân năm 2007- 2008 tại Tràng định - Lạng Sơn 47 4.2.5 Kết quả kiểm tra PVX,PVY trên khoai tây nhập khẩu từ Trung

Quốc gieo trồng vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Lộc Bình -

4.2.6 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant nhập khẩu từ

Hà Lan vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại đặng Xá- Gia Lâm- Hà

4.2.7 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu từ

đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Hà Hồi- Thường Tắn- Hà

4.2.8 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu từ

đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 54 4.2.9 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant nhập khẩu

từ Hà Lan vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 55

4.3 Kết quả lây nhiễm virus trên cây chỉ thị và cây ký chủ phụ trong

DANH MỤC CÁC BẢNG

4.1 Tình hình nhập khẩu giống khoai tây vào Việt Nam năm 2007 364.2 Kết quả kiểm tra PVX và PVY trên mẫu củ giống khoai tây nhập

4.3 Kết quả kiểm tra PVX,PVX trên khoai tây nhập khẩu trồng trong

nhà kắnh tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khảu I 404.4 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên khoai tây nhập khẩu tại Trung

4.5 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên giống khoai tây Diamant (Hà

Lan) vụ đông Xuân 2007- 2008 tại đặng Xá- Gia Lâm- Hà Nội 454.6 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên giống Solara (đức) vụ đông

Xuân 2007- 2008 tại Hà Hồi- Thường Tắn- Hà Nội 464.7 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên giống khoai tây VT2 nhập khẩu

từ Trung Quốc gieo trồng tại Tràng định - Lạng Sơn 494.8 Kết quả kiểm tra PVX, PVY trên khoai tây VT2 nhập khẩu từ

Trung Quốc gieo trồng vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Lộc

4.9 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant vụ đông

Xuân năm 2007- 2008 tại đặng Xá- Gia Lâm- Hà Nội 514.10 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu từ

đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Hà Hồi- Thường Tắn- Hà

4.11 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu từ

đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ - Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 54

4.12 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant nhập khẩu

từ Hà Lan vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 564.13 Kết quả lây bệnh nhân tạo PVX (potato virus X) lên cây chỉ thị

4.14 Triệu chứng của PVX trên cây chỉ thị và ký chủ phụ 604.15 Kết quả lây bệnh nhân tạo PVY (potato virus Y) lên cây chỉ thị

4.16 Triệu chứng của PVY trên cây chỉ thị và ký chủ phụ 65

DANH MỤC CÁC HÌNH

4.2 Khoai tây trồng tại Trung tâm KDTV Sau nhập khẩu I 41

4.3 Triệu chứng khảm thường lá khoai tây 43

4.5 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant nhập khẩu

từ Hà Lan vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại đặng Xá- Gia

4.7 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu

từ đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Hà Hồi - Thường

4.8 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Solara nhập khẩu

từ đức vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ - Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 554.9 Diễn biến bệnh khảm lá khoai tây trên giống Diamant nhập

khẩu từ Hà Lan vụ đông Xuân năm 2007- 2008 tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 56

4.10 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv

4.17 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv

4.18 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv

4.19 Triệu chứng bệnh trên cây Nicotiana tabacum cv Samsun

4.20, 4.21 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana

4.22 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv

4.23 Triệu chứng bệnh trên cây thuốc lá Nicotiana glutinosa nhiễm

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Khoai tây (Solanum tuberosum L thuộc cây họ cà Solanaceae) là cây

lương thực chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế của nhiều nước trên Thế giới Theo ñánh giá của FAO (1995), khoai tây là cây lương thực ñược xếp thứ tư sau lúa mì, ngô và lúa nước [6]

Cây khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ, ñược trồng ñầu tiên ở vùng núi Andes, sau ñó ñược ñem ñến Châu Âu vào thế kỷ 16 ðến thế kỷ 19, thời

kỳ ñang diễn ra cuộc cách mạng công nghiệp tại Anh, cây khoai tây là một cứu tinh cho con người Nó chính là nguồn cung cấp calo rẻ và rất dễ trồng, giải phóng ñáng kể sức lao ñộng của con người, giúp các nhà máy sản xuất công nghiệp có ñủ nhân lực Khi nhắc ñến khoai tây, người Mỹ nghĩ ngay ñến Idaho, nơi trồng hơn 1/4 số khoai tây của nước này Người Ailen sẽ nghĩ ngay ñến nạn ñói do mất mùa khoai tây năm 1845, còn người Ba Lan thì nghĩ ñến rượu Vodka làm từ khoai tây Nhưng tự hào về loài cây này nhất là ở Peru, nơi ñã trồng khoai tây từ cách ñây hơn 7.000 năm Theo tổ chức khoai tây Quốc tế, ñất nước Nam Mỹ này là nơi cư ngụ của hơn 3.500 giống khoai tây khác nhau

Và bình quân mỗi người dân Peru tiêu thụ 90 kg khoai tây một năm Tuy nhiên, một ñiều ñáng ngạc nhiên là con số ñó mới chỉ bằng 1/4 lượng khoai tây tiêu thụ của Belarus, quốc gia ñược coi là ăn nhiều khoai tây nhất trên Thế giới Với hy vọng Thế giới có nhận thức ñúng và ñầy ñủ hơn về loại cây trồng rất hữu ích này, góp phần vào việc ñạt ñược những mục tiêu thiên niên

kỷ (MDGs) ñã ñề ra (bao gồm xoá ñói giảm nghèo, tăng cường an ninh lương thực và thúc ñẩy phát triển kinh tế), Liên hiệp quốc ñã tuyên bố năm 2008 là năm Quốc tế về khoai tây

Cơ quan ñặc trách về lương thực và nông nghiệp của Liên hiệp quốc

(FAO) ñang hợp tác với Hiệp hội các nhà trồng khoai tây Quốc tế tổ chức hội nghị ở thành phố Cusco của Peru ñể bàn về những lợi ích của việc sản xuất khoai tây, món ăn ñang ñược xem là thực phẩm ñứng số 1 của Thế giới, nếu chỉ

kể về loại thực phẩm không phải là hạt Hội nghị lần này tại Peru có mục tiêu thảo luận tiềm năng của việc sản xuất khoai tây, ñặc biệt là tại các nước nghèo Theo các chuyên gia, trước tình hình giá cả các loại ngũ cốc tăng cao, các nước nghèo có thể tiêu thụ nhiều khoai tây hơn vì vừa không chiếm nhiều diện tích, lại dễ trồng và có nhiều chất bổ

Ở Việt Nam, khoai tây ñược ñưa vào trồng cách ñây khoảng 100 năm Ngày nay, khoai tây là một trong bốn loại cây lương thực quan trọng của nước

ta sau lúa, ngô và khoai lang [6]

Ở nước ta, khoai tây ñược trồng chủ yếu ở ñồng bằng sông Hồng và ñược xem là cây vụ ñông quan trọng trong cơ cấu luân canh cây trồng

Khoai tây là sản phẩm vụ ñông quan trọng, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn cây lúa, ngô hay khoai lang trên cùng một diện tích, ñặc biệt là ở những vùng như ñồng bằng sông Hồng và miền Bắc Việt Nam (chiếm 85% sản lượng cả nước) bởi nó ñược trồng luân canh xen kẽ giữa hai vụ lúa, thời gian canh tác không quá dài

Khoai tây ñã góp phần quan trọng giúp nông dân nâng cao thu nhập, xoá ñói giảm nghèo, nhất là ở những nơi mà mật ñộ dân số ñông và diện tích ñất hạn chế

Khoai tây là nguồn lương thực quan trọng, ñồng thời là nguồn thực phẩm quý, cùng với các loại rau khác, nó ñã cung cấp nguồn vitamin C, B1,B2, PP và nhiều thành phần dinh dưỡng, khoáng chất Mặt khác, xét về thời gian sinh trưởng cây trồng, khoai tây là cây có thời gian sinh trưởng ngắn nhưng cho năng suất năng lượng và năng suất protein cao nhất so với lúa gạo và ngô [6] Sản xuất khoai tây tại Việt Nam ñã ñạt ñỉnh cao về diện tích vào những

năm 1979- 1980, sau ñó giảm dần ðến nay, cây khoai tây ở Việt Nam có diện tích khoảng 40 nghìn ha với trên 10 nghìn hộ nông dân tham gia trồng trọt, sản lượng 450 nghìn tấn, ñáp ứng ñược một nửa nhu cầu trong nước Theo dự báo chiến lược của FAO, thế kỷ 21 này, khi mức sống của con người nâng lên thì nhu cầu sử dụng khoai tây cũng sẽ tăng Việc mở rộng và phát triển sản xuất khoai tây ñược coi là tiềm năng lớn, góp phần làm tăng thu nhập và cải thiện ñời sống ở vùng ñồng bằng sông Hồng Bên cạnh những thuận lợi, sự

mở rộng và phát triển sản xuất khoai tây ñang phải ñối mặt với nhiều thách thức, nhất là về chất lượng giống Có nhiều nguyên nhân dẫn ñến tình trạng diện tích sản xuất khoai tây bị thu hẹp Việc sử dụng phổ biến các giống khoai tây kém chất lượng hoặc thoái hoá là những yếu tố hạn chế ñối với sản xuất khoai tây Hiện tượng thoái hoá này là do bệnh truyền nhiễm virus gây ra [19] Bệnh virus không những gây ra hiện tượng thoái hoá củ giống mà còn ảnh hưởng ñến phẩm chất củ khoai tây như: làm cho củ nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng thấp [19] ðặc biệt triệu chứng virus rất khó phát hiện, chúng có thể ẩn khi nhiệt ñộ quá cao hoặc quá thấp Vì vậy rất dễ bị nhầm lẫn khi chọn phải củ giống ñã bị nhiễm virus, ñó là nguyên nhân chính dẫn ñến việc năng suất giảm ñáng kể và hiệu quả kinh tế thấp

Vấn ñề khó khăn của Việt Nam khi phát triển diện tích cây khoai tây lên 50 nghìn ha vào năm 2010 ñó là giống Hiện nay, giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng 20 - 25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc và một số nước khác nên không kiểm soát ñược chất lượng giống Trong những năm gần ñây, khoai tây giống nhập khẩu từ các nước như: ðức, Hà Lan, Trung Quốc ngày càng tăng về cả số lượng và chủng loại nên diện tích trồng và năng suất tăng, nhưng bên cạnh ñó chất lượng giống chưa ñảm bảo

để ựáp ứng ựược nhu cầu ngày càng cao về số lượng cũng như chất lượng của thị trường, các giống khoai tây cũ dần dần ựược thay thế bằng các giống mới có năng suất, phẩm chất tốt hơn Tuy nhiên, nguồn giống trong nước không ựủ cung cấp cho sản xuất, chắnh vì vậy hàng năm số lượng và chủng loại giống nhập khẩu từ nhiều nguồn gốc khác nhau tăng lên không ngừng

Bệnh truyền qua giống nhập khẩu không những làm giảm chất lượng giống mà còn ựe doạ gây tổn thất cho sản xuất trong nước, trong

ựó có những bệnh hại ựặc biệt nghiêm trọng Việc nghiên cứu các loại bệnh hại củ giống là ựiều cần thiết và có ý nghĩa làm cơ sở khoa học cho biện pháp xử lý củ giống, góp phần bảo vệ sản xuất ựồng thời tăng cư-ờng công tác Kiểm dịch thực vật, ngăn ngừa các loại bệnh hại nguy hiểm

từ nước ngoài qua con ựường nhập khẩu giống vào nước ta góp phần phát triển một nền nông nghiệp bền vững Giống mang nguồn bệnh có thể truyền cho vụ sau hoặc lây lan từ nơi này tới nơi khác qua con ựường trao ựổi giống đây là một phương thức lan truyền nhanh nhất, xa nhất và hiệu quả nhất của dịch hại Ngoài ra, việc nhập khẩu giống còn là một trong những nguyên nhân làm thay ựổi thành phần dịch dại, làm cho thành phần dịch hại ngày càng trở nên phong phú và phức tạp hơn Theo số liệu của CABI năm 2005 có 351 loài gây hại trên cây khoai tây, trong ựó có 28 loài là virus Chắnh vì vậy, việc tạo nguồn giống khoẻ, sạch bệnh ngày càng trở nên quan trọng và ựóng vai trò then chốt trong tạo giống

Xuất phát từ thực tế trên, ựể ựánh giá tình hình bệnh virus trên một số giống khoai tây nhập nội và thực trạng bệnh virus hại khoai tây vụ đông Xuân năm 2007, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về thành phần sâu bệnh hại trên khoai tây phục vụ cho việc phân tắch nguy cơ dịch hại, xây dựng danh mục Kiểm dịch thực vật trên khoai tây nhập khẩu, chúng tôi tiến hành thực

hiện ựề tài: ỘNghiên cứu, ựiều tra bệnh virus khảm lá (Potato virus X- PVX

và Potato virus Y - PVY) trên khoai tây nhập khẩu tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I vụ đông Xuân năm 2007 Ờ 2008Ợ

1.2 Mục ựắch , yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

Nghiên cứu ựánh giá thực trạng bệnh virus khảm lá (Potato virus X - PVX và Potato virus Y - PVY) trên khoai tây nhập khẩu tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I

Áp dụng phương pháp ELISA ựể xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh virus khảm lá PVX và PVY trên khoai tây nhập khẩu

- Kiểm tra bệnh virus khảm lá khoai tây PVX, PVY bằng phương pháp

ELISA, phương pháp cây chỉ thị

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

2.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại khoai tây trên thế giới

Hiện nay, trên Thế giới ñã phát hiện ñược 977 loài virus khác nhau thuộc

70 giống [71] Theo George N Agrios [59] tổng số các loài virus phát hiện ñược khoảng 2000 loài và các loài virus mới ñược công bố hàng tháng Khoảng một phần tư trong tổng số các loài virus phát hiện ñược có khả năng tấn công

và gây hại cho thực vật Một loài virus có khả năng xâm nhiễm một hoặc nhiều loại thực vật khác nhau và một loài thực vật thường bị nhiều loài virus gây hại Một cây có thể bị nhiều loài virus gây hại trong cùng một thời gian

Bệnh virus hại khoai tây ñược nhiều nhà khoa học trên Thế giới quan tâm nghiên cứu chi tiết về hình thái, cấu tạo, phân loại, ñặc ñiểm sinh thái học, quy luật phát sinh phát triển và phương thức lan truyền ñể ñưa ra biện pháp phòng trừ hiệu quả ñối với từng loại bệnh

2.1.2 Tác hại của bệnh virus hại khoai tây

Bệnh virus gây thiệt hại rất lớn cho sản suất khoai tây, làm giảm năng suất, chất lượng và gây ra hiện tượng thoái hóa giống (J.A.Debokx, 1981; W.J.Hooker và Editor, 1981; Salazar và P.D.Darison, 1979)

Theo Houtonia (1972), hàng năm bệnh virus làm thiệt hại mất 13% sản lượng tức khoảng 13 triệu tấn khoai tây Sự thiệt hại này phụ thuộc vào từng loại virus, từng vùng sinh thái khác nhau và có thể làm giảm 25 - 30% năng suất (Ambrosov, 1964; V.A Smuglie và ctv, 1988)

Theo A.Reestman (1972), thiệt hại do bệnh gây ra tăng dần theo mức ñộ nhiễm bệnh Nếu tỷ lệ bệnh từ 5 -15% thì năng suất giảm 2%, tỷ lệ bệnh từ 15 -25% thì năng suất giảm 7,5%, tỷ lệ bệnh từ 25 - 50% thì năng suất giảm 18%, còn tỷ lệ bệnh trên 50% thì năng suất giảm 39% trở lên [22]

ðối với từng loại virus, hầu hết các tác giả như: J.A.Debokx (1972); W.J.Hoker (1981); D.Peters (1970), ñều thống nhất cho rằng: trong số các loại virus khoai tây thì virus Y khoai tây (PVY) là loại bệnh rất nguy hiểm Khoai tây bị nhiễm PVY có thể làm giảm năng suất từ 10 -80% tùy thuộc vào chủng của PVY

Theo Bode (1968); J.A.Debokx (1981); A.Reestman (1970), khoai tây

bị nhiễm virus X (PVX) có thể làm giảm năng suất từ 10 - 20%, nhiễm virus

A năng suất giảm 40%, nhiễm virus S năng suất giảm 10 - 20% [19]

Theo R.A.C.Jone và C.E.Fribour (1978), thiệt hại do bệnh gây ra ở dạng ẩn triệu chứng năng suất bị giảm ít hơn so với dạng có triệu chứng Theo kết luận của Trung tâm khoai tây Quốc tế (CIP), 1977: sự kết hợp của nhiều loại virus trên khoai tây gây thiệt hại nhiều hơn khi chỉ có một loại virus [28][36]

2.1.3 Những nghiên cứu về triệu chứng của virus hại khoai tây

Các tác giả trong và ngoài nước ñã mô tả và phân loại triệu chứng virus hại khoai tây và ñược chia thành các nhóm khác nhau

+ Triệu chứng khảm lá: lá loang lổ, mặt lá xanh xen kẽ với những vết màu vàng, lá gồ ghề, cây phát triển kém, ñôi lúc lá hơi nhăn nheo và có các vết chết hoại

+ Triệu chứng nhăn lá ñen gân: lá nhăn nheo khi có biểu hiện khảm lá Mặt dưới gân lá có nhiều vết ñen Mức ñộ ñen gân tùy theo chủng virus, giống khoai tây và thời tiết Cây lùn hẳn, có thể bị chết khô do các vết ñen gân gây ra

+ Triệu chứng xoăn lá: cây bị bệnh thấp lùn, lá co nhỏ, xoăn cuốn không ựều, bản lá nhỏ, dầy và giòn, thân mảnh, lá thưa

+ Triệu chứng cuốn lá: lá bị cuốn hai mép và có dạng hình thìa đuôi lá ngọn bị ựỏ, có khi tắm thâm, lá cứng, dựng ựứng, cây lùn, toàn cây hơi vàng nhạt

+ Triệu chứng vàng lùn: cây lùn thấp, giòn và dễ gãy Toàn cây có màu vàng nhạt, mép lá cuốn hướng lên trên, lá co ngắn chiều dài

+ Triệu chứng lùn biến dạng: lá bị bệnh biến dạng mạnh, thay ựổi hẳn

Lá bị nhăn nheo, không bằng phẳng, mép lá không ựều, lá dài có khi gấp 2 lần

lá bình thường

+ Triệu chứng hỗn hợp: cây có biểu hiện ắt nhất hai loại hình triệu chứng

2.1.4 Những nghiên cứu về Potato virus X (PVX)

Trong vị trắ phân loại PVX thuộc họ Flexiviridae và giống Potexvirus,

ngoài tên PVX, virus này còn có tên khác như: Potato X potexvirus, Potato mild mosaic virus, Potato virus B, Ptato virus DẦ

PVX ựược mô tả ựầu tiên vào năm 1931, ựược Brandes và Wetter (1959) nhóm với những virus có hình dạng và kắch thước phân tử tương tự [35]

Nhóm này ban ựầu dược xác ựịnh là nhóm Potato virus, sau ựó ựược sửa lại thành nhóm Potexvirus Năm năm sau, nó ựược Ủy ban danh pháp virus Quốc tế xếp vào nhóm của PVX

+ Phổ ký chủ

PVX có phổ ký chủ rất rộng và là loài phổ biến trong tự nhiên Nó có thể tồn tại trên 62 loài thực vật thuộc 27 họ và có thể nhiễm bệnh nhân tạo trên 348 loài trong 33 loài thực vật khác nhau [54] PVX ựặc biệt quan trọng trên Thế giới như một tác nhân chắnh gây bệnh trong mùa vụ đáng chú ý là ở

khoai tây, thuốc lá, cà chua, hồ tiêu Ở một số nơi nó còn gây hại trên cây

astiso (Scolymus sp.), cây củ cải (Brassica sapa) và một số cây trồng khác

(Paulus và cộng sự, 1960; Fribourg và Fernander)

Các cây ký chủ chính bao gồm: cây ớt (Capsicum annuum), cây cà chua

(Lycopersicon esculentum), cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), cây khoai tây

(Solanum tuberosum)

Các cây ký chủ phụ bao gồm: cây củ cải (Brassica sapa), cây astiso

(Scolymus sp.), cây cỏ ba lá (Trifolium pratense), cây nho (Vitis vinifera)

Cây ký chủ dại bao gồm: cây rau muối (Chenopodium album), cây

Amaranthus retroflexus, cây Solanum laciniatum

+ Phân bố ñịa lý

PVX ñầu tiên ñược phát hiện cách ñây 7 thập kỷ và các isolate của PVX

loài huyết thanh O xuất hiện ở khắp nơi trên Thế giới Tuy nhiên, các isolate

của PVX loài huyết thanh A chỉ xuất hiện ở Peru và Bolivia

+ ðặc ñiểm sinh vật học và sinh thái học

Trải qua một thời gian dài người ta mới biết ñược rằng PVX lan truyền

dễ dàng qua sự tiếp xúc của cây khỏe và cây bệnh hoặc qua các tác ñộng cơ

giới ngoài ñồng ruộng (Smith, 1933; Loughname, 1972) Nó lan truyền từ củ

bệnh sang củ khỏe khi ñể trong cùng một bao (Bawden và cộng sự, 1948)

Ở ngoài ñồng nó lây lan qua các dụng cụ làm vườn ñã bị lây nhiễm khi làm

việc (Winther - Nielson, 1972) và các ñộng vật cào từ củ bệnh sang củ khỏe

như thỏ, chó (Todd,1958) Có một cảnh báo là PVX có thể lan truyền qua

châu chấu (Melanopus differentialis và Ettigonia viridissima) Cũng có một

báo cáo cho rằng PVX có thể truyền qua du ñộng bào tử của nấm

Synchytrium endobioticum ðây là sự ghi nhận về sự lan truyền qua ñất của

PVX [86]

Nguồn xâm nhiễm ban ñầu của PVX thường từ ruộng trồng khoai tây

hoặc củ trong bảo quản

+ Tác hại của virus

Virus có phạm vi ký chủ rộng, nó gây hại trên ít nhất 62 loài thực vật thuộc 27 họ khác nhau [59] Trên thế giới PVX ñặc biệt quan trọng với cây khoai tây và ở một số nước nó là một trong những bệnh quan trọng trên cây

ớt, cà chua và thuốc lá

Thiệt hại về năng suất hàng năm ở Mỹ khoảng 13%, gấp 2 lần so với

thiệt hại do bệnh sương mai và bệnh do Rhioctonia gây ra [47] Các chủng

ñộc có thể gây thiệt hại lên tới 50% cho những giống không chống chịu [45] Ngay cả những chủng nhẹ của PVX cũng làm giảm 15% năng suất bởi những cây bị bệnh cho củ nhỏ hơn và ít hơn (Munro, 1961) Hậu quả của toàn bộ sự nhiễm bệnh là mất 10 - 15% năng suất (Beukema và Zaag, 1997) Mặt khác

sự chết hoại do các chủng PVX gây ra có thể làm giảm 50% số cây con, thậm chí năng suất bị thiệt hại nặng hơn nếu như bị hỗn hợp với các virus khác, ñặc biệt với PVY (Smith, 1931) Khi cả PVX và PVY cùng xâm nhiễm trên cây, triệu chứng nghiêm trọng hơn khi bị một loài virus xâm nhiễm Tính nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào chủng virus nhưng triệu chứng thể hiện rõ hơn khi bị nhiễm ñồng thời cả 2 virus

+ Hình thái của virus

Virus có phân tử dạng sợi mềm, kích thước 515x12nm

Trọng lượng phân tử: 35x106 (Koenig and Lesemann, 1989)

Hệ số lắng ñọng: 118 s (Koenig and Lesemann, 1989)

ðiểm ñẳng ñiện: pH = 5,5 (Koenig and Lesemann, 1989)

Trọng lượng riêng: 0,73 cm3/g (Koenig and Lesemann, 1989)

Hệ số tan (1mg/ml, ñường sáng 1cm): 2,97 (Koenig and Lesemann, 1989)

Phân tử chứa khoảng 6% RNA trọng lượng 2,1x106 (6435 nucleotide),

trình tự nucleotide một số chủng của PVX và tổ chức gennom của RNA ñã ñược xác ñịnh [27][66][73]

Vỏ protein bao gồm 1270 tiểu ñơn vị polypeptide, mỗi tiểu ñơn vị khoảng 25,08 kda [99] và chứa khoảng 236 axitamin Có lẽ chúng ñược phiên

mã từ RNA phụ [74]

Ban ñầu virus phân bố rải rác trong tế bào chất của tế bào nhiễm bệnh nhưng sau ñó tập hợp lại thành bó sợi và lấp ñầy tế bào Khối này có thể dễ dàng phát hiện dưới kính hiển vi quang học

+ ðặc ñiểm chống chịu của virus

Theo U.Hamann (1962); R.Bercks (1970); Peter Widly (1971) cho biết: virus X có nhiệt ñộ làm mất hoạt tính Q10 khoảng 65 - 760C Theo A.G.Zukin thì nhiệt ñộ mất hoạt tính của virus khoảng 60 - 800C tùy theo chủng virus Theo Brandes và R.Bercks (1965), virus có ngưỡng pha loãng của dịch cây bệnh 10-5 -10-6, virus có thể giữ trong dịch cây vài tuần ở 200C và giữ trong glycerin tới hơn 1 năm

+ Triệu chứng gây bệnh

Rất nhiều chủng PVX khó phát hiện trên lá ở những cây con và tất cả những triệu chứng chúng gây ra ñều giống nhau Một số chủng khác gây ra khảm lá mạnh và nhăn lá hoặc gây ra những vết chết hoại và thường làm cây

2.1.5 Những nghiên cứu về Potato virus Y (PVY)

Potato virus Y là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất

cho khoai tây trên Thế giới ñặc biệt là ở những vùng khí hậu nóng, có một mùa ñông lạnh [19]

Potato virus Y thuộc nhóm virus họ Potyviridae, giống Potyvirrus

Ngoài tên gọi Potato virus Y, còn có nhiều tên gọi khác nhau như: Potato Y potyvirus, Tobacco vein banding mosaic virus, Tobacco veinal necrosis virus, Brinjal mosaic virus, Potato virus 20, Tabakrippenbraune virus, Datura 437 virus, Potato acropetal necrosis virus, Potato severe mosaic virus, Marmor upsilon, Solanum virus 2, Tobacco vein-banding virus, Potato C virus trong

ñó Potato virus Y là tên gọi phổ biến nhất

Potato virrus Y là loại virus ñiển hình thuộc giống Potyvirrus, họ Potyviridae, có phổ ký chủ rất ña dạng và virus rất khác nhau Các chủng của virus thường chia thành 3 nhóm chính: nhóm chủng bình thường (PVYO); nhóm chủng chết hoại (PVYN); nhóm chủng ñốm sọc (PVYC) Ngoài ra còn

có nhóm chủng PVYNTN PVYNTN là chủng mới gây chết hoại củ

Nhóm chủng gây chết hoại gân thuốc lá từ lâu ñã ñược phân biệt bằng phản ứng huyết thanh và một số triệu chứng chúng gây ra trên một số cây ký

chủ kiểm tra bao gồm: Nicotiana tabacum, Physalis pubescens

+ Phổ ký chủ

Trong tự nhiên, PVY xuất hiện trên ít nhất 41 loài thuộc 4 họ khác nhau như: ớt, cà chua, khoai tây, thuốc lá và một số cây họ cà khác là ký chủ chính Các chủng virus có thể lây nhiễm nhân tạo trên 400 loài thực vật trong ñó có hơn 300 loài thuộc cây họ cà [27] Trong số các loài mẫn cảm này, các loài

sau ñây ñược sử dụng thường xuyên như cây chỉ thị ñể kiểm tra: Capsicum frutescens, Chenopodium amaranticolor, C quinoa, Lycium spp., Nicotiana glutinosa , Physalis pubescens, Solanum chacoense, Solanum demissum, Solanum tuberosum , Tinantia erecta , Solanum demisum hybride

+ Phân bố ñịa lý

PVY phân bố rộng khắp Thế giới và là một trong những bệnh quan trọng nhất gây hại trên khoai tây Cho ựến nay có 3 nhóm chắnh ựã ựược phân biệt: PVYO, PVYN, PVYC

PVYO (chủng thông thường) ựược tìm thấy ở tất cả các nước trồng khoai tây trên Thế giới

PVYN là chủng ựã ựược báo cáo ở Châu Âu, Nam Mỹ, Bắc Mỹ và một phần Châu Phi (Stevenson và ctv.,2001)

PVYC có mặt ở đông Australia, Nam Mỹ, New Zealand, Châu Âu, Nam Phi và Nam Mỹ

Ngoài ra PVY còn có chủng PVYNTN PVYNTN là một chủng mới ựược tìm thấy lần ựầu tiên ở Châu Âu vào năm 1984 (Beczner và ctv.,1984) và ựược báo cáo sau ựó bởi nhiều tác giả PVYNTN là một chủng mới ựược cấu tạo thành bởi các nhóm dưới của các isolate PVYN (Boonham và ctv.,1998) Chủng này ựã ựược báo cáo ở Châu Âu, New Zealand, Trung đông, Nam Mỹ

và Nhật Bản

+ đặc ựiểm sinh vật học và sinh thái học

Nhiều nghiên cứu ựã kết luận virus Y có thể truyền bằng tiếp xúc cơ học [20][28][10]

PVY lan truyền không bền vững qua trên 50 loài rệp [152][149] [141][46], những loài rệp ựược biết ựến là khác nhau thì khả năng truyền virus của chúng là khác nhau (Kenedy và cộng sự, 1962; Sigvald, 1984) Tất

cả các công trình nghiên cứu chỉ ra rằng rệp ựào Myzus persicae truyền virus rất hiệu quả Ngoài ra một số loài khác cũng truyền PVY như: Phorodon humuli , Rhopalosiphum insertum, Aphis nasturtii

PVY không truyền qua hạt mà truyền qua củ khoai tây Mầm củ khoai tây có khả năng nhiễm virus cao nhưng lúc ựó ở trạng thái ẩn triệu chứng

+ Thiệt hại kinh tế

Virus Y khoai tây là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất cho khoai tây trên Thế giới, ựặc biệt là ở các vùng khắ hậu nóng và có một mùa ựông lạnh

Ở Châu Âu, PVY cũng là một bệnh hại quan trọng, nhất là ở đông Âu

và Liên Xô cũ Theo S.M.Bukashov và A.Y.A.Kamera (1972), PVY làm giảm năng suất khoai tây ở Liên Xô cũ khoảng 50 - 90% sản lượng trên một ruộng

bị bệnh nặng

A.J.Reestman (1970) cho biết PVY làm giảm năng suất khoai tây ở Tây

Âu khoảng 50% khi triệu chứng nặng

Theo Weideman (1979), năng suất khoai tây có thể giảm tới 60% khi bị bệnh nặng

Theo De Bokx và Huttinga (1981), thiệt hại về năng suất khi khoai tây

bị nhiễm PVY lên tới 80% Tùy theo từng giai ựoạn bị hại, chủng gây hại mà năng suất có thể mất từ 10- 100%

Thiệt hại do PVY gây ra sẽ lớn hơn rất nhiều khi PVY có mặt gây hại cùng các virus khác, ựặc biệt là PVX, PVA, PVS

Khi PVYO gây hại cùng PVX làm năng suất giảm 10 lần so với khi nhiễm riêng trên khoai tây, thuốc lá Thiệt hại về năng suất do PVY gây ra là 57% và 71% khi nhiễm cùng với PVX (Corsini và ctv, 1938)

Các thiệt hại gây nên do PVY còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong ựó giống khoai tây và chủng virus là hai yếu tố quan trọng nhất Chủng virus YN,

ựã gây tác hại nặng nhất ựối với khoai tây ở Tây Âu rồi ựến đông Âu Chủng

YO phổ biến và gây tác hại lớn ở nhiều nơi trên Thế giới

+ Hình thái của virus

Virus Y có dạng hình sợi nhỏ, mềm, dài 720 - 730nm, ựường kắnh 11nm

và có cấu trúc xoắn Các sợi virus khi làm sạch, có trường hợp chỉ dài 684nm

(R.G.Groganm, 1970) Sợi virus Y có ñặc ñiểm thường xoắn lại với nhau, ít bị tách rời Phân tử có cấu trúc vòng xoắn với chiều dài vòng xoắn 3,3nm

Theo Gorier và Woods (1971); Huttinga (1975), chiều dài và ñộ mềm mại của PVY không bị ảnh hưởng bởi ion Mg2+ hoặc Ethyl Diamine Tetra Acetate (EDTA), chính ñặc ñiểm này làm cho nó khác với các Potyvirus khác [20]

Cấu trúc phân tử của virus Y gồm vỏ protein và lõi axit nucleic Axit nucleic là loại ARN có cấu trúc ñơn, có trọng lượng 3,1- 3,2 x 106, chiếm 5,4-6,4% toàn bộ sợi (Leiser và Richter, 1978) [18][30]

Vỏ protein gồm 2 chuỗi polypeptide chuyển ñộng như dải băng trong ñiện di SDS - polyacrylamide

Theo Hiebert và Mcdonal (1973) [26]; Huttinga và Mosh (1975); Moghal và Francki (1976) [27] thì chuỗi lớn có 34.000 ñơn vị và chuyển ñộng chậm hơn, còn chuỗi nhỏ chuyển ñộng nhanh hơn với 28.000 ñơn vị Phần protein chiếm 93,6 - 94,6% khối lượng toàn bộ sợi [18]

Genom bao gồm một sợi ARN ñơn Kích thước tổng số của genom gồm 9.754 nucleotides, trình tự của gen ñã ñược xác ñịnh [145]

+ ðặc ñiểm chống chịu của virus

Năm 1951, Darby và ctv ñã làm thí nghiệm với 18 chủng PVY khác nhau gây hại trên thuốc lá cho thấy ở 540C sau 10 phút tất cả các chủng vẫn

có khả năng lây nhiễm, nhưng tới 620C thì không còn khả năng lây nhiễm nữa Tác giả kết luận nhiệt ñộ làm mất hoạt tính của PVY là 620C, thời gian tồn tại trong dịch chiết lá thuốc lá bệnh từ 7 - 18 ngày ở 20 - 220C ðiểm hòa loãng tối ña là 10-4 - 10-6 Virus có thể giữ khả năng lây bệnh trong lá bệnh khô có phủ 1 lớp CaCl3 ở 40C có thể bảo quản virus trong 6 tháng [9]

Theo Smith (1957), ñộ pha loãng gây bệnh của PVY là 1/1000 [32] Walker (1965), virus Y mất hoạt tính trong dịch cây sau 36h ñể ở nhiệt

ñộ phòng thí nghiệm [34]

Theo R.G.Gogan (1970), virus có nhiệt ñộ mất hoạt tính Q10 khoảng 55

- 600C Ngưỡng pha loãng của dịch cây bệnh khoảng 10-2 - 10-3 Virus trong dạng dịch cây ở nhiệt ñộ phòng thí nghiệm có thể giữ ñặc tính lây bệnh giọt dịch từ 48 - 72 giờ [6]

Peter Wildy (1971) cho rằng : nhiệt ñộ mất hoạt tính Q10 của virus Y khoảng 50 -600C, virus có nồng ñộ trong dịch cây sau khi làm sạch là 5 - 25mg/l [6]

A.G.Zukin (1976) cho biết: nhiệt ñộ mất hoạt tính của virus Y khoảng

560C, virus giữ ñược hoạt tính trong giọt dịch 48 ngày, có ngưỡng pha loãng lớn nhất tới 10-5 ðặc biệt, virus giữ ñộc tính trong lá tươi ở 40C trong 6 ngày Nếu giữ lá tươi ở 1 lớp CaCl3 ở 40C có thể bảo quản virus trong 6 tháng Dùng lá khô ñể ở ñiều kiện ñông lạnh có thể bảo quản virus tới 11 tháng [7] + Triệu chứng gây bệnh

Với cây khoai tây, virus Y gây ra hiện tượng khảm lá nhẹ ñến khảm lá nặng hoặc gây ra các vết chết thâm ñen với sự chết hoại của mạch dẫn (Beemster và Rozendaal, 1972)

PVY thường kết hợp với các virus khác như: PVX, PVA… gây ra triệu chứng xoăn lùn, củ nhỏ hoặc không có củ

Solanan (1932) chia triệu chứng PVY trên khoai tây thành các nhóm: nhóm không biểu hiện triệu chứng, nhóm chỉ gây chết ở mô cây, nhóm khảm nhăn lá, nhóm khảm chết gân, nhóm khảm nhăn lá kèm theo chết gân

Các chủng virus khác nhau dẫn ñến triệu chứng biểu hiện trên cây khác nhau, các triệu chứng này thường xuyên bị thay ñổi bởi sự ña dạng của mùa

vụ và ảnh hưởng của ñiều kiện khí hậu (De Boxk và Pison, 1974)

Sự nhiễm bệnh bởi chủng PVYN thường gây nên vết chết hoại hình tròn hoặc những chấm nhỏ và ñốm nhẹ Ở lần xâm nhiễm thứ hai có triệu chứng khảm rõ nêt Triệu chứng biểu hiện sớm hay muộn là tùy thuộc vào ñiều kiện

ngoại cảnh

Một số chủng gây chết hoại gây ra những tổn thất ở củ với những vết hoại hình trịn (chủng PVYC) Chủng PVYC gây ra những chấm lốm đốm chết hoại, nhăn lá hoặc chết đen gân

Sự nhiễm bệnh với những chủng thơng thường (chủng PVYO) gây nên những vết chết hoại, chấm nhỏ hay biến vàng phiến lá, lá héo rũ rồi chết Lá

bị bệnh cĩ triệu chứng đốm vằn nhẹ và đơi khi bị biến dạng Cuống lá rũ xuống và phiến lá cuộn về phía sau Khi bị bệnh nặng, trên những lá già cĩ những vết chết hoại màu nâu đen, gân lá biến vàng, trên thân vỏ mất dần màu Cây trưởng thành bị lùn

Theo Roger Jone, Satendra Kumar và Alison Mackie (2003) (Government of Western Astralia) triệu chứng của chủng PVYO và PVYC cĩ thể bao gồm: lá lốm đốm hoặc biến vàng, lá bị biến dạng, lá bị các đốm chết hoại hoặc hình nhẫn, gân lá chết hoại, lá nhỏ và cuống lá rũ xuống Cây bị nhiễm các chủng này cĩ thể mọc rậm rạp ở phần trên của cây với vài lá ở giữa cuống Tuy nhiên, cây bị xâm nhiễm các chủng nhẹ và các giống kháng cĩ thể biểu hiện triệu chứng nhẹ khơng cĩ vết chết hoại hoặc chồi non khơng bị chết sớm Chủng PVYN gây nên các dạng lá lốm đốm nhẹ

Trên các cây bị nhiễm PVYO, PVYN, PVYC thường xuất hiện củ quá dài Tuy nhiên, đối với chủng PVYNTN bên ngồi vỏ củ khơng đều, đốm hình nhẫn cĩ màu hơi nâu, chết hoại vịng quanh và phá hoại củ, cĩ dạng chết hoại hình cung ở thịt củ và cĩ những vết nứt ở vỏ trên bề mặt củ

2.1.6 Những nghiên cứu về chẩn đốn bệnh bằng phương pháp ELISA

Việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật hiện đại đã trở lên cần thiết và hữu hiệu trong việc chẩn đốn các bệnh nguy hiểm trên cây trồng Một trong những phương pháp hiệu quả, chính xác được áp dụng phổ biến trên Thế giới là phương pháp Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(ELISA) Ngày nay, nhiều dạng khác nhau của ELISA ựang ựược sử dụng thường xuyên [65][77] Trong ựiều kiện Việt Nam hiện nay, phương pháp ELISA ựặc biệt có ý nghĩa trong chẩn ựoán bệnh hại cây trồng do vi sinh vật gây ra

Năm 1969, khi Arrameas liên kết một kháng thể IgG với một Enzyme

và chứng minh rằng, kháng thể liên kết Enzyme này vừa duy trì tắnh ựặc hiệu miễn dịch của kháng thể vừa duy trì tắnh hoạt ựộng của Enzyme

Năm 1977, Clarck và Adams lần ựầu tiên ứng dụng phương pháp ELISA ựể chẩn ựoán các cây nhiễm bệnh virus thực vật

Hiện nay, có hai phương pháp ELISA ựang ựược ứng dụng rộng rãi là phương pháp Double Antibody Sandwich (DAS - ELISA), phương pháp này

gọi là phương pháp ELISA trực tiếp Phương pháp thứ hai là Indirect ELISA

gọi là phương pháp ELISA gián tiếp

+ Phương pháp ELISA trực tiếp (DAS - ELISA):

Phương pháp DAS - ELISA ựược sử dụng dưới dạng kỹ thuật ELISA kẹp kép kháng thể và ựược Clarck và Adam mô tả vào năm 1977 Phương pháp DAS - ELISA sử dụng kháng thể ựặc hiệu virus ựể vừa bẫy virus vừa phát hiện virus ựã bẫy ựược (kháng thể liên kết men sẽ tập hợp ựặc hiệu với virus ựược bẫy) Kỹ thuật này ựược sử dụng rộng rãi nhưng có hai nhược ựiểm:

- Rất ựặc hiệu chủng, do vậy khó phát hiện ựược các chủng của cùng một virus nếu chủng này có quan hệ huyết thanh kém Tắnh ựặc hiệu cao này

là do Enzyme khi liên kết với kháng thể ựã làm giảm khả năng kết hợp của kháng thể này với các chủng virus có quan hệ huyết thanh không chặt

- đòi hỏi phải có từng loại kháng thể liên kết Enzyme khác nhau cho mỗi loại virus [66]

+ Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA):

Theo Koenig R (1981), ưu ựiểm của phương pháp này là một kháng

thể đặc hiệu kháng thể (kháng thể liên kết với Enzyme) cĩ thể phát hiện rất nhiều chủng của virus cần kiểm tra đĩ ðộ nhạy của kháng nguyên cao hơn và

cĩ giá trị Optical Density (OD) ở các giếng đối chứng (mẫu cây khỏe) thấp hơn Cĩ được ưu điểm này là nhờ kháng thể đặc hiệu virus và kháng thể đặc hiệu kháng thể tạo ra từ động vật máu nĩng khác lồi (Rowhani and Falk, 1995) [85] Theo L.F Salazar (1990), phương pháp ELISA nĩi chung nhạy cảm rất nhiều và cũng cần ít huyết thanh hơn các phương pháp huyết thanh khác [9]

2.1.7 Nghiên cứu phương pháp truyền lan và xác định bệnh virus bằng cây

chỉ thị

Cây chỉ thị là cây báo hiệu hoặc giúp con người phát hiện ra một hiện tượng, một sự vật mà họ quan tâm Trong cơng tác bảo vệ thực vật, một số lồi cây rất mẫn cảm đối với một số chủng hoặc lồi vi sinh vật gây bệnh được dùng làm cây chỉ thị Trồng hỗn hợp các loại cây này lẫn với các cây

khác, khi thấy xuất hiện triệu chứng bệnh là biết ở nơi đĩ cĩ bệnh

Phương pháp sử dụng cây chỉ thị được áp dụng từ sau những năm 20 của thế kỷ thứ 20, các phịng thí nghiệm bệnh lý thực vật trên Thế giới khơng chỉ sử dụng cây chỉ thị để chẩn đốn bệnh virus thực vật mà cịn sử dụng trong việc chẩn đốn các chủng virus, nịi nấm, vi khuẩn và các nguyên nhân gây bệnh khác trên thực vật [21]

Với bệnh virus hại thực vật, phương pháp sử dụng cây chỉ thị khơng thể thiếu được Ngồi tác dụng chẩn đốn trong phịng thí nghiệm, phương pháp dùng cây chỉ thị cịn cĩ tác dụng nhân virus, tạo số lượng virus lớn để phục vụ nghiên cứu cơ bản trong phịng thí nghiệm [21][62]

Thực nghiệm nghiên cứu về Potato virus X cũng xác định được dạng

triệu chứng bệnh Trên cây cà độc dược (Datura stramonium) gây nhiễm hệ

thống, đốm vàng hình nhẫn, gây khảm và các đường vằn lốm đốm Trên cây

thuốc lá cũng gây triệu chứng tương tự Một số cây thường dùng ñể lây nhiễm

nhân tạo ñối với PVX là cây cải củ (Brassica campestris L.), cây cà ñộc dược (Datura stramonium), cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa), cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), cây khoai tây (Solanum tuberosum) [16][45]

Triệu chứng của PVX gây ra trên các cây chỉ thị chủ yếu phụ thuộc vào chủng virus Tuy nhiên, phần lớn các chủng virus ñều biểu hiện triệu chứng trên các loại cây chỉ thị

Trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum: gây nhiễm hệ thống, tạo ñốm

sáng sau chuyển thành vết chết hoại hình nhẫn

Trên cây rau muối (Chenopodium amaranticolor) và cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa): gây nhiễm bộ phận, vết chết hoại có viền ñỏ

Trên cây khoai tây (Solanum tuberosum) giống Arran crest, Epicure,

King edward: gây nhiễm hệ thống, thường chết hoại nghiêm trọng dẫn ñến chết cả cây

Trên cây cà ñộc dược (Datura stramonium) miễn dịch với virus Y nên

rất cần cho quá trình tách virus X ra khỏi hỗn hợp virus

Các nghiên cứu trên PVY cho thấy, trên giống thuốc lá Nicotinana tabacum var xanthi- nc là cây thích hợp cho việc nhân và giữ virus tinh sạch

Nicotiana tabacum ñược sử dụng làm cây chỉ thị ñể nhận biết các chủng PVY nhờ các triệu chứng khác nhau mà chủng ñó gây ra cho loài này

Cây Solanum demisum hybride “A6” và Chenopodium amaranticolor, C quinoa là các loài dùng làm cây chỉ thị cho PVY

Triệu chứng của PVY gây ra trên các cây chỉ thị Tùy theo các nhóm chủng khác nhau mà triệu chứng của PVY trên các cây chỉ thị là khác nhau

Trên cây rau muối (Chenopodium amaranticolor), PVY gây triệu chứng

vết vàng, sau có viền ñỏ, bên trong vết bệnh có màu trắng bạc hoặc khô

Trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), PVY gây nhiễm hệ thống, tạo

ñốm lá gân sáng

Trên cây thuốc lá (Nicotiana glutinosa), PVY gây nhiễm hệ thống, tạo

ñốm nhỏ ñến lớn

Trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum cv Samsun và N tabacum cv

White Burley) thường dùng ñể phân biệt chủng YO và YN Chủng YN gây hiện tượng sáng gân, sau ñó rải rác có các vết chết hoại hơi trắng hoặc hơi nâu Vùng chết hoại sau ñó chuyển xuống gân chính và phát triển làm gân chết hoại có màu nâu (Klinkowski và Schmelzer, 1960) [19]

Cây chỉ thị quan trọng nhất là cây Solanum demisum hybride “A6” Lá

cây bị nhiễm PVY trong ñiều kiện truyền bệnh lá cắt rời ở nhiệt ñộ 200C Cường

ñộ ánh sáng 1200- 1400 Lux sẽ tạo vết ñốm vòng khuyên có màu xám ñen

Hầu hết các chủng PVY ñều gây vết chết hoại cục bộ trên cây A6 (Boks, Kratchanora và Maat, 1975)

2.2 Những nghiên cứu ở trong nước

- Bệnh virus ñầu tiên ở Việt Nam ñược ghi nhận ñầu tiên là bệnh lúa vàng lụi ở Tây Bắc hại trên lúa nếp vào năm 1910 và ở Lạng Sơn vào năm

1920 [19]

- Từ những năm 1960, những nghiên cứu về virus khoai tây bắt ñầu ñược

ñề cập [7] ðến nay, bệnh virus hại khoai tây ñã ñược nghiên cứu bởi nhiều tác giả như: Nguyễn Hữu Thụy, Hà Minh Trung, Nguyễn Thơ, Vũ Triệu Mân

- Năm 1967, Nguyễn Hữu Thụy ñã xác ñịnh sự có mặt của virus X trên khoai tây

- Năm 1971, Hà Minh Trung và Nguyễn Phương ðại ñã ñiều tra bệnh virus hại khoai tây trên giống khoai tây Thường Tín và kiểm tra virus bằng phương pháp huyết thanh và phương pháp so màu, ñã xác ñịnh ñược virus X,

Y, S, M và xác ựịnh virus cuốn lá có tỷ lệ nhiễm bệnh cao từ 76 - 100% số mẫu ở một số vùng trồng khoai tây [40]

- Năm 1972, Nguyễn Thơ ựã xác ựịnh virus X và một số virus khác xuất hiện trên khoai tây ở Gia Lâm - Hà Nội

- Năm 1973, Vũ Triệu Mân bằng cách sử dụng ba phương pháp nghiên cứu: phương pháp cây chỉ thị, phương pháp huyết thanh, phương pháp hiển vi ựiện tử ựã xác ựịnh ựược 7 virus chắnh gây hại trên khoai tây ở miền Bắc Việt Nam, trong số này có virus X

- Năm 1976, Hà Minh Trung và Nguyễn Phương đại kiểm tra virus trên khoai tây bằng phương pháp kháng huyết thanh và ựã có kết luận Các virus

X, M, A, S ựã nhiễm trên khoai tây với tỷ lệ từ 10,3 - 66,1%

- Theo Vũ Triệu Mân (1981), virus khoai tây hại trên cà chua với tỷ lệ 20% trong vụ đông và trong vụ Xuân Hè là 25% Các chủng PVX1 và PVX2 ựều có mặt trên cây cà chua [17]

- Theo Nguyễn Hữu Thụy, Hà Minh Trung, Nguyễn Thơ, Vũ Triệu Mân (1973- 1983), PVY gây hại nghiêm trọng nhất trên khoai tây ở Việt Nam [19]

- Theo Nguyễn Thơ (1984), bệnh virus làm giảm năng suất từ 15-40%,

số lượng củ bé tăng lên từ 2-4 lần so với ựối chứng

- Theo Vũ Triệu Mân (1984), khi nghiên cứu bệnh virus hại khoai tây giống Ackersegen trồng ở miền Bắc Việt Nam ựã xác ựịnh ựược hai chủng PVX1 và PVX2 Theo tác giả, khi PVX kết hợp với PVY gây hiện tượng xoăn lùn, củ nhỏ hoặc không có củ Ngoài ra, PVX còn gây hại trên một số giống cây họ cà khác như: cà chua, ớt, thuốc lá Tác giả phân loại 5 triệu chứng cơ bản của virus khoai tây trên cà chua: xoăn xanh ngọn, xoăn vàng ngọn, xoăn lùn, cuốn lá và khảm lá [20]

- Theo kết quả nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1984), các virus gây hại trên khoai tây giống Ackersegen trồng ở miền Bắc Việt Nam là PVX, PVY,

PMV, PVA, PLRV và PAMV Bằng các phương pháp huyết thanh, phương pháp cây chỉ thị, phương pháp hiển vi điện tử, tác giả đã xác định các virus khoai tây gây hại trên một số cây trồng họ cà ở miền Bắc Việt Nam là PVX, PVY, PMV, PVA, PLRV và PAMV [17]

- Theo Vũ Triệu Mân (1986), bệnh virus hại khoai tây đã cĩ ở tất cả các vùng trồng khoai tây ở nước ta Tỷ lệ bệnh từ 20 - 70%, ở một số điểm điều tra tỷ lệ bệnh cĩ thể đạt 100% Các giống khoai tây triển vọng được nhập vào Việt Nam bị nhiễm bệnh khá nặng sau 3 năm trồng và bảo quản ở khu vực đồng bằng và trung du Bắc Bộ

- Năm 1989, Vũ Triệu Mân nghiên cứu về PVX trên giống khoai tây Ackersegen đã xác định tác nhân gây bệnh PVX gồm các chủng XV1 và XV2 Hai chủng này cĩ chiều dài từ 510 - 515 nm, chiều rộng là 11nm Ngưỡng pha lỗng là 1/100.000 Thời gian tồn tại trong phịng thí nghiệm ở 200C là 30 ngày Nhiệt độ mất hoạt tính là 70 - 750C Tác giả kết luận, bệnh virus khoai tây xuất hiện ở các vùng trồng khoai tây ở đồng bằng Bắc Bộ Tỷ lệ bệnh quan sát bằng mắt thường chiếm 40%, nếu tính cả bệnh ẩn cĩ thể lên tới 90% [18]

- Năm 1991-1992, Vũ Triệu Mân, H Lecoq (inra - pháp) và các cộng tác viên đã áp dụng phương pháp ELISA đế xác định một số virus cĩ mặt trên

24 loại cây trồng

- Năm 1996, Lê Sơn Hà và Hồng Hải Vũ, Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I đã sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đốn bệnh ẩn trên giống cây nhập nội vào miền Bắc Việt Nam Kết quả kiểm tra trên 9 giống khoai tây và cà chua đã xác định được 7 mẫu nhiễm virus trên các giống kiểm tra Các tác giả kết luận rằng: cĩ thể ứng dụng phương pháp ELISA vào phục vụ cơng tác Kiểm dịch thực vật để chẩn đốn bệnh virus [10]

- Theo NguyễnVăn Tuất (Viện Bảo vệ thực vật), virus sau khi ựã xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta có thể quan sát bằng mắt thường Tuy nhiên, cũng có trường hợp không ghi nhận ựược bất cứ một biểu hiện nào khác bằng mắt thường, người ta gọi là bệnh ẩn [23]

- Năm 1992, các chuyên gia côn trùng và bệnh cây Nhật Bản và đài Loan (Mitsuo kameza và Hong jisu), Viện Bảo vệ thực vật ựã thực hiện chẩn ựoán và giám ựịnh các bệnh virus bằng phương pháp thử DNA và ELISA ở Việt Nam trên nhiều loại cây trồng khác nhau [27]

- Theo Hà Minh Trung (1996), nhiều loại virus khoai tây và các cây thuộc họ cà ựã ựược phát hiện vào giai ựoạn 1970-1975 như virus X, Y, M, S, TMV, CMV , giai ựoạn này ựã sử dụng các phương pháp lây bệnh bằng côn trùng môi giới, cây chỉ thị, phản ứng kháng huyết thanh [28] Những kết quả nghiên cứu ựã công bố có ý nghĩa trong việc ựịnh hướng các nghiên cứu về sau

- Trong ựề tài "Bước ựầu nghiên cứu một số bệnh virus gây hại chắnh trên thuốc lá ở Tây Ninh", bằng phương pháp DAS - ELISA ựã xác ựịnh ựược

trên thuốc lá ở Tây Ninh có 6 loài virus gây hại: Tomato spotted wilt virus, Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic virus, Tobacco leaf curl virus, Potato virus Y và Tomato bushy stunt virus [1]

- Năm 2002, Bùi Ngọc Lan và Nguyễn Thị Ngọc Trúc ựã phát hiện thấy

4 loài virus trên các cây ký chủ khác nhau là Cucumber mosaic virus trên cây dưa chuột, cây ớt, cây dưa hấu, cây bắ: tomato mosaic virus trên cây cà chua, cây ớt; potato virus Y trên cây ớt và cây cà chua [15]

- Năm 2003, đoàn Thị Ái Thuyền, Lưu Việt Dũng, Vũ Triệu Mân ựã phát hiện tới 30,23% số mẫu nhiễm virus ToMV, PVX, PVY trong tổng số

140 mẫu thử của một số cây trồng thuộc họ cà Trong ựó có 23,25% mẫu bị

nhiễm ToMV, 36% mẫu bị nhiễm ñồng thời cả 3 virus ToMV, PVX, PVY; 18,2% mẫu bị nhiễm 2 virus ToMV và PVY [26]

-Năm 2005, khi nghiên cứu thành phần sâu bệnh hại thuốc lá ở Việt Nam, Nguyễn Văn Biếu (Viện nghiên cứu thuốc lá) ñã xác ñịnh ñược 9 loài

virus gây hại trên thuốc lá: Tobacco mosaic virus, Potato virus Y, Potato virus

A, Tomato spotted wilt virus, Potato virus X, Tobaco leaf curl virus, Cucumber mosaic virus, Tobacco ringspot virus, Tobacco etch virus và

Tobacco necrotic virus [5]

3 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

- Bệnh khảm lá (Potato virus X - PVX) trên khoai tây

- Bệnh khảm nhăn lá (Potato virus Y - PVY) trên khoai tây

3.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 10 / 2007 ñến tháng 10 / 2008

- ðịa ñiểm thực hiện ñề tài:

+ Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I- Hà Nội

+ Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội + Trung tâm nghiên cứu cây có củ - Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Giống khoai tây

- Mẫu củ khoai tây nhập khẩu thu thập từ Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I (CụcBảo vệ thực vật) năm 2007 và 6 tháng ñầu năm 2008 + Giống khoai tây ðức: Bellasora, Esprit, Solara, Marabel, Atlantic, Telly, Agria, Marella, Omega

+ Giống khoai tây Trung Quốc: VT2, KT2

+ Giống khoai tây Hà Lan: Diamant

- Mẫu lá khoai tây bị bệnh ñược thu thập trên những cây có triệu chứng virus ñiển hình Mỗi mẫu lá ñược bảo quản trong túi nilon có ñánh số thứ tự

và kí hiệu Sau ñó toàn bộ mẫu lá ñược cho vào trong hộp xốp có ñể chai nước ñá lạnh Trọng lượng mỗi mẫu thu thập khoảng 20 g Trọng lượng mỗi mẫu ñưa vào kiểm tra ELISA là 2 gam Các mẫu ñã xác ñịnh ñược virus cần kiểm tra ñược thu lại 10 gam lá bảo quản trong lạnh - 20oC ñể lây bệnh nhân tạo trên cây chỉ thị

3.3.2 Dụng cụ, hĩa chất nghiên cứu

3.3.2.1 Dụng cụ nghiên cứu

- Máy đọc bản ELISA, tủ lạnh sâu - 200C, tủ lạnh thường, máy đo pH, máy li tâm, cân điện tử, tủ định ơn

- Pipet tự động các loại, đầu cơn nhựa, bản ELISA 96 giếng

- Túi đựng mẫu, dụng cụ nghiền mẫu, dụng cụ rửa bản ELISA, giấy thấm, hộp nhựa cĩ nắp đậy

3.3.2.2 Hĩa chất nghiên cứu

- Các hĩa chất để pha dung dịch đệm: KH2PO4, NaCl, Na2CO3, KCl, Na2HPO4, NaN3, Tween 20, Ovabumin, Diethanolamine, PVP, NPP

- Kháng huyết thanh cần chẩn đốn: PVX, PVY do Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Trường ðHNN Hà Nội cung cấp

- Bột Cacborandum 600 mesh

3.3.3 Nội dung nghiên cứu

- Kiểm tra virus PVX và PVY trên mẫu củ giống nhập khẩu năm 2007

- 2008 trước gieo trồng tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I

- Kiểm tra bệnh virus trên mẫu giống khoai tây nhập khẩu gieo trồng trong nhà kính tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu I

- Kiểm tra bệnh virus trên mẫu giống khoai tây nhập khẩu trồng tại Trung tâm nghiên cứu cây cĩ củ- Viện khoa học nơng nghiệp Việt Nam

- ðiều tra tình hình và diễn biến triệu chứng bệnh virus tại khu thí nghiệm của Trung tâm nghiên cứu cây cĩ củ- Viện khoa học nơng nghiệp Việt Nam, vùng Hà Nội và phụ cận

- Tìm hiểu phương thức truyền bệnh của PVX và PVY

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.3.4.1.Phương pháp nghiên cứ ngồi đồng

- Tham khảo tiêu chuẩn ngành số 10 TCN 224-2003 ban hành kèm theo

quyết ñịnh số 82/2003/Qð -BNN ngày 4/9/2003 của Bộ nông nghiêp và Phát triển nông thôn và phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1 (Viện BVTV, 1997)

- Sử dụng phương pháp ñiều tra cơ bản của Trung tâm bệnh cây nhiệt ñới- Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội

ðiều tra theo phương pháp 5 ñiểm chéo góc Mỗi ñiểm ñiều tra 100 cây ñối với ruộng có diện tích lớn

ðiều tra tất cả các khóm ñối với cây trồng trong nhà kính và ruộng có diện tích nhỏ

ðiều tra ñịnh kỳ 10 ngày 1 lần và tính tỷ lệ bệnh

3.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng

+ Phương pháp kích thích nảy mầm

ðể chủ ñộng tạo mầm củ khoai tây ñể kiểm tra virus trước gieo trồng chúng tôi sử dụng quy trình phá ngủ khoai tây của Viện công nghệ sinh học- Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- Phun dung dịch GA3 2ppm + thioure 3% lên bề mặt khoai tây Tiến hành phun 5 lần và giữa mỗi lần phun phải ñể se vỏ mới phun tiếp

- Cho khoai tây vào thùng kín, dùng xilanh phun dung dịch CS2 vào chén và ñậy kín

- Sau 4 ngày xử lý (lúc này khoai tây ñã bắt ñầu nhú mầm), mang khoai tây ra và tiếp tục ủ ở nhiệt ñộ 20- 250C

- Sau 7 ngày có thể lấy mầm khoai tây ñể kiểm tra

+ Phương pháp kiểm tra mẫu củ giống trước gieo trồng:

Cân 2g mầm củ khoai tây, cho vào túi nilon nghiền nhỏ với ñệm chiết mẫu với tỷ lệ 1:10 Dung dịch mẫu ñược dùng ñể giám ñịnh virus PVX và PVY

+ Phương pháp kiểm tra củ khoai tây trồng trong nhà kính:

Mẫu củ giống ñược gieo trồng trong chậu nhỏ ñã có sẵn chất nền (mùn rơm, chấu, mùn cưa ủ mục, xỉ than) ñã ñược xử lý nhiệt 700C trong 2h, mỗi chậu một cây Số lượng cây ñược trồng là 10 cây Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây Thu mẫu ở tất cả các cây ñể kiểm tra virus PVX và PVY + Lây bệnh trên cây chỉ thị :

- Sử dụng các mẫu khoai tây ñã ñược xác ñịnh nhiễm virus PVX và PVY thu từ ñiểm ñiều tra Bảo quản các mẫu bệnh này ở ñiều kiện nhiệt ñộ lạnh sâu -

200C ñể làm nguồn bệnh lây nhiễm khi tiến hành thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo

- Tiến hành gieo trồng các cây chỉ thị bao gồm một số cây thuộc họ thuốc lá và một số cây ký chủ hoang dại Các cây ký chủ làm cây lây nhiễm ñược kiểm tra ñảm bảo sạch bệnh virus, ñất trồng ñược xử lý nhiệt và nguồn nước ñược sử dụng riêng biệt Nhà lưới trồng cây ñược cách ly côn trùng, ñể khống chế các nguồn virus khác xâm nhiễm bệnh vào cây ký chủ tham gia thí nghiệm Các cây sau khi lây nhiễm ñược ñưa vào trong lồng lưới và chăm sóc

ở ñiều kiện bình thường

- Giá thể ñể gieo cây chỉ thị, cây ký chủ phụ: ñất phù sa ñược hấp khử trùng bằng nồi hấp chuyên dụng ở nhiệt ñộ từ 115 ñến 1200C trong 45 phút ñể tiêu diệt các nguồn bệnh vi sinh vật và côn trùng gây bệnh như nấm, vi khuẩn , tuyến trùng và các sinh vật khác có trong ñất thí nghiệm ðất sau khi ñã ñược hấp khử trùng ñược bổ xung phân bón vi sinh và trấu hun tạo ñược giá thể dùng

ñể gieo trồng cây chỉ thị Cây chỉ thị ñược gieo trồng chăm sóc cẩn thận Khi cây lớn, ñạt số lá thật nhất ñịnh thì tiến hành lây nhiễm nhân tạo Với cây thuốc lá ñạt 4 - 6 lá thật, cây rau muối có từ 8 - 10 lá thật [22]

+ Cây chỉ thị và cây ký chủ phụ :

Hạt cây chỉ thị dùng trong lây nhiễm nhân tạo do Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới cung cấp Khi tiến hành làm thí nghiệm phải ñeo găng tay cao su, sử