PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN LÁ (RICE RAGGED STUNT VIRUS) TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA VÀ RTPCR

HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN LÁ RICE RAGGED STUNT VIRUS TRÊN CÂY LÚA Oryza sativa BẰNG PHƯƠNG... HCM BỘ MÔN CÔNG N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN

LÁ (RICE RAGGED STUNT VIRUS) TRÊN

CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN

LÁ (RICE RAGGED STUNT VIRUS) TRÊN

CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

 Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

 ThS Trần Thị Việt Hà, ThS Nguyễn Thị Hoa và ThS Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện tốt nhất cho việc thực hiện và hoàn tất khoá luận tốt nghiệp

 Các anh chị thuộc Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu II, Cục Bảo vệ Thực Vật đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian thực tập ở phòng thí nghiệm

 Các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học

và Môi trường, Đại học Nông Lâm Tp HCM đã quan tâm giúp đỡ trong khoảng thời gian thực tập phòng thí nghiệm

 Toàn thể lớp CNSH 30 và những người bạn tốt đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tháng 10, năm 2008

Trịnh Quang Vỹ

iii

TÓM TẮT

Trịnh Quang Vỹ, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2008

“PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN LÁ (RICE RAGGED STUNT

VIRUS) TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA VÀ

RT-PCR”

Hướng dẫn khoa học

ThS TRẦN THỊ VIỆT HÀ - Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II

ThS NGUYỄN THỊ HOA - Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II

ThS NGUYỄN VŨ PHONG – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Lúa gạo là cây trồng quan trọng ở nước ta Bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá gây tổn thất đến năng suất và phẩm chất cây lúa mỗi năm Bệnh rất khó phát hiện Vì vậy yêu cầu cấp thiết hiện nay là tìm phương pháp phát hiện bệnh nhanh nhạy và hiệu quả

Nội dung nghiên cứu

 Phát hiện virus RRSV bằng phương pháp ELISA

 So sánh hiệu quả ly trích RNA tổng số của lá lúa theo qui trình Aurum TM total RNA mini Kit và qui trình ly trích bằng TRIzol

 Áp dụng phương pháp RT-PCR phát hiện virus RRSV

Kết quả đạt được

 Phát hiện virus RRSV trên các mẫu lúa và mẫu rầy nhiều địa phương

 Qui trình ly trích RNA tổng số bằng TRIzol có hiệu quả cao

 Đã bước đầu xây dựng qui trình RT-PCR phát hiện được virus RRSV với cặp mồi RRSV-1

iv

SUMMARY

Trinh Quang Vy, Nong Lam University, October, 2008 “DETECTION RICE

RAGGED STUNT VIRUS (RRSV) OF THE RICE (Oryza sativa) BY ELISA AND

RT-PCR METHOD”

Supervisor:

MSc.TRAN THI VIET HA

MSc.NGUYEN THI HOA

MSc.NGUYEN VU PHONG

Studying content

 Detect RRSV by ELISA method

 Extraction total RNA by Aurum TM total RNA mini Kit protocol and TRIzol protocol

 Detection RRSV by RT-PCR method

Result

 Dectected RRSV in rice samples and brown planthopper (Nilaparvata

lugens) samples of many locations

 Total RNA of TRIzol protocol is high quality

 RT-PCR method can dectect RRSV with primers RRSV-1

v

MỤC LỤC

Cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xii

PHẦN 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây lúa 3

2.1.1 Phân loại thực vật 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 3

2.1.4 Các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa 4

2.1.5 Tầm quan trọng của cây lúa 4

2.1.6 Sơ lược về các bệnh trên lúa 4

2.2 Sơ lược về bệnh lùn xoắn lá lúa và tác hại của nó 5

2.2.1 Một số hiểu biết cơ bản vể virus thực vật 5

2.2.1.1 Đặc tính chung của virus hại thực vật 5

2.2.1.2 Sự xâm nhiễm và tổng hợp virus mới 6

2.2.1.3 Sự truyền bệnh ở virus thực vật 6

2.2.2 Virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa (Rice ragged stunt virus - RRSV) 7

2.2.2.1 Tên gọi và phân loại 7

2.2.2.2 Cấu trúc thể virus 8

2.2.2.3 Cấu tạo genome của RRSV 9

2.2.3 Môi giới truyền virus gây bệnh lùn xoắn lá 10

vi

2.2.3.1 Mô tả rầy nâu (Nilaparvata lugens) 10

2.2.3.2 Vòng đời rầy nâu 10

2.2.3.3 Đặc điểm gây hại của rầy nâu 11

2.2.4 Đặc điểm của bệnh lùn xoắn lá trên lúa 11

2.2.5 Triệu chứng bệnh 12

2.2.6 Tác hại về kinh tế do virus gây bệnh lùn xoắn lá gây ra 13

2.2.7 Các phương pháp xác định bệnh 14

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 14

2.3.1 Khái niệm 14

2.3.2 Phân loại 15

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR 15

2.4.1 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 15

2.4.2 Giới thiệu về kĩ thuật RT-PCR (PCR ngược) 17

2.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 19

2.5 Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về virus RRSV 20

2.5.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 20

2.5.2 Những nghiên cứu trên thế giới 21

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu và phương pháp 22

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22

3.2.2 Phương pháp chẩn đoán virus RRSV 22

3.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 22

3.2.2.2 Hóa chất 23

3.2.2.3 Qui trình thực hiện 24

3.2.2.3.1 Phương pháp ELISA 24

3.2.2.3.2 Phương pháp RT-PCR 25

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả thu được từ thí nghiệm ELISA 31

4.1.1 Đánh giá tình hình nhiễm virus ở một số địa phương 31

4.1.2 Đánh giá độ nhạy của thí nghiệm ELISA giữa kiểm tra RRSV và RGSV 33

4.1.3 Tỉ lệ nhiễm RRSV với các mẫu lúa có triệu chứng điển hình 35

vii

4.2 Kết quả thu được từ thí nghiệm RT-PCR 37

4.2.1 Kết quả ly trích RNA bằng Aurum TM total RNA mini Kit (Bio-rad) 37

4.2.2 Kết quả ly trích RNA tổng số bằng TRIzol (qui trình IRRI cung cấp) 38

4.2.3 Đánh giá chất lượng RNA thu được 39

4.2.4 So sánh hiệu quả ly trích giữa qui trình ly trích bằng kit Bio-rad và qui trình ly trích bằng TRIzol 40

4.2.5 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi dựa vào trình tự trên Genbank 41

4.2.6 Kết quả RT-PCR 43

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.1.1 Kết quả thu được từ thí nghiệm ELISA 49

5.1.2 Kết quả ly trích RNA tổng số 50

5.1.3 Kết quả RT-PCR 50

5.2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

RRSV: Rice Ragged Stunt Virus

RGSV: Rice Grassy Stunt Virus

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

ctv: Cộng tác viên

DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

dsRNA : double strand RNA

DNA deoxyribonucleic acid

OD: Optical density

mRNA: Messenger RNA

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử .8

Hình 2.2 Hình dạng và kích thước của RRSV 8

Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gene của RRSV .9

Hình 2.4 Một số hình ảnh về rầy nâu 10

Hình 2.5 Vòng đời của rầy nâu 11

Hình 2.6 Triệu chứng của cây lúa nhiễm RRSV 13

Hình 2.7 Nguyên tắc phản ứng PCR 16

Hình2.8 Tiến trình thực hiện RT – PCR một bước 17

Hình 2.9 Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bước 18

Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp cDNA 18

Hình 3.1: sơ đồ bố trí các mẫu thí nghiệm kiểm tra virus RRSV bằng phương pháp ELISA 24

Hình 4.1 Phản ứng màu của thí nghiệm ELISA kiểm tra RRSV 31

Hình 4.2 Bảng ELISA thử nghiệm RRSV và RGSV 33

Hình4.3 Kết quả đo OD của các mẫu kiểm tra RGSV 34

Hình 4.4 Kết quả các mẫu kiểm tra RRSV 35

Hình 4.5 cây lúa có triệu chứng điển hình nhiễm RRSV thu thập ở Tiền Giang 36

Hình 4.6 Mẫu lúa được lây nhiễm RRSV nhân tạo ở đại học Cần Thơ 36

Hình 4.7 Kết quả ly trích RNA từ mẫu lá lúa bằng Aurum TM total RNA mini Kit 37

Hình 4.8 Kết quả ly trích RNA từ mẫu lá lúa bằng TRIzol có chất lượng kém 38

Hình 4.9 Kết quả điện di RNA tổng số với RNA markers 39

Hình 4.10: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi 1 42

Hình4.11: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer 2 42

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RRSV-1 và RRSV-2 43

Hình4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi RRSV-1 và RRSV-2 44

Hình 4.14 kết quả điện di sản phẩm PCR với hóa chất và qui trình chuẩn của Bio-Rad 44

Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RRSV-1 cũ và RRSV-1 được tổng hợp mới theo hóa chất Invitrogen 45

x

Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR theo chu trình nhiệt mới 47 Hình 4.17: Kết quả điện di sản phẩm PCR với các điều kiện đã được tối ưu hóa và theo chu trình nhiệt cũ với 35 chu kì 48

xi

xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng4.1 Kết quả nhiễm virus trên các mẫu lúa của một số địa phương 32

Bảng 4.2 Kết quả nhiễm virus trên các mẫu rầy của một số địa phương 32

Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra các mẫu thu thập ở Tiền Giang và Cần Thơ 37

Bảng 4.4: Kết quả đo OD hai mẫu RNA tổng số lần 1 40

Bảng 4.5: Kết quả đo OD hai mẫu RNA tổng số lần 2 41

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Lúa gạo từ lâu đã là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới Lúa gạo còn là mặt hàng xuất khẩu thu ngoại tệ đáng kể cho nhiều nước trên thế giới như: Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ,… trong đó có Việt Nam Gần đây khi cuộc khủng hoảng lương thực trên thế giới đang đe dọa gây ra nạn đói các nước nghèo, làm ảnh hưởng đến tình hình kinh tế, xã hội, và chính trị của nhiều nước có nền nông nghiệp không thể tự đáp ứng được nhu cầu trong nước và phải nhập khẩu từ nước ngoài Chính phủ Việt Nam đã xác định lúa gạo là mặt hàng nông nghiệp xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Năm 2007, Việt Nam đã xuất khẩu 4,5 triệu tấn trị giá lên đến 1,4 tỉ USD (Heong và Escalada, 2008)

Với tầm quan trọng như vậy, nhà nước Việt Nam đã, đang rất chú trọng đầu tư cho các nghiên cứu cây lúa để đảm bảo năng suất phẩm chất của nó Tuy nhiên, các vụ lúa luôn bị đe dọa bởi sâu và bệnh hại, trong đó đặc biệt là bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá Đây là bệnh do tác nhân là hai virus RRSV (Rice ragged stunt virus) và RGSV (Rice grassy stunt virus) gây ra Bệnh lây lan thông qua môi giới truyền bệnh là rầy nâu

(Nilaparvata lugens) vì thế phát tán rất nhanh chóng trên phạm vi rất lớn Bệnh khó có

thể kiềm chế khi đã phát dịch, làm cho cây lúa bị lùn, không phát triển được, cây lúa trưởng thành không có hoa hoặc hoa trổ bị nghẹn đòng gây thiệt hại rất nặng nề đến năng suất và phẩm chất hạt lúa Trước tính chất nghiêm trọng của bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá, phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả có độ nhạy cao để phát hiện virus gây bệnh phục vụ cho công tác dự báo phòng chống dịch bệnh đang là vấn đề cấp thiết

Từ đó, đề tài “Phát hiện virus rice ragged stunt gây bệnh lùn xoắn lá trên lúa

(Oryza sativa) bằng kĩ thuật ELISA và RT- PCR” được tiến hành

1

Chọn được qui trình ly trích RNA tổng số có hiệu quả và độ tinh sạch cao Xây dựng qui trình phát hiện virus RRSV bằng phương pháp RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây lúa

2.1.1 Phân loại thực vật

Ngành thực vật có hoa: Angiospermae

Lớp một lá mầm: Monocotyledons

Bộ hòa thảo có hoa: Poales (Graminales)

Họ hòa thảo: Poaceae (Gramineae)

Họ phụ hòa thảo ưa nước: Pryzoideae

Chi lúa: Oryza

Loài lúa trồng: Oryza sativa

Loài phụ:

 Subsp: japonica: Loài phụ Nhật Bản

 Subsp: indica: Loài phụ Ấn Độ

 Subsp: javanica: Loài phụ Java

(Nguyễn Văn Hoan, 2003)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu

lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi

này và 2 loài lúa được đã thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima)

Tổ tiên của lúa châu Á O sativa là một loại lúa hoang phổ biến (Oryza

rufipogon) dường như có nguồn gốc tại khu vực xung quanh chân núi Himalaya, với

O sativa thứ indica ở phía Ấn Độ và O sativa thứ Japonica ở phía Trung Quốc Hiện

nay đây là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Lúa là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đôi khi cao hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài 50-100 cm Các hoa nhỏ thụ phấn nhờ gió

3

mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30-50 cm Hạt là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12 mm và dày 2-3 mm

2.1.4 Các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa (Nguyễn Văn Hoan, 2003)

Trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển, cây lúa trải qua 3 thời kì lớn Ở mỗi thời kì, cây lúa biến đổi cả về lượng và chất để hoàn thành chu kì phát triển Người ta phân biệt 3 thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa là: thời kì sinh trưởng sinh dưỡng, thời kì sinh trưởng sinh thực và thời kì hình thành hạt và chín

Thời kì sinh trưởng sinh dưỡng (115-125 ngày): là thời kì cây lúa hình thành nhánh, lá và một phần thân

Thời kì sinh trưởng sinh thực (kéo dài khoảng 35 ngày): là thời kì cây lúa hình thành hoa, tập hợp nhiều hoa thành bông lúa

Thời kì chín (kéo dài khoảng 30 ngày): ở các hoa lúa được thụ tinh xảy ra quá trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi, phát triển thành hạt, sản phẩm chủ yếu của cây lúa

2.1.5 Tầm quan trọng của cây lúa

Lúa là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam…

Nước ta có nền nông nghiệp lâu đời, rất nhiều hộ gia đình thu nhập chủ yếu từ cây lúa Chính vì thế, cây lúa còn có ý nghĩa quan trọng đối với nền kinh tế nước ta Đặc biệt, hiện nay Việt Nam đứng thứ 2 trên thế giới về xuất khẩu gạo, cây lúa là nguồn thu ngoại tệ đáng kể của Việt Nam với hàng tỉ USD mỗi năm Cụ thể, năng suất lúa gạo tăng 60% từ 1990-2000 với tốc độ tăng trưởng là 5%/ năm Vào năm 1995, Việt Nam xuất khẩu khoảng 2 triệu tấn lúa gạo và tăng lên 4,5 triệu tấn năm 1999 (Heong và Escalada, 2008) Xuất khẩu gạo năm 2007 của Việt Nam đạt 4 triệu 500 nghìn tấn, trị giá 1 tỷ 400 triệu USD (http://www.rfa.org/vietnamese/in_depth /2007/12/20/Rice_export_performance_may_affect_consumer_prices_NNguyen/19k)

2.1.6 Sơ lược về các bệnh trên lúa

Có rất nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa đã được xác định gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến trên lúa như sau

Bệnh do virus

4

Các bệnh gây ra do virus thường đi kèm với tác hại gây ra bởi vector truyền

bệnh một số bệnh phổ biến thường gặp: Tungro (Nephotettix sp.), bệnh vàng lụi (Nephotettix sp.), bệnh lúa lùn (Nephotettix sp.), bệnh đốm sọc đen lụi (Laodelphax sp.), bệnh vàng lá (Nephotettix sp.)

Bệnh do vi khuẩn

Bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae), bệnh đốm sọc (Xanthomonas oryzicola), bệnh thối bẹ (Pseudomonas oryzicola), bệnh thối đen hạt (Pseudomonas glumae)

Bệnh do nấm

Phổ biến và gây hại nghiêm trọng điển hình như các bệnh: Bệnh đạo ôn

(Piricμlaria oryzae), bệnh rỉ sắt (Puccinia graminis), bệnh mốc sương (Sclerophthora

macrospora)

Bệnh do tuyến trùng

Tuyến trùng thân (Ditylenchus angustus), bệnh khô đầu lá (Anphelenchoides

oryzea), bệnh nốt sần rễ (Meloidogyne graminicola), tuyến trùng lúa lùn

(Tμlenchorhynchus martini), tuyến trùng rễ (Hirschrmanuiella oryzae)

2.2 Sơ lược về bệnh lùn xoắn lá lúa và tác hại của nó

Bệnh lùn xoắn lá lúa do virus RRSV (rice ragged stunt virus) gây ra và có môi

giới truyền bệnh là rầy nâu (Nilaparvata lugens) Rầy nâu có khả năng di chuyển rất

rộng vì thế lây bệnh nhanh chóng, trên phạm vi rộng và rất khó kiểm soát

2.2.1 Một số hiểu biết cơ bản vể virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

2.2.1.1 Đặc tính chung của virus hại thực vật

Virus thực vật là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Virus có cấu tạo rất đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và nucleic acid Lõi nucleic ở bên trong và được bao bọc bằng một lớp vỏ protein (vỏ capsid) Thường acid nucleic của virus thực vật là RNA và chỉ khoảng hơn 25 loài virus có lõi

là DNA Virus gây bệnh cây thường chỉ có một loại protein

Virus kí sinh ở mức độ tế bào Một virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus khác nhau Trong tế bào

5

chủ, nó sẽ điều khiển tế bào chủ dùng vật chất từ chính tế bào chủ để tạo thành nhiều

virus mới Cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết

2.2.1.2 Sự xâm nhiễm và tổng hợp virus mới

Sự xâm nhiễm

Virus xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do xây xát và nhờ sự tiếp xúc của các giọt dịch virus hoặc do cọ sát tiếp xúc giữa lá cây bệnh, cây khỏe mà virus xâm nhập vào tế bào Virus còn có thể truyền bệnh qua quá trình thụ phấn Trong mô cây đã bị nhiễm bệnh, virus di chuyển trong tế bào chất của tế bào và có thể đi sang tế bào chất thông qua các sợi liên bào hay những vết thương mở ra ở vách tế bào

Sự tái tổ hợp virus

Sau khi xâm nhiễm, ARN của virus trước tiên được giải phóng khỏi lớp vỏ protein Do cảm ứng với các acid nucleic, tế bào hình thành các men (enzyme) gọi là ARN polymerase Các enzyme này với sự biểu hiện của ARN virus (sợi +) như một khuôn mẫu… giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi – và sợi +) sau này

Ở các virus có RNA (sợi -) thì chúng bắt buộc chuyển sang RNA thông tin (sợi+) Khi xâm nhiễm vào cây chủ virus đã đưa sợi RNA (sợi -) và enzyme vào tế bào

Các virus có sợi RNA kép thì quá trình hình thành sợi RNA (sợi +) và RNA (sợi-) được thực hiện nhờ enzyme polymerase khi virus xâm nhập vào tế bào cây chủ

Với các virus chứa DNA thì từ các DNA virus như các khuôn mẫu đã được sự giúp đỡ của các ezyme từ tế bào chủ

Sự tổng hợp mới

Trong sự tổng hợp protein virus, đoạn RNA virus ghi mã cho protein virus giữ vai trò của RNA thông tin, virus sử dụng amino acid, Ribosome và RNA vận chuyển của tế bào cây kí chủ, nhưng lại biến thành RNA thông tin của chính nó và protein được hình thành đã trở thành vỏ bọc

2.2.1.3 Sự truyền bệnh ở virus thực vật

Virus có cơ chế truyền bệnh rất thụ động do virus là vật kí sinh tuyệt đối ở mức

độ tế bào Vì vậy, sự lan truyền của bệnh có những đặc điểm riêng, khác các nhóm vi sinh vật khác

6

Sự truyền bệnh không nhờ môi giới

Truyền bệnh qua nhân giống vô tính thực vật: Chẳng hạn truyền qua nuôi cấy

mô tế bào; qua hom giống chiết từ cây bị bệnh, qua mắt ghép, cành ghép, chồi ghép, gốc ghép bị nhiễm bệnh

Truyền bệnh qua hạt giống và phấn hoa: Virus thường truyền qua hạt giống song cũng có khoảng 100 virus lan truyền được qua hạt giống

Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Thường xảy ra với các bệnh virus có tính chống chịu cao với điều kiện môi trường

Sự truyền bệnh nhờ môi giới

Côn trùng là nhóm môi giới truyền bệnh virus quan trọng nhất Có thể chia các kiểu truyền bệnh qua côn trùng và các động vật thành 3 nhóm virus

Nhóm truyền theo kiểu bền vững: Là những virus có thể sống bền vững trong

cơ thể côn trùng một thời gian dài từ một vài tiếng đến một tuần lễ mới có khả năng lây bệnh cho cây

Nhóm truyền bệnh theo kiểu không bền vững: Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây đến 30 phút chích hút ở cây bệnh sau

đó có thể lây lan ngay

Nhóm truyền bệnh nửa bền vững: Gồm các virus có đặc tính truyền trung gian giữa hai nhóm trên

Ngoài ra, virus còn có thể truyền bệnh thông qua môi giới là nhện, tuyến trùng, nấm, dây tơ hồng (Cuscuto sp.)

2.2.2 Virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa (Rice ragged stunt virus - RRSV)

2.2.2.1 Tên gọi và phân loại ( Hibino, 1996; Hồ Xuân Thiện, 2006)

17 nm ở phần trên (Milne và Ling, 1982; Chen và ctv, 1997)

A

C

B

Hình 2.1 RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(A) Thể virus trong tế bào chất của tế bào nhu mô lúa, thanh ngang dài 1 μm

( http://www.iah.bbsrc.ac.uk ); (C) Các thể virus liên kết lại tạo thành sợi dài

xem trong uranyl acetate, thanh ngang dài 50 nm ( http://www.dpvweb.net )

B A

Hình 2.2 Hình dạng và kích thước của RRSV

(A) Thể virus RRSV đã tinh sạch trong uranyl acetate, thanh ngang có chiều dài là 50 nm ( http://www.dpvweb.net ); (B) Tế bào lớp mỏng của rây nâu nhiễm cho thấy các hạt virus ở tiểu quản, thanh ngang có chiều dài là 100 nm ( http://www.dpvweb.net )

8

2.2.2.3 Cấu tạo genome của RRSV

Phân tử RRSV có đường kính khoảng 57-65 nm và có 8 cấu trúc protein tiểu đơn vị nhỏ nhất khác nhau với trọng lượng phân tử lần lượt là (KDa) 125, 97, 66, 64,

48, 43, 36 và 32 mỗi phân tử RRSV chứa khoảng 10 đoạn sợi đôi RNA (doubles trand RNA -dsRNA) với kích thước từ 1,15-3,9kb (Milne, 1980; Hagiwara, 1986; Hibino, 1996) Một số protein sau khi được tạo ra sẽ tự phân cắt để cho ra một số protein nhỏ hơn mang các chức năng riêng biệt (hình 2.3)

Tất cả 10 đoạn RNA của bộ gene virus đều đã được đọc mã (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) và đã phát hiện được nhiều chức năng của các protein (phụ lục 1)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gene của RRSV (Hồ Xuân Thiện, 2006)

Các thanh đen hình sợi chỉ tượng trưng cho các RNA với chiều dài đã

được xác định Các mũi tên đen tượng trưng cho các sản phẩm protein Chiều mũi

tên là chiều của quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide Một số protein sẽ

tự phân cắt để tạo ra các protein chức năng có kích thước nhỏ hơn

9

2.2.3 Môi giới truyền virus gây bệnh lùn xoắn lá (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006)

2.2.3.1 Mô tả rầy nâu (Nilaparvata lugens)

Rầy trưởng thành cánh dài (hình2.4 (A)) xâm nhập vào ruộng lúa và đẻ trứng trên các bẹ lá hoặc ở các gân lá

Trứng xếp hình nải chuối (hình 2.4 (B)) Rầy non tuổi 1 có màu trắng, các tuổi sau có màu vàng nâu (hình 2.4 (C)) Rầy trưởng thành có hai loại: cánh dài (hình 2.4(A)) và cánh ngắn (hình 2.4 (D))

Rầy trưởng thành cánh ngắn xuất hiện phổ biến trước lúc trổ bông, rầy cánh dài thường xuất hiện vào giai đoạn lúa chín và di chuyển, phát tán

B

A

Hình 2.4 Một số hình ảnh về rầy nâu (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006)

(A) Rầy nâu cánh dài; (B) Trứng của rầy nâu (C) Ấu trùng; (D) Rầy nâu cánh ngắn

2.2.3.2 Vòng đời rầy nâu

Vòng đời của rầy nâu kéo dài 25 - 28 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC Chúng đẻ trứng bên trong bẹ lá, và nở sau 6-7 ngày Rầy cám mới nở lột xác 5 lần (5 tuổi) trong khoảng 12-14 ngày và trở thành rầy trưởng thành Rầy trưởng thành cánh ngắn sống từ 7-14 ngày đẻ trứng sớm hơn , rầy trưởng thành cánh dài sống từ 7-14 ngày

10

Hình 2.5 Vòng đời của rầy nâu (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006) 2.2.3.3 Đặc điểm gây hại của rầy nâu

Tác hại trực tiếp

Rầy cám và rầy trưởng thành cánh dài hoặc cánh ngắn đều chích hút nhựa cây lúa gây ra hiện tượng cháy rầy khi mật số cao

Tác hại gián tiếp

Là môi giới truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá cho cây lúa

2.2.4 Đặc điểm của bệnh lùn xoắn lá trên lúa

Cây nhiễm RRSV ở giai đoạn cây mạ phát triển lá mới có triệu chứng có thể nhận biết được sau hai tuần bị nhiễm và ở các giai đoạn tiếp theo sau đó lá phát triển

có biểu hiện ôn hòa hơn hoặc không nhận thấy được Ở giai đoạn trổ bông, cây biểu hiện triệu chứng một lần nữa ở những lá phía trên và lá đòng (Hibino, 1996)

Thể virus có rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và thường liên kết với nhau tạo thành các sợi dài Virus không được phát hiện ở các mô khác (Hibino, H 1979; Milne, 1980) Các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá (Hibino, 1996) Hiện tượng tương tự cũng

11

được quan sát thấy tại các tế bào tuyến nước bọt của rầy nâu nhiễm virus, nhưng ở rầy không có sự phình to của tế bào (Hibino, 1979)

Bệnh được truyền thông qua môi giới trung gian là rầy nâu Nilaparvata lugens

(N.lugens) Rầy vẫn truyền virus theo kiểu bền vững (Hibino, 1996) Rầy nâu chích

hút nhựa cây lúa bị bệnh lùn xoắn lá rồi mang mầm bệnh virus này trong cơ thể truyền sang cho cây lúa khỏe mạnh khi chúng chích hút nhựa cây lúa đó

Khoảng thời gian lấy virus tối thiểu của rầy nâu N lugens là 3 giờ Thời gian ủ

bệnh của rầy dao động từ 2 – 33 ngày (trung bình là 9 ngày) và thời gian truyền bệnh tối thiểu là 1 giờ

Triệu chứng bắt đầu thể hiện trên cây lúa bệnh lúc 10 – 36 ngày sau khi chủng

Tỉ lệ rầy nâu có khả năng truyền khoảng 6 –76% (trung bình là 40%) (Hibino, 1979)

Bốn biotype của rầy nâu đều có khả năng truyền bệnh như nhau Virus không được truyền qua trứng rầy bị bệnh (Hibino, 1996) Virus không truyền qua hạt của cây lúa bệnh (Ling và ctv, 1978) Virus không truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh

2.2.5 Triệu chứng bệnh

Ba loài lúa O latifolia, O nivara, và O sativa bị nhiễm virus RRSV trong điều

kiện tự nhiên (Ling và ctv, 1978; Hibino, 1979)

Theo Ling và ctv (1978); Hibino (1996); Bùi Bá Bổng và ctv (2006), cây lúa nhiễm bệnh thườngbiểu hiện các triệu chứng sau:

 lùn hơn so với cây lúa bình thường nhưng bộ rễ không hư

 Lá lúa bệnh thường bị xoắn, mép lá bị rách và gân lá bị sưng to giống như những u bướu

 Khi bị nhiễm virus, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình

ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá

 Bệnh lâu ngày, bụi lúa thường có chồi đâm ra từ đốt thân bên trên mặt đất Lá lúa vẫn xanh đậm và không bị vàng

 Cây lúa không chết nhưng không trổ bông hay trổ không thoát (nghẹn đòng) và cho nhiều hạt lép

12

A B C

D

Hình 2.6 Triệu chứng của cây lúa nhiễm RRSV

(A) Cây lúa bệnh lùn hơn so với cây lúa bình thường (IRRI);(B) Cây lúa bệnh lá bị xoắn, không trổ bông hay trổ không thoát (nghẹn đòng) và cho nhiều hạt lép (IRRI); (C) Bộ rễ cây lúa bệnh bình thường (IRRI); (D) Gân lá bị sưng to giống như những u bướu (Bùi Bá Bổng

và ctv, 2006);(E) Lá lúa bệnh bị xoắn, mép lá bị rách (hình chụp 15/09/2006);(F) Cây lúa bệnh có chồi đâm ra từ đốt thân trên mặt đất (http://www.mard.gov.vn)

2.2.6 Tác hại về kinh tế do virus gây bệnh lùn xoắn lá gây ra

Cây lúa bị nhiễm bệnh ở giai đoạn còn non về sau có thể không trổ bông được, năng suất giảm nghiêm trọng hoặc mất trắng Cây lúa già bị nhiễm bệnh thì năng suất cũng bị giảm đáng kể

Thiệt hại trên thế giới

RRSV gây vấn đề nghiêm trọng cho lúa ở Thái Lan, Malaysia, Philippines, Ấn

Độ và Indonesia làm năng suất lúa giảm từ 50-100% (Hibino, 1996)

Vào năm 2005, rầy nâu có mật độ thấp kể từ năm 1980 đã gây nên dịch bệnh tại Việt Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản Trận dịch gây thiệt hại lớn nhất ở Trung Quốc, khoảng 7,5 triệu ha lúa bị nhiễm bệnh và làm giảm khoảng 2,8 triệu tấn lúa gạo (Heong và Escalada, 2008)

13

Ở Thái Lan, dịch bệnh xảy ra vào năm 1979, trên tổng diện tích 42.200 hecta và kết quả là năng suất lúa bị thiệt hại 70%, và trận dịch lớn 1989-1990 xảy ra trên diện tích 171.000 hecta (Suchada Pattayawat và ctv, 2002)

Thiệt hại trong nước

Trận dịch năm 2006, tổng cộng đã có 21 tỉnh, thành phố bị bệnh dịch với diện tích khoảng 500.000 ha, thiệt hại khoảng 2000 tỉ đồng và ảnh hưởng đến 2,5 triệu người.(http://tuoitre.com.vn/Tianyon/Index.aspx?ArticleID=170744&ChannelID=3)

Năm 2006, theo Bộ Nông Nghiệp thì tình hình thiệt hại khoảng 700.000 tấn lúa chính phủ hạn chế xuất khẩu gây biến động tình hình kinh tế trong nước (Heong và Escalada, 2008)

Chính phủ đã sử dụng 105.758,5 tỉ đồng (6,6 triệu USD) từ ngân sách nhà nước

để dập tắt dịch rầy nâu và bệnh virus năm 2006 (Heong và Escalada, 2008)

2.2.7 Các phương pháp xác định bệnh

Hiện nay do vấn đề nghiên cứu gây bệnh lùn xoắn lá trên thế giới còn mang tính cảm quan nên các kĩ thuật nghiên cứu chuẩn đoán và phát hiện vẫn còn nhiều giới hạn về tài liệu tìm hiểu Sau đây xin nêu vắn tắt các phương pháp phát hiện và xác định đáng tin cậy nhất là sử dụng kĩ thuật huyết thanh học hoặc các mồi nucleic acid

Cả kháng thể đơn dòng và đa dòng đã được tạo ra để kháng lại RRSV

Một số kĩ thuật sử dụng xác định virus RRSV

 Kĩ thuật ELISA

 Immunosorbent Electron Microscopy

Hiện nay, sử dụng phương pháp RT-PCR để phát hiện RRSV với mẫu dò nucleic acid hoặc là các mồi chuyên biệt

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

2.3.1 Khái niệm

ELISA là phương pháp men liên kết miễn dịch dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

14

2.3.2 Phân loại

Hai kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (Direct Double Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Các enzyme thường dùng là β-galactosidase, glucosidase, peroxidase và phosphatase kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003)

Phương pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich

Gồm các bước sau

Bước 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA

Bước 2: Cố định dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA

Bước 3: Cố định kháng thể có gắn enzyme

Bước 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA

Kết quả được đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 405 nm

Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4oC và cần xem vào khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl

Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

Kỹ thuật này thường được dùng để định tính và định lượng kháng thể hiện diện trong mẫu cần xác định Gồm các bước:

Bước 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng

Bước 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào

Bước 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào

Bước 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003)

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR

2.4.1 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :

Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (denature)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95oC) trong vòng 30 giây đến

1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

15

Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi

mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để có phân tử DNA mới

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70oC, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp

Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Hình 2.7 Nguyên tắc phản ứng PCR

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m : là số bản sao của chuỗi mã hóa

n : là số chu kỳ

Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA Trong chu

kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hình

16

thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Người ta hy vọng có khoảng 105 lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000 bp

Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn nào đó của DNA

2.4.2 Giới thiệu về kĩ thuật RT-PCR (PCR ngược)

Nguyên tắc chung

Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là sao chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép ngược Giai đoạn này được thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút Giai đoạn 2 là dùng chính DNA vừa sao chép làm khuôn cho phản ứng PCR, quá trình được thực hiện theo

ba bưóc như đã trình bày ở trên

Phân loại RT – PCR

Phản ứng RT – PCR một bước (ONE STEP)

Hình2.8 Tiến trình thực hiện RT – PCR một bước

( www.promega.com/guides/rna_guide/amplifyingrna.pdf )

17

Phản ứng RT – PCR hai bước (TWO STEP)

Hình 2.9 Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bước

(www.promega.com/guides/rna_guide/amplifyingrna.pdf)

Các phương pháp được thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA (hình 2.20)

Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp cDNA (Sambrook và Russell, 2001)

18

Gồm 2 trường hợp:

Trường hợp 1

Đối với các loại virus có đuôi poly (A) thì sự tổng hợp cDNA có thể được thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6 nucleotide

Trường hợp 2:

Ngược lại với các loại virút không có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các loại primer: primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và primer ngẫu nhiên là các đoạn gồm 6 nucleotide

2.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR

DNA khuôn

DNA khuôn chứa trình tự cần khuếch đại có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng

rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng PCR diễn ra tối ưu với các DNA khuôn hoàn toàn tinh sạch

Dung dịch đệm (buffer)

Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase được dùng Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, gelatin và Tris - HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng)

MgCl 2

Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Cụ thể, Mg2+ làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 - 5 mM Nồng độ MgCl2 từ 1,5 – 2 mM thường được xem là tối ưu

Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA Hỗn hợp dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM mỗi nucleotide Điều quan trọng là phải giữ cho nồng độ của cả 4 loại dNTP bằng nhau vì

sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase

19

Primer

Primer là một oligonucleotide thường có chiều dài từ 20 – 30 nucleotide Đây là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR

Taq – polymerase

Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ vi khuẩn suối nước

nóng Thermus aquaticus Taq polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của

phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 - 72oC

Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5-5 unit/100μl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ

không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn

Nhiệt độ bắt cặp

Phản ứng PCR rất nhạy cảm với nhiệt độ, đặc biệt là với nhiệt độ bắt cặp của mồi Vì thế bất cứ sự thay đổi nào của yếu tố này cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt Thông thường, số base của primer càng ít, nhiệt độ này càng thấp và ngược lại

Số chu kỳ của phản ứng PCR

Số chu kỳ cho một phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu

Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là

102 – 103 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005; Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.5 Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về virus RRSV

2.5.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam

Sau trận dịch năm 2006, nước ta đã tập trung vào nghiên cứu RRSV với sự hỗ trợ của thành tựu công nghệ sinh học Cụ thể Phạm Văn Dư và ctv đã tiến hành nghiên cứu bệnh vàng lùn hại lúa ở đồng bằng sông Cửu Long hiện để tìm giống lúa kháng bệnh lùn xoắn lá, nguồn gen kháng và cách phòng trị và ngăn chặn bệnh lây lan hữu hiệu Phương pháp phát hiện virus RRSV bằng phương pháp ELISA và RT-PCR cũng được nghiên cứu Tuy nhiên, đề tài vẫn ở giai đoạn nghiên cứu, chưa có công bố về kết quả đạt được Hà Viết Cường và ctv (2007) tiến hành nghiên cứu sản xuất kháng huyết

20

thanh để phát triển phương pháp ELISA chẩn đoán bệnh nhanh Kháng huyết thanh đã được thử nghiệm nhưng vẫn không đạt kết quả mong muốn Đồng thời, tác giả cũng đã tiến hành phát hiện RRSV bằng phương pháp RT-PCR với cặp mồi khuếch đại đoạn S9 Nhưng kết quả chỉ phát hiện 1 trong 3 mẫu có kết quả ELISA dương tính

2.5.2 Những nghiên cứu trên thế giới

Bệnh lùn xoắn lá được phát hiện ở Indonesia năm 1976 (Hibino, 1996) Cho đến nay, nghiên cứu trên thế giới đã có những bước tiến đáng kể Hagiwara và ctv (1986), Robert G Milne (1980), Shinji Kawano và ctv (1983), Chen và ctv (1997) lần lượt tiến hành quan sát và mô tả cấu trúc của thể virus và bộ gen Hiện nay, cấu trúc và

bộ gen của virus RRSV đã được quan sát và mô tả rất chi tiết

Năm 1995, khi Jin Yan và ctv đã giải trình tự được đoạn S10 của RRSV thì toàn bộ trình tự gen bộ gen của RRSV đã được giải trình tự và công bố trên Genbank

Song song đó một số nghiên cứu của Chaivat Kiitigμl và ctv; Hibino và Kimura, 1982 tạo kháng huyết thanh của RRSV để phục vụ cho việc phát hiện virus bằng phương pháp ELISA

Hiện nay, các nhà khoa học thực hiện những nghiên cứu xa hơn về vai trò và chức năng protein của virus từ đó tiến đến tạo lúa chuyển gen kháng virus và nhiều mục đích khác (Upadhyaya và ctv, 1998; Zhongyi Li và ctv, 1996; Ichiro Uyeda và ctv, 1995)

21