Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam

Hiện nay, dân số trên thế giới đ• là hơn 6 tỉ người và vẫn đang tiếp tục tăng, nguồn lương thực chính được sử dụng là lúa gạo. Châu á là nơi trồng và tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất với trên 90% tổng sản lượng, trong khi đó, diện tích đất trồng lúa vào khoảng 148 triệu heta chiếm 11% tổng diện tích đất canh tác trên thế giới. Do dân số ngày một tăng mà diện tích đất trồng trọt là có giới hạn nên muốn giải quyết được vấn đề lương thực thì không còn cách nào khác là phải tăng năng suất. Sâu bệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất cây lúa, do đó muốn tăng năng suất thì phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Theo ước tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam á và Đông Nam á (Hert,1991), cao hơn tại vùng Đông á và các vùng ôn đới khác. Bệnh bạc lá cũng là một trong nhưng bệnh chính hại lúa ở các nước vùng nhiệt đới châu á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảm trên 50% năng suất, mức độ ảnh hưởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, điều kiện thổ nhưỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002). Việt Nam nằm ở một vùng được ưu đ•i về địa lý và có một nền nông nghiệp trồng lúa nước truyền thống được phát triển từ lâu đời. Nước ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghề nông. Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nước ta đ• có nhiều sự đầu tư cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Đối với lúa ở nước ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là những bệnh chính gây nhiều thiệt hại. Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tại Việt Nam là 15-30% (Vien, 1992). Cho tới nay đ• có biện pháp phòng trừ khá hiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhưng biện pháp này có nhiều tác động xấu đến con người, hệ vi sinh vật và môi trường. Do đó, việc tìm ra và phát triển những giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởng xấu đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trường.

Mở đầu

Hiện nay, dân số trên thế giới đã là hơn 6 tỉ ngời và vẫn đang tiếp tụctăng, nguồn lơng thực chính đợc sử dụng là lúa gạo Châu á là nơi trồng và tiêuthụ lúa gạo nhiều nhất với trên 90% tổng sản lợng, trong khi đó, diện tích đấttrồng lúa vào khoảng 148 triệu heta chiếm 11% tổng diện tích đất canh tác trênthế giới Do dân số ngày một tăng mà diện tích đất trồng trọt là có giới hạn nênmuốn giải quyết đợc vấn đề lơng thực thì không còn cách nào khác là phải tăngnăng suất Sâu bệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất câylúa, do đó muốn tăng năng suất thì phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây

ra Theo ớc tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam

á và Đông Nam á (Hert,1991), cao hơn tại vùng Đông á và các vùng ôn đớikhác Bệnh bạc lá cũng là một trong nhng bệnh chính hại lúa ở các nớc vùngnhiệt đới châu á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảmtrên 50% năng suất, mức độ ảnh hởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh tr-ởng, điều kiện thổ nhỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002)

Việt Nam nằm ở một vùng đợc u đãi về địa lý và có một nền nông nghiệptrồng lúa nớc truyền thống đợc phát triển từ lâu đời Nớc ta đang là nớc xuấtkhẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghềnông Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nớc

ta đã có nhiều sự đầu t cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụcho nông nghiệp Đối với lúa ở nớc ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là nhữngbệnh chính gây nhiều thiệt hại Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tạiViệt Nam là 15-30% (Vien, 1992) Cho tới nay đã có biện pháp phòng trừ kháhiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhng biện pháp này có nhiều tác độngxấu đến con ngời, hệ vi sinh vật và môi trờng Do đó, việc tìm ra và phát triểnnhững giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà

chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hởng xấu

đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trờng

Ngời ta đã sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn tạo các giống lúa có khảnăng kháng một số bệnh trên Việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong công tácchọn tạo ra các giống kháng bệnh đã và đang phất triển ngày càng có hiệu quảlớn Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân tích đa dạng trình tự

nucleotit các vùng tơng đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam“

nhằm góp một phần vào công tác chọn tao giống lúa ở nớc ta hiện nay

Chơng I : tổng quan tài liệu

1 Sự đa dạng ADN

Trên trái đất của chúng ta có rất nhiều sinh vật, chúng tạo nên sự đa dạng

và phong phú rất cao Chính vì sự đa dạng đó mà ngời ta đã xếp sinh vật vào cácbậc phân loại khác nhau

ở mức vĩ mô ngời ta chia làm 3 nhánh chính: Động vật, thực vật và visinh vật Trong mỗi nhánh ngời ta lại phân loại theo thang bậc gồm 6 lớp:ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài Thang phân loại này dựa theo tiêu chẩn hình thái,vì vậy nó vẫn cha mô tả đợc hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên ngời talại phải sử dụng đến các tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơnnữa nh dới chi, loài Vì hệ thống phân loại nói trên dựa vào kết quả quan sát

đặc điểm hình thái, chính vì vậy mà đã gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hànhphân loại sâu hơn, trong khi đó sự phân loại dới loài lại đóng vai trò rất quantrọng Để khắc phục tình trạng này ngời ta phải sử dụng chỉ thị “phi hình thái” ởdạng phân tử mà một trong số đó là chỉ thị ADN Khi nói đến sự đa dạng ADN ,nghĩa là sự khác nhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng mộtloài sống ở trong một vùng địa lý nhất định Nghiên cứu đa dạng ADN thựcchất cũng là phân loại nhng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giốngnhau giữa hai cá thể cùng loài, chẳng hạn nh sự giống hay khác nhau giữa cácgiống lúa trong cùng một loài phụ mà không thể phân biệt đợc qua chỉ thị hìnhthái (Lã Tuấn Nghĩa, 2004)

Nghiên cứu đa dạng ADN đóng vai trò rất quan trọng, thông qua phântích tính đa dạng ta có thể chọn đợc những cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọntạo giống cây trồng Chẳng hạn, khi tiến hành chọn cặp lai hoặc chọn dòng ởcây trồng, quan sát đặc điểm hình thái cho thấy chúng rất giống nhau, vì vậy rấtkhó chọn lọc Tuy nhiên nếu dùng chỉ thị ADN sẽ giúp chúng ta dễ dàng chọnlọc đợc những cặp lai thích ứng hoặc những dòng mong muốn Chỉ thị ADN đặc

biệt có lợi khi sử dụng để chọn lọc cây trồng có đặc tính khó hoặc không thểquan sát bằng mắt thờng nh khả năng chịu bệnh, chịu rét, chịu mặn, năng suất

2 Các chỉ thị sinh học và ứng dụng của nó trong nghiêncứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống

2.1 Chỉ thị hình thái.

Một tính trạng đợc coi là một chỉ thị di truyền nếu nó đợc kiểm soát bởimột locus xác định và không bị ảnh hởng bởi các yếu tố bên ngoài của môi tr-ờng, mặc dù chỉ thị hình thái thờng đợc sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồngtrội, song trong nhiều trờng hợp chúng vẫn bị ảnh hởng của các yếu tố khác nhtơng tác gen, nhân tố gen nhẩy và các nhân tố môi trờng Trong các giai đoạnkhác nhau của sự phát triển của cây các đặc điểm hình thái cũng khác nhau nênchúng không đợc xem là đặc trng Hơn nữa các đặc điểm hình thái cũng khôngnhiều ở mỗi sinh vật, do đó khả năng ứng dụng của chúng còn nhiều hạn chế

Tuy nhiên số lợng kiểu hình isozyme trong thực tế là không nhiều, khôngphân bố trên toàn bộ gen mà thờng xuyên bị ảnh hởng của yếu tố môi trờngHơn nữa, isozyme chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình pháttriển cơ thể (P Samee, 1996)

2.3.Chỉ thị phân tử ADN.

Hạn chế của việc sử dụng chỉ thị hình thái , chị thị protein là chúng chỉdùng để nghiên cứu gián tiếp hệ gen của vi sinh vật, do đó ngời ta đã phát triểnnhng kĩ thuật dùng ngay ADN làm chỉ thị phân tử Chỉ thị phân tử bao gồmRFLP, PCR dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN(hoặc ARN) đợc sử dụng để lai với ADN của hệ gen cần phân tích Việc sửdụng chỉ thị ADN đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học có thể nghiên cứu trựctiếp hệ gen của sinh vật Chỉ thị ADN rất phong phú và có tính ổn định cao, hơnnữa chúng ta có thể nghiên cú ở bất kì giai đoạn nào của cá thể Chỉ thị ADN rấtthích hợp cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học, lập bản đồ di truyền và chọntạo giống cây trồng.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nghĩa là đa hình độ

dài các mảnh giới hạn RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai

axitnucleic Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằngenzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axitnucleic (sợi ADN hoặc mARN) Khi xử lý ADN bằng các enzym giới hạn sẽthu đợc những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thớc khác nhau, những mảnh nàysau đó đợc điện di trên gel agaroza 0.8% Tiếp theo ngời ta chuyển các mảnhADN lên một màng lai theo nguyên tắc thẩm thấu giữ nguyên vị trí (SouthenBloting), sau đó ngời ta cho mẫu dò có trình tự nucleotit đã biết trớc và đợc

đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng chất hoá học lai với ADN cố địnhtrên màng lai, nếu chúng bổ sung với nhau thì sẽ cho phản ứng lai Kết quả củaphản ứng lai sẽ đợc phát hiện bằng cách nhuộm màu hoặc dùng phóng xạ quaphim X-quang Dựa vào những băng ADN chúng ta có thể xác định đợc sự đahình giữa các mẫu ADN khác nhau (Bùi Chí Bửu, 1999)

Chỉ thị RFLP đợc ứng dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền, sự phânhoá trong di truyền huyết thống và lập bản đồ gen: lập bản đồ di truyền trên câylúa (Mc.Couch và cs, 1988), lập bản đồ gen cho bệnh đạo ôn (Yu và cs, 1991),

bệnh bạc lá (Ogawa, 1987; Kinoshita, 1991), bệnh rầy nâu (Lang và cs, 1999),bệnh sâu đục thân (Tan và cs, 1993).

2.3.2 Chỉ thị PCR

1 Khái niệm:

PCR (Polimerase Chain Reaction) hay phản ứng chuỗi polimeraza là mộtquá trình cho phép nhân nhanh các đoạn ADN trong một khoảng thời gian ngắn.Kỹ thuật này do Kary Mullis phát minh năm 1985

Nguyên tắc: Nhờ enzym ADN polymeraza xúc tác, trên các mạch khuônADN tổng hợp nên các mạch đơn mới, các mạch đơn vừa đợc tổng hợp lại đợc

sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mach mới của chu kì tiếp theo Sựtổng hợp mạch ADN mới cần có sự tham gia của các đoạn ADN mồi làm xuấthiên những nhóm 3’OH tự do,các nucleotit đợc gắn ở vị trí nhóm OH kéo dàitạo thành mạch đơn mới, chiều tông hợp là chiều 5’-3’

2 Các bớc tiến hành.

Kỹ thuật PCR gồm 3 bớc:

a) Giai đoạn biến tính: Giữ nhiệt độ khoảng 94-950C trong 30’ đến 1 phút

để phá vỡ các liên kết hydro giữa 2 mạch ADN để tạo thành sợi đơn Nếu đoạnkhuôn có tỉ lệ G-C cao, chuỗi G, C liền nhau càng dài thì nhiệt độ biến tính sẽcao hơn do đó cần tính toán để có nhiệt độ và thời gian phù hợp

b) Giai đoạn gắn mồi: Hạ nhiệt độ xuống khoảng 30- 600C trong 30’ đến

1 phút , các mồi sẽ bắt cặp với khuôn

c) Giai đoạn tổng hợp: Giữ nhiệt độ ở 720C là nhiệt độ thích hợp nhất với

sự hoạt động của enzym polymeraza, ADN mới sẽ đợc tổng hợp theo chiều 3’ bắt đầu từ vị trí gắn mồi

5’-Sau mỗi chu kì, một đoạn ADN đợc nhân lên thành 2, các ADN đợc nhânlên lại đợc sử dụng làm khuôn cho quá trình sau, sau n chu kỳ ta có 2n đoạnADN

3 Thành phần phản ứng.

a) Khuôn:

Khuôn có thể là ADN mạch đơn hoặc mạch kép thậm chí cả ARN.Khuôn đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao, nồng độ thích hợp khoảng 50- 100 ng,nếu ít quá thì phản ứng sẽ không thể xảy ra, nếu cao quá thì sẽ hình thành sảnphẩm phụ không mong muốn và làm giảm độ nét của các băng ADN

b) Mồi:

Là những đoạn oligonucleotit dài khoảng 6-10 nucleotit (mồi ngẫu nhiên)hoặc từ 18-24 nucleoitit (mồi đặc trng) Nồng độ thích hợp là từ 100-500 nM.Nồng độ thấp sẽ không đủ cho phản ứng do đó sẽ không tạo băng ADN hoặcnếu có băng thì nồng độ ADN sẽ rất thấp, ngoài ra cần phải chọn các mồi saocho không có sự bắt cặp giữa chúng làm giảm hiệu quả phản ứng

c) Enzym Taq:

Đợc tách chiết từ vi khuẩn Themus aquticus hay sống ở suối nớc nóng cókhả năng chịu nhiệt cao đợc dùng thay cho enzym Klenow tách chiết từ VKE.Coli không chịu đợc nhiệt Enzym Taq có trọng lợng phân tử (TLPT) 94 kD

và nhiệt độ hoạt động tối u là 720C, nếu tăng nhiệt độ lên 950C trong 20’ để biếntính ADN sợi kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym còn lại 65% sau 50 chu kìphản ứng Nồng độ thích hợp là 0,5-2,5 đơn vị

c) MgCl2:

Ion Mg2+ có ảnh hởng quan trọng đến phản ứng vì nó ảnh hởng đến sựhoạt động của enzym polymeraza, tạo phức chất tan với dNTP, nồng độ Mg2+

phụ thuộc vào nồng độ dNTP, pyrophosphat tự do (PPi) và EDTA là những hợpchất liên kết với những ion có trong dung dịch Nồng độ thích hợp cho phản ứng

là từ 0.5-5mM

d) dNTP (deoxynito triphosphat)

Gồm 4 loại là: dATP, dCTP, dGTP, dTTP Nó chính là nguyên liệu đểtổng hợp nên các đoạn ADN mới, nồng độ dNTP thờng sử dụng cho mỗi phảnứng là 200àM Khi tăng nồng độ dNTP lên cao thì nó sẽ liên kết với Mg2+ ảnh

hëng tíi ph¶n øng tæng hîp Ngoµi ra nã cßn cã tÝnh kh«ng bÒn nhiÖt vµ dÔ bÞchuyÓn ho¸ thµnh dNDP vµ dNMP.

5’ 3’

3’ 5’

30oC- 65oCGắn mồi vào sợi đơn

ở pH trung tính, axit nucliec mang điện tích âm nhờ nhóm phophoitnằm trên phosphodieste của các sợi axit nucleic Do đó chúng sẽ di chuyển vềphía điện cực dơng khi đặt chúng vào điện trờng

b) Quá trình điện di:

Các mẫu a.nucleic đợc đặt vào gel và đặt trong một điện áp nào đó saukhi đợc nhuộm bằng chất nhuộm Dựa vào sự di chuyển của chất nhuộm này đểdừng quá trình chạy gel Kết quả đợc nhìn thấy khi soi bản gel dới đèn tử ngoại(UV), các băng ADN màu da cam hiện lên có thể nhìn thấy bằng mắt thờng

Có hai loại gel cơ bản thờng dùng là:

2.3.4 Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi:

a) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

Kỹ thuật này đợc William và cs xây dựng năm 1990 Đây là kỹ thuật dựatrên cơ sở của PCR với việc sử dụng các mồi ngẫu nhiên (Random Primer) dàikhoảng 10 bp Trong phản ứng các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn

ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Sản phẩm PCR đợc điện ditrong gel agaroza và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidiumbromide, kích thớc sản phẩm có chiều dài 200bp đến 2000 bp (Trần Duy Dơng,1999)

Chỉ thị RAPD thuộc loại chỉ thị di truyền trội Ngời ta có thể phân biệthai cá thể thông qua sự có hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trng Phơng

pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian và ít tốn kém Hạnchế lớn nhất của kỹ thuật này là nó rất nhạy cảm với nhiều yếu tố nh thành phầntham gia phản ứng, nhiệt độ gắn mồi (Lã Tuấn Nghĩa, 2004)

ứng dụng : Kỹ thuật này đợc sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền(Bun, 1999) và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant InbredLine)

b) Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)(Vos,

1995)

Kỹ thuật này đợc tạo ra bằng cách nhân lên những đoạn ADN trong hệgen đã đựoc cắt bởi enzym giới hạn bằng máy PCR Các sản phẩm thu đợc tạo

ra phản ánh đợc sự đa hình đoạn phân cắt giới hạn của phân tử ADN Sản phẩm

đó đợc nhận biết bằng cách điện gi trên gel polyacrylamit và nhuộm bằng thuốcnhuộm đặc trng hay dùng chất phóng xạ Kỹ thuật này đợc sử dụng rộng rãitrong nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002)

c) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)

Nguyên lý: Trên cơ sở hệ gen sinh vật gồm rất nhiều đoạn ADN lặp lại,

số lần lặp lại và số bản sao đặc trng ở mỗi loài cá thể, ngời ta thiết kế đoạn mồi

đặc trng cho các đoạn lặp, sử dụng phản ứng PCR và kỹ thuật điện di phân tích

sự khác nhau giữa các cá thể thông qua số lần lặp lại khác nhau các đoạnnucleotit đặc trng cho mỗi cá thể (Bùi Chí Bửu, 1999)

Đây là nhóm chỉ thị đồng trội, có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao,

do đó đợc sử dụng trong lập bản đồ gen và chọn giống Hạn chế của phơng pháplà: đoạn lặp lại ở mỗi loài là khác nhau do đó phải thiết kế mồi đặc trng cho mỗiloài nhng mặt khác giá thành lại cao

ứng dụng: Kỹ thuật SSR đợc dùng trong phân tích gen do tính đa hìnhphong phú, tiết kiệm thời gian so với các phơng pháp khác nên bản đồ di truyền

đã đợc xác định thành công nh: phân nhóm di truyền lúa mùa địa phơng, xác

định bản đồ gen kháng rầy nâu, xác định bản đồ gen kháng mặn trên lá lúa(Lang và cs, 2001).

d) Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Sites)

Kỹ thuật này do Olson và cs đề xuất năm 1989 STS là một đoạn ADNngắn gồm 60-1000bp có thể phát hiện bằng kỹ thuật PCR Nó cho phép xác

định những vị trí đã đợc đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleôtit biếttrớc ADN trong gen Hai đoạn mồi đợc thiết kế trong dựa trên các trình tựnucleotit đã đợc biết giúp ta xác định đợc vùng ADN cần tìm kiếm Các đoạnmồi STS thờng chứa khoảng 20 nucleotit nên có tính đặc hiệu cao đối với PCR

Nh vậy chỉ thị STS thực chất có nguồn gốc từ chỉ thị RFLP mà phơng pháp pháthiện là kĩ thuật PCR thay cho kỹ thuật lai ADN

ứng dụng: Kỹ thuật STS đợc dùng để phát hiện tính đa hình, lập bản đồgen và tìm vị trí gen gần nhất trong quá trình fine mapping (Nguyễn Thị Lang,2002)

e) Kỹ thuật RGA (Resistance gene analog)

Khi so sánh trình tự ADN giữa những gen kháng đã phân lập từ nhiềuloài thực vật khác nhau (Johal và cs, 1992; Song và cs, 1995; Barker và cs,1997 ), các nhà khoa học đã phát hiện ra điều thú vị rằng, các gen này có một

số đặc điểm giống nhau Các gen này đều có những vùng giàu Leucine (LeucineRich Repeat = LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site =NBS) và vùng protein kinaza Trên cơ sở đó họ đã xây dựng một kỹ thuật dựatrên cơ sở của kỹ thuật PCR đặt tên là RGA Bản chất của kỹ thuật này là dựavào những vùng giống nhau ở các gen kháng, ngời ta thiết kế những đoạn mồi t-

ơng ứng, sau khi chạy PCR sản phẩm thu đợc có thể là một phần của gen khánghoặc toàn bộ gen kháng Sản phẩm PCR đợc đem đi điện di và các băng ADN

có thể nhìn thấy trên bản gel bằng mắt thờng khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm

đặc trng

Trớc nghiên cứu của Chen và cs (1998), sản phẩm PCR nhận đợc từ kỹthuật RGA chỉ đợc điện di trong gel agaroza Bởi vậy mà nó không thể phát

hiện hết, với băng ADN rõ nét và số lợng nhiều hơn (Chen và cs, 1998; Wang

và cs, 1999) Gần đây, Chen và cs (1998) đã giả định rằng những băng ADN cóthể đợc phân tách tốt hơn và sự đa hình có thể phát hiện cao hơn nhờ sử dụng

điện di phân giải cao Bởi vậy, họ đã xây dựng kỹ thuật RGA cùng với điện diphân giải cao trong gel polyacrylamit

Kỹ thuật RGA là một kỹ thuật mới, nó đợc sử dụng để phân tích đa hình,phát hiện nguồn gen kháng trong tập đoàn giống, lập bản đồ gen kháng và môtả dạng di truyền (Chen và cs, 1988;Yu và cs, 1996; Feuillet và cs, 1997) Trongviệc lập bản đồ gen ngời ta dùng những đoạn mồi đặc trng dài khoảng 20 bp,việc này làm tăng tính đặc trng của mồi và khả năng liên kết với gen kháng củachúng rất cao

Kỹ thuật này đã đợc ứng dụng trong phân tích hệ gen lúa, lúa mạch vàlúa mì Kết quả chỉ ra rằng, tuỳ thuộc vào mồi PCR mà số lợng băng của mỗisản phẩm PCR có thể từ 30 đến 130 Những băng đa hình đã phát hiện trong lúamì, lúa và lúa mạch là 40%, 47%, 27% Những mồi RGA đã sử dụng cũng táchbiệt những giống lúa có hệ gen di truyền indica từ hệ gen di truyền japonica.Hơn nữa mối liên kết giữa CTPT RGA với gen kháng bệnh rỉ sắt cũng đã đợcphát hiện (Chen và cs, 1998) Trong nghiên cứu của Wang và cs (1999) đã môtả 36 giống lúa ở vùng châu thổ sông Dơng Tử (Trung Quốc) sử dụng chỉ thịphân tử RGA, nghiên cứu này cho thấy những giống lúa có hệ gen di truyền

indica, japonica và lúa lai tạo thành những nhóm riêng biệt Họ đã phát hiện

thấy mối liên kết giữa kiểu gen RGA và kiểu hình kháng/nhiễm bệnh đạo ôn

Họ cũng cho thấychỉ cần sử dụng bất cứ 2 hoặc 3 tổ hợp mồi tơng ứng với vùngNBS và LRR cũng đủ để phân nhóm các giống lúa theo các hệ gen di truyềnkhác nhau

3 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu các gen kháng ở lúa

3.1 Bệnh bạc lá:

Bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) gây

ra

Bệnh phát sinh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây, nhng điển hình là thời

kỳ lúa bắt đầu trổ bông đến lúc chín sữa Triệu chứng bệnh là ở mép lá, mút lá

có những vệt có độ dài ngắn khác nhau, có màu vàng, nâu bạc, khô xác Khibệnh phát triển thì vết bệnh từ mút lá, mép lá lan dần vào trong phiến lá hoặckéo dài theo gân chính theo đờng gợn sóng, nhng cũng có khi vết bệnh từ ngaygiữa phiến lá lan rộng ra Kết quả là lá lúa đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanhchóng khô chết hoặc bộ lá xơ xác, ảnh hởng lớn đến quang hợp làm cho tỉ lệ hạtlép cao, năng suất giảm sút rõ rệt Bệnh này có khả năng gây dịch bệnh cao và

sự huỷ hoại đối với cây lúa, đặc biệt là trong điều kiện trời ma và ẩm ớt

Nhờ ma gió, sự va chạm của các lá lúa vi khuẩn xâm nhập lên bề mặt láhoặc thân cây Khi mặt lá có màng nớc, vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào bêntrong qua các lỗ khí, qua vết thơng mà vi khuẩn nhân lên về mặt số lợng, theocác bó mạch lan rộng đi

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, cómột lông roi ở đầu, kích thớc 1-2 x 0,5-0,9àm Khuẩn lạc có dạng hình tròn,màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ớt, nhuộm Gram âm Vi khuẩn không

có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3 nhng tạokhí H2S Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn hoạt động là 26- 300C, pH thích hợp là5,7- 8,5

Tính kháng bệnh của cây chủ đợc xem nh là một phơng pháp an toàn đểphòng chống bệnh, nhng tính kháng này thờng không ổn định (Mew và cs,1992)

Hơn 20 gen kháng ở lúa đã đợc xác định trong đó có 2 gen Xa1 và Xa21

đã đợc lập bản đồ Xa1 là gen mã hoá một protein kiểu R bao gồm một vùng vịtrí liên kết nuclotit và một vùng lặp lại giàu leucin, gen này đã mã hoá mộtprotein kháng bạc lá (X oryzae pv Oryzae) dòng Nhật Bản 1 (Yoshimura,1998) Gen Xa21 mã hoá một phân tử protein, gen này chứa vùng giàu leocin

và một vùng Cytoplasmit kinaza, đó là kiểu duy nhất của gen R Xa21 điềukhiển kháng X oryzae pv oryzae Philipine dòng 6 (PR6) (Song, 1995)

Gen Xa21 đợc nhân dòng bởi Song và cs (1995) Các cây lúa chuyển gen

Xa21 đã đợc kiểm nghiệm có khả năng kháng bệnh bạc lá (Wang và cs, 1996).

Zhang và cs đã công bố kết quả chuyển gen Xa21 vào các giống lúa IR64, IR72

và Minghui63 (dòng bố mẹ sản xuất lúa lai) Rất nhiều dòng lúa chuyển gen ởthế hệ R2 đã tỏ ra kháng các bệnh vi khuẩn, một dòng của giống IR72 ở thế hệR3 đã chứng minh có khả năng kháng bệnh vi khuẩn (Zhang và cs, 1998) Sựkết hợp 4 gen kháng vi khuẩn bạc lá: Xa4, Xa5, Xa13 và Xa21 vào một dòng lúatạo cây mang cả 4 gen có tính kháng bệnh u việt hơn so với cây lúa mang mộtgen kháng bệnh (Huang và cs, 1997)

3.2 Bệnh đạo ôn:

Bệnh đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá là một trong những bệnh gâyhại quan trọng nhất trên đồng ruộng ở nớc ta ở Việt Nam bệnh xảy ra ở cả bamiền Bắc, Trung, Nam nhng nguy hại hơn là ở vùng đồng bằng Bắc Bộ và BắcTrung Bộ vào vụ Đông-Xuân khi thời tiết ẩm ớt thuận lợi cho bệnh phát triển

Bệnh này do nấm Pyricularia grisea gây nên Nấm có vòng đời ngắn

nh-ng khả nănh-ng sinh bào tử rất lớn (một vết bệnh có khả nănh-ng sinh 2000-6000 bào

tử mỗi ngày và kéo dài trong khoảng 14 ngày ở điều kiện phòng thí nghệm),bào tử chính là nguồn phát tán(nhờ gió) của bệnh, khi bào tử rơi lên lá gặpnhững giọt sơng và điều kiện thuận lợi chúng nảy mầm trở lại, do đó bệnh cóthể xâm nhiễm và lây lan rất nhanh trên một diện rộng Bệnh phát triển nhanhkhi gặp các yếu tố thích hợp nh: trồng giống nhiễm, nhiệt độ từ 20-320C, độ ẩm

>93% (đặc biệt khi trời có nhiều mây và sơng mù vào sáng sớm), gieo mật độdày hay sử dụng quá nhiều phân hoá học (Lê Tơng Tề, 1998)

Bệnh có thể xuất hiện trên lá, đốt thân của cây cổ bông hoặc những phầnkhác trên bông, đôi khi cả trên hạt Bệnh có thể gây hại ở tất cả các giai đoạnsinh trởng của cây, vết bệnh điển hình có hình thoi, rộng ở giữa và nhọn ở hai

đầu, tâm thờng có màu xám hoặc hơi trắng, xung quanh thờng có màu nâu hoặcnâu đỏ Một vết bệnh phát triển đầy đủ có thể dài từ 1-1,5cm và rộng từ 0,3-0,5cm, tuy nhiên kích thớc và màu sắc vết bệnh thay đổi tuỳ theo điều kiện môitrờng, giống nhiễm hay kháng Khi bệnh nặng các vết bệnh phát triển to lên, lanrộng ra và liên kết với nhau làm cho cả lá bị cháy khô và chết ở giai đoạn trổbông, vết bệnh ở cổ bông có màu nâu hay đen, sau đó bông lúa bị gãy và rơixuống ở nơi vết bệnh Bệnh tấn công sớm thì gây lép cả bông, trễ hơn thì làmtăng tỉ lệ hạt lép, hoặc làm cây chết, do đó làm giảm năng suất (Ngô Vĩnh Viễn,1997).

Cơ chế gây bệnh: Khi xâm nhập vào lúa sợi nấm hình thành đĩa bám,bám chặt vào mặt cây đồng thời hình thành một sợi xuyên đục thủng lớp biểu bìcủa tế bào để hút chất dinh dỡng và do đó, cây sẽ dần bi kiệt quệ và có thể bịchết

Sự hiểu biết về đa dạng nguồn gen của quần thể nấm đạo ôn đóng vai tròquan trọng trong việc hiểm soát bệnh, đặc biệt trong việc phát triển các giốnglúa kháng đạo ôn khác nhau (Lã Tuấn Nghĩa, 1997) Những thông tin về đadạng nguồn gen bệnh có thể đợc sử dụng trong việc xác định và mô tả genkháng để cung cấp cơ sở lý luận của gen kháng (Chen, 1995)

Năm 1975, Ou và cộng sự đã chia gen kháng làm hai loại : gen khángchính (Major gene) và gen kháng bổ sung (Minor gene) Cây lúa mang genkháng chính có thể ngăn chặn sự hoàn thiện vòng đời của các nòi nấm

Pyriculiria grisa bất tơng hợp Gen kháng bổ sung có thể làm giảm sự sinh bào

tử của nấm đạo ôn tơng hợp Tính kháng hoàn toàn do gen trội qui định(Kiyosawa, 1981; Mackll và cs, 1985; Yu và cs, 1987; Mackill và Bonman,1992) Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định đợc hơn 50 gen kháng đạo ôntrong hệ gen lúa (Kinoshita, 1991; Mackill và Bonman, 1992; Zhu, 1993; Wang

và cs, 1994; Mendosa, 1996) trong đó có 23 gen kháng chính và 27 gen kháng

bổ sung Trên nhiễm sắc thể số 11 có 8 gen kháng chính là Pi-a, Pi-f, Pi-k, Pi-z, Pi-is-1(Rb4), Pi-se-1(Rb1), Pi-1(t), Pi-7 và một gen kháng bổ sung (Wang

M-và cs, 1994; Mendoza, 1996), trên nhiễm sắc thể số 6 có 4 gen kháng bổ sung,trên nhiễm sắc thể số 12 có 4 gen kháng chính (Shen và cs, 1986; Yu và cs,1994)

Các nhân tố gây bệnh khác nhau đã đợc nghiên cứu kĩ lỡng trong nhữngthập kỉ gần đây (Yamada, 1976) Năm 1992, Sasaki lần đầu tiên đã có bản báocáo về sự khác nhau giữa các chủng nấm Kể từ đó hàng trăm dòng nấm gâybệnh đã đợc xác định ở nhiều vùng trên thế giới dựa trên phản ứng của nhữnggiống cây khác nhau (Lã Tuấn Nghĩa, 1997)

3.3 Bệnh rầy nâu

Đến nay các nhà khoa học đã tìm ra 10 gen kháng chính (major gene) vàmột số gen kháng phụ khác (minor gene hay QTL) dựa vào sự phản ứng của cácgiống lúa đối với các biotyp rầy nâu cũng nh các thí nghiệm phân tích di truyền(Sidu và Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii, 1994; Bùi Chí Bửu và cs, 1997).Ngoài ra còn tồn tại nguồn gen kháng có bản chất tế bào chất (Rao, 1993)

Biến động quan trọng và đáng lo ngại nhất của quá trình kháng rầy nâu là

sự hình thành các biotyp mới có khả năng bẻ gãy tính kháng của các giống lúa.Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định đợc ít nhất 4 biotyp rầy nâu có mặt ởcác vùng trồng lúa trên thế giới

Đặc tính kháng nhiễm rầy của các giống lúa tròng phổ biến tại Đồngbằng Bắc Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long đối với quần thể rày nâu thuộc cácbiotyp 1,2,3 dã đợc các cán bộ nghiên cứu ở viện Bảo vệ thực vật và viện lúa

ĐBSCL khảo nghiệm trong nhiều năm (Nguyễn Công Thuật và cs, 1991 ; LơngMinh Châu và Nguyễn Văn Luật, 1998)

Giống lúa CR203 đợc Nguyễn Công Thuật chọn lọc từ dòng 132-622 (một dòng lúa thuộc Viện lúa Quốc tế) và đợc đa ra sản xuất từ nhữngnăm 80 CR203 mang gen kháng lặn bph2 Trong nhiều năm, các giống lúamang gen bph2 nh CR203, IR36, IR42, CN2 vẫn thể hiện tính kháng tốt vớiquần thể rày nâu ở Đồng bằng Bắc Bộ (Nguyễn Công Thuật và cs, 1996)

IR8423-4 Nghiên cứu đa dạng ADN qua giải trình tự các nucleotit

4.1 Các phơng pháp xác định trình tự nucleotit

Việc giải trình tự các nucleotit đã đợc xác định từ những năm 70 nhờ sự

ra đời của hai phơng pháp khác nhau: phơng pháp hoá học và phơng phápenzym

a) Phơng pháp hoá học (Maxam- Gilrbert, 1977)

Nguyên tắc : Dùng nhiệt độ biến tính phân tử ADN thành các mạch đơnkhông thể tự xoắn lại với nhau đồng thời đánh dấu đầu 5’ của các mạch bằng

đồng vị phóng xạ P32 Tiếp theo, xử lý hoá học đặc hiệu phân huỷ đặc trng mộtloại nucleotit của các mạch ADN đã đánh dấu phóng xạ tạo thành các đoạnoligonucleotit có chiều dài hơn kém nhau một nucleotit đợc phát hiện bằng điện

di Kết quả của 4 nhóm phản ứng hoá học xử lý mạch ADN đợc phát hiện bằng

điện di trên gel polyacrylamit, dựa vào đó ta có thể xác định trình tự các mạch

đơn đang đợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên Kết quả là tạo ra các đoạnoligonucleotit dài ngắn hơn nhau một nucleotit, có thể nhận biết đợc bằng ph-

ơng pháp điện di

Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động : Máy hoạt động dựatrên cơ sở phơng pháp dideoxy, chùm tia laser trên máy đánh dấu vị trí và thờigian đi qua của các nucleotit, từ đó cho biết kết quả trình tự gen Ngoài ra, máycòn đọc trình tự trên cả hai mạch đơn, do đó có thể phát hiện và làm giảm cácnhầm lẫn do kỹ thuật

Do giải trình tự gen bằng máy tự động có nhiều u điểm nh: cho kết quảnhanh, độ chính xác cao, ít công đoạn chuẩn bị nên chúng tôi đã dùng công cụnày trong nghiên cứu đề tài

4.2 ứng dụng của nghiên cứu đa dạng trình tự nucleotit:

Ngày nay, việc áp dụng đọc trình tự nucleotit đã mang lại những thànhtựu to lớn trong các lĩnh vực nh nông, lâm, ng nghiệp và đặc biệt là con ngời.Nhờ sự ra đời của kỹ thuật di truyền, trong điện di trọng trờng (pulse fiesldelectrophoresis) cho phép tách các đoạn ADN dài cả triệu nucleotit Cuối năm

1989 ở Mỹ, chơng trình xác định trình tự nucleotit của bộ gen ngời (HumanGenome Project) với chi phí 3 tỉ USD đã đợc bắt đầu và đến năm 2003 đã cơbản đợc hoàn thành

Hiện nay, trên thế giới có tổng cộng hơn 80 phòng thí nghiệm lớn thamgia vào chơng trình bộ gen ngời Tuy đã đạt đợc những kết quả quan trọng nhtạo dòng 2375 gen của bộ não ngời vào năm 1992, nhng vẫn còn nhiều khókhăn lớn Sự can thiệp của tin học đã giúp rút ngắn đáng kể thời gian của một sốphân đoạn trong đọc trình tự gen (Phạm Thành Hổ, Nxb Giáo dục, 1998)

Một trong những bớc tiến dài trong xác định trình tự nucleotit của bộ genngời là việc sử dụng các EST (Expressed Sequence Tags) để chuyển mRNAthành các đoạn cDNA bằng khuếch đại nhờ kỹ thuật PCR Nhờ kỹ thuật này, sựbiểu hiện của các gen ở các mô đặc hiệu đợc ghi nhận Ưu thế của xác địnhtrình tự nucleotit bằng EST là chỉ các gen biểu hiện ở một loại mô chuyên biệt

đợc phát hiện (nhờ xác định mRNA trởng thành và phiên mã ngợc thànhcDNA), Trình tự cDNA đợc gắn vào các véctơ plasmit để tách dòng Sự lựachọn các dòng để xác định trình tự nucleotit và sự so sánh tiếp theo cho phép

đánh giá mức độ biểu hiện của gen ở các mô khác nhau Sự dò theo các ESTgiúp xác định sự phân bố các gen mã lên các nhiễm sắc thể, xây dựng bản đồ ditruyền và vật lý của bộ gen ngời, cũng nh thực vật và xác định rõ các gen gâybệnh (Adams và cs, 1992)

Lần đầu tiên, việc áp dụng EST đợc sử dụng vào lúa vào năm 1992(Uchimiya và cs, 1992) Sau đó chúng đợc áp dụng rỗng rãi cho việc đọc trình

tự của lúa (Sasaki và cs, 1994; Yamamoro, 1997) Cho tới nay có khoảng 12000ESTs một vùng dữ liệu trong ngân hàng gen (Tarchini 2002)

4.3 Đọc trình tự genome

Trình tự genom đã đa ra đầy đủ các thông tin về kích thớc cũng nh sựliên kết các genome lúa Đó là một sự thành công trong việc khám phá ra cácgen lúa, các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống, lập bản đồ gen và tính trạng

điều khiển của các gen liên kết Chúng có thể giúp ta so sánh về mối quan hệgiữa genome của lúa và các giống cây trồng khác

Vào tháng 4 năm 2002, hai bên phác thảo về trình tự genome của lúa ởhai nhóm Japonica và Indica ở hai nhóm đã đợc đọc trình tự (Goff và cs, 2002;

Yu và cs, 2002) Trong kết quả này, họ đã thấy rằng nhóm Japonica,

Nipponhare chứa 93% của 420Mb genome (Goff và cs, 2002) ở đây, họ đã

phân biệt đợc chúng có kháng 32000-150000 gen khác nhau và hầu hết làprotein (98%) và chúng có sự tơng đồng so với một số loại cùng ngũ cốc khác

nh ngô, lúa mì và lúa mạch

Xét về nhóm Indica, chúng có khác một chút so với nhóm Japonica, cókhoảng 466 Mb trình tự genome và khoảng xấp xỉ từ 45022-55615 gen khácnhau (Yu và cs, 2002; Sasaki và cs, 2002; Feng và cs, 2002)

Chơng 2 vật liệu, nội dung và phơng pháp

nghiên cứu

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu đợc sử dụng trong nghiên cứu này gồm 35 giống lúa

ở Việt Nam đợc lấy từ Viện Di truyền Nông nghiệp

Bảng 1 Tên các giống lúa dùng trong nghiên cứu

5 AC Indica Chưa biết

Ho¸ chÊt :

§Öm chiÕt ADN

0,1M Tris-HCl (pH=8)

0,05M EDTA 0,5M NaCl 0,7% b-Mercaptol Ethanol

Đệm CTAB

0,2M Tris-HCl (pH=7,5)0,05M EDTA

2M NaCl2% (w/v) CTABDung dịch10% SDS

2.3.1 Tách ADN của lúa

Chúng tôi đã sử dụng phơng pháp CTAB (Sagha- Marool, 1984) có cảitiến để tách chiết ADN từ lúa Phơng pháp này có u điểm là giữu đợc ADN khá

nguyên vẹn do dùng CTAB để liên kết với ADN loại bỏ protein Qui trình táchchiết nh sau :

- Nghiền 2g lá lúa (thu lúc 2-3 tuần tuổi) với nitơ lỏng trong ốngEppendof

2ml thành dạng bột mịn với cối và chày chuyên dụng

- Thêm 1ml dung dịch đệm chiết và 50 àl 10% SDS, trộn đều cho dungdịch ngấm vào mẫu Nếu tách nhiều mẫu thì sau khi nghiền mẫu và dung dịch

đệm chiết ta cắm vào đá, chờ nghiền đủ mẫu mới chuyển sang bớc sau

- ủ mẫu ở nhiệt độ 650C trong 30 phút.Trong quá trình ủ thờng xuyên lắctrộn (5 phút một lần) để quá trình chiết xảy ra hoàn toàn

- Ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C sau đó chuyển dịchtrong ở phía trên sang ống Eppendof mới

- Thêm vào ống một thể tích tơng ứng isopropanol lạnh để kết tủaaxitnucleic, lắc nhẹ nhàng và giữ lạnh trong 10-15 phút

- Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch trong và thutủa, hoà tan tủa trong 400 àl TE

- Ly tâm ở 40C với tốc độ 12000 vòng/ phút, loại bỏ phần dịch giữ lại tủa

- Thêm 400àl Ethanol 70% để rửa tủa, lắc nhẹ nhàng

- Ly tâm 12000 v/p, loại cồn lấy tủa, làm khô tủa (bằng máy hoặc ở nhiệt

độ phòng)

- Hoà tan tủa trong 200àl nớc cất khử trùng (để làm ngay) hoặc trong 100àl dung dịch 1xTE (giữ để làm sau)

50-2.3.2 Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của ADN

Để xác định độ tinh sạch của ADN chúng tôi đo chỉ số OD của ADN ở 2bớc sóng 260nm và 280 nm và tính kết quả tỉ số OD260/ OD280

Để xác định nồng độ axit nucleic thu đợc ta điện di mẫu trong gelagaroza 0,8% cùng với những mẫu λADN chuẩn đã biết trớc nồng độ, các mẫu

λADN chuẩn đợc pha với các nồng độ khác nhau Sau đó ta so sánh mẫu ADNtổng số với các mẫu chuẩn đã biết trớc nồng độ, từ đó suy ra một cách tơng đốinồng độ của các mẫu tách chiết

Để xác định một cách chính xác ta đo chỉ số OD của ADN tổng số bằngmáy quang phổ ở bớc sóng 260nm Kết quả đợc tính toán dựa trên phần mềmSpectrophomoter Hitachi U2000

Chuẩn bị gel Agaroza0,8%:

- Cân 0.8g agaroza vào bình đựng 100ml dung dịch 1XTAE

- Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất

- Để nguội đến 50- 600C, thêm 5àl Ethidium Bromide và lắc đều

- Chuẩn bị khay và lợc Đổ dung dịch agaroza vào khay đã đợc chuẩn bịtrớc sao cho không để lại bọt khí

- Chờ đến khi gel đông cứng rồi tra vào mỗi giếng 5àl mẫu (gồm 2àAND và 3àl Ethidium Bromide)

Chạy điện di 120 V trong khoảng 4h Lấy gel ra soi gel bằng đèn tử ngoại

và chụp ảnh

2.3.5 Phân lập các mảnh ADN từ sản phẩm PCR

Sau khi phản ứng PCR, những băng ADN muốn tách đợc cắt bằng daochuyên dụng sạch thành nhiều mảnh nhỏ và đợc đa vào ống ly tâm nhỏ vôtrùng

Thêm vào đó một lợng dung dịch đệm (Gene- Spin 1.4.3 DNA extractionProtect), tuỳ thuộc vào trọng lợng của gel mà cho dung dịch đệm tơng ứng(100àl binding buffer với 100mg gel) và đun cho nóng chảy ở 600C trong 5phút đến 15 phút hoặc lâu hơn cho đến khi hỗn hợp hoà tan hoàn toàn Tiếp theo

đa những ống chuyên dụng (spin column) đựng hỗn hợp vào trong máy ly tâm

và ly tâm khoảng 12000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển ống ra ngoài, loại bỏphần lọc

Thêm 500àl dung dịch (binding solution) vào mỗi ống, ly tâm12000vòng/phút trong 1 phút, sau đó chuyển ống (column) sang một ống mới

Thêm 700àl dung dịch rửa (washing solution) vào mỗi ống và ly tâm

12000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ phần lọc và ly tâm tiếp 12000vòng/phúttrong 3 phút để loại bỏ phần sót lại của ethanol, ủ ống ở 37-600C trong 5 phút

để làm khô ethanol trớc khi làm sạch ADN

Chuyển ống (column) sang một ống ependof mới, thêm 30 àl dịch hoàtan (Elution buffer với pH>7) hoặc đệm TE, ly tâm 12000vòng/phút trong 1phút, lợng ADN hoà tan để đọc trình tự

2.3.6 Tách dòng và đọc trình tự ADN

Các đoạn ADN đã tách dòng đợc đọc trình tự bằng phơng pháp chuỗi kếtthúc Big Dye deoxy trên phần mềm ABIRPISM 3100 Gennetic Analyzer.

Cặp mồi đợc sử dụng là:

T7 : (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’) và

M13 : (5’-TGTAAAAACGGGCCGAT-3’)

2.3.7 Kết quả phân tích trình tự và cấu trúc sơ đồ hình cây

Dữ liệu trình tự đợc phân tích bằng phần mềm DNA Star (Hitachi,Clifornia, USA) Những ADN tơng đồng đợc biểu diễn với thuật toán BLASTcủa NCBI (2003) Trình tự nucleotit đợc liên kết bằng việc sử dụngCLUSTALX.1 (8.1) Ma trận khoảng cách gen đợc tính toán từ MeGalig củaphần mềm DNA Star và sơ đồ hình cây sử dụng TREEVIEW trong Mega2

Chơng 3 kết quả và thảo luận

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

ảnh 1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của 35 giống lúa

M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến);

4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11(DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp);

18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23(Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan

Sử dụng 4 cặp mồi khác nhau ta có thể nhân bản 35 đoạn gen có chứavùng NBS – LRR của 35 giống lúa khác nhau từ ADN tổng số bởi phơng phápPCR.

Với 2 cặp mồi F11&R16 (ảnh 2) và F11&R18 (ảnh 3), xuất hiện mộtbăng chính có kích thớc khoảng 200 bp và vài băng mờ xấp xỉ khoảng 400-

2500 bp có thể quan sát đợc Với hai cặp mồi khác là F11&R11 (ảnh 4) vàLM637 & LM638 (ảnh 5) cho kết quả trên băng chính cỡ 500 bp Trong cặpmồi F11&R11 có một băng chính khác cỡ 1000 bp cũng đợc nhân bản (ảnh 4)

Với những băng có kích thớc xấp xỉ 500 bp thì trình tự của chúng tơng

đồng với trình tự của các gen N của cây thuốc lá (Nicotin), L6 của cây lanh(Flax) và RPS2 của cây Arabidopsis Tất cả chúng đều chứa vị trí liên kếtnucleotit và các vùng giàu leucin (NBS - LRR) Dựa trên kết quả đó chúng tôinhận thấy rằng, với hai cặp mồi F11&R11 và LM637 & LM638, chúng mangcác băng chính có kích thớc từ 502-517 bp sau phản ứng PCR, chính vì vậy màcác băng này sẽ đợc sử dụng để tách dòng và đọc trình tự

Tuy nhiên, với hai cặp mồi F11&R16 và LM637 & LM638, cặp mồiF11&R16 không tơng đồng với trình tự NBS- LRR sau khi đọc trình tự và đem

so sánh trên BLAST Trình tự của chúng giả thiết nh là trình tự mã hoá proteinhoặc không phải protein Chỉ duy nhất đoạn băng có trọng lợng phân tử 500 bpcủa cặp mồi LM637 & LM638 xuất hiện trình tự tơng đồng với trình tự NBS-LRR, vì vậy mà nó đợc sử dụng để nghiên cứu trong đề tài này