Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA 2013 - 2018

HÀ NỘI - 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA 2013 - 2018

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2018

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS

Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa

Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa Chúng tôi xin cảm ơn Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.17.01)

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi trong quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Trần Mai Anh

Trang 4

DAD Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector)

FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm

sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use)

EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

USP – NF Dược điển và Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (United States

Pharmacopoeia – National Formulary)

ATC Mã Giải phẫu – Điều trị – Hoá học (Anatomical – Therapeutic –

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về flurbiprofen 3

1.1.1 Cấu trúc, tính chất 3

1.1.2 Tác dụng dược lý 3

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang 4

1.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 4

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang 8

1.3 Các phương pháp định lượng flurbiprofen 10

1.3.1 Phương pháp chuẩn độ 10

1.3.2 Phương pháp quang phổ phân tử 10

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.3.4 Phương pháp sắc ký khí 15

1.4 Thẩm định quy trình phân tích 16

1.4.1 Tính đặc hiệu 17

1.4.2 Độ chính xác 18

1.4.3 Độ đúng 19

1.4.4 Tính tuyến tính 20

1.4.5 Miền giá trị 20

1.4.6 Giới hạn phát hiện 21

1.4.7 Giới hạn định lượng 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 23

Trang 6

2.1.1 Dung môi, hóa chất 23

2.1.2 Trang thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 24

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích 29

2.2.3 Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 31

3.1.1 Cài đặt các thông số ban đầu 31

3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch khảo sát 31

3.1.3 Xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu 32

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 35

3.2.1 Tính đặc hiệu 35

3.2.2 Tính tuyến tính và miền giá trị 37

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 38

3.2.4 Độ đúng 39

3.2.5 Độ chính xác 39

3.3 Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén 42

3.4 Bàn luận 42

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Công bố kết quả nghiên cứu

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 Chương trình pha động gradient 17 Bảng 4

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa

Bảng 5 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng

độ dung dịch chuẩn và diện tích pic của flurbiprofen 41 Bảng 6 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp 43 Bảng 7 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 44

Bảng 8 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của

Bảng 9 So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp

Bảng 10 So sánh các thông số thẩm định quy trình định lượng

flurbiprofen của đầu dò DAD và đầu dò FLD 48

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Công thức cấu tạo của flurbiprofen 3

Hình 4 Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang 13

Hình 6 Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ

Hình 12

Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu của các pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c)

40

Hình 13 Sắc ký đồ của mẫu phân huỷ dưới tác động của tác

nhân oxi hóa H2O2 với đầu dò FLD 41 Hình 14 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ

Trang 9

MỞ ĐẦU

Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt Khi sử dụng bằng đường uống, flurbiprofen thể hiện hiệu quả trong điều trị tấn công các bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng [10] Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp [10] Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13] Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu rất mạnh và giảm nguy cơ cũng như trì hoàn sự xuất hiện của bệnh Alzheimer khi sử dụng lâu dài [17, 23, 25, 32] Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [18]

Trên thế giới, đặc biệt là tại các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ, flurbiprofen đang được sử dụng rộng rãi dưới nhiều tên thương mại khác nhau như Antadys, Amedolfen, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên các thuốc này chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có chuyên luận về Flurbiprofen Phát triển các nghiên cứu về flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm lựa chọn thuốc trong điều trị, nhất là với một thuốc có giá trị ứng dụng lâm sàng cao và tác dụng đa dạng như flurbiprofen Một tính chất đáng chú ý

là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là hướng nghiên cứu được quan tâm trên thế giới [10, 18, 25, 35]

Trong quá trình tìm hiểu của chúng tôi, cho đến thời điểm hiện tại, trên thế giới chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để định lượng flurbiprofen trong dược phẩm tinh khiết và các dạng bào chế được công bố Số lượng các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để xác định flurbiprofen trong dịch sinh học

Trang 10

là không nhiều Điều này càng cho thấy tính mới và cần thiết của việc xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode–array [2] Mục tiêu của đề tài

này là tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên

nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European

Medicines Agency – EMA) [8] và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) [33]

Trang 11

mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04 [36], mã Pubchem là

3394 [28] và mã Drugbank là DB00712 [16]

Hình 1 Công thức cấu tạo flurbiprofen

Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học (+) S và (–) R Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [12]

Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như trắng

và nóng chảy ở 114 – 117oC Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC là 8 mg/L (22oC), các chỉ số LogP và LogS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [15, 16, 28]

Trang 12

(COX) không chọn lọc, từ đó ức chế hoạt động của cả hai enzyme COX–1 và COX–2 – có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2)

và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic Nồng độ prostaglandin giảm giúp cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt

Tác dụng dược lý

Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của hai đồng phân quang học (+) S và (–) R Đồng phân (+) S thể hiện hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm đau

Thuốc được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối với bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp, đau thắt lưng, viêm gan cấp tính [10] Thuốc cũng có thể được sử dụng

để giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình

đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13] Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu rất mạnh Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy việc sử dụng lâu dài flurbiprofen làm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và trì hoãn

sự xuất hiện của nó [17, 23, 25, 32] Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ [18]

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang 1.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển

của pha động lỏng dưới áp suất cao

Hình 2 Sơ đồ hệ thống HPLC

Trang 13

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp [6, 7, 11, 26, 34]

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

– Thời gian lưu

tR (Thời gian lưu) là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào

hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó

t0 (Thời gian chết) là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký

tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR – t0

W: chiều rộng đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic

Hình 3 Minh hoạ các thông số sắc ký

- Hệ số dung lượng k

Trang 14

Trong đó:

Vs : thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động

Qs: lượng chất trong pha tĩnh; Qm: lượng chất trong pha động

Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1 < k’< 8

W1/20 : chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2 Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối

- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số Số đĩa lý thuyết N của cột:

Trong đó:

W: chiều rộng đo ở đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

- Độ phân giải R s

Trang 15

Trong đó:

tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB , WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn

vị Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia thành 4 bước Mỗi bước đều có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng Các bước này là:

- Lấy mẫu thử

- Tiến hành sắc ký

- Đo tín hiệu đầu dò

- Phương pháp định lượng

Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng

Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [5, 6]:

- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản,

trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử

những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội Từ những dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội

và mẫu thử có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác

- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết

của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫu

Trang 16

thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng của diện tích hoặc chiều cao pic

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một

chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa trên cơ chế hấp phụ – chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ

và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ) Sắc kí hấp phụ được dùng nhiều để tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước

có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000đvC Phương pháp này mạnh hơn hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân

Hiện tượng huỳnh quang

Hiện tượng quang – phát quang là sự hấp thụ ánh sáng có bước sóng này để phát ra ánh sáng có bước sóng khác thường trong miền ánh sáng nhìn thấy Định luật Stokes về sự phát quang: ánh sáng phát quang có bước sóng dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích λpq > λkt

Huỳnh quang là sự phát quang (phát xạ bức xạ điện từ, thường là ánh sáng nhìn thấy) thường xảy ra với chất lỏng và chất khí khi phân tử hấp thụ năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon) Hiện tượng phát huỳnh quang có thời gian phát quang ngắn, huỳnh quang tắt sau khi ngừng kích thích khoảng từ 10-8 đến 10-9s Trong đó thời gian tồn tại của electron ở trạng thái kích thích là rất thấp, cỡ 10-9 giây

Quá trình phát xạ năng lượng của huỳnh quang có 2 bước Bước 1 phát

xạ dưới dạng nhiệt (phonon), bước 2 phát xạ dưới dạng quang (photon) nên năng lượng photon khi phát xạ sẽ không thể tương đương năng lượng mà phân tử đã hấp thụ trước đó

Đầu dò huỳnh quang

Đầu dò là một trong những bộ phận quan trọng được sử dụng trong

Trang 17

máy phân tích sắc ký Đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định lượng [1, 6]

Đầu dò huỳnh quang ứng dụng hiện tượng nhiều hợp chất có khả năng hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn ngay lập tức (huỳnh quang) hoặc sau một thời gian ngắn (lân quang) Phần năng lượng phát xạ trở lại sau khi bị hấp thụ thường tương đối thấp nhưng ở một vài hợp chất, phần phát xạ trở lại có thể có độ lớn từ 0.1 – 1 năng lượng hấp thụ nên thích hợp cho việc dò tìm huỳnh quang [1, 7]

Bảng 1 Đặc điểm của một số đầu dò

Kiểu đầu dò Đáp ứng Mức ồn Giới hạn phát

hiện (g/cm3)

Thể tích buồng đo (μl)

UV–VIS Chọn lọc 10-4 a.u 10-8 1-8 Huỳnh quang Chọn lọc 10-7 a.u 10-12 8-25

Đo độ dẫn Chọn lọc 10-2 μS/cm 10-7 1-5

Đo chỉ số khúc xạ Phổ thông 10-7 r.i.u 10-6 5-15 Đầu dò huỳnh quang là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang Phổ huỳnh quang là phổ phát xạ phân tử Sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ

tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức

xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang Cường độ huỳnh quang F của một dung dịch loãng tỉ lệ thuận với nồng độ C (mol/l) trong điều kiện xác định khi cường độ và bước sóng kích thích là hằng số Việc đo phổ huỳnh quang chỉ nên tiến hành với dung dịch loãng C < 10-4 mol/l để tránh ảnh hưởng suy giảm cường độ của bức xạ phát ra [6]

Hình 4 Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang

Trang 18

Đầu dò huỳnh quang (FLD) là đầu dò nhạy nhất trong số các đầu dò hiện có của HPLC, có thể phát hiện sự hiện diện của một phân tử chất duy nhất trong buồng đo Thông thường, độ nhạy của đầu dò huỳnh quang cao hơn 10 – 1000 lần so với đầu dò UV – Vis Đầu dò huỳnh quang chính xác và

có tính chọn lọc hơn các đầu dò quang học khác

Khoảng 15% các hợp chất trong tự nhiên có huỳnh quang Đầu dò huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang Sự hiện diện của các liên kết liên hợp, đặc biệt là trong các thành phần thơm có nhiều nhân cho cường độ huỳnh quang cao nhất Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hợp [4, 7]

1.3 Các phương pháp định lượng flurbiprofen

1.3.1 Phương pháp chuẩn độ

Theo Dược điển châu Âu (EP) 2010 [14] và Dược điển và Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (USP 40 – NF 35) [15], phương pháp chuẩn độ dựa vào phản ứng acid – base của gốc acid trong cấu trúc flurbiprofen Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng bền hơn 30 giây [15] Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [15] 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2

Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và người phân tích

1.3.2 Phương pháp quang phổ phân tử

Phương pháp quang phổ phân tử: Phổ UV – Vis, phổ hồng ngoại, phổ huỳnh quang đóng vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc Hầu hết các dược điển đều áp dụng phương pháp này trong định tính, định lượng và thử tinh khiết của thuốc và chế phẩm

Nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới

Trang 19

thiệu hai phương pháp quang phổ phân tử định lượng flurbiprofen Phương pháp được tiến hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH và EMA [11]

Trong quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV – Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet 1 cm, tốc độ quét

600 nm/phút, dải quét 190 – 320 nm, độ rộng khe 2 nm Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 trong hệ điều hành Windows Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 1 – 14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml

Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng máy đo huỳnh quang Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU RF–5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm, bước sóng kích thích λex= 248 nm, bước sóng phát xạ λem=

308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 trong hệ điều hành Windows Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 – 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml

Các phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện ngắn, ít tốn kém, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất nhỏ Vì vậy, những phương pháp này có thể được sử dụng thành công để phân tích dược phẩm, liên quan đến kiểm soát chất lượng sản phẩm thương mại và nghiên cứu dược động học Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

USP 40 – NF 35 [15] và BP 1993 [29] đều đề xuất phương pháp HPLC

để phân tích flurbiprofen tinh khiết và ở dạng phân liều (thuốc viên và thuốc nhỏ mắt) Cả hai phương pháp đều đề nghị sử dụng pha động acetonitril : nước :

Trang 20

acetic acid băng (60 : 35 : 5; v/v/v) ở tốc độ dòng 1 ml/phút

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV – Vis

Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ thống HPLC – DAD [14] Dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp acetonitril : nước (45:55) Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung môi trên để được 100 ml Pha tĩnh là octadecylsilyl silica gel kích thước 5 µm trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm Pha động là hỗn hợp axit axetic : acetonitril : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60 Tốc độ dòng 1 ml/phút Thể tích tiêm là 10 µl Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD Pha tĩnh được sử dụng là cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút Mẫu được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút, bước sóng phát hiện 247

nm Thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml, diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (μg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ theo phương trình y

= 0,680x với bình phương hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,9993 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với flurbiprofen, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71%, độ lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34% [2]

Phương pháp có những ưu điểm là độ chính xác cao, nhạy với các nồng

độ nhỏ, tính đặc hiệu cao nên có khả năng tách các chất ra hoàn toàn và có thể

áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi Đặc biệt đầu dò DAD có khả năng quét phổ hấp thụ, ứng dụng trong kiểm tra độ tinh khiết của mẫu Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền

và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ

Trang 21

Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen

và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng

hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC – MS/MS) [22,

24, 26, 27]

Nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương pháp LC–MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [24] sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu UFLC LC–30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ) Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm Điều kiện chạy nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 2

Bảng 2 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

Thông số Giá trị

Thế phun điện tử –4,5 kV Nhiệt độ mao quản 400 oC

Đầu dò với các thông số Năng lượng va chạm (CE) = –12 V, Thế phân nhóm (DP) = –26 V, Thế đầu vào (EP) = –8 V, Năng lượng (CXP) = –8 V Ion có dạng 242,9 → 198,7

Pha tĩnh: cột silica gel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex

Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 3

Bảng 3 Chương trình pha động gradient

Thời gian (phút) Tốc độ dòng

(ml/phút)

Kênh A: Nước:

Acid formic (99,9 : 0,1; v/v)

Kênh B: Acetonitril: Acid formic (99,9 : 0,1; v/v)

Trang 22

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Phương pháp HPLC–MS / huỳnh quang đã được Kuma và các cộng sự phát triển để định lượng flurbiprofen cùng dextromethorphan, midazolam và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tương lợn Các chất được phân tách bởi cột Luna C8(II) (50 mm L × 3 mm ID) (Phenomenex, Torrance, CA) với thời gian cho 1 lần chạy mẫu là 20 phút Flurbiprofen và 4 – hydroxyl – flurbiprofen được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang còn các chất còn lại (dextromethorphan, dextrorphan, midazolam và 1 – hydroxyl – midazolam) được phát hiện bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương Hệ thống sắc ký (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm hai máy bơm LC–10ADVP, một máy khử khí DGU–14A và một bộ lấy mẫu tự động SIL–10ADVP Đầu dò sử dụng là đầu dò huỳnh quang RF10–XL (Shimadzu, Nhật Bản) ghép đầu dò khối phổ LCMS–2010A (Shimadzu, Nhật Bản) Pha động bao gồm methanol (dung môi A) và đệm ammonium acetate 20 mM (điều chỉnh đến pH 3,9 với axit formic) (dung môi B) Tốc độ dòng 0,2 ml / phút và thực hiện sắc ký ở nhiệt độ môi trường Nồng độ của methanol trong dung môi tăng từ 40% tại thời điểm tiêm mẫu đến 90% sau 10 phút và duy trì đến hết quá trình sắc ký (20 phút) Flurbiprofen và 4 – hydroxyl flurbiprofen được cài bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng phát xạ λEm = 320nm [21] Có thể thấy cặp bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng

Trang 23

phát xạ λEm = 320nm được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác [19, 30]

Một nghiên cứu đã mô tả phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để xác định flurbiprofen trong huyết thanh người với mục đích nghiên cứu dược động học đã sử dụng pha động axetonitrile : nước : acid phosphoric (650 : 350 : 0,5; v/v/v) Tốc độ dòng là 1,0 ml / phút, thể tích tiêm mẫu 20ml

và thời gian chạy cho mỗi mẫu là 8 phút Quy trình định lượng sử dụng đầu

dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx = 250nm và bước sóng phát xạ

λEm = 315nm Thời gian lưu của flurbiprofen và acid 4 – biphenylacetic lần lượt là 5 phút và 6,1 phút [9]

Nghiên cứu của Knadler và các cộng sự (1989) lại sử dụng pha động là acetonitril : nước (62 : 38) với tốc độ dòng 1ml/phút qua cột C18 Quy trình định lượng sử dụng đầu dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx = 200nm và bước sóng phát xạ λEm = 320nm [20]

m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách Tiêm mẫu không chia dòng, khí mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ đầu phun và máy dò là 250°C Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV Miền giá trị được xây dựng trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt 99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml

Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,

độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao Phương pháp

Trang 24

này có nhược điểm là giá thành cao, không áp dụng được cho những chất không bền nhiệt và chất dễ khó hơi

1.4 Thẩm định quy trình phân tích

Quy trình phân tích hay cũng còn gọi là quy trình thử nghiệm (test procedures) là sự mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện một thử nghiệm phân tích (analytical test), bao gồm từ việc chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn và các thuốc thử, việc sử dụng các trang thiết bị, việc xây dựng đường cong chuẩn độ, cho đến việc sử dụng công thức để tính toán và biện giải kết quả, v.v…[5]

Thông thường có 4 loại quy trình phân tích được thẩm định [3, 5]:

- Quy trình định tính (identification test)

- Quy trình định lượng tạp chất (quantitative tests for impurities’ content)

- Quy trình thử giới hạn tạp chất (limit test for the control of impurities)

- Quy trình định lượng (quantitative tests of the active moiety or other

components)

Quy trình định lượng là quy trình nhằm đo lường chất cần thử trong mẫu thử Đối với chế phẩm, thử định lượng nhằm xác định hàm lượng của các hoạt chất có trong mẫu chế phẩm đem thử [5]

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình thực hiện thiết lập các thông số đặc trưng của phương pháp để cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến Nói cách khác kết quả của việc thẩm định một quy trình phân tích có thể chứng minh một cách khoa học rằng các sai số mắc phải của quy trình thử nghiệm là rất nhỏ và chấp nhận được, nhằm đảm bảo quy trình phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích [3, 5]

Theo ISO/IEC 17025 – tiêu chuẩn về hệ thống quản lý chất lượng áp dụng chuyên biệt cho phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, do Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế International Organization for Standardization (thường gọi tắt là ISO) phát triển và ban hành, phương pháp phân tích phải được thẩm định hoặc thẩm định lại khi [3]:

- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn

Trang 25

(nonstandard method)

- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa

vào sử dụng thành thường quy

- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng

của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn

- Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người

phân tích…)

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp” (Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [33], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc

phải có trong quy trình thẩm định

không phải là pic của hai thành phần trở lên [3, 5]

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:

- Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không

có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [3, 5, 31, 33]

Phương pháp xác định

Trang 26

Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp Độ nhiễu càng thấp,

tính đặc hiệu càng cao

Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên

Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm phân huỷ

1.4.2 Độ chính xác

Khái niệm

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện Độ chính xác cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so

với giá trị trung bình [3, 5, 31, 33]

Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên

Độ lặp lại: Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và

trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, trên cùng một thiết bị

và trong cùng một thời gian

Tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%

Độ chính xác trung gian: Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các

biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày),

với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với các trang thiết bị khác nhau…

Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể để đưa ra những cách thức xác

Trang 27

định phù hợp Nguyên tắc chung là phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy… thay đổi

Yêu cầu

Tiêu chuẩn cho giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2% Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [3, 5]

1.4.3 Độ đúng

Khái niệm

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [3, 5, 31, 33]

Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau)

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:

Tỷ lệ phục hồi = 𝑋

µ × 100%

Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết

Yêu cầu

Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [3, 5] Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao

Trang 28

1.4.4 Tính tuyến tính

Khái niệm

Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của

đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x)

Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [3, 5, 31, 33]

Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ [3,

5, 31, 33]

Trang 29

- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định

- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn phát hiện được

- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử:

áp dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là

S LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

LOD = 3,3 × 𝑆𝐷

𝑎

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng

Trang 30

1.4.7 Giới hạn định lượng

Khái niệm

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [3, 5, 31, 33]

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

LOD = 10 × 𝑆𝐷

𝑎

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

Trang 31

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị

2.1.1 Dung môi, hóa chất

Flurbiprofen đạt tiêu chuẩn chất chuẩn theo dược điển châu Âu (code: EPF0285200)

Natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn HPLC

Nước (H2O) được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV–TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m

Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Antadys 100mg Theramex, Pháp số lô 1M620 01 2014

Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150mm

Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang

bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC – 150H, MRC Ltd, Isareal Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản, Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ Bình định mức, ống đong, cối chày, giấy lọc Whatman®

40, đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm, Sartorius, Đức

Trang 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang, thẩm định quy trình phân tích và ứng dụng phương pháp đã thẩm định

để định lượng flurbiprofen trong viên nén Antadys 100 mg Theramex, Pháp

Trước khi sắc ký, các mẫu đều được lọc bằng đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm, tiêm mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình

Xử lí thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel

2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

Khi phát triển một phương pháp HPLC, ta muốn đạt được một mức độ tách có thể chấp nhận được tất cả các cấu tử ta quan tâm trong mẫu với một thời gian vừa phải và độ phân giải vừa đủ xác định Một số mẫu ta chỉ cần phân tích một hoặc vài cấu tử có trong mẫu

Ở một mức độ nào đó, sự tách có thể chịu ảnh hưởng bởi các thông số như nhiệt độ, cột tách, tốc độ dòng của pha động, đầu dò, thể tích tiêm mẫu và một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát tách là thành phần của pha động [7]

Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen bằng phương pháp HPLC – DAD, chúng tôi sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen nồng độ 20 μg/ml để khảo sát và đã xác định được các điều kiện sắc ký tối ưu như sau [2]:

- Pha tĩnh cột silica gel C8 5 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm

- Pha động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v)

ưu Phương pháp được tiến hành như sau:

Trang 33

Nhiệt độ buồng đo

Nhiệt độ của mẫu ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang của nó Do đó, sự biến đổi của nhiệt độ môi trường ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu thu nhận được

từ đầu dò huỳnh quang Đầu dò huỳnh quang mà nghiên cứu sử dụng cho phép nâng nhiệt độ của buồng đo và kiểm soát nhiệt độ trong buồng đo ở mức nhiệt độ ổn định để đảm bảo buồng đo ổn định ngay cả khi nhiệt độ môi trường thay đổi Cài đặt nhiệt độ của buồng đo cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 15˚C – như hướng dẫn của nhà sản xuất

Độ nhạy của đầu dò

Ống quang tử đo cường độ của ánh sáng phát xạ sau khi đi qua bộ tán

xạ đơn sắc Độ nhạy của ống quang tử được sử dụng để tối ưu tỉ lệ S/N trong sắc ký Độ nhạy được điều chỉnh trong quá trình sắc ký và tối ưu theo 8 mức dựa trên cường độ của quang phổ phát xạ huỳnh quang Mức 8 ứng với độ bão hòa của ống quang tử ≥ 100% Mỗi mức của độ nhạy tăng lên tương ứng với sự tăng xấp xỉ 2 lần của cường độ quang phổ phát xạ huỳnh quang

- Nếu lựa chọn độ nhạy quá nhỏ, chiều cao pic giảm xuống và tỉ lệ

S/N không tối ưu

- Nếu lựa chọn độ nhạy quá lớn, tín hiệu của ống quang tử bão hòa Trong trường hợp này đầu dò tự động giảm độ nhạy đã cài đặt Khi cài đặt độ nhạy quá lớn, sắc ký đồ có hình dạng như mức 8 ở hình 5, sau đó hệ thống tự

động cài lại độ nhạy trước đó

Hình 5 Thang độ nhạy của đầu dò FLD

Trang 34

Nồng độ dung dịch khảo sát

Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen trong chế phẩm dược phẩm bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang của Bilal Yilmaz và cộng sự (2015), khoảng tuyến tính được sử dụng là 50 – 350 ng/ml, bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm [11]

Từ đó, chúng tôi tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ

400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm để đánh giá hình dạng pic trên sắc ký đồ Dựa vào tín hiệu thu được và

độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử trên phần mềm điều khiển Chromeleon

Dionex, điều chỉnh nồng độ khảo sát phù hợp để giá trị độ bão hòa lớn nhất

của ống quang tử đạt tối ưu (30 – 80%) theo bảng 4:

Bảng 4 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống

quang tử

Giá trị độ bão hòa lớn

nhất của ống quang tử Giải pháp

< 30%

- < 30%: Tăng độ nhạy lên 1 mức

- < 15%: Tăng độ nhạy lên 2 mức

30% – 80% Giá trị độ nhạy là tối ưu

80% – 99%

Giảm độ nhạy đi 1 mức để tránh độ bão hòa của ống quang tử không mong muốn khi nồng độ thay đổi

≥ 100% Giảm độ nhạy đi ít nhất 1 mức

Bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu

Với hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo Scientific Hoa Kỳ sử dụng đầu dò FLD – 3100, cặp một bước sóng kích thích và một bước sóng phát xạ tối ưu sau khi được xác định sẽ cho tỉ lệ S/N tốt nhất ngay cả với những mẫu có nồng độ nhỏ Phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1 có những chế độ dò bước sóng như sau:

Trang 35

- Chế độ Zero Order

Trong chế độ Zero Order, bộ tán xạ đơn sắc cho toàn bộ quang phổ đi qua thay vì chỉ có một bước sóng nhất định Bước sóng kích thích được đặt trước thành 1 giá trị như bình thường Đầu dò FLD – 3400RS có thêm chức năng lọc vùng bước sóng không mong muốn Sau đó, cài đặt thuộc tính của bước sóng phát xạ và bắt đầu quét

Chế độ Zero Order phù hợp với các mẫu có nhiều chất phát xạ huỳnh quang với phổ phát xạ của mẫu rộng Cường độ của ánh sáng phát xạ trong chế độ Zero Order cao hơn so với khi hệ thống hoạt động bình thường Điều này cho phép hệ thống xác định được chất ở những nồng độ rất thấp

- Chế độ quét 2D

Với đầu dò FLD – 3100, hệ thống có thể ghi lại một số loại phổ 2D Các bước sóng kích thích hoặc bước sóng phát xạ (hoặc đồng thời cả hai) được quét trên một dải bước sóng được cài đặt Cường độ của các tín hiệu huỳnh quang sẽ được tính toán và ghi lại liên tiếp với mỗi bước sóng Qua đó, chế độ quét 2D ghi lại phổ 2D, từ đó xác định được bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu

Có 3 chế độ quét 2D như sau:

Quét đồng thời

Khi bước sóng kích thích đã được quét trong phạm vi bước sóng được cài đặt, bước sóng phát xạ được quét đồng thời với một khoảng cách chênh lệch cố định so với bước sóng kích thích Chức năng quét đồng thời cho phép xác định sơ bộ bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ Tuy nhiên để xác định chính xác cặp bước sóng tối ưu, cần sử dụng chức năng quét riêng biệt hai bước sóng

Quét bước sóng kích thích

Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải bước sóng được cài đặt Kết quả là phổ kích thích của mẫu

Trang 36

Quét bước sóng phát xạ

Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải bước sóng được cài đặt Kết quả là phổ kích thích của mẫu

- Chế độ quét 3D

Từ phiên bản Chromeleon 7.1 trở đi, chức năng quét 3D được hỗ trợ cho đầu dò huỳnh quang để xác định các thời gian lưu giữ và mức hấp thụ tối đa của hỗn hợp chất trong dung dịch Trái ngược với chế độ quét 2D, chế

độ quét 3D không cần chọn trước phạm vi bước sóng để quét mà quét liên tục trên toàn bộ dải phổ, chế độ này tương tự như chế độ quét phổ 3D của đầu dò DAD

Cũng như chế độ quét 2D, chế độ quét 3D bao gồm 3 chế độ Quét bước sóng kích thích, quét bước sóng phát xạ và quét đồng thời

Quá trình tối ưu hóa bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ có các tiêu chí chính sau:

- Tốt nhất là lựa chọn bước sóng kích thích là bước sóng hấp thụ tối đa của thành phần trong mẫu

- Pha động nên có các thành phần không hoặc ít hấp thụ bước sóng kích thích được lựa chọn Do đó bước sóng kích thích lựa chọn phải trên giới hạn cực tím của dung môi

- Chọn bước sóng phát xạ cao hơn ít nhất 20nm so với bước sóng kích thích

Trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu, chúng tôi cần xác định bước sóng kích thích tối ưu và bước sóng phát xạ tối ưu của một chất là flurbiprofen, do vậy việc sử dụng chế độ Zero Order là không cần thiết Qua

đó, nghiên cứu này lựa chọn chế độ quét 3D – lần lượt quét đồng thời để sơ

bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu, xác định bước sóng phát xạ tối ưu, xác định bước sóng kích thích tối ưu

- Sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu: Quét phổ đồng thời bước sóng kích thích trong dải 200 – 400nm và bước sóng

Trang 37

phát xạ trong dải 275 – 475nm (luôn chênh so với bước sóng kích thích một khoảng 75nm cố định)

- Xác định bước sóng phát xạ tối ưu: Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xác định được flurbiprofen có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 247nm [2] Cài bước sóng kích thích λEx = 247nm và quét phổ bước sóng phát xạ trong dải phát xạ xác định được

- Xác định bước sóng kích thích tối ưu: Cài bước sóng phát xạ λEm tối

ưu để quét phổ bước sóng kích thích trong dải 200 – 300nm chứa bước sóng hấp thu cực đại 247nm

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích

Tính đặc hiệu

Đầu dò FLD khác với đầu dò DAD là không có chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic thông qua sự trùng phổ hấp thụ Vì vậy để thẩm định tính đặc hiệu cần kết hợp với một phương pháp khác, ở đây chúng tôi sử dụng đầu

dò DAD [2]

Flurbiprofen được xử lý với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm phân huỷ mẫu và xác định xem flurbiprofen có tách hoàn toàn ra khỏi sản phẩm phân huỷ (nếu có) hay không Những mẫu xuất hiện pic của sản phẩm phân hủy trên sắc ký đồ khi xác định bằng phương pháp HPLC – DAD tiếp tục được tiến hành sắc ký bằng phương pháp HPLC – FLD để đánh giá

Tính tuyến tính và miền giá trị

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 5 nồng độ là 100, 50, 25, 10, 5 ng/ml Tiến hành phân tích các mẫu Xây dựng phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu Xác định giá trị R2

Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định bằng phương pháp pha loãng mẫu LOD là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 2 – 3 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần

Trang 38

Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của các lần đo

Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel

2.2.3 Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén

Áp dụng phương pháp đã thẩm định trên để định lượng flurbiprofen trong viên nén Antadys 100 mg Theramex, Pháp số lô 1M620 01 2014

Chuẩn bị mẫu dược phẩm để định lượng

Lấy 20 viên nén flurbiprofen trong vỉ, tính khối lượng trung bình viên Cạo lớp bao film và nghiền mịn trong cối sứ Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 10 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động sắc ký đến vạch, siêu âm khoảng 15 phút và lọc qua giấy lọc Whatman® 40 Pha loãng dung dịch trên 2000 lần trong pha động sắc ký được dung dịch có nồng độ khoảng 50 ng/ml, lọc qua đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm

Tiến hành định lượng flurbiprofen theo phương pháp đã được thẩm định Dựa vào phương trình hồi quy để xác định nồng độ C ng/ml của dung dịch định lượng Hàm lượng phần trăm flurbiprofen so với hàm lượng ghi trên nhãn được tính bằng công thức 100(C/50) Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết

quả trung bình

Trang 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

3.1.1 Cài đặt các thông số ban đầu

Nhiệt độ của buồng đo

Do tín hiệu của mẫu do đầu dò thu được giảm khi nhiệt độ môi trường tăng lên, không nên cài đặt nhiệt độ buồng đo quá cao Tuy nhiên, nhiệt độ buồng đo phải cao hơn nhiệt độ của đèn quang học của đầu dò – nơi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường Do nhiệt độ trong phòng thí nghiệm của chúng tôi là khoảng 30˚C, nghiên cứu này lựa chọn cài đặt nhiệt độ của buồng

đo là 45˚C, cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 15˚C – như hướng dẫn của nhà sản xuất

Độ nhạy của đầu dò

Cài đặt độ nhạy của đầu dò = 5 là giá trị trung bình trong thang độ nhạy của đầu dò FLD Độ nhạy của đầu dò = 5 không quá nhỏ, tránh làm giảm chiều cao pic và gây ra tỉ lệ S/N không tối ưu Độ nhạy của đầu dò được cài đặt quá cao cũng làm tín hiệu của ống quang tử bão hòa gây giảm tuổi thọ của đèn Xenon

3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch khảo sát

Tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm, sắc ký

đồ thu được thể hiện trong hình 6

Hình 6 Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	2,09 MB