BÀI GIẢNG BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay thế.. Quy tr

12/2/17 vbngoc@hcmus.edu.vn TS Vũ Bích Ngọc- 1

Dịch vụ làm đông lạnh cơ thể

người chết để chờ hồi sinh

•  Gần 1000 người trên thế giới đã chọn

cách bảo quản lạnh cơ thể sau khi chết để

chờ cơ hội tái sinh trong tương lai

Khi "khách hàng" đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor

chuyển họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim

phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa

Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho

tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu

và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay

thế

Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần Tiếp đó, họ cho các thi thể vào tủ đông lạnh hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống

•  chịu được nhiệt -100 0 C

1949 Polge, Parks và Smith

•  là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính

•  Quá trình ổn định vật liệu sinh học ở nhiệt

Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quy trình bảo quản tế bào

Tất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến

•  Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn về đặc tính

•  Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào

•  Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu hình

•  Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn trong nuôi cấy

•  Sự tương đồng trong thí nghiệm

•  Tiết kiệm thời gian và vật liệu

YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỐNG- CHẾT CỦA

rã đông

Môi trường đông lạnh-chất bảo quản

! Môi trường cơ bản:

DMEM, IMDM, RPMI, …

! Huyết thanh

! Kháng sinh

! Chất bảo quản

(CPA): glycerol, DMSO

VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10% DMSO, 1% Antibiotic-antimycotic

bào và thường không độc hại cho tế bào

–  glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi

–  giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá

trình đóng băng

–  giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ thấp

•  Các chất tan không thấm qua màng:

đường và các hợp chất có phân tử lượng cao như polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl starch, polyethylen glycol và dextrans

•  chất bảo quản không thấm có thể góp

phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung

dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn

sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá

4oC ——> 2 giờ -40oC ——> Một vài ngày -80oC ——> Một vài tháng

Nhi ệ t đ ộ th ấ p có kh ả năng "làm ch ậ m th ờ i gian" ho ặ c th ậ m chí

d ừ ng l ạ i th ờ i gian” sinh h ọ c

-196oC " một vài thế kỷ

•  -5 0 C, cả tế bào và môi trường quanh nó chưa

bị đóng băng

bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool)

thể xảy ra đối với cơ thể sống

không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không

đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt

độ này trong nhiều thế kỷ

T ố c đ ộ làm l ạ nh Chu ẩ n hoá th ờ i gian h ạ nhi ệ t

Bảo quản đông lạnh

Cách tiếp cận hiệu quả

để tối ưu hoá bảo quản đông lanh

Quy trình đông lạnh quá chậm

Tế bào sẽ mất nhiều nước

Thể tích tế bào trở nên quá nhỏ

Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng

Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước

nước được giữ trong tế bào trở thành tinh thể đá,

thể tích tế bào có thể không đổi, thậm chí lớn hơn

Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào

I am Lucky

Th ờ i gian đông l ạ nh phù h ợ p, t ế bào gi ữ

đ ượ c đi ề u ki ệ n t ố t nh ấ t cho s ự s ố ng sót

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/93/Cryopreservation.jpg http://www.scq.ubc.ca/a-cold-greeting-an-introduction-to-cryobiology/

Tốc độ làm lạnh có ảnh hưởng

lớn đến sự hình thành đá nội bào

Nuôi cấy/chuẩn bị tế bào

Bổ sung chất bảo quản

Làm lạnh Lưu trữ

Rã đông phục hồi tế bào Nuôi tăng sinh

•  Kính hiển vi đảo ngược

•  Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II

•  Tế bào được nuôi cấy trong Flask hoặc dụng

•  ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml

•  Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng

Kiểm tra dòng tế bào về sự ổn

định và nhiễm

Tế bào được nuôi lại để đảm

bảo ở pha log của tăng

trưởng

Dán nhãn cryotubes với tên

dòng tế bào, số lượng tế bào/

lọ, ngày

Xác định tỉ lệ tế bào sống chết

Chuẩn bị tế bào trước đông lạnh

Đông lạnh tế bào

Thu tế bào đơn

Bổ sung từ từ (nhỏ giọt) môi trường đông lạnh chứa chất bảo quản đông lạnh (DMSO nồng độ 5-10%) vào ống

chứa tế bào sao cho mật độ tế bào từ 10 6 đến 10 7 tế

bào/vial

Làm lạnh tế bào theo quy trình phù hợp

Lưu giữ tế bào ở nhiệt độ -80 đến -196 0 C

Các b ướ c c ơ b ả n cho b ả o qu ả n đông l ạ nh mô/t ế bào

cài đặt hệ thống làm lạnh với thông số nhiệt độ và thời gian làm lạnh tương ứng

chuyển vào bình ni tơ lỏng

•  Ở tốc độ làm lạnh cực nhanh và độ nhớt cao, tế bào không hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào

•  việc kiểm soát độ nhớt mong muốn cần phải được khảo sát và chuẩn hoá

•  phương pháp đã thành công cho tế bào tinh trùng, trứng, phôi và tế bào gốc phôi

•  Nhiệt độ khởi động: 4 0 C hoặc RT

•  Tốc độ hạ nhiệt: làm lạnh -1 0 C mỗi phút và hạ nhiệt đến

•  nhiệt độ đạt dưới -100 0 C, có thể đặt trực tiếp vào ni

Các tế bào cần được làm tan nhanh chóng và sau đó pha loãng từ

từ vào môi trường tăng trưởng

Chuyển một ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm

DMSO có thể gây độc cho tế bào " nên thay môi trường nhanh

Có thể thay DMSO bằng glycerol

Rã đông tế bào

Các b ướ c c ầ n thi ế t đ ể rã đông mô/t ế bào

và chu ẩ n b ị cho s ử d ụ ng lâm sàng

•  làm tan nhanh tinh thể đá có thể cứu được nhiều tế bào vì có thể ngăn chặn được sự tăng trưởng của tinh thể đá nhỏ thành tinh thể đá lơn hơn (tái kết tinh) trong tế bào

(-5 đến -15 độ)

•  1 số nghiên cứu cho thấy làm ấm chậm có hiệu quả tối ưu cho các mẫu đông lạnh

lậm

•  tế bào nhạy cảm với việc phình ra hơn so với việc co nên việc loại bỏ chất bảo quản

có thể gây hư hại tế bào nhiều hơn so với việc bổ sung (ASTT)

•  trong quá trình rã đông, môi trường chứa chất bảo quản thường được pha loãng

trước khi loại bỏ hoàn toàn khỏi tế bào

•  tế bào bám dính, việc thao tác rã đông

đơn giản hơn với việc loại bỏ môi trường đông lạnh khỏi lớp đơn tế bào và bổ sung môi trường nuôi tế bào mới

•  huyền phù tế bào, ly tâm để tách tế bào khỏi môi trường có chất bảo quản đông lạnh

•  Bể ổn nhiệt

•  Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II

•  Máy ly tâm

•  Ống chứa tế bào đông lạnh

•  Môi trường rã đông: bao gồm môi trường

cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 20-30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm

•  Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng

•  Flask nuôi tế bào

•  Tế bào từ các bình bảo quản đông lạnh (ở

nhiệt thập cực thấp) nên được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt (37 0 C) để tránh tối đa sự tái kết tinh tinh thể đá

•  Các thao tác trên tế bào nên được thực hiện

nhẹ nhàng để tránh gây tổn thương cho tế

bào

•  Sau khi rã đông 1 ngày, tỷ lệ tế bào chết

chiếm một số lượng đáng kể, nên thay môi trường mới để loai bỏ tế bào chết

Ủ ấm môi trường nuôi tế bào ở 37 0 C và chuyển vào tủ thao tác vô trùng

Lấy ống tế bào từ bình ni tơ lỏng, chuyển ngay vào bể ổ nhiệt ở 37 0 C, ủ đến khi dung dịch tan băng trên 70% (tránh cho nước dính vào

nắp cryovial, có thể gây nhiễm khuẩn)

Nhẹ nhàng hút chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 ml

Nhẹ nhàng bổ sung thêm môi trường rã đông với tốc độ 6-10 ml môi trường rã đông trong 2 phút, trộn nhẹ

Ly tâm ở tốc độ 1.500-3.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ môi trường có chứa DMSO, thu tế bào

Tái huyền phù tế bào trong môi trường rã đông hoặc môi trường chuyên biệt

Phần tế bào còn lại trong ống ly tâm có thể sử dụng để kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào

Chuyển huyền phù tế bào vào Flask nuôi và tiến hành nuôi trong tủ nuôi tế bào ở điều kiện phù hợp