Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym ?-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

ữa là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giúp cho sự hấp thụ phospho và canxi cao, có tính kháng thể mạnh, do vậy rất tốt cho trẻ em và người già. Lactoza là disccarit chiếm chủ yếu trong thành phần sữa. Sự có mặt của lactoza trong quá trình chế biến thực phẩm đôi khi không có lợi, gây sẫm màu và tạo ra mùi không mong muốn đối với sản phẩm khi gia nhiệt, làm ảnh hưởng tới chất lượng cảm quan do sự tái kết tinh của chúng. Sau khi dùng sữa, lactoza được enzym ?-galactosidaza trong ruột non của người phân giải thành glucoza và galactoza. Tuy nhiên năng lực tổng hợp enzym trên ở người bị mất dần khi qua tuổi cai sữa. Kết quả là đại đa số người trưởng thành và người già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza. Nghĩa là, ở những người này khi sử dụng nhiều sữa sẽ có các triệu chứng như đầy hơi, chướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn. Vì vậy các hướng giải quyết được đặt ở đây là: • Phát triển các sản phẩm sữa có hàm lượng lactoza giảm để những người mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza có thể sử dụng được. • Dùng trực tiếp các chế phẩm enzym dưới dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt độ enzym ?-galactosidaza trong ruột non. Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza và galactoza có thể dùng axit hoặc enzym ?-galactosidaza. Việc thuỷ phân bằng axit dẫn đến một số bất lợi như hao mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường, gây khó khăn cho việc đảm bảo an toàn thực phẩm mà phương pháp enzym hoàn toàn có thể khắc phục được. Ngoài ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tiềm năng ứng dụng của enzym ?-galactosidaza trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản, trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein (làm các gen thông báo, chỉ thị, các phân tử cảm biến...), trong sản xuất dược phẩm và trong y học là rất lớn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym ?-galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa. Đề tài “Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym ?-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

Mục lục

Lời mở đầu 3

Phần I: tổng Quan 5

I.1 Sơ lợc về enzym -galactosidazagalactosidaza 5

I.1.1 Vi sinh vật có khả năng tổng hơp enzym -galactosidaza 5

I.1.2 Đặc tính enzym -galactosidaza từ vi sinh vật 6

I.2 Các nguồn enzym -galactosidazagalactosidaza 7

I.2.1 Enzym -galactosidaza từ vi khuẩn 7

I.2.2 Enzym -galactosidaza từ nấm mốc 8

I.2.3 Enzym -galactosidaza từ thực vật 8

I.3.Một số cơ chế của các phản ứng đợc xúc tác bởi enzym -galactosidazagalactosidaza 9

I.3.1 Cơ chế động học của phản ứng ONPG 9

I.3.2 Cơ chế động học của phản ứng lactoza 10

I.3.3 Cơ chế thuỷ phân lactoza của -galactosidaza có pH trung tính 11

I.4 Sự điều hoà sinh tổng hợp enzym -galactosidazagalactosidaza của vi sinh vật 13

I.5 Tách chiết và tinh chế enzym 14

I.5.1 Tách chiết 14

I.5.2 Tinh chế 14

I.6 ứng dụng của enzym -galactosidazagalactosidaza 16

I.6.1 ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các thành phần của sữa 16

I.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza 19

I.6.3 Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein 20

I.7 Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tơng lai 21

I.8 Khả năng ứng dụng của enzym -galactosidazagalactosidaza trong tơng lai 22

Phần II: nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 23

II.1 Nguyên liệu 23

II.2 Hoá chất 24

II.3 Thiết bị 24

II.4 Các phơng pháp nghiên cứu 25

II.4.1 Nhuộm gram 25

II.4.2 Xác định định tính enzym -galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal 27

II.4.3 Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza nội bào 27

II.4.4 Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza ngoại bào 30

Phần III: Kết quả và thảo luận 32

III.1 Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng 32

III.2 Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cácbon khác nhau 33

III.3 Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men 35

III.4 Xác định một số đặc tính enzym -galactosidazagalactosidaza thu đợc 38

III.4.1 ảnh hởng của pH phản ứng tới hoạt độ của enzym 38

III.4.2 ảnh hởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ của enzym 40

III.4.3 ảnh hởng của pH tới tính bền của enzym 41

III.4.4 ảnh hởng của pH tới tính bền của enzym 42

III.5 Nghiên cứu khả năng thu enzym nội bào 43

III.6 Nghiên cứu khả năng kết tủa enzym bằng muối amonsunfat 45

Kết luận 46

Tài liệu tham khảo 47

Lời mở đầu

Sữa là một thực phẩm có giá trị dinh dỡng cao, giúp cho sự hấp thụphospho và canxi cao, có tính kháng thể mạnh, do vậy rất tốt cho trẻ em và ng ờigià Lactoza là disccarit chiếm chủ yếu trong thành phần sữa Sự có mặt củalactoza trong quá trình chế biến thực phẩm đôi khi không có lợi, gâysẫm màu vàtạo ra mùi không mong muốn đối với sản phẩm khi gia nhiệt, làm ảnh hởng tớichất lợng cảm quan do sự tái kết tinh của chúng Sau khi dùng sữa, lactoza đợc

enzym -galactosidaza trong ruột non của ngời phân giải thành glucoza và

galactoza Tuy nhiên năng lực tổng hợp enzym trên ở ngời bị mất dần khi quatuổi cai sữa Kết quả là đại đa số ngời trởng thành và ngời già trên thế giới

đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza Nghĩa là, ở những ngời này khi sửdụng nhiều sữa sẽ có các triệu chứng nh đầy hơi, chớng bụng, đau bụng, tiêuchảy, buồn nôn Vì vậy các hớng giải quyết đợc đặt ở đây là:

 Phát triển các sản phẩm sữa có hàm lợng lactoza giảm để những ngời

mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza có thể sử dụng đợc.

 Dùng trực tiếp các chế phẩm enzym dới dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt

độ enzym -galactosidaza trong ruột non.

Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza và galactoza có thể dùng

axit hoặc enzym -galactosidaza Việc thuỷ phân bằng axit dẫn đến một số bất

lợi nh hao mòn thiết bị, ô nhiễm môi trờng, gây khó khăn cho việc đảm bảo antoàn thực phẩm mà phơng pháp enzym hoàn toàn có thể khắc phục đợc

Ngoài ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tiềm năng ứng dụng của

enzym -galactosidaza trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản, trong sinh học

phân tử và kỹ nghệ protein (làm các gen thông báo, chỉ thị, các phân tử cảmbiến ), trong sản xuất dợc phẩm và trong y học là rất lớn.

Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym

-galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa.

Đề tài “Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym

-galactosidazagalactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16” nhằmnhững mục đích sau:

 Khảo sát đặc tính sinh enzym của chủng S paucimobilis BK16.

 Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym -galactosidaza chủng S paucimobilis BK16.

 Xác định một số đặc tính của enzym -galactosidaza thu đợc từ chủng

S paucimobilis BK16.

 Nghiên cứu khả năng thu enzym kỹ thuật.

Phần I

Tổng quan

I.1 Sơ lợc về enzym -galactosidazagalactosidaza:

Enzym -galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển hóa các gốc -D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành glucoza và

galactoza [6]

Enym -galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực

vật và động vật Các enzym này đã đợc ứng dụng trong nhiều quá trình công nghệsinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật đợc sử dụng để thủy phân lactozanhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng củacác sản phẩm từ sữa Phản ứng chuyển hoá galactozyl cũng thờng đợc sử dụng đểtạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng và cấu trúc củanguyên liệu thực phẩm, dợc phẩm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [6]

Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzym

-galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phơng pháp

tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau nh trong côngnghiệp thực phẩm, trong y học và dợc phẩm cũng nh cả trong lĩnh vực nghiên cứucơ bản Mặc dù vậy, ở nớc ta, việc nghiên cứu về enzym này mới chỉ là bớc đầu vàứng dụng của chúng rất ít đợc đề cập đến

I.1.1 Vi sinh vật có khả năng tổng hợp -galactosidazagalactosidaza :

Hiện nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra đợc nhiều chủng loại vi sinh vật có

khả năng sinh tổng hợp enzym -galactosidaza với hoạt lực cao Enzym khi đợc

tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trờng) hoặc nội bào (tích tụtrong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặclyzosome của tế bào…) [6].) [6]

Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym -galactosidazagalactosidaza:

lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis …

Nấm mốc

Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae, Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum canescens, Rhizopus acidus, R.niveus,…

Vi khuẩn

Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie, A.formicans, Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae, Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris,…

Vi khuẩn gram dơng : Bacillus acidocaldarius, B.circulans, B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira, …

I.2 Đặc tính của enzym -galactosidazagalactosidaza từ vi sinh vật:

Khối lợng phân tử của enzym dao động từ 19.000 đến 630.000 Dalton Cấutrúc dới phân tử của các enzym này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer

(enzym từ Kluyveromces lactic) đến octamer (enzym từ E.coli) [4].

Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzym

là khác nhau Các enzym -galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối u thuộc vùng trung tính, trong khi đó hầu hết các enzym -galactosidaza từ nấm mốc

có pH thuộc vùng axit, có một số chủng đạt tới pH tối u là pH=2 [15]

Một số enzym -galactosidaza từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2, ví dụ nh enzym -galactosidaza từ S rectivirgula

cần phải có mặt nhiều ion kim loại hoá trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối

đa Tuy nhiên một số enzym -galactosidaza khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại nh enzym từ Rhizobium melioti [15].

Những điểm trên cho ta thấy tính đa dạng của enzym -galactosidaza vi

sinh vật

I.2 Các nguồn enzym -galactosidaza:galactosidaza:

Mặc dù rất nhiều enzym -galactosidaza từ vi sinh vật đợc biết đến nhng

chỉ có một số ít các vi sinh vật đợc lựa chọn làm nguồn sinh enzym trong côngnghiệp Hầu hết các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc nh là

Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryzae hoặc từ vi khuẩn

nh E.coli Những loài vi sinh vật đó đợc lựa chọn chính vì chúng có thể tạo ra enzym -galactosidaza với giá rẻ và an toàn khi cho thêm vào thực phẩm [5].

Enzym từ vi sinh vật, thực vật đợc ứng dụng rất rộng rãi trong các quá trìnhcông nghệ sinh học

I.2.1 Enzym từ vi khuẩn:

Vi khuẩn E.coli là đối tợng đợc nghiên cứu đầu tiên Cấu trúc bậc ba của

enzym từ E.coli cũng nh cơ chế điều hoà phiên mã của gen lacZ đã đợc khẳng định

tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ hơn về cơ chế xúc tác của enzym này Mặc

dù vậy, việc sử dụng enzym này vào các quá trình sinh học chỉ đợc kiểm nghiệm ởquy mô phòng thí nghiệm do vi khuẩn này không đợc phép có mặt trong các sản

phẩm thực phẩm Lĩnh vực chủ yếu của enzym từ vi khuẩn E.coli này là trong

nghiên cứu sinh học phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn dịch

Enzym -galactosidaza từ Steptcoccus thermophilus – một trong những vi

khuẩn đợc sử dụng ở công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ sữa cũng đã đợc

sử dụng để thủy phân lactoza trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt và

độ an toàn khi đợc sử dụng dới dạng phụ gia sản phẩm Nó cũng đợc dùng làmchất xúc tác cho quá trình sản xuất các galacto-oligosaccarit từ lactoza do hoạt tínhchuyển hóa galactozyl của nó cao Đối với vi khuẩn chúng có thể phát triển tối utrong dải pH từ 6,5 đến 7,5 Chúng kém phát triển ở pH dới 4 hoặc trên 8,5 [5]

I.2.2 Ezym từ nấm mốc:

Enzym từ nấm mốc nh Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và

A.oryae đã đợc sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa Đặc

biệt enzym từ A.orytococcuss laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính

chuyển hóa galactozyl cao do vậy đợc dùng để sản xuất các galato-oligosaccarit từlactoza

Nấm mốc phát triển tối u trong phạm vi pH từ 5 đến 7, chúng có thể pháttriển ở dải pH từ 3 đến 8,5 [6]

I.2.3 Enzym từ thực vật – lá bina:

Các nhà khoa học đã tách chiết và tinh chế đợc enzym -galactosidaza từ lá cây bina Enzym -galactosidaza tách từ nguồn thực vật này có khả năng thủy

phân các loại cơ chất khác nhau ở các tốc độ khác nhau Cụ thể là thủy phân

lactoza với tốc độ bằng 2% so với thủy phân p-nitrophenyl--galactozit.

Monogalactozyldiglyxerit đợc hấp thụ vào trong celit bị thủy phân bởi

-galactosidaza tại tốc độ nhỏ hơn 250 lần so với thủy phân

p-nitrophenyl--galactozit [8]

I.3 Một số cơ chế của các phản ứng đợc xúc tác bởi enzym -galactosidazagalactosidaza :

I.3.1 Cơ chế động học của phản ứng với ONPG:

Cơ chế động học của phản ứng với sự xúc tác của enzym -galactosidaza từ

Escerichia coli có thể đợc thể hiện đơn giản nhất bằng phản ứng với nitrophenyl- -D-galatopyranozit (ONPG) ONPG là cơ chất tổng hợp trong

2-đó aglycon 2-đóng vai trò là nhóm chuyển dời ONPG (đợc ký hiệu là S) gắn với

enzym để hình thành phức chất Michaelis ES (bớc a) 2-nitrophenolat nhanh chóng

đợc giải phóng để tạo thành hợp chất trung gian enzym-galatozyl (bớc b), một phần hợp chất này đợc thuỷ phân tiếp theo (bớc c) và phần còn lại đợc chuyển hoá

galatozyl (g,h) Đối với phản ứng thuỷ phân phân tử H2O phản ứng với hợp chất

trung gian enzym galatozyl để tạo ra galatoza và enzym ở dạng tự do (bớc c) Đối

với phản ứng chuyển hoá galatozyl, chất nhận galatozil (kí hiệu là Nu) có mặt tronghỗn hợp phản ứng gắn vào vị trí glucoza của enzym để tạo thành phức chất gồm 3

cấu tử (bớc g), sau đó tạo thành sản phẩm phụ Gal-Nu (bớc h) Trong phản ứng

chuyển hoá galatozil, khi nồng độ chất nhận tăng thì tỷ lệ 2-nitrophenol giải phóng

ra cũng tăng, giảm hoặc không đổi tùy thuộc vào bản chất của chất nhận và cáchằng số Michaelis (k2, k3 và k6).

Kí hiệu:

E: enzym S: cơ chấtNP: 2-nitrophenol

Gal: galactozaGlu: glucozaNu: chất nhận galactozyl

I.3.2 Cơ chế động học của phản ứng với lactoza:

Cơ chế động học của phản ứng với lactoza (một cơ chất tự nhiên) khác so vớiphản ứng với ONPG ở trên (hình 1) Bớc (b) đợc thay thế bằng các bớc (d, e) và (f)

do glucoza (sản phẩm của quá trình thuỷ phân lactoza) có ái lực đối với vị tríglucozyl trên enzym này, vì vậy glucoza đợc giải phóng ra có thể kết hợp ngợc lại đểhình thành một phức chất gồm 3 cấu tử và sau đó phản ứng với galactoza để tạo

allolactoza Trong suốt quá trình thủy phân lactoza, allactoza chỉ đợc hình thành tạmthời do nó cũng là một cơ chất trong enzym này.

Khi nồng độ lactoza tham gia phản ứng cao, lactoza cũng đóng vai trò chấtnhận lactozyl (Nu) và sản phẩm chuyển hoá là lactozyllactoza Ngợc lại,galactozyllactoza có thể đóng vai trò làm chất nhận galactozyl để tạo ra cáctetrasaccarit Bằng cách này, hỗn hợp các oligosaccarid bao gồm các di-, tri- vàcác saccarit cao hơn sẽ đợc hình thành từ lactoza

I.3.3 Cơ chế thuỷ phân lactoza của -galactosidazagalactosidaza có pH trung tính:

Nhóm sulfhydryl nằm ở vị trí hoạt hóa của -galactosidaza đóng vai trò

làm axit chung để proton hoá nguyên tử oxy của liên kết galactozyt, một nhómimidazol đóng vai trò làm nhóm ái nhân và tấn công vào vị trí C-1 của glycon này.Phản ứng đã dẫn đến sự hình thành một phức chất trung gian enzym-galactozylnhờ liên kết đồng hóa trị Galatoza sau đó tách khỏi enzym nhờ sự hấp thụ mộtproton từ nớc bởi anion sulfhydryl đóng vai trò nh một bazơ và giúp cho nhóm OHtấn công vào vị trí C-1 (hình bên)

H×nh 2: C¬ chÕ thuû ph©n lactoza cña -galactosidazagalactosidaza cã pH trung tÝnh

I.4 sự Điều hoà sinh tổng hợp enzym -galactosidazagalactosidaza của vi

sinh vật :

Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật tạo ra các sản phẩm vừa đủ mứccần thiết cho hoạt động sống, sinh sản và phát triển của chúng Vận tốc sinh tổnghợp enzym đợc điều chỉnh một phần bằng bộ máy di truyền, còn một phần là docác yếu tố của môi trờng bên ngoài quyết định

Sự tổng hợp enzym trong tế bào sống có thể đợc tăng cờng (kích thích) hoặc

có thể bị kìm chế (trấn áp) Sự tăng cờng sinh tổng hợp một enzym nào đó hoặcmột nhóm enzym cùng tham gia vào việc xúc tác một trình phản ứng dới ảnh hởngcủa hợp chất hóa học (mà thờng là cơ chất phản ứng) gọi là sự phản ứng sinh tổnghợp Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp (gây nên sự gia tăng enzym nào đó)gọi là chất cảm ứng (yếu tố cảm ứng), còn enzym đợc tạo thành bằng cơ chế cảmứng đợc gọi là enzym cảm ứng Chất gây kìm hãm sự sinh tổng hợp một enzymnào đó gọi là chất kìm toả phụ, các enzym bị kìm hãm không đợc tổng hợp gọi làenzym bị kìm toả

Sự tạo thành các enzym dị hoá (enzym xúc tác sự phân giải cơ chất) đợc

điều chỉnh bằng cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp Một trong những ví dụ điển hình

về cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym đã đợc nghiên cứu khá cặn kẽ là sự tổng

hợp enzym -galactosidaza cần để sử dụng lactoza của tế bào E.coli Các tế bào

E.coli nguyên thuỷ có thể sinh trởng trên nhiều cơ chất chỉ chứa một lợng rất nhỏ

-galactosidaza Nếu cho thêm vào môi trờng lactoza hay -galactosidaza khác trong trong một ít thời gian thì hoạt lực -galactosidaza của chúng tăng lên 1.000 lần Trong trờng hợp nh vậy có đến 3% toàn bộ protein tế bào là -galactosidaza.

I 5 Tách chiết và tinh chế enzym :

I.5.1 Tách chiết:

Để tách chiết và thu hồi enzym cần phải sử dụng nguồn nguyên liệu có khảnăng tách chiết đợc một lợng lớn enzym bằng các quy trình thông thờng Đối vớienzym từ một số nguồn cơ chất nhất định cần phải sử dụng phơng pháp tách chiếtnhất định, không thay thế bằng phơng pháp khác

Nguyên tắc chung của quá trình tách chiết enzym là cần phải biết rõ vị tríenzym nằm trong tế bào (enzym có mặt ở dạng tự do hoặc dạng liên kết với màng)

để xác định phơng pháp tách chiết phù hợp Đặc biệt trong trờng hợp enzym làenzym nội bào thì trớc hết phải phá vỡ cấu trúc của tế bào Có thể phá vỡ cấu trúccủa các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóabằng thiết bị đồng hóa), bằng tác dụng của hóa chất (rợu butylic, axeton, glixerin,clorofom, SDS…) [6] ), bằng sóng siêu âm…) [6] Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tếbào, enzym đợc chiết bằng nớc, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dungdịch muối trung tính

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lợng cao khác thờngdùng kết hợp nhiều phơng pháp khác nhau: phơng pháp biến tính chọn lọc nhờ tácdụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trờng, phơng pháp kết tủa phân đoạn bằngmuối trung tính hoặc dung môi hữu cơ, các phơng pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc

ký trao đổi ion), điện di, phơng pháp lọc gel…) [6]

Phơng pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH môi trờngchỉ dùng đối với trờng hợp của các enzym bền nhiệt hoặc bền axit Dịch enzym đợcgiữ ở 50 đến 700C hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đóprotein tạp đã bị biến tính đợc loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

Phơng pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau

về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độbão hòa) xác định đợc dùng phổ biến để loại bỏ bớc đầu protein tạp của các dịchenzym Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ tuy nhiên phơngpháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ chọndùng Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải đ-

ợc thực hiện ở nhiệt độ thấp (00C)

Phơng pháp hấp thụ chọn lọc đợc dùng phổ biến trong việc tách và làm sạchenzym Chất hấp thụ chủ yếu thờng đợc dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách

đặc biệt cao Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách là chấthấp thụ protein tạp hoặc hấp thụ enzym Quá trình hấp thụ thờng đợc tiến hành ở 00C.Enzym sau đó dợc chiết bằng các dung môi thích hợp

Phơng pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi iongiữa protein đợc tan trong nớc hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi

ion Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc dẫn xuất este củaxelluloza Phơng pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE – xenlluloza)

có u điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại

bỏ cả các tạp chất axit nucleic Điều đó cho phép không cần dùng đến các biệnpháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp nh kết tủa protamin hoặcstreptomixinsufat thờng dùng trớc đây

Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử củachúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng củaepiclohidrin tạo thành “sàng phân tử” Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợpmột hỗn hợp gồm nhièu chất trên cột sephadex, các phân tử có kích thớc nhỏ sẽkhuếch tán vào bên trong cột, các phân tử có kích thớc lớn không có khả năng đivào sẽ đợc chiết ra khỏi cột Vậy cơ sở của phơng pháp lọc gel sephadex dựa vào

sự khác nhau về kích thớc, hình dạng và phân tử lợng của các chất trong hỗn hợp

Sự chênh lệch nhiều về phân tử lợng của các enzym (12.700 – 1.000.000 Da) chophép tách và làm sạch enzym bằng phơng pháp lọc gel sephadex là phơng pháp cónhiều triển vọng [1]

Cho đến nay không có phơng pháp tách và làm sạch chung cho mọi enzym

Để xây dựng phơng pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết lựa chọn vàphối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau

I.6 ứng dụng của enzym -galactosidaza:galactosidaza:

I.6.1 ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa:

Enzym -galactosidaza thuỷ phân các gốc -galactosidaza tận cùng đều không khử của các -D-galactosit thành các oligosaccarit bao gồm cả lactoza.

Lactoza là disaccarrit bao gồm galactoza và glucoza, trong sữa bò nó chiếmkhoảng 40% trọng lợng chất khô

Việc tách loại lactoza khỏi các sản phẩm thực phẩm là cần thiết đối với đại đa

số ngời tiêu dùng - những ngời bị thiểu năng chuyển hoá lactoza với các triệu chứng

đau bụng, khó tiêu khi dùng lactoza Tuy nhiên, các sản phẩm thủy phân của lactozabao gồm glucoza và galactoza đều dễ hấp thụ qua đờng tiêu hoá và dễ đồng hoá

Lactoza trong sữa cũng có thể gây ra một số khó khăn trong quá trình chếbiến phomat Quá trình sản xuất phomat tạo ra một lợng lớn dịch sữa “whey” dớidạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên Dịch sữanày là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực thực phẩmcũng nh thức ăn gia súc Vấn đề là lactoza không hoà tan hoàn toàn và có xu hớngkết tinh từ dung dịch này Điều này làm cho việc vận chuyển dich sữa là khó khăn,

đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do vậy mỗi năm ng ời ta phải

đổ đi một lợng lớn dịch sữa

Lactoza có thể đợc thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ phânbằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong quá trình chế biến

Cách tốt hơn là sử dụng enzym -galactosidaza Enzym này đã đợc tìm thấy

trong nhiều hệ vi sinh vật Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm men,nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thơng mại chính

Một quá trình khả thi về mặt kỹ thuật và công nghệ khi sử dụng enzym này

để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đông tụ sữa chua hoặc dịchpermeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về công nghệ nh hiện tợng “lên cát”

ở kem, hoặc hiện tợng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa nh dịch sau đông tụphomat Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học

của enzym -galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần chính

phụ của ngành công nghiệp chế biến sữa

Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những ngời bệnh bị thiểunăng chuyển hoá lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ phân này,

đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh Vì vậy, ngời ta mong muốn sản xuất ra sữa

có hàm lợng lactoza thấp sao cho mọi ngời đều có thể dụng các sản phẩm từ nó

Việc lựa chọn công nghệ cho quá trình thuỷ phân tuỳ thuộc chủ yếu vào đặctính và các chi phí sản xuất, tàng trữ và tiếp thị sản phẩm Quy trình công nghệ khảthi bao gồm bổ sung trực tiếp enzym hoà, tan, tái tuần hoàn enzym hoà tan bằngquy trình màng hoặc sử dụng enzym cố định Mặt khác, ở những phân xởng nhỏ sảnxuất các sản phẩm từ sữa cũng có thể sử dụng các sản phẩm enzym ở dới dạng canhtrờng nuôi cấy một cách đơn giản

Vấn đề khó nhất khi sử dụng -galactosidaza là khó đạt đợc thuỷ phân hoàn

toàn vì 2 lý do sau:

 Enzym này là sản phẩm bị ức chế bởi glucoza đợc tạo ra trong quá trìnhphản ứng

 Enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tổng hợp các đồng phân liên kết 

1-6 của lactoza và các chất khác ngoài lactoza.

Đối với mục đích sử dụng thuỷ phân lactoza các hớng chính hiện nay là:

 Sử dụng enzym cố định

Có rất nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về sử dụng enzym

-galactosidaza cố định nhng cho đến nay áp dụng nó vào quy mô công nghiệp vẫn

gặp nhiều khó khăn Enzym này đợc cố định trên một loạt các chất mang vô cơ,Shepadex, DEAE-xenllulose, thuỷ tinh xốp hoặc bẫy vào trong gelpolyacrylamit…) [6] Enzym cố định đợc sử dụng cả trong các thiết bị phản ứng liên tục

và gián đoạn [9]

 Sử dụng ở dạng liposom sấy khô có chứa -galactosidaza để thuỷ phân

lactoza trong sữa

Liposom bao gồm một màng kép lipit giống nh màng sinh học có khả năng

ứng dụng rộng rãi trong y học Enzym -galactosidaza đợc thêm vào giữa dới

dạng các liposom sấy khô có khả năng thuỷ phân lactoza trong sữa nhờ sự phângiải liposom với sự có mặt của các muối hoá trị 2 và đợc hoàn nguyên gần nh hoàntoàn bằng cách hydrat hoá lại [10]

 Sử dụng vi sinh vật chịu nhiệt để sinh tổng hợp nên enzym có tính bền nhiệtcao có thể sử dụng trong các quá trình chế biến đòi hỏi nhiệt độ cao

Hạn chế lớn nhất của các enzym này là để vô hoạt enzym sau quá trình chếbiến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao, điều này đôi khi dẫn đến chất lợng sản phẩmthay đổi

 Sử dụng vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp để sinh tổng hợpenzym có khả năng ở nhiệt độ thấp

Ngời ta mong muốn các enzym hoạt động ở nhiệt độ thấp này có phân tửlinh động hơn, cho phép biến đổi thuận nghịch về cấu tạo nhằm tạo điều kiện chohoạt động xúc tác Tính linh động hơn về cấu trúc cũng khiến cho enzym này nhạy

đối với sự phá huỷ bởi nhiệt và hóa chất Các enzym này cũng góp phần đáng kểtrong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và sự ổn định của các phân tửprotein Khi sản xuất các enzym này thì công nghệ tách cần phải thực hiện trong

các điều kiện nhẹ nhàng và giảm thiểu số bớt tinh chế nhằm hạn chế sự hao hụtenzym [8].

1.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza:

Oligosaccharid còn đợc gọi là galactoligosacchatit (GO), là sản phẩm củachuyển hoá nội phân tử

Trong những thập kỷ qua ngời ta đã phát hiện ra GO có tác dụng tốt đối vớisức khoẻ con ngời, GO có khả năng chống lại đợc chất gây ung th, giảm lợngcholesterol và tốt cho đờng ruột, GO còn đợc sử dụng làm chất tạo ngọt, chất hoàtan…) [6] Vì vậy nó đợc dùng làm nguyên liệu thực phẩm

Để có sản phẩm GO lactoza, rất nhiều thử nghiệm đợc nghiên cứu trên

những vi sinh vật có khả năng sinh GO cao hoặc enzym -galactosidaza có hoạt

tính chuyển hoá galatozyl cao Ngày nay, có rất nhiều loài vi sinh vật đợc tìm thấy

có khả năng sinh enzym có thể chuyển hoá galatozyl cao nh là Bacillus circulans,

Steptococcus thermophuluss, Aspergillus oryzae Những tế bào nấm men và vi

khuẩn lactic cũng có thể sinh enzym chuyển hoá lactoza thành GO [12]

Vào những năm 1950 phát hiện oligosaccharid đợc hình thành trong quá trình

thuỷ phân nhờ enzym -galactosidaza Có 12 loại oligosaccharid đợc tạo thành tuỳ

thuộc vào nguồn enzym và cấu trúc của các oligosaccharid đó đã đợc các nhà khoahọc phân tích Nakanishi đã đa giả thiết sự tổng hợp oligosaccharid nhờ phản ứng

chuyển hoá glycozyl từ enzym -galactosidaza của vi khuẩn Bacillus circulans,

nh-ng ônh-ng vẫn cha đa ra đợc cấu trúc của các oligosaccharid đó Xa hơn, Usui et al đã

chỉ ra sự chuyển hoá đặc hiệu mối liên kết -galactosidaza(1-galactosidaza4) galatozyl-disaccharit nhờ enzym

-galactosidaza từ Bacillus circulans.

Có 11 oligosaccharit tạo ra nhờ enzym -galactosidaza của vi khuẩn

Bacillus circulans với cơ chất là lactoza đã đợc phát hiện và làm sáng tỏ việc Việc

điều tra nghiên cứu cấu trúc của các galatoligosaccharit nhờ phản ứng chuyển hoá

glycozyl của enzym -galactosidaza từ vi khuẩn Bacillus circulans sử dụng

pNP-galactoza nh là một chất cho galatozyl và glucoza nh một chất nhận đã đợc nghiêncứu

I.6.3 Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein:

Enzym -galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển

hoá các gốc -galactosidazaD-galactozyl Các gen -galactosidaza đã đợc tạo dòng và tách chiết

từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Chúng có những cấu trúc bậc một, cáu trúcbậc bốn, khối lợng phân tử, tính đặc hiệu cơ chất và tính đặc hiệu xúc tác khác nhau

rõ rệt Chúng đợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến do khả năng ứng dụngrộng rãi làm các gen thông báo trong nhiều hệ thống, chúng thờng liên quan đếncác bệnh di truyền của ngời nh bệnh GMY-gangliosidosis và bệnh Morquio typ B

Kỹ nghệ Protein là một lĩnh vực cực kỳ phát triển nhằm tạo ra các protein đachức năng, tạo ra các dạng đột biến của enzym với các đặc tính tốt và số lợng ngày

một gia tăng Enzym -galactosidaza từ E.coli từ lâu đã đợc ứng dụng rộng rãi làm

các maker phân tử Bằng cách cài cho phép xác định rõ vị trí dung nạp đối với sự

điều tiết của các peptit chức năng lạ và sự biểu hiện của chúng trên bề mặt tiếp xúcvới dung dịch của enzym có hoạt tính Hơn nữa việc định vị peptit kháng thể từ

virut trên vòng hoạt hoá của -galactosidaza tạo ra một phân tử cảm biến nhằm

phát hiện định tính các kháng thể đặc hiệu Việc gắn kết của enzym này với huyết

thanh hoặc kháng thể đơn dòng đợc cho là ngăn chặn sự cài gắn peptit Hoạt tính

đợc phục hồi này có thể đợc xác định một cách chính xác, nhanh chóng và dễ dàng

bằng phơng pháp so màu quang phổ Vì các lý do trên, -galactosidaza trớc đây

đ-ợc gọi là phosphataza kiềm có thể trở thành nền tảng cho một thế hệ phân tử cảmứng mới từ enzym

I.7 Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tơng lai:

Mặc dù việc sản xuất và ứng dụng -galactosidaza ngày một phát triển, ngời ta

vẫn cố gắng giảm chi phí sản xuất, tối thiểu hoá lợng enzym cần sử dụng, nhng nângcao tốc độ và hiệu suất thuỷ phân Nguồn enzym trong tơng lai sẽ là enzym đợc sửdụng ở dạng vi năng, enzym đợc cải biến bằng phơng pháp hoá học hoặc phơng pháp

di truyền đối với chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó

I.8 Khả năng ứng dụng của enzym -galactosidaza:galactosidaza trong t-galactosidaza:

ơng lai:

Do tầm quan trọng của enzym -galactosidaza trong các quá trình sinh học,

trong các ứng dụng trị liệu và chế biến thực phẩm nên việc đánh gia và tối u hoáphơng pháp tổng hợp nhằm tạo ra phơng pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả

là mục tiêu của các nhà sản xuất và nghiên cứu

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tổng hợp nên các oligosaccarit mới cótiềm năng ứng dụng rất lớn Các glicoprotein chứa duy nhất một loại gốc đờngtham gia vào việc xác định loại nhóm máu, đóng vai trò trong các bệnh truyềnnhiễm virut và nhiễm khuẩn, chịu trách nhiệm đối với các nhận biết tế bào – tếbào, nằm trên các vị trí thụ thể tế bào Các galactozit có thể đợc sử dụng làm phụgia thực phẩm với nhiều mục đích, chức năng khác nhau nh làm chất tạo ngọt,chất ổn định, chất hoà tan…) [6]

Trong tơng lai, các ứng dụng trong thực phẩm, dợc phẩm và y học tập trungvào các quá trình chuyển hoá galatozyl nhằm tổng hợp nên các hợp chất chức năngduy nhất bằng cách thêm vào các phần tử nhận

Phần II

Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu

II.1 Nguyên liệu:

II.1.1 Môi trờng nuôi cấy, phân lập:

II.1.1.1 Môi trờng thạch dùng để phân lập (môi trờng Lactoza-galactosidazaBroth):

II.1.1.2 Môi trờng nuôi cấy cơ bản (môi trờng Lactoza):

Môi trờng thạch dùng để cấy chuyền và giữ giống còn có thêm Agar-Agar với hàm lợng 15  20g/lít môi trờng