NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bệnh này không thể chẩn đoán dễ dàng bằng phương pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, cây chỉ thị, hay ELISA Hung và ctv, 1999 được trích dẫn bởi Ruangwong và ctv, 2006.. Từ yêu c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 – 2008

Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊNH

Tháng 9/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

LỜI CẢM TẠ

Trước hết, con xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến cha mẹ Con kính chúc cha mẹ sức khỏe và con sẽ luôn phân đấu để không phụ lòng cha mẹ

Tiếp đó, tôi xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 ThS Nguyễn Thị Ngọc Trúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam

 Toàn thể cán bộ Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam đã quan tâm giúp

đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận

 Các bạn Trần Thành Danh, Đinh Bá Phước, Dương Thị Kim Phụng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

 Tập thể lớp DH04SH đã chia sẻ buồn vui cùng tôi trong suốt thời gian học và thực tập

Sinh viên thực hiện Trần Thịnh

 Việc sử dụng ly tâm nóng thay ly tâm lạnh cho tỷ lệ PCR thành công là 100 % với cặp primer OI1/OI2c Có thể ứng dụng kết quả này trong điều kiện phòng thí nghiệm cấp cơ sở

 Hóa chất ly trích DNA giảm từ 750 µl của Cloroform: isopropanol xuống 550

µl, isopropanol giảm từ 650 µl xuống 450 µl và TE 1X 100 µl xuống còn 70 µl vẫn cho tỷ lệ PCR thành công là 100%

 Nồng độ primer OI1 và OI2c khảo sát giảm từ 0,5 µM xuống còn 0,2 µM đều cho lệ PCR thành công là 100% Mức độ rõ nét của band là như nhau ở các nồng độ

 Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát giảm từ 1,25 U xuống còn 0,6 U cho

vẫn cho tỉ lệ PCR thành công là 100% Mức độ rõ nét của band giảm dần từ nồng độ cao nhất 1,25 U đến nồng độ thấp nhất 0,6 U

 Bộ Kit PCR VLG sản xuất thử nghiệm ở tuần thứ 4 vẫn cho hiệu quả PCR là 100% Hai nồng độ Tween 20 là 0,05% và 0,3% đều cho lệ PCR thành công là 100% sau 1 tháng bảo quản ở 40C

SUMMARY

TRAN THINH, Nong Lam University, September 2008 “Improving diagnostic protocol of Greening Disease on Citrus by PCR” Work was carried out at Southern Fruit Research Institute, Vietnam from May 15, 2008 to August 30, 2008

Supervisor:

NGUYEN THI NGOC TRUC MSc Southern Fruit Research Institute, Vietnam Greening disease is the most destructive disease of citrus in many countries in the world It is very serve in Vietnam One of the most powerful tool to diagnostic this disease is PCR However, it is very expensive and complex, not easy for provincal centers to diagnostic The experiment were carried out to improve the protocol with the aim to reduce the cost of testing disease and also to reduce the risk to the environment due to reducing a lot of toxic chemicals The results are included:

 Use centrifuge at room temperature instead of use cool centrifugate were not effect to PCR results with the primers OI1/OI2c So in the small labs, when they have not enough good equipments, they can apply this result in diganostic Greening disease

 In the DNA extraction steps, the chemical were reduced from 750 µl of Cloroform: isopropanol to 550 µl, isopropanol from 650 µl to 450 µl and TE 1X from

100 µl to 70 µl, the PCR results were 100%

 The primer OI1 and OI2c concentration was reduced from 0,5 µM to 0,2 µM the PCR results were 100% The clearness of the band were same at all concentrations

of this primer

 The concentration of Taq DNA polymerase were reduced from 1,25 U to 0,6 U

but PCR results were 100% The clearness of the band were being decreased according

to the reducing of concentration of Taq DNA polymerase

 The PCR Kit to diagnostic Greening disease were gaven good results after one month produced (stored at 40C)

 Concentration of Tween 20 at 0,05% and 0,3% were given good result (PCR is 100%) (stored at 40C)

MỤC LỤC

Trang tựa Trang Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Cây có múi 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Sinh thái 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật 3

2.2 Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi 5

2.2.1 Vi khuẩn Liberibacter 5

2.2.1.1 Phân loại 5

2.2.1.2 Hình thái 6

2.2.1.3 Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR 6

2.2.2 Bệnh vàng lá Greening .8

2.2.2.1 Lịch sử bệnh VLG 8

2.2.2.2 Triệu chứng 9

2.2.2.3 Tác nhân gây bệnh VLG 10

2.2.2.4 Tác nhân truyền bệnh VLG 10

2.2.2.5 Các phương pháp phát hiện bệnh 10

2.2.2.6 Tình hình bệnh VLG trên thế giới và trong nước 11

2.3 Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction) 13

2.3.1 Ly trích DNA 13

2.3.1.1 Nguyên lý 13

2.3.1.2 Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA 14

2.3.2 Phản ứng PCR 15

2.3.2.1 Khái niệm chung 15

2.3.2.2 Nguyên lý 15

2.3.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 16

2.3.2.4 Các giai đoạn phản ứng PCR 18

2.3.2.5 Những sai sót trong phản ứng PCR và một số biện pháp khắc phục 19

2.3.2.6 Nguyên tắc tạo kít PCR 20

2.3.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

2.3.3.1 Tình hình ngoài nước 21

2.3.3.2 Tình hình trong nước 22

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.2.1 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 23

3.2.2 Hoàn thiện quy trình chạy PCR 23

3.2.3 Thử nghiệm sản xuất Kit PCR cho giám định bệnh VLG 23

3.3 Vật liệu và hóa chất 23

3.3.1 Mẫu lá cây có múi 23

3.3.2 Cặp primer sử dụng 23

3.3.3 Hóa chất 24

3.3.3.1 Hóa chất ly trích DNA, điện di và phân tích sản phẩm 24

3.3.3.2 Hóa chất PCR 24

3.3.4 Thiết bị và dụng cụ 24

3.4 Phương pháp tiến hành 25

3.4.1 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 25

3.4.1.1 Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA 27

3.4.1.2 Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) 27

3.4.2 Hoàn thiện quy trình chạy PCR 28

3.4.2.1 Thí nghiệm 3: Giảm nồng độ (giảm lượng) primer OI1 và OI2c 28

3.4.2.2 Thí nghiệm 4: Giảm nồng độ Taq DNA polymerase 29

3.4.3 Thử nghiệm tạo Kit PCR cho giám định bệnh VLG 30

3.4.3.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ chất tẩy (Tween 20) 30

3.4.3.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ Glycerol 31

3.4.3.3 Thí nghiệm 7: Bước đầu tạo Kit PCR VLG cho giám định bệnh VLG 32

3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả hoàn thịên quy trình ly trích DNA 34

4.1.1 Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA 34

4.1.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích 34

4.1.1.2 Kết quả PCR 35

4.1.2 Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) 36

4.1.2.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích 36

4.1.2.2 Kết quả PCR 36

4.2 Kết quả hoàn thiện quy trình chạy PCR .37

4.2.1 Thí nghiệm 3: Giảm nồng độ (giảm lượng) primer OI1 và OI2c 37

4.2.2 Thí nghiệm 4: Giảm nồng độ Taq DNA polymerase 38

4.3 Kết quả thử nghiệm tạo Kit PCR cho giám định bệnh VLG 38

4.3.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ chất tẩy (Tween 20) 38

4.3.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ Glycerol 39

4.3.3 Thí nghiệm 7: Bước đầu tạo Kit PCR VLG cho giám định bệnh VLG 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

Taq: Thermus aquaticus

ctv: Cộng tác viên

MM Master Mix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự primer OI1 và OI2c (Sandrine Jagoueix và ctv, 1995) 24

Bảng 3.2 Thành phần dịch trích CTAB (Lê Thị Thu Hồng và ctv, 2002) 24

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR (Lê Thị Thu Hồng và ctv, 2002) 26

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt PCR với cặp primer OI1/OI2c 26

Bảng 3.5 Các nghiệm thức thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA .27

Bảng 3.6 Các nghiệm thức giảm lượng hóa chất ly trích .28

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ primer khác nhau 29

Bảng 3.8 Các nghiệm thức giảm nồng độ primer OI1 và OI2c 29

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Taq khác nhau 30

Bảng 3.10 Các nghiệm thức giảm nồng độ Taq DNA polymerase 30

Bảng 3.11 Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Tween 20 khác nhau 31

Bảng 3.12 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ Tween 20 31

Bảng 3.13 Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Glycerol khác nhau 32

Bảng 3.14 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ Glycerol 32

Bảng 3.15 Các nghiệm thức về tạo Kit PCR VLG 33

Bảng 3.16 Thành phần PCR trong Kit 33

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản Kit MM I và MM II 40

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA 6

Hình 2.2 Tế bào Liberobacter 6

Hình 2.3 Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E coli và BLO 8

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh Vàng lá Greening 9

Hình 2.5 Diaphorina citri 10

Hình 4.1 Ly trích DNA 34

Hinh 4.2 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích về thay đổi nhiệt độ trong ly tâm 34

Hình 4.3 Kết quả chạy PCR về thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi ly trích DNA 35

Hinh 4.4 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích về giảm lượng hóa chất ly trích DNA 36 Hình 4.5 Kết quả chạy PCR về giảm lượng hóa chất ly trích DNA 36

Hình 4.6 Kết quả chạy PCR về việc giảm nồng độ primer 37

Hình 4.7 Kết quả chạy PCR về việc giảm nồng độ Taq 38

Hình 4.8 Kết quả chạy PCR các nồng độ Tween 20 khác nhau 38

Hình 4.9 Kết quả chạy PCR các nồng độ Glycerol khác nhau 39

Hình 4.10 Thử nghiệm Kit PCR VLG vừa mix 40

Hình 4.11 Thử nghiệm Kit PCR VLG mix 4 tuần 41

Tuy diện tích cây có múi ngày càng tăng nhưng vấn đề bệnh hại đã làm thiệt hại đáng kể cho nhà vườn Trên cây có múi có rất nhiều bệnh khác nhau và nhóm gây thiệt hại mạnh là nhóm có côn trùng truyền bệnh trung gian như bệnh Tristeza do virus

Tristeza, bệnh Vàng lá Greening (VLG) do vi khuẩn mạch dẫn Liberobacter, bệnh Stubbon do Spiroplasma citri, bệnh Witches blood trên chanh do Phytoplasma, bệnh vàng lá Xylella fastidiosa và bệnh lùn mất màu do virus (Lê Thị Thu Hồng, 2000)

Trong đó, bệnh Vàng lá Greening hay Huanglongbing đang lan rộng trên 50 quốc gia, đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi các châu Á và thật sự là một hiểm họa cho nghề trồng cây có múi Việc xác định mầm bệnh thì khó khăn vì mật số vi khuẩn trong cây kí chủ rất thấp Bệnh này không thể chẩn đoán dễ dàng bằng phương pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, cây chỉ thị, hay ELISA (Hung và ctv, 1999 được trích dẫn bởi Ruangwong và ctv, 2006) Do đó, PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp chẩn đoán phân tử rất hữu hiệu để phát hiện vi khuẩn

Liberibacter - tác nhân gây ra bệnh VLG Nhưng việc giám định bệnh bằng phương

pháp PCR khá tốn kém

Từ yêu cầu đó, được sự cho phép của Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam

và Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cải tiến quy trình giám định bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

Cam quýt ưa ánh sáng nhẹ từ 10.000 – 15.000 lux, cao quá sẽ làm giảm quang hợp

và quả dễ bị cháy nắng Cam quýt rất sợ gió bão, vì vậy chú ý làm đai chắn gió

Cam quýt cần canh tác sâu độ 1,5 m, nhưng nó còn tùy thuộc vào phương pháp nhân giống, loại gốc ghép, thủy triều cao thấp,… Độ pH thích hợp từ 5,5 đến 6,5 pH thấp cần bón vôi để vừa nâng cao năng suất vừa nâng cao tuổi thọ của cây Cam quýt cần nhiều K hơn N, vì vậy muốn có quả to, ngon ngọt và đẹp mã không nên quên chất này (Nguyễn Văn Kế, 2000)

2.1.3 Đặc điểm thực vật

Rễ: Khi trồng bằng hột hay cây ghép, cây con được chuyển từ vườn ươm tới vườn

sản xuất bị bứng đi bứng lại nhiều lần nên rễ cọc thường bị đứt và vì vậy chúng sẽ cho 2

hơn 0,5 mm), trên các rễ sợi này mới mang lông hút Trên đất cao theo H Rebour thì có tới 60% số rễ phân bố ở tầng đất 0-50 cm; 30% ở tầng đất 50-100 cm và 10% còn lại nằm dưới 100 cm Khi trồng bằng cành chiết 80% số rễ nằm ở tầng mặt Rễ cam có thể ăn lan rộng gấp đôi hình chiếu của tán Sự sinh trưởng của rễ thường theo sau sự sinh trưởng thân cành, nhưng thường chậm và kéo dài hơn Rễ hút nước và muối khoáng liên tục nhưng mạnh nhất vào thời kỳ ra hoa và kết quả (Nguyễn Văn Kế, 2000)

Thân cành: Cam quýt có dạng thân trụ hay bán bụi Trên thân cành có thể có gai

Táng cây có nhiều dạng tùy theo giống và cách tạo tỉa: hình chổi (cam sanh), hình cầu (cam ngọt), hình mâm xôi (bưởi) Cành cam quýt sinh trưởng theo kiểu hợp trục Mỗi năm có từ 3-4 đợt lộc cành, điều này thể hiện rõ ở những vùng có 4 mùa như Bắc Bộ Đợt cành mùa xuân cho ra cành dinh dưỡng và cành quả, đợt cành mùa hè và mùa thu cho ra cành mẹ của cành quả năm tới và đợt cành mùa đông mọc ra từ những cành quả không hữu hiệu của mùa xuân Ở Nam Bộ, do nóng quanh năm nên các đợt lộc cành chồng chất lên nhau Đợt cành đầu mùa mưa cho cành quả và cành dinh dưỡng và đợt cành giữa và cuối mùa mưa là cành mẹ của cành quả năm tới,…

Lá: Bản chất lá cam quýt là lá kép, điều này còn thấy rõ ở cam 3 lá (Poncitrus

trifoliata) Lá của các giống cam trồng trọt gồm một bản lá với cuống có một eo lá hay

còn gọi là cánh lá Cánh lá rất to ở lá bưởi, lá trúc (Citrus hystrix), nhỏ ở lá cam, rất nhỏ ở lá quýt, tắc và không có ở chanh tây, thanh yên (Citrus medica),… Lá có hình

dạng thay đổi theo mùa, thường có dạng elip, dày, có tuyến tinh dầu, mặt dưới có khoảng 500 khẩu bào/mm2 Số lượng lá trên cây rất quan trọng: để tạo ra một quả bưởi cây cần tối thiểu 60 lá, một quả cam cần 50 lá, một quả chanh cần 20-30 lá,… nên cần có biện pháp duy trì số lá xanh nhiều và tốt

Hoa: Hoa đơn hoặc chùm mọc ở nách lá, thơm, thường có màu trắng, nhiều nhị

đực kết thành bó ở phía gốc Ở phía Bắc bán cầu sự phân hóa mầm hoa xảy ra từ sau thu hoạch cho tới khoảng tháng 2-3 dương lịch

Trái: Có hình cầu (cam), hình cầu dẹp (quýt mandarin), hình quả lê (bưởi),…Vỏ trái có một lớp chứa tinh dầu (lớp flavedo) và một lớp màu trắng xốp (lớp albedo) Phần ruột chia làm nhiều múi, trong mỗi múi có các lông của nội quả bì mọng nước biến thành con tép, hình dạng, màu sắc con tép thay đổi theo loài Dịch quả trong con tép chứa nhiều chất bổ dưỡng, hương vị thơm đặc trưng tùy loài và các enzyme

Hạt: Phần lớn các loại cam quýt là hạt đa phôi Gồm một phần phôi hữu tính và

gồm nhiều phôi vô tính phát triển từ phôi tâm Màu của tử diệp trắng ở bưởi, cam; xanh ở quýt; xanh nhạt ở các loài lai (cam sành, sảnh) (Nguyễn Văn Kế, 2000)

2.2 Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi

Bệnh Vàng lá Greening do vi khuẩn Liberibacter

Bệnh lây lan nhanh do rầy chổng cánh Bị nặng trên cam sành, cam mật, quýt; chanh và bưởi bị nhẹ hơn Nhà vườn thường gọi là bệnh “vàng lá gân xanh”, Trung Quốc gọi là bệnh “Hoàng Long”, một số nơi gọi là bệnh CVPD (Citrus Vein Phloem Discoloration)

Lá bị khảm, gân xanh cứng và uốn cong ra ngoài như hiện tượng lá “tai thỏ” của dấu hiệu thiếu Zn; nhánh bị khô, quả nhỏ, méo, dễ rụng,…

Cần áp dụng các biện pháp tổng hợp để phòng trừ như: trồng giống sạch bệnh; bón phân tập trung hơn để cây ra đọt đều phòng trừ rầy chổng cánh dễ hơn như phun thuốc hay phát triển các thiên địch như kiến vàng,… hủy diệt nguồn bệnh, lưu ý cây hoang dại cả những cây kiểng trong họ cam quýt; nghiên cứu gốc ghép kháng bệnh như gốc Citrange Troyer,… (Võ Thị Thu Oanh, 2004)

VLG là bệnh nguy hiểm vì không có gốc kháng, chỉ có bưởi và vài loại quýt tương đối chống chịu, cam mật, quýt và tangelo là những giống nhiễm nặng Bệnh không

truyền được qua hạt mà do RCC Diaphorina citri ở châu Á và rầy châu Phi T

erytreae Aubert và Quilici (1984) đã sử dụng hiệu quả ong ngoại ký sinh phòng trị

RCC tại đảo Reunion và nhờ vậy công cuộc phòng trị bệnh VLG đã thành công tại đây (Lê Thị Thu Hồng, 2000)

2.2.1 Vi khuẩn Liberibacter

2.2.1.1 Phân loại

Ở hình 2.1, Liberibacter thuộc α-subdivision của lớp Proteobacteria Murray & Schleifer, (1994) đã đề nghị dùng thuật ngữ “Candidatus” để chỉ những vi khuẩn

không nuôi cấy được Một trong những vi khuẩn không nuôi cấy được này là vi khuẩn

gây bệnh VLG Cho đến nay, vi khuẩn này gồm có 3 loài: Candidatus Liberibacter asiaticus (châu Á), Candidatus Liberibacter africanus (châu Phi), Candidatus

Liberibacter americanus (châu Mỹ) Liber có nghĩa là vỏ cây (bark) và bacter để chỉ vi

khuẩn (bacterium) (Bové, 2006)

Hình 2.1 Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA

(Nguồn: Teixeira và ctv, 2006)

2.2.1.2 Hình thái

Bové và cộng sự (1980) đã xác định

được hai loài Liberobacter gây bệnh VLG đó

là Liberobacter asiaticum (dòng châu Á) và

Liberobacter africanum (dòng châu Phi), vỏ

có bề dày khoảng 25 nm với 3 lớp của một vi

khuẩn Gram âm thực sự Vi khuẩn có hai

dạng: dạng dài có chiều dài đo được 1-4 µm,

đường kính 0,15-0,3 µm và dạng tròn có

đường kính 0,1 µm (Trích dẫn bởi Lê Thị

Thu Hồng, 2000) Hình 2.2 Tế bào Liberobacter

(Nguồn: Bové, 2006)

2.2.1.3 Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR

Vùng 16S rDNA

Người ta dựa vào trình tự gene 16S rDNA (gene RNA ribosome 16S) của vi khuẩn

Liberibacter để tìm ra vị trí phát sinh loài của chúng, 16S rDNA của dòng (strain)

Nelpruit Nam Phi và dòng Poona châu Á đã thu được từ DNA tổng số của những cây dừa cạn bị nhiễm HLB, thông qua việc nhân bản PCR, sử dụng universal PCR-primer f-D1/r-P1cho việc khuếch đại 16S rDNA của prokaryote (Weisburg và ctv, 1991, trích dẫn bởi Bové, 2006) Trong những thí nghiệm này, thao tác phải được thực hiện để ngăn chặn sự can thiệp của những 16S rDNA lục lạp và ti thể của dừa cạn Điều này

có thể thu được bằng việc cắt 16S rDNA của ti thể với enzyme giới hạn BclI trước khi

khuếch đại PCR Đoạn DNA nhân bản có kích thước khoảng 1500 bp, chứa 16S rDNA của lục lạp cũng như vi khuẩn Sự có mặt DNA của vi khuẩn có thể biết chắc bằng

EcoRI, enzyme giới hạn này cắt đoạn nhân bản tạo thành 2 đoạn (khoảng 650 bp và

850 bp), trong khi DNA lục lạp thì không bị cắt Những 16S rDNA này được clone từ sản phẩm khuếch đại khoảng 1500bp, và được sequence Những thí nghiệm lai DNA

và PCR đã được thực hiện với những oligonucleotide chuyên biệt cho những trình tự khuếch đại đã chỉ ra rằng những đoạn DNA thu được là 16S rDNA của vi khuẩn HLB,

và không có DNA của sinh vật ngoại nhiễm (Jagoueix và ctv, 1994 trích dẫn bởi Jagoueix và ctv, 1995 )

Dựa trên vùng trình tự 16S rDNA, người ta có thể thiết kế primer cho việc phát

hiện vi khuẩn Liberibacter Đó là các primer OI1, OI2c, OA1, cặp primer OI1/OI2c phát hiện các Liberibacter không phân biệt được dòng châu Á hay châu Phi; còn cặp OI2c/OA1 chỉ phát hiện riêng dòng châu Phi (L africanum)

Nhóm gene rplKAJL-rpoBC (β-operon)

Nhóm gene rplKAJL-rpoBC được biết như là β-operon ở vi khuẩn, mã hóa cho

protein ribosome Các protein ribosome vi khuẩn như L11, L1, L10, L12 và tiểu đơn vị

β của RNA polymerase, được mã hóa bởi các gene tương ứng như rplK, A, J, L và

rpoB Trong BLO (Bacterial Like Organism), những gene mã hóa cho protein trên

được sắp xếp giống trong E coli và những loài vi khuẩn khác Những vùng gene này

giữ vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình phiên mã và dịch mã Trong E coli (và những vi khuẩn thật khác) sự điều hòa quá trình phiên mã của rplKAJL-rpoBC thì

phức tạp (Villechanoux và ctv, 1993)

Vùng giữa gene rplA và rplJ ở dòng châu Á dài hơn dòng châu Phi là 34 bp Đây

là cơ sở để thiết kế primer xuôi f-rplA2 (dựa gene rplA) và primer ngược r-rplJ5 (dựa vào gene rplJ) để phân biệt hai dòng châu Á (kích thước khuyếch đại là 703 bp) và

dòng châu Phi (kích thước khuyếch đại là 669 bp) (Hocquellet và ctv, 1999; được trích dẫn bởi Bové, 2006)

Hình 2.3 Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E coli và BLO

(Nguồn: Villechanoux và ctv, 1993)

Trong hình 2.3, P: promoter; T: terminator; A: attenuator Những con số thể

hiện kích thước (bp) giữa các gene, vùng giữa các gene không thể hiện ở đây

2.2.2 Bệnh vàng lá Greening

2.2.2.1 Lịch sử bệnh VLG

Bệnh VLG có nhiều tên gọi khác nhau theo từng địa phương, ở Trung Quốc có tên

là Hoàng Long (HLB - Huanglongbin), ở Philipine gọi là Lá vàng lốm đốm (Mottle leaf), ở Indonesia gọi là sự thoái hóa mô libe ở phiến lá (CVPD – Citrus Vein Phloem Degeneration), Bệnh này được Reinking mô tả lần đầu tiên vào năm 1919 ở Trung Quốc (dạng Châu Á), triệu chứng xác định nhờ các đặc tính thể hiện ở điều kiện nhiệt

độ mát và ấm; dạng ở châu Phi được mô tả ở Nam Phi vào năm 1937 với triệu chứng thể hiện ở điều kiện nhiệt độ từ 20 – 240C Năm 1956, Lin đã chứng minh bệnh VLG

có thể truyền qua mắt ghép, đây là một phát hiện có ý nghĩa cho việc kiểm soát dịch bệnh sau này Năm 1965, A P D McClean và Oberholzer đã chứng minh bệnh có thể

truyền qua mắt ghép cũng như qua rầy chổng cánh Triozea erytreae ở Nam Phi Năm

1967, tại Ấn Độ, Capoor và cộng sự đã thành công trong việc truyền bệnh này bằng

rầy chổng cánh Diaphorina citri Từ 1977 – 1984, Garnier và Bove đã chứng minh

được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Gram âm bằng kính hiển vi điện tử Năm 1995, tổ chức IOCV (International Organization of Citrus Virologists) đặt tên chính thức của bệnh là Huanglongbin (HLB), và đã được chấp nhận Ngày nay, tên HLB được dùng rộng rãi cho các dạng bệnh châu Á, châu Phi và châu Mỹ (Bové, 2006)

2.2.2.2 Triệu chứng

Theo Hà Minh Trung quan sát triệu chứng bệnh trên các giống cam quýt khác nhau

ở các độ tuổi khác nhau có độ biểu hiện triệu chứng khác nhau Về cơ bản có mấy nét chính sau:

 Lúc đầu, bệnh xuất hiện cục bộ trên một vài nhánh bệnh thể hiện qua sự biến màu vàng của lá

 Biến màu vàng hầu hết

phiến lá, chỉ gân lá và vùng phụ

cận vẫn còn xanh (giống thiếu

Mn)

Hình

 Hầu hết phiến và gân đều

vàng chỉ còn vài điểm xanh như

cong vẹo, gân lá bị sưng (giống thiếu Bo)

 Trên hoa và quả: quả trái vụ, quả nhỏ, lệch tâm, hạt lép (Trích dẫn bởi Nguyễn

Minh Quang, 2002)

Những triệu chứng bệnh trên có thể giải thích Bệnh VLG không ảnh hưởng đến mạch gỗ nhưng ảnh hưởng đến mô libe, sự vận chuyển đường đến các phần trên của của cây bị cản trở Lá bị vàng héo, mau chết, quả mất chất lượng, sự phân chia tế bào luôn xảy ra khiến gân lá sưng lên Người ta nghi ngờ rằng vi khuẩn có thể tiết ra chất độc và chính chất độc này hơn là mật số đã gây ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý của cây Do sự hiện diện và mật số vi khuẩn đã làm xáo trộn dinh dưỡng, tắc nghẽn vận chuyển dinh dưỡng khiến lá cây bị thiếu Zn, thiếu Mn, thiếu Bo, thiếu Mg, … (thể hiện qua triệu chứng thiếu các vi lượng này) (Lê Thị Thu Hồng, 2000)

2.2.2.3 Tác nhân gây bệnh VLG

Bệnh VLG gây ra bởi vi khuẩn Liberibacter Cho đến nay, dựa vào trình tự 16S người ta đã xác định được 3 dòng châu Á (L asiaticus), châu Phi (L

africanus) và châu Mỹ (L americanus) Hai dòng châu Á và châu Phi được phát

hiện từ rất sớm và mãi đến năm 1995, Jagoueix và ctv mới đưa ra phương pháp phát hiện chính xác hai loài này bằng PCR; trong khi dòng châu Mỹ được phát hiện bởi Teixeira và ctv vào năm 2005

2.2.2.4 Tác nhân truyền bệnh VLG

Tác nhân truyền bệnh là do hai loài rầy chổng cánh Loài thứ nhất là Diaphorina

citri Kuwayama chịu được nhiệt độ trên 300C, truyền vi khuẩn Ca.L.asiaticus (dòng

châu Á) Loài này phân bố ở châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia,

Malaysia, Bruney, Ấn Độ,… Loài thứ hai là Triozea erytreae Del Guercio phát triển tốt

ở nhiệt độ 22-250C, truyền vi khuẩn Ca L africanus

(dòng châu Phi) Loài này ở châu Phi như Nam Phi,

Sudan, Madagasca

Người ta cũng ghi nhận vài vùng có cả hai loại

rầy và cả hai loại vi khuẩn như ở Reunion,

Mauritius, Tây Nam Ả Rập Mỗi loại rầy đều có

khả năng truyền cả hai loại vi khuẩn (Aubert và

CSV, 1988, trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000)

Hình 2.5 Diaphorina citri

(Nguồn: VNCCAQMN,

2.2.2.5 Các phương pháp phát hiện bệnh

PCR

Để phát hiện Liberibacter asiaticus và L africanus ta dùng cặp primer

OI2c/OA1 khuếch đại trình tự 16S rDNA, và cặp primer A2/J5 nhân bản nhóm

gene protein ribosome (rpl) Trong trường hợp có mặt cả Liberibacter dòng châu Á

và dòng châu Phi thì nên sử dụng tổ hợp primer f-(OA1+OI1)/r-OI2c (Jagoueix và

ctv, 1995) Còn đối với Liberibacter americanus (dòng châu Mỹ) được phát hiện

nhờ cặp primer f-GB1/r-GB3 (Teixeira và ctv, 2005) Để phát hiện đồng thời 3

Liberibacter (L asiaticus, L africanus, L americanus) ta sử dụng kỹ thuật

multiplex PCR với hai cặp primer f-A2/r-J5 và f-GB1/ r-GB3 (Bové, 2006)

Lai phân tử (Dot blot hay Southern Blot)

Hai probe In-2.6 (2.6 kbp), AS-1.7 (1.7kbp) được xây dựng dựa trên vùng

gene rplKAJL-rpoBC của vi khuẩn gây bệnh VLG In-2.6 có nguồn gốc từ dòng

vi khuẩn Poona (Ấn Độ) châu Á, lai rất nghiêm ngặt với các dòng châu Á do đó

probe In-2.6 dùng để phát hiện các Liberibacter dòng châu Á rất hiệu quả, trong

khi đó probe AS-1.7 bắt nguồn từ dòng Nelspruit châu Phi, dùng nó có thể phát hiện được các dòng châu Phi (Bové, 2006)

Do vi khuẩn Liberibacter không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên hai

phương pháp dựa trên cơ sở acid nucleic nói trên là rất có ý nghĩa cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh VLG vì nó giúp phát hiện bệnh nhanh, nhạy, đặc hiệu và độ tin cậy cao Ngoài ra, người ta cũng sử dụng một số phương pháp khác như dùng cây chỉ thị, phương pháp ELISA, kính hiển vi điện tử, thử nghiêm Iode Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn còn một số hạn chế như: độ tin cậy không cao, khó khăn trong việc sản xuất kháng thể đơn dòng cũng như thời gian chẩn đoán dài

2.2.2.6 Tình hình bệnh VLG trên thế giới và trong nước

 Tình hình bệnh VLG trên thế giới

Châu Á, Đông Nam Á D ctri là vector, Ca L asiaticus là tác nhân gây bệnh

HLB, và cả hai đều chịu nhiệt Những vùng hoặc quốc gia châu Á nơi mà Ca L

asiaticus đã được phát hiện bằng phương pháp EM, lai DNA, và/hoặc PCR gồm: tiểu lục địa Ấn Độ (Ấn Độ, Pakistan, Nepal, Bhutan, Bangladesh, Sri Lanka), Đông Nam Á (Myanmar, Thailand, Malaysia, Campuchia, Lào, Việt Nam), Đông Nam Trung Quốc, Đài Loan, Miền Nam Nhật Bản (đảo Ryukyu, Okinawa) (Miyakawa và Tsuno, 1989), Philipine, Indonesia (Java, Sumatra, miền Đông Kalimantan, miền Nam Sulawasi, Bali), Đông Timor (Trích dẫn bởi Bové, 2006)

Châu Phi và bán đảo Madagascar T erytreae là vector, Ca L africanus là tác

nhân gây bệnh HLB, cả hai đều nhạy với nhiệt độ những vùng và quốc gia ở miền

Nam và miền Đông châu Phi nơi mà Ca L africanus được phát hiện bằng kỹ thuật

EM, lai DNA và/hoặc PCR gồm: Nam Phi, Zimbabwe, Malawi, Bunruni, Kenya, Somalia, Ethiopia Ở miền Tây châu Phi, bệnh này chỉ có ở Cameroon (Bové, 2006)

Bán đảo A-rập Ở A-rập Saudi, HLB hiện diện ở vùng Biển Đỏ từ Mecca đến

Najan, gần biên giới Yemeni Vector truyền bệnh là D citri HLB xảy ra những ốc đảo

chỉ tìm thấy những vùng đất cao lạnh lẽo Vì thế, HLB ở Yemen là dạng chịu nhiệt (Bové và Garnier, 1984, trích dẫn bởi Bové, 2006)

Phía nam biên giới giữa Saudi/Yemen, ở vùng Abha-Khamis Mushayt, có cả hai vector được tìm thấy , và hai dạng HLB có thể hiện diện Trường hợp này có thể giải

thích như sau: ở Yemen, HLB dạng châu Phi và T erytreae đã được tìm thấy chắc

chắn từ Ethiopia gần đó, qua phía Nam Biển Đỏ, thông qua eo biển hẹp, và di chuyển

xuống phía Nam Ở rập Saudi, HLB dạng châu Á và D citri đã đi vào bán đảo

A-rập, có thể di chuyển đến Mecca, và đã di chuyển về phía Nam Cuối cùng, cả hai vector cũng như hai dạng HLB châu Á và châu Phi, đã được tìm thấy ở vùng Abha-

Khamis Mushayt Sự di chuyển xa hơn của T erytreae lên phía Nam bị cản trở bởi khí hậu nóng nhưng sự di chuyển của D citri về hướng Nam Yemen không bị suy yếu bởi

khí hậu

Những đảo ở Ân Độ Dương: Reunion và Mauritius Hai vector và hai dạng

HLB xảy ra ở Reunion và Mauritius (Garnier và cộng sự, 1996) Sự phân bố hai vector

rầy chổng cánh này gắn liền với nhiệt độ/độ cao so mặt nước biển D citri hiện diện ở vùng bờ biển trên mực nước biển khoảng 500 m, trong khi đó T erytreae phổ biến dưới độ cao này D citri cũng đã được phát hiện ở đảo Rodrigues, phía Tây của Mauritius Cả hai Ca L asiaticus và Ca L africanus đều hiện diện Vài cây đã chứng

minh là nhiễm đồng thời hai loại liberibacter, một trường hợp được quan sát ở bang

São Paulo với Ca L americanus và Ca L asiaticus (trích dẫn bởi Bové, 2006)

Nam Mỹ Florida, USA, đã là vùng thứ hai ở châu Mỹ báo cáo về HLB, vào năm

2005 D citri đã được ghi nhận trước đó 7 năm Liberibacter là Ca L asiaticus (Trích

dẫn bởi Bové, 2006)

 Tình hình bệnh VLG trên trong nước

Hiện tượng Vàng lá suy tàn cây có múi ở nước ta do nhiều nguyên nhân song quan trọng nhất là do nhóm bệnh virus và tương tự virus gây ra mà Vũ Khắc Nhượng, 1997 thì đầu những năm 60 điều tra của đoàn Viện sĩ L A Canchaveli và Cục Sản Xuất Nông Nghiệp thì tỉ lệ cây bị vàng lá còn thấp (1-5%), mật độ rầy chổng cánh chưa cao, đến cuối những năm 60 đầu những năm 70 do việc nhân giống không thận trọng, tốc

độ lây lan lên đến 50-60 % mặc dù mãi đến sau năm 1975 thì nguyên nhân dịch bệnh mới được xác định rõ Ở miền Nam, việc nhân giống không quản lý an toàn dịch bệnh cũng biểu hiện khắp nơi, nhất là tại huyện Chợ Lách tỉnh Bến Tre, nơi sản xuất cây

giống quan trọng cho cả vùng với số lượng năm 1992 xấp xỉ hơn 1 triệu cây giống cây

có múi các loại (thông tin Khoa Học Công nghệ, 1993) (trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000)

Kết quả điều tra phân bố và mức độ lây hại của bệnh VLG ở miền Bắc Việt Nam năm 1990-1991 cho thấy bệnh lan tràn và nhiễm trên hầu hết các vùng trồng cam quýt chính, gây hại cây bệnh ở mọi lứa tuổi, làm giảm tuổi thọ, năng suất và chất lượng quả (Đỗ Thành Lâm và Hà Minh Trung, 1993) Biểu hiện đặc trưng và diễn biến triệu chứng bệnh trên cây có múi ở phía Nam cũng được tác giả ghi nhận và mô tả (Hà Minh Trung và ctv, 1995) Sự biểu hiện của bệnh VLG trên cây có múi ở ĐBSCL được khẳng định qua phương pháp giám định DNA tại Đại học Đoài Lan và việc giám định nhiều mẫu cây có múi thu thấp khắp các tỉnh trong cả nước bằng lai phân tử tại

INRa, Pháp (Bové và ctv, 1995) (Trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000)

2.3 Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction)

2.3.1 Ly trích DNA

2.3.1.1 Nguyên lý

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh các tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này

Phương pháp tách chiết DNA gồm 3 bước:

Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông thường người

ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein Mẫu được lắc thật mạnh trong các dung dịch phenol và chloroform, dung dịch phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan các acid nucleic Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol: chloroform Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại

Bước 3: Tủa acid nucleic Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông

Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung dịch ethanol/1 dung dịch mẫu), nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tủa Hầu như toàn bộ acid nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên

Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol/thể tích dung dịch mẫu là 1/1 Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa isopropanol

Trong cả 2 phương pháp trên, acid nucleic thu nhận lại bằng li tâm Sau đó, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của ethanol còn dính lại trên mẫu (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2002)

2.3.1.2 Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA

Để xác định mức độ tinh sạch và hàm lượng hỗn hợp acid nucleic thu được sau khi tách chiết, người ta dùng phương pháp đo quang phổ và phương pháp điện di

 Phương pháp đo quang phổ

Phương pháp đo quang phổ dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau của các base nitrogen của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (Optical Density – OD260 nm) cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch Một đơn vị OD có bước sóng 260 nm ký hiệu là A260 nm

CDNA= A260 nm x 50 x độ pha loãng

Ví dụ, khi tách chiết DNA mạch kép khi pha loãng gấp 2 lần có giá trị A260nm = 0,6 thì dung dịch có nồng độ là:

CDNA= 0,6 x 50 x 2 = 60 µg/ml

Khi tách chiết DNA có thể còn lẫn tạp với protein Để đánh giá độ tinh sạch DNA người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280 nm là phổ hấp thụ cực đại của protein Nếu tỉ lệ A260 nm/ A260 nm = 1,8 – 2 thì có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch

Nếu tỉ lệ A / A ≥ 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch

 Phương pháp điện di

Để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn của phân tử DNA sau khi tách chiết, người ta dùng phương pháp điện di DNA DNA là đại phân tử mang điện tích âm nên trong điện trường chúng sẽ chạy về cực dương Nếu phổ điện di của dung dịch DNA tách chiết sau khi hiện hình cho một dãi băng rộng hoặc có nhiều vạch thì chứng tỏ DNA bị gãy đoạn nhiều, hoặc lẫn DNA với RNA Phổ điện di là băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị gãy, không bị tạp

Để điện di người ta dùng gel agarose hoặc gel polyacrylamide Để phát hiện băng DNA trên gel điện di có thể dùng Ethidium bromide Thuốc thử này tạo liên kết nhuộm với các base nitrogen Khi chiếu tia tử ngoại (UV) vào bản gel thì các liên kết nhuộm sẽ phát quang màu da cam ở bước sóng 300 nm Cũng có thể nhận biết các band điện di bằng phương pháp nhuộm bạc Bản gel sau khi điện di được cố định bằng acid acetic 10%, sau đó rửa acid acetic Bước tiếp theo là nhuộm bằng dung dịch AgNO3 và phát hiện DNA bằng formaldehyt ở pH kiềm, hoặc bằng dung dịch Na2CO3

(Trịnh Đình Đạt, 2006)

2.3.2 Phản ứng PCR

2.3.2.1 Khái niệm chung

Kỹ thuật PCR (Polymease Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác cao được thực hiện trong máy luân nhiệt

Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp thu hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi

khuẩn Thermophilus aquaticus và một số vi khuẩn khác Máy PCR ngày càng hoàn

thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ từng giai đoạn nhân bản DNA Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền quan trọng của công nghệ di truyền (Trịnh Đình Đạt, 2006)

2.3.2.2 Nguyên lý

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzyme DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (940C) để tháo xoắn thay cho helicase kết hợp enzyme

đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Nhờ kỹ thuật PCR mà với lượng nhỏ DNA ban đầu ta có thể thu đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm DNA (Trịnh Đình Đạt, 2006)

2.3.2.3 Các thành phần phản ứng PCR

 DNA khuôn (DNA template):

Phản ứng khuếch đại tối ưu trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một

ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả mẫu DNA bảo quản không tốt, đã bị phân hủy một phần như các vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết, (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2002) Lượng DNA mẫu sử dụng có thể rất thấp từ 1 đến hàng chục ng (Trịnh Đình Đạt, 2006)

 Mồi (primer):

Lựa chọn cặp mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR Đoạn mồi là các đoạn oligonucleotide có độ dài 6 – 30 nu, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự hai đầu mạch khuôn Trình tự mồi xuôi và mồi ngược bảo đảm không tự bắt cặp bổ sung cho nhau, không có cấu trúc kẹp tóc, giàu GC (chiếm trên 60%) Mồi phải đảm bảo đủ dài

để bắt cặp chính xác Nhiệt độ gắn mồi (Ta) không khác nhau quá lớn, nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:

o Đối với mồi không quá 20 nu thì nhiệt độ gắn mồi tính như sau:

Ta = [2(A+T) + 4(G+C)]0C

o Đối với mồi lớn hơn 20 nu thì nhiệt độ gắn mồi tính như sau:

Ta = 22 + 1,46[2(G+C) + (A+T)]0C

Nhiệt độ gắn mồi nằm trong khoảng từ 50-800C

Nồng độ mồi thường khoảng 0,1 – 0,5 µM là thích hợp Nồng độ primer cao hơn có thể làm cho primer bắt cặp sai tạo ra những sản phẩm không chuyên tính

và có thể tăng khả năng tạo ra cấu trúc primer-dimer Những sản phẩm không chuyên tính và cấu trúc primer-dimer là cơ chất cho PCR và cạnh tranh với sản phẩm mong muốn về enzyme, dNTP và primer, kết quả là số lượng sản phẩm mong muốn thấp hơn (Acadamic Press, 1990)

 DNA polymerase:

Là enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp mạch DNA mới Ngày nay, người ta

thường dùng nhiều loại DNA polymerase: Taq DNA polymerase, P fu DNA

polymerase, T4 DNA polymerase, T th DNA polymerase… nhưng phổ biến là Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng

Thermophilus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92-940C)

Taq DNA polymerase có hoạt tính ở dãi nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra

 Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP):

Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo mạch DNA mới Nồng độ dNTP trong khoảng 20-200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính Nồng độ tối ưu của dNTP thường 100-200µM Tuy nhiên, ở nồng độ

dNTP thấp (10-100 µM) thì Taq DNA polymerase hoạt động chính xác hơn

 Dung dịch đệm (buffer):

Thành phần dung dịch đệm phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR Ví dụ thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR khi sử dụng Taq DNA polymerase gồm: Tris HCl 100 µM với pH=8 ở 250C; KCl 500 µM; Gelatin 0,01% (Trịnh Đình Đạt, 2006)

 MgCl2:

Nồng độ MgCl2 có thể trong khoảng 0,5- 5 mM Nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến:

o Quá trình bắt cặp của primer

o Nhiệt độ tách mạch tạo thành dây đơn

o Sự chuyên tính của sản phẩm PCR

o Hoạt động của enyme và trung thực của kết quả

Taq cần có MgCl2 tại vị trí đỉnh, nơi xảy ra sự gắn kết với primer, dNTP và DNA template Sự có mặt của EDTA và những chất bám khác (chelator) trong dung dịch mẹ của primer hay DNA template có thể gây xáo trộn nồng độ tối hảo của MgCl2

Nồng độ MgCl2 cao sẽ làm phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, ngăn chặn sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm kết quả PCR ít đi Dư thừa lượng MgCl2 dẫn đến sự bắt cặp nhầm sẽ ổn định cho ra sản phẩm không mong muốn Ngược lại nếu nồng độ primer thấp, sẽ làm xấu đi quá trình kéo dài, trong đó Mg2+đóng vai trò là co-factor của Taq DNA polymerase Một vài ion Mg2+ bị kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng, do đó cần tối ưu nồng độ Mg2+ để đảm bảo số lượng cũng như chuyên tính của sản phẩm PCR

 Các chất tăng cường sử dụng trong phản ứng PCR:

Những chất tăng cường được dùng để gia tăng hiệu quả và tính chuyên biệt và để vượt qua những khó khăn gặp phải với hàm lượng GC cao và DNA mẫu dài Những chất tẩy không phải ion (nonionic) (Triton X-100, Tween 20, hay Nonidet P-40) trung hòa những chất mang của chất tẩy ion thường được dùng trong chuẩn bị DNA mẫu và nên được sử dụng trong hỗn hợp phản ứng cơ bản hơn là những chất tăng cường không bắt buộc Hiệu quả cao hơn sẽ đạt được bằng việc ổn định (Stabilizing) hay tăng cường (enhancing) hoạt tính polymerase như những protein ổn định enzyme (BSA hay gelatin), chất tan ổn định enzyme như betaine hay betaine-HCl, dung môi ổn định enzyme (Glycerol), dung môi tăng cường khả năng hòa tan (DMSO hay Acetamide),

và tính thích hợp của các muối đối với polymerase, (NH4)2SO4 được đề nghị dùng cho

polymerase khác hơn là Taq (John Wiley và Sons, 2004)

2.3.2.4 Các giai đoạn phản ứng PCR

Bước 1: Biến tính (Denaturing)

Trong một dung dịch phản ứng bao gồm những thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 -

950C trong vòng 30 giây – 1 phút

Bước 2: Gắn mồi (Annealing hay hybridization)

Nhiệt độ hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 720C, tùy thuộc vào Tm của mồi sử dụng và kéo dài 30 giây – 1 phút

Bước 3: Kéo dài - tổng hợp (Extending hay Elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tốt nhất Thời gian kéo dài tùy thuộc vào chiều dài trình tự DNA cần khuếch đại, thời gian khoảng 20 giây đối với DNA khuôn nhỏ hơn 500 nucleotide,

40 giây đối với đoạn DNA nhỏ hơn 1200 nucleotide Thường thời gian kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2002)

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như trên, lặp lại 25 lần đến 50 lần tùy thuộc mục đích, yêu cầu nghiên cứu Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nếu thời gian kéo dài quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng theo Số lượng bản sao n chu kỳ là a x 2n (trong đó a là

số đoạn khuôn)

2.3.2.5 Những sai sót trong phản ứng PCR và một số biện pháp khắc phục

 Trong thực nghiệm, kích thước trình tự cần khuếch đại là hạn chế đầu tiên Trừ một số trường hợp đặc biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt Với các độ dài hơn điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả

có thể rất nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường cửa, thiết bị, dụng cụ,… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thể khắc phục một phần vấn đề này như sau:

o Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

o Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không dùng vào các mục đích khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng

o Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại ở các lần khuếch đại