Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu

Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những năm 1960. Hiện nay đ• thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt, được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: x• Tân Quang huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên, thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên, x• Ninh Hiệp huyện Gia Lâm, trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác. Khi thu hoạch người ta thường sơ chế bằng phương pháp xông sinh sau đó đem bán ra thị trường. Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lưu huỳnh dùng để xông là bao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâu mới được sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con người, đảm bảo được chất lượng của thuốc đạt được tiêu chuẩn dược điển Viêt Nam và khu vực. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hưởng của quá trình xông sinh đến chất lượng dược liệu ngưu tất. Mục đích : đánh giá hàm lượng lưu huỳnh còn tồn dư, hàm lượng saponin toàn phần, hàm lượng đường và độc tính cấp của dược liệu được sơ chế với các phương pháp xông sinh khác nhau.Trên cơ sở đó có thể đề xuất phương pháp xông sinh thích hợp cho dược liệu chất lượng tốt và an toàn cho người sử dụng. Để đạt được mục đích trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu với một số nội dung sau: -Xông sinh ngưu tất bằng các phương pháp khác nhau: Về liều lượng sinh, thời gian xông, nhiệt độ sấy. -Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu.

Đặt Vấn Đề

Ngu tất là một vị thuốc đợc dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyềnvới nhu cầu ngày càng tăng, đợc nhập trồng vào nớc ta từ những năm 1960.Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nớc ta và phát triển tốt, đợc trồng ở nhiềunơi nhất là đồng bằng Bắc bộ nh: xã Tân Quang huyện Văn Lâm tỉnh HngYên, thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hng Yên, xã Ninh Hiệp huyệnGia Lâm, trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một sốnơi khác Khi thu hoạch ngời ta thờng sơ chế bằng phơng pháp xông sinh sau

đó đem bán ra thị trờng Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lu huỳnh dùng để xông làbao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâumới đợc sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con ngời, đảm bảo

đợc chất lợng của thuốc đạt đợc tiêu chuẩn dợc điển Viêt Nam và khu vực Vìvậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hởng của quá trình xông sinh đếnchất lợng dợc liệu ngu tất Mục đích : đánh giá hàm lợng lu huỳnh còn tồn d,hàm lợng saponin toàn phần, hàm lợng đờng và độc tính cấp của dợc liệu đợcsơ chế với các phơng pháp xông sinh khác nhau.Trên cơ sở đó có thể đề xuấtphơng pháp xông sinh thích hợp cho dợc liệu chất lợng tốt và an toàn cho ngời

sử dụng Để đạt đợc mục đích trên, đề tài đợc tiến hành nghiên cứu với một

số nội dung sau:

-Xông sinh ngu tất bằng các phơng pháp khác nhau: Về liều lợng sinh, thờigian xông, nhiệt độ sấy

-Đánh giá hàm lợng lu huỳnh tồn d, hàm lợng saponin, đờng tự do,và độc tínhcấp của các mẫu dợc liệu

Phần I: Tổng quan

1-Tổng quan về ngu tất

1.1- Đặc điểm thực vật, phân bố và thu hái

Vị thuốc Ngu tất là rễ phơi hay sấy khô của cây Ngu tất: Achyranthesbidentata Blume họ rau Dền Amaranthaceae

Cây thuộc thảo cao khoảng 1m Thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầunhọn, mép lá nguyên dài 5-12 cm Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá Hoamọc hớng lên nhng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống Quả nang, lá bắccòn lại và nhọn thành gai cho nên vớng phải có thể mắc vào quần áo.

Cây mọc ở Trung quốc, Việt Nam và các nớc Đông Nam á

Trồng bằng hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10 thu hoạch vàotháng 2-3 Vùng miền núi trồng vào tháng 2-3 thu hoạch vào tháng 9-10.Muốn lấy giống thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lạikhoảng 4 tháng nữa mới lấy hạt [2]

Năng suất hiện nay vào khoảng 1,2 tấn một hecta

1.2- Thành phần hoá học

Rễ có chứa các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acidoleanolic., ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron, glucose, galactose,rhamnoza

Muối kali [2,8], và một số thành phần khác nh: Betain, polysaccharide,emodin, physcion[ 15]

O OH

H

CH2OH

1.3- Tác dụng dợc lý

 Làm giảm sức co bóp của tim ếch [8 ]

 Giãn mạch hạ huyết áp, ức chế nhẹ tim ếch cô lập [2]

 Tăng co bóp tử cung [2,6]

 Tác dụng phá huyết và làm vón albumin [2,8]

 Tác dụng hạ cholesterol trong máu và hạ huyết áp [2 ]

 Ecdysteron và Inokosteron có tác dụng chống viêm,kháng khuẩn [8]

 Lợi tiểu, hạ đờng huyết, cải thiện chức năng gan [9].

 Thúc đẩy quá trình tổng hợp protein[9]

- Ngu tất thái dùng sống

Ngu tất đợc rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày 1-3mm (nếu rễ to);cắt đoạn 3-5mm (nếu rễ nhỏ), phơi hoặc sấy khô để dùng [10]

- Ngu tất sao cám

Ngu tất rửa sạch, thái phiến, để ráo nớc Sao cám nóng già, bốc khóitrắng, cho ngu tất phiến vào sao đều đến khi có màu vàng Lấy ra rây bỏ cám

- Ngu tất trích rợu

Đem ngu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong vàng

đậm; có thể trích rợu sao đen nh trên

- Ngu tất sao đen

Lấy ngu tất phiến, dùng nhỏ lửa sao cho đến khi xuất hiện các chấm

đen

- Ngu tất trích muối

Ngu tất phiến 10 kg

Muối 0.2 kg

Muối hoà thành dung dịch đủ để tẩm vào ngu tất đã thái phiến ; ủ 30phút , sao khô

1.5- Công năng chủ trị [4, 8, 9, 10]

- Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: dùng trong các trờng hợp kinh nguyệt

bế, kinh nguyệt không đều

- Th cân, mạnh gân cốt, bổ can thận dùng cho các bệnh đau xơng khớp,

đau xơng sống, đặc biệt đối với khớp của chân; sinh lý yếu, tiểu không tự chủ

-Giáng áp, giải độc chống viêm: dùng phòng bệnh bạch hầu

-Làm tá dợc dẫn huyết, hoả đi xuống

2- Diêm sinh

2.1- Nguồn gốc.

Diêm sinh còn gọi là sinh, diêm vàng, hoàng nha, lu hoàng, thạch luhoàng, oải lu hoàng, tên khoa học là sulfur Là một nguyên tố có sẵn trongthiên nhiên hay do chế từ những hợp chất có lu huỳnh trong thiên nhiên Luhuỳnh có thể tồn tại dới dạng tự do, hay sunphua nh pyrit, sunphua kẽm, hoặc

sunphua các kim loại khác, sunphua hydro…[6] Tuỳ theo nguồn gốc và cách[6] Tuỳ theo nguồn gốc và cáchchế biến khác nhau, lu hoàng có khi là bột màu vàng, có khi là những cục tokhông đều màu vàng tơi, hơi có mùi đặc biệt, ít tan trong nớc, trong rợu vàete, tan nhiều hơn trong dầu Khi đốt lên cháy với ánh lửa xanh và toả ra mùikhét khó thở [8]

2.2- Thành phần hoá học

Thành phần chủ yếu của diêm sinh là chất sulfur nguyên chất, tuỳ theonguồn gốc và cách chế tạo, có thể có những tạp chất nh: đất, vôi, asen, sắt [8]

3.3- Công dụng và liều dùng [8]

Diêm sinh đợc dùng trong cả đông và tây y.Theo tài liệu cổ, diêm sinh

có vị chua, tính ôn, có độc, vào hai kinh tâm và thận Có tác dụng bổ hoả,tráng dơng, bổ mệnh môn chân hoả, lu lợi đại trờng, sát trùng Dùng trongnhững trờng hợp liệt dơng, lỵ lâu ngày, ngời già yếu, h hàn mà bí đại tiện,phong thấp Dùng trong còn có tác dụng sát trùng, chữa mẩn ngứa, mụn nhọt.Ngày dùng 2-3g dới dạng thuốc bột hay thuốc viên.

Phần II:Thực nghiệm và kết quả

1- Nguyên liệu, phơng tiện và phơng pháp nghiên cứu

1.1- Nguyên liệu, phơng tiện.

 Nguyên liệu

- Rễ ngu tất tơi thu hoạch ở trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biếncây thuốc Hà Nội

- Diêm sinh lấy mẫu tại một số nơi dùng để chế biến thuốc

Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm Hà Nội(Ký hiệu mẫu:S1)

.Thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang huyện Văn Lâm(Ký hiệu mẫu:S2).Thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hng Yên(Ký hiệu mẫu:S3).Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội (Ký hiệumẫu:S4)

 Hoá chất,thuốc thử

Cồn tuyệt đối, acid sulphuric 72, dd KOH/cồn 0.5N, dd acid HCl0.5N,ortho.Toluidin, Thioure, chỉ thị Methyl da cam, đạt tiêu chuẩn do việnDợc liệu cung cấp

 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh,có khối lợng 20-22g do đủ tiêu chuẩnthínghiệm mua tại Hà Tây

 Máy móc và trang thiết bị

- Máy đo độ ẩm Precisa MA300 Thuỵ Sĩ

- Máy quang phổ UV-VIS Cary 1E cua hãng Varian(Mỹ)

- Máy đo quang phổ tử ngoại (máy ASIMCO của Anh)

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử( máy AAS-Shimadza của Nhật)

1.2- Phơng pháp thực nghiệm

1.2.1- Xông sinh ngu tất

1.2.1.1- Xông sinh ngu tất với lợng sinh khác nhau

Các mẫu ngu tất cùng khối lợng đợc xông sinh với những lợng sinhkhác nhau, trong cùng một thời gian một ngày một đêm.Với khối lợng sinh

nh sau: 0,5kg S/tạ dợc liệu; 1kg S/tạ dợc liệu; 1.5kg S/tạ dợc liệu; 3kg S/tạ

d-ợc liệu Sấy ở 60C đạt độ thuỷ phần <15

1.2.1.2- Xông sinh ngu tất với thời gian khác nhau

Xông sinh các mẫu có khối lợng bằng nhau với cùng lợng sinh 1.5kgS/tạ dợc liệu nhng thời gian khác nhau, xông 4h, 12h, 24h.

Sấy khô ở 60C đạt độ thuỷ phần < 15

1.2.1.3- Sấy ở các nhiệt độ khác nhau

Sấy ở nhiệt độ khác nhau 60C, 70C, 80C, 100C đến đạt độ thuỷ phần

< 15

Sau khi chế biến tiến hành kiểm tra chất lợng đồng thời đóng túi bảo quản

1.2.2- Định lợng một số thành phần trong ngu tất sau khi xông

1.2.2.1- Định lợng saponin (TCCS VDL)

Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu

Theo phơng pháp đo quang ở bớc sóng = 538, với chất chuẩn là acidoleanolic và thuốc thử tạo màu là cồn Vanilin trong H2SO4 đặc

Hàm lợng Saponin (tính theo acid oleanolic) đợc tính bằng công thức:

Thực hiện tại tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu

Theo phơng pháp đo quang ở bớc sóng =630nm , với chất chuẩn là glucoza0.1, thuốc thử là O.Toluidin và Thioure

Hàm lợng đờng đợc tính theo công thức:

X () =

) 100 (

1000

B P

X: Hàm lợng đờng tự do tính theo Glucoza

Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn

P: Lợng dợc liệu(gam) B: Độ ẩm của dợc liệu()

1.2.2.3- Định lợng lu huỳnh trong ngu tất sau khi xông sinh và trong dịch chiết nớc và cồn

Thực hiện tại phòng phân tích môi trờng- Viện công nghệ môi trờng

- Định lợng theo phơng pháp cân

Nguyên tắc: Mẫu đợc nghiền nhỏ, vô vơ hoá và kiềm chảy với Na2CO3.Hỗn hợp nóng chảy đợc lấy bằng nớc cất nóng Acid hoá bằng HCl và dùng để

định lu huỳnh dới dạng BaSO4 bằng phơng pháp trọng lợng

1.2.3- Thử độc tính cấp của lu huỳnh và ngu tất sau khi xông sinh

Thực hiện tại bộ môn phân tích - Trờng đai học Dợc Hà Nội

- Liều LD50 đợc nghiên cứu theo phơng pháp Karber thí nghiệm trênchuột nhắt trắng có khối lợng 18-20g Những nhóm chuột 12 con đợc chouống cao ngu tất với các liều tăng dần; trong đó liều tối đa không gây chết connào, liều tối thiểu gây chết toàn bộ lô chuột thí nghiệm(LD100) và một số liềutrung gian, mà khoảng cách có thể không bằng nhau

Theo dõi và ghi số chuột chết ở mỗi nhóm Thời gian theo dõi là ba ngày

1.2.4- Xác định hàm lợng lu huỳnh trong các mẫu diêm sinh

Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dợc liệu

Định lợng theo phơng pháp acid-base thừa trừ, chỉ thị màu là Methyl dacam

Nguyên tắc phản ứng: Cân chính xác Pt gam mẫu thử, thêm V ml (chính xác)

dung dịch KOH 0.5N/cồn và nớc đun cách thuỷ sôi đến tan hết lu huỳnh vàcồn, thêm H202 đến khi mất màu dung dịch Để nguội thêm 2 giọt Methyl dacam và định lợng KOH d bằng acid HCL 0.5N.Song song tiến hành làm mẫutrắng,

1ml KOH 0.5N tơng đơng với 0.00817g lu huỳnh

Hàm lợng lu huỳnh đợc tính theo công thức:

X () =

Pt

k Vt

Trong đó:

Vo: Thể tích acid HCL dùng cho mẫu trắng

Vt: Thể tích acid HCl dùng cho mẫu thử

Pt: Lọng mẫu đem cân

K : Hệ số hiệu chỉnh KOH 0.5N/cồn

2 Thực nghiệm và kết quả

2.1 Xông sinh ngu tất

2.1.1 Xông sinh với lợng sinh khác nhau

Ngu tất sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, chia thành

4 lô, mỗi lô khối lợng 20 kg, phơi nắng 2 ngày, rửa sạch bằng nớc, để ráo

n-ớc, buộc thành các bó nhỏ, xếp vào lò xông sinh và xông sinh với thời gian 1ngày, một đêm với những lợng sinh khác nhau, theo các mẫu sau:

Mẫu 1: 0.5kg/tạ dợc liệu (Ký hiệuM1) Mẫu 2: 1kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M2)Mẫu 3: 1.5kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M3) Mẫu 4: 3kg/tạ dợc liệu (Ký hiệu M4)

Xông sinh một ngàymột đêm, sau đó lấy ra sấy ở nhiệt độ 60C cho đếnkhô đạt độ ẩm<15 Bảo quản mẫu để nghiên cứu tiếp

Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 2

- Nhận xét:

Ngu tất khi đã chế củ nhuận dẻo, bẻ gập của không bị gẫy nh khi còn tơi.Ngu tất xông sinh trắng hơn và nhuận dẻo hơn ngu tất không xông sinh

Độ nhuận dẻo của ngu tất phụ thuộc tỉ lệ thuận với độ thuỷ phần trong dợc liệu

Màu sắc của cả 4 lô ngu tất xông sinh với lợng lu huỳnh khác nhau

nh-ng đều giốnh-ng nhau(Xem ảnh) sau khi sấy khô ta khônh-ng nh-ngửi thấy mùi luhuỳnh Nh vậy bằng cảm quan ta khó phát hiện đợc dợc liệu có xông sinh haykhông

Bảng 2: Tỷ lệ dợc liệu khô và một số chỉ tiêu ở các lô thực nghiệm

2.1.2 Xông sinh với thời gian khác nhau

Ngu tất sau khi thu hoạch làm tơng tự nh trên, chia thành 4 lô khối lợngmỗi lô 20kg, xông sinh với lợng sinh nh nhau 1.5kg/tạ

Lô 1: Xông sinh 4 giờ (M5) Lô 2: Xông sinh 12 giờ (M6) Lô 3: Xông sinh 24 giờ (M7)

Sau khi xông sinh đem sấy ở 60C đến đạt độ thuỷ phần<15, bảo quản cácmẫu Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 3

Mặc dù xông sinh với thời gian khác nhau nhng màu sắc của các lô là

nh nhau.Sau khi sấy khô ta cũng không ngửi thấy mùi lu huỳnh trong dợc liệu(xem ảnh )

2.1.3 Sấy ở nhiệt độ khác nhau

Ngu tất sau khi thu hoạch chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất , phơi 2 ngày,

đem rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 60C (kí hiệu mẫu T1), 70C(kí hiệu T2) ,

80C(kí hiệu T3), 100C(kí hiệu T4) đến khi đạt độ thuỷ phần <15 Bảo

quản các mẫu Kết quả ghi ở bảng 4

Bảng 4:Tỉ lệ dợc liệu khô và một số chỉ tiêu ở các lô thực nghiệm

Độ nhuận dẻo Dẻo kém Dẻo kém Dẻo kém Dẻo kém

- Nhận xét:

Sau khi chế dợc liệu có màu nâu tối hơn mẫu xông sinh và không nhuậndẻo bằng các mẫu xông sinh

2.2.Định lợng lu huỳnh trong ngu tất sau khi xông

2.2.1 Định lợng lu huỳnh trong ngu tất ngay sau khi xông

Ngay sau khi xông xong, các mẫ đợc đem định lợng lu huỳnh Ta có:

a.Kết quả các mẫu M1, M2, M3, M4 đợc ghi ở bảng 5, hình 1

Bảng 5: Hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi xông ở các sấy với lợng

- Hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi xông với lợng lu huỳnh đem xông

từ 0.5 kg/tạ tới 3 kg/tạ thì hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi xông tỉ lệthuận với lợng diêm sinh đem xông (Hình 1 )

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

M1 M2 M3 M4

H×nh 1: Hµm lîng lu huúnh sau khi x«ng ë c¸c mÉu x«ng víi lîng sinh

kh¸c nhau.

b KÕt qu¶ ë c¸c mÉu M5, M6, M7 ghi ë b¶ng 6, h×nh 2

B¶ng 6: Hµm lîng lu huúnh ë c¸c mÉu x«ng sinh víi thêi gian kh¸c nhau.

4.81 5.21

6.13

0 1 2 3 4 5 6 7

Hàm l ợng

%

M5 M6 M7

Hình 2: Biểu đồ biểu diễn hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi

xôngở các mẫu sấy với thời gian khác nhau.

2.2.2.Định lợng lu huỳnh trong ngu tất sau khi sấy

Sau khi sấy khô các mẫu xông sinh, ta tiến hành định lợng lu huỳnh trong cácmẫu xông sinh đợc kết quả nh ở bảng 7, và hình 3

Bảng 7: Hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi sấy.

Độ ẩm 14.33 12.22 11.38 12.40 8.17 13.03 10.66

Hàm lợng 2.90 3.66 4.09 4.95 3.61 3.94 4.58

Hình 3:Hàm lợng lu huỳnh ở các mẫu sau khi xông và sau khi sấy Nhận xét:

Hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi sấy giảm đi so với sau khixông Lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi xông càng cao thì sau khi sấygiảm đi càng nhiều (Hình 3)

2.2.3 Định lợng lu huỳnh trong cao lỏng

Ngu tất thờng đợc sử dụng dới dạng nớc sắc hoặc ngâm rọu hoặc đợcchiết bằng cồn làm cao lỏng để bào chế các dạng thuốc khác vì vậy để kiểmtra chúng tôi tiến hành định lợng lu huỳnh trong dịch chiết bằng cồn 80 và n-

ớc của ngu tất đã xông sinh và sấy khô Định lợng mẫu dợc liệu M4 và M1

Tiến hành: chiết 100gam dợc liệu bằng cồn và nớc Cô dịch chiết tới

cao lỏng 1:1 Đem định lợng kết quả thu đợc nh ở bảng 8 , hình 4

Bảng 8 :Hàm lợng lu huỳnh trong các mẫu cao lỏng 1:1

Hàm lợng lu huỳnh  0.14 0.25 0.14 0.24Nhận xét: Hàm lợng lu huỳnh trong dợc liệu sau khi sấy và lợng lu

huỳnh trong cao 1:1 của dợc liệu giảm đi hàng chục lần Và khi chiết bằngcồn thì d lợng lu huỳnh giảm đi so với chiết bằng nớc 1.7 lần

Hàm lợng

Chiết n ớc Chiết cồn

Hình 4: Hàm lợng lu huỳnh trong dịch chiết nớc và dịch chiết cồn (mẫu M1 và M4)

2.3 Định lợng một số thành phần hoá học trong ngu tất

2.3.1- Định lợng đờng tự do

Tiến hành

Cân chính xác khoảng 1g dợc liệu cho vào cối sứ, nghiền kĩ Dùng nớckéo dần vào bình định mức 100 ml, tráng kĩ chày cối và thêm nớc vừa đủ100ml, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ dịch đầu, thu lấy dịch trong

Pha mẫu chuẩn:

- Cân chính xác 1g glucoza đã sấy khô ở 100-105C đến khối lợngkhông đổi, hoà tan vào nớc cất trong bình định mức 100 ml, thêm nớc cất đếnvạch Lắc đều Lấy 5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 200 ml, thêmnớc đến vạch Lắc đều

- Pha thuốc thử O.Toluidin

O.Toluidin 8ml

Thiore 0.15g

Acid acetic đậm đặc vừa đủ 100 ml

Lần lợt hút chính xác vào các bình nón theo bảng sau: