NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC CHẤT MANG THÍCH HỢP CHO CÁC VI SINH VẬT Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata LÀM TIỀN ĐỀ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH CHO CÂY TRỔNG

Bốn dòng vi sinh vật Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata là những vi sinh vật có khả năng cố định đạm, phân giải lân, giải phóng các chất kích thích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC CHẤT MANG THÍCH HỢP CHO

CÁC VI SINH VẬT Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas striata LÀM TIỀN ĐỀ

SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH

CHO CÂY TRỔNG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 – 2008

Tháng 10/2008

1

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC CHẤT MANG THÍCH HỢP CHO

CÁC VI SINH VẬT Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas striata LÀM TIỀN ĐỀ

SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH

CHO CÂY TRỔNG

PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI TRẦN THÀNH DANH ThS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÚC

Tháng 10/2008

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

Ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Viện cây ăn quả Miền Nam

đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận

PGS TS Nguyễn Ngọc Hải; ThS Nguyễn Thị Ngọc Trúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận

Anh Phong, chị Bình, anh Bình, chị Hiền, chị Yến đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện

Bạn Dương Thị Kim Phụng, Trần Thịnh, Đinh Bá Phước đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Vô cùng biết ơn gia đình bà tám đã động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho con

Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với ba mẹ; cám

ơn ba mẹ và các anh chị em luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt

Sinh viên thực hiện

Trần Thành Danh

iii

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu công thức chất mang thích hợp cho các vi sinh vật Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata làm tiền đề sản xuất phân

bón vi sinh cho cây trồng” được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2008

tại Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam, Việt Nam Bốn dòng vi sinh vật Azotobacter,

Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata là những vi sinh vật có khả

năng cố định đạm, phân giải lân, giải phóng các chất kích thích sinh trưởng và phòng trừ bệnh cho cây trồng.Trên nền chất mang với năm thành phần bao gồm: đất, tro trấu, phân heo hoai, trấu, xác khóm đã được phối trộn theo 19 công thức (bảng 3.1)

Mục đích của đề tài nhằm tìm ra chất mang thích hợp nhất cho các dòng vi sinh vật mà chúng đang mang thông qua các chỉ tiêu: mật số vi sinh vật ; ẩm độ; pH; protein; khả năng sinh enzyme urease, Phosphomonoesterase

Các kết quả thu được:

(1) Mật số vsv Azotobacter cao ở các công thức chất mang 10, 15, 17, 14, 9, 3; đối với Azospirillum: 17,

13, 2, 9, 15, 10; Pseudomonas fluorescens: 17, 3, 13, 16, 1, 14; và Pseudomonas striata:

13, 12, 15, 14, 2, 6, 17

(2) pH thích hợp nhất ở các công thức chất mang 3, 7, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18

(3) Ẩm độ cao ở các công thức chất mang 3, 15, 14, 17

(4) Lượng protein cao ở các công thức chất mang 8, 10, 4, 11, 5

(5) Lượng enzyme urease cao ở các công thức chất mang 4, 1, 19, 11, 8

(6) Lượng enzyme alkaline phosphatase cao ở các công thức chất mang 5, 17, 3, 14; lượng enzyne acid phosphatase cao ở các công thức chất mang: 17, 5, 15, 3, 14

Từ các kết quả trên ta có thể thấy công thức chất mang số 17 (đất + phân heo hoai + xác khóm) là tốt nhất trong 19 công thức Bên cạnh đó, các công thức số s15, 14, 13 và 3 cũng khá tốt

Giới hạn của đề tài: Thời gian ngắn nên chưa khảo sát hết các mẫu đến 6 tháng sau khi

chủng vi sinh vật vào chất mang; số mẫu lớn nên gặp nhiều khó khăn trong thí nghiệm

iv

SUMMARY

An experiment entitled “Study on carrier compositions for Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata for producing biofertilizer”

was conducted at the Division of Biotechnology, SOFRI, Tien Giang, Vietnam during

1/4/2008 – 30/8/2008 Four species of Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas striata which are able to fix nitrogene, solubilize phosphate, produce growth

regulator and prevent plant pathogens were isolated and used for the experiment The carrier was including of soil, rice husk ash, degraded pig manure, straw, pineapple wastes and prepared to 19 formulas (as showed in table 3.1)

Aims of the thesis have been to find out the best carrier formulas for bacteria species

as mentioned above On basic of observation of bacteria counts (CFU), moisture, pH, protein content, enzymes of urease, phosphomonoesterase, the results were given as follows:

(1) Bacteria counts (cfu/g) for Azotobacter was high in treatments of 10, 15, 17, 14, 9 and 3, for

Azospirillium (17, 13, 2, 9, 15, 10), Pseudomonas fluorescens (17, 3, 13, 16, 1, 14) and Pseudomonas striata (13, 12, 15, 14, 2, 6, 17)

(2) pH in the treatments of 3, 7, 10, 12, 13, 14, 16, 17 and 18 was the most suitable for growth

of those bacteria

(3) In the treatments of 3, 15, 14 and 17 were found having high moisture content

(4) High protein content was observed in the treatments of 8, 10, 4, 11 and 5

(5) Concentration of urease enzyme were high in the treatments of 4, 1, 19, 11 and 8

(6) Concentration of alkaline phosphatase were high in the treatments of 5, 17, 3 and 14 while that of acid phosphatase was found in the treatments of 17, 5, 15, 3 and 14

From above results, the treatment 17 (soil, degraded pig manure, pineapple wastes)

was the best, then treatments 15, 14, 13 and 3

MỤC LỤC

TRANG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv

v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xi

Danh sách các bảng xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi sinh vật 3

2.1.1 Vi sinh vật đất 3

2.1.2 Ảnh hưởng của ẩm độ đến vi sinh vật 4

2.1.3 Ảnh hưởng của pH đến vi sinh vật 5

2.2 Giới thiệu về bốn dòng vi sinh vật Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata và tính hữu ích của chúng 6

2.2.1 Azotobacter 6

2.2.2 Azospirillum 7

2.2.3 Pseudomonas fluorescens 9

2.2.4 Pseudomonas striata 12

2.3 Enzym trong đất 12

2.3.1 Định nghĩa enzyme 12

2.3.2 Enzyme trong đất 13

2.3.3 Những nguồn của enzyme trong đất 13

2.3.4 Enzyme nitrogenase 14

2.3.5 Enzyme phosphatase 15

2.4 Phân bón vi sinh 16

2.4.1 Khái niệm 16

2.4.2 Phân loại 17

2.4.2.1 Phân loại theo công nghệ sản xuất phân bón 17

2.4.2.2 Phân loại theo tính năng tác dụng của các nhóm vi sinh vật chứa trong phân bón 18

2.4.2.3 Phân loại theo trạng thái vật lý của phân bón 19

2.5 Chất mang 19

2.5.1 Phân loại 19

2.5.2 Thành phần và tính chất của một số loại chất mang 20

vi

2.5.2.1 Đất 20

2.5.2.2 Tro trấu 20

2.5.2.3 Phân heo hoai 20

2.5.2.4 Trấu 21

2.5.2.5 Xác khóm 21

2.6 Một số loại phân bón vi sinh vật chủ yếu và tác dụng của chúng trong sản xuất nông, lâm nghiệp 21

2.6.1 Phân vi sinh vật cố định đạm 21

2.6.1.1 Vòng tuần hoàn của Nitơ 21

2.6.1.2 Tác dụng của phân vi sinh vật cố định đạm trong sản xuất nông lâm nghiệp 23

2.6.2 Phân vi sinh vật phân giải lân 23

2.6.2.1 Lân vô cơ 24

2.6.2.2 Lân hữu cơ 24

2.6.2.3 Tác dụng của phân vi sinh vật cố định đạm trong sàn xuất nông lâm nghiệp 25

2.6.3 Phân vi sinh vật hỗn hợp 25

2.6.4 Phân vi sinh vật chức năng 26

2.7 Yêu cầu chất lượng đối với phân bón vi sinh vật 28

2.8 Một số nghiên cứu mới về phân vi sinh 29

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Thời gian và địa điểm 32

3.2 Vật liệu và dụng cụ 32

3.2.1 Vật liệu 32

3.2.2 Chuẩn bị vật liệu 32

3.2.2.1 Đất 32

3.2.2.2 Tro trấu 33

3.2.2.3 Phân heo hoai 33

3.2.2.4 Trấu 33

3.2.2.5 Xác khóm 33

3.2.2.6 Phối trộn và tạo các công thức chất mang 34

3.2.2.7 Chuẩn bị vi sinh vật 34

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 36

3.3 Hóa chất 36

3.3.1 Hóa chất dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36

3.3.1.1 Môi trường nuôi cấy Azotobacter 36

vii

3.3.1.2 Môi trường nuôi cấy Azospirillum 36

3.3.1.3 Môi trường nuôi cấy Pseudomonas fluorescens 37

3.3.1.4 Môi trường nuôi cấy Pseudomonas striata 37

3.3.2 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 37

3.3.2.1 Hóa chất dùng trong thí nghiệm kiểm tra protein trong đất bằng phương pháp Lowry 37

3.3.2.2 Hóa chất dùng trong thí nghiệm khả năng sinh urease 37

3.3.2.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm khả năng sinh Phosphomonoesterase 38

3.4 Nội dung nghiên cứu 39

3.4.1 Bố trí thí nghiệm các công thức chất mang 39

3.4.2 Chỉ tiêu theo dõi 40

3.4.2.1 Mật số vi sinh vật 40

3.4.2.2 pH 40

3.4.2.3 Ẩm độ 40

3.4.2.4 Kiểm tra protein trong chất mang bằng phương pháp Lowry 41

3.4.2.5 Khả năng sinh enzyme urease 42

3.4.2.6 Khả năng sinh enzyme Phosphomonoesterase 42

3.5 Xử lý số liệu 43

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Mật số vi sinh vật 44

4.1.1 Mật số vi sinh vật Azotobacter 44

4.1.2 Mật số vi sinh vật Azospirillum 45

4.1.3 Mật số vi sinh vật Pseudomonas flourescens 46

4.1.4 Mật số vi sinh vật Pseudomonas striata 47

4.2 Ảnh hưởng của các công thức chất mang khác nhau đến pH của công thức chất mang ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 48

4.3 Ảnh hưởng của các loại chất mang khác nhau đến ẩm độ ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 49

4.4 Ảnh hưởng của các chất mang khác nhau đến protein ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv50 4.5 Ảnh hưởng của các chất mang khác nhau đến lượng urease ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 51

4.6 Enzyme phosphomonoesterase 52

4.6.1 Ảnh hưởng của chất mang đến enzyme alkaline phosphatase ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 52

viii

4.6.2 Ảnh hưởng của chất mang đến enzyme acid phosphatase ở thời điểm 30 ngày sau chủng

vsv 53

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MUB Modifide universal buffer PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria

PNPPH P – nitrophenyl phosphate được hydrat hóa Stt Số thứ tự

THAM Tris (hydroxymethyl) aminomethane

VCAQMN Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Azotobacter vinelandii 7

Hình 2.2 Azospirillum brasilense .8

Hình 2.3 Enzyme nitrogenase 14

Hình 2.4 Cơ chế tyrosine dephosphoryl hóa bởi tổ hợp enzyme – phosphatase .16

Hình 2.5 Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên 22

Hình 3.1 Đất 32

Hình 3.2 Tro trấu, phân heo hoai, trấu và xác khóm 33

Hình 3.3 Khuẩn lạc Azotobacter trên môi trường Jensen 34

Hình 3.4 Khuẩn lạc Azospirillum trên môi trường Rojo Congo 35

Hình 3.5 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trường King’s .35

Hình 3.6 Khuẩn lạc Pseudomonas striata trên môi trường Pikovskaja .36

xi

Bảng 4.3 Sự thay đổi của mật số vi khuẩn Pseudomonas flourescens theo thời gian của các

công thức chất mang (đv: 109 cfu/g) .46

Bảng 4.4 Sự thay đổi của mật số vi khuẩn Pseudomonas striata theo thời gian của các công

thức chất mang (đv: 109 cfu/g) .47 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các công thức chất mang khác nhau đến pH của công thức chất mang ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 48

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các loại chất mang khác nhau đến ẩm độ ở thời điểm 30 ngày sau

chủng vsv 49 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các chất mang khác nhau đến protein ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 50 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của các chất mang khác nhau đến lượng urease ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 51 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của chất mang đến enzyme alkaline phosphatase ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 52 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của chất mang đến enzyme acid phosphatase ở thời điểm 30 ngày sau chủng vsv 53

Phân bón hóa học góp phần làm tăng năng suất cây trồng thông qua nhiều cơ chế tác động khác nhau, cung cấp cho cây trồng những dinh dưỡng cần mà đất không

đủ khả năng cung cấp, duy trì độ phì nhiêu trong quá trình canh tác

Bên cạnh ích lợi mà phân bón hóa học mang lại, chúng còn gây nên hiện tượng chai cứng, giảm độ phì, thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất trồng Đặc biệt là những bất lợi của phân bón hóa học đến con người, động thực vật và môi trường sinh thái đó là nguy cơ gây ngộ độc nitrat, phú dưỡng nước và tích lũy kim loại nặng trong nông sản

Phân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành Thông qua các hoạt động của chúng sau quá trình bón vào đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (N, P, K, ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng xuất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân vi sinh bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Để sản xuất phân vi sinh, ngoài các loài vi sinh vật có ích thì chất mang là vô cùng quan trọng Chất mang là chất để vi sinh vật được cấy tồn tại và phát triển, tạo điều kiện thuận lợi cho vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân vi sinh

Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự chấp thuận của Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Viện cây ăn quả Miền Nam, chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu công thức chất mang thích hợp cho các vi sinh vật Azotobacter,

Azospirillum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas striata làm tiền đề sản xuất

phân bón vi sinh cho cây trồng”

1.2 Mục tiêu đề tài

Bước đầu xác định công thức chất mang hợp lý và lý tưởng cho bốn dòng vi sinh vật, làm tiền đề sản xuất phân bón vi sinh cho cây trồng

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi sinh vật (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

Là tên gọi chung để chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏ bé, chỉ có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử

Vi sinh vật (vsv) bao gồm nhiều nhóm khác nhau: các virus (nhóm chưa có cấu

tạo tế bào), các vi khuẩn cổ (Archaea) và vi khuẩn (nhóm sinh vật Nhân sơ), các vi nấm (nhóm sinh vật Nhân chuẩn) và cả một số động vật nguyên sinh cũng như tảo đơn bào cũng thuộc nhóm này

Giữa các nhóm trên không có mối liên hệ chặt chẽ về mặt hình thái hay phân loại, nhưng người ta gộp chúng lại vì chúng cùng có một số phương pháp nuôi dưỡng, nghiên cứu và hoạt động sinh lý gần giống nhau và đều có các đặc điểm chung:

 Kích thước nhỏ bé

o Vi sinh vật thường được đo kích thước bằng đơn vị micromet Virus được

đo kích thước đơn vị bằng nanomet

o Kích thước càng bé thì diện tích bề mặt của vsv trong 1 đơn vị thể tích càng lớn Chẳng hạn đường kính của một cầu khuẩn chỉ có 1 μm, nhưng nếu xếp đầy chúng thành một khối lập phương có thể tích là 1 cm3 thì chúng có diện tích bề mặt rộng tới 6 m2

 Sinh sản nhanh

 Hấp thu nhiều chuyển hóa nhanh

 Khả năng thích ứng rất cao và phát sinh biến dị mạnh

 Phân bố rộng và chủng loại nhiều

 Có chủng xuất hiện sớm nhất trên trái đất

2.1.1 Vi sinh vật đất (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

Đất là môi trường thuận lợi cho vsv sống và phát triển (thức ăn, độ ẩm, nhiệt

độ, pH, )

Số lượng và kết cấu khu hệ vsv thường xuyên thay đổi tùy theo loại đất, khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ và chế độ canh tác

Thành phần vsv đất rất phức tạp bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm, vi tảo, động vật nguyên sinh Riêng vi khuẩn rất phong phú, bao gồm vi khuẩn hiếu khí, kị khí, tự dưỡng, dị dưỡng, vi khuẩn cố định đạm,…

Trong đất canh tác, có nhiều chất hữu cơ, thoáng khí, số lượng vsv lên tới hàng triệu cá thể trong 1 g đất, đất hoang hóa và đất sa mạc có số lượng ít hơn

Số lượng vsv thay đổi theo độ sâu của đất: trên bề mặt có ánh sáng mặt trời, khô ráo nên có ít vsv, ở độ sâu 0,5 – 25 cm, có số lượng nhiều, 100 – 200 cm số lượng bắt đầu giảm, sâu vài mét, vsv ít tồn tại vì thiếu chất hữu cơ và oxy

Các nhóm vsv trong đất thường xuyên có liên quan với nhau, có khi tác động tương hỗ lẫn nhau như Nitrosomonas và Nitrobacter, có khi chống đối nhau như các loài vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn phát sinh ra các chất kháng sinh ức chế sự phát triển của các loại vsv khác

Vi sinh vật đất có tầm quan trọng đặc biệt trong sự hình thành chất mùn Trong đất còn có những vi khuẩn cố định nitơ sống tự do hoặc cộng sinh làm giàu thêm nitơ cho đất Nhưng ngược lại trong đất cũng có những vi khuẩn phản nitrate hóa, phản sunfat hóa, mức độ phì nhiêu của đất phụ thuộc vào sự hoạt động của chúng Do đó

ta phải khống chế hoạt động của chúng để phát huy ảnh hưởng tốt, hạ thấp ảnh hưởng xấu, đưa năng suất mùa màng lên cao Đất cũng là nguồn tốt để phân lập vsv hữu ích

2.1.2 Ảnh hưởng của ẩm độ đến vi sinh vật

Hoạt động sống của vsv đều liên quan đến nước và tỷ lệ nước trong tế bào của chúng rất cao Nấm men 73 – 82 %, nấm mốc 84 – 90 %, vi khuẩn 75 – 85 % Vì vậy thiếu nước tế bào có thể bị chết do hiện tượng loại nước ra khỏi cơ thể (Nguyễn Xuân Hòa và ctv, 2007)

Hầu hết các quá trình sống của vsv có liên quan đến nước, do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường Đa số vi khuẩn thuộc các sinh vật ưa nước nghĩa là chúng cần nước ở dạng tự do, dễ hấp thụ Chỉ một số xạ khuẩn có thể xếp vào bọn ưa khô Nếu làm lạnh tế bào đồng thời làm khô trong chân không ta có thể bảo quản được sức sống của tế bào trong một thời gian dài Đây là nguyên tắc của phương pháp làm đông khô vi khuẩn (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

Sự đề kháng của vsv với trạng thái khô (Nguyễn Xuân Hòa và ctv, 2007) phụ thuộc vào:

 Nguồn gốc vsv: vsv trong không khí chịu khô tốt hơn vsv trong đất, nước

 Loại hình vsv: sự đề kháng với trạng thái khô của nhóm xạ khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc

 Trạng thái tế bào: tế bào già, tế bào có nha bào đề kháng tốt hơn tế bào khô, tế bào không có nha bào

Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi khô hoặc sấy khô ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loài sản phẩm (hoa quả khô, cá, ruốc thịt khô) (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

2.1.3 Ảnh hưởng của pH đến vi sinh vật

pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vsv Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và sinh sản của

vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt động của nhiều enzyme Giới hạn pH hoạt động đối với vsv ở trong khoảng 4 – 10 Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trung tính (7,0) như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4) Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn nốt sần, xạ khuẩn, vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm Một số

vi khuẩn chịu acid (vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina ventriculi), một số khác ưa acid như Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thiooxydans (oxy hóa lưu huỳnh thành

H

2SO

4) có thể sinh trưởng ở pH < 1 Nấm mốc và nấm men ưa pH acid (pH 4 – 6) pH môi trường không những ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến các quá trình trao đổi chất (Biền Văn Minh và ctv, 2006)

pH của môi trường không những ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến quá trình trao đổi chất (Nguyễn Xuân Hòa và ctv, 2007)

Màng tế bào chất của vi khuẩn ít thấm đối với các ion H+ và OH- Mặc dù pH bên ngoài môi trường dao động trong giới hạn rộng, nồng độ của hai ion trong tế bào chất nói chung tương đối ổn định Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt động của vi

sinh vật có thể do kết quả của sự tác động qua lại giữa ion H+ và men chứa trong màng

tế bào chất và thành tế bào (Nguyễn Xuân Hòa và ctv, 2007)

Để duy trì pH trong quá trình nuôi cấy, đối với các vi khuẩn sinh acid nhưng lại

không chịu lại được acid (Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas) người ta

thêm các chất đệm, thường là các muối của các acid yếu (phosphate, acetat, carbonat) (Nguyễn Xuân Hòa và ctv, 2007)

2.2 Giới thiệu về bốn dòng vsv Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas striata và tính hữu ích của chúng

Azotobacter Là vi khuẩn hình trứng, gram âm không sinh nha bào, hiếu khí, tế bào có

kích thước dao động chiều dài 3,0 – 10,9 μm x 1,3 – 2,7 μm chiều rộng, khuẩn lạc màu trắng trong, lồi, nhầy Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục hoặc màu nâu thẫm tế bào được bao bọc một lớp vỏ dày và tạo thành nang xác, gặp điều kiện thuận lợi nang xác này sẽ nức ra và tạo thành các tế bào mới (Martin Dworkin và ctv, 2006)

Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy ở môi trường nhân tạo thường biểu hiện tính

đa hình, khi còn non có tiêm mao, có khả năng di động được nhờ tiêm mao

Vi khuẩn Azotobacter thích ứng ở pH 7,2 – 8,2, nhiệt độ 28 – 30oC, độ ẩm

40 – 60 % Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường kép, cứ tiêu tốn 1 g đường glucose nó có khả năng đồng hóa được 8 – 18 mg N Ngoài ra Azotobacter có

khả năng tiết ra một số vitamin thuộc nhóm B như B1, B6, một số acid hữu cơ như: nicotinic, acid pantotenic, biotin, auxin Các loại chất kháng sinh thuộc nhóm anixomyxin (Martin Dworkin và ctv, 2006)

Azotobacter có nhiều loài khác nhau: A chroococcum (Beijerinck, 1901),

A vinelandi (Lipman, 1903), A beijerinckii (Lipman, 1904), A paspali (Dobereiner, 1966), A nigricans, A armeniacus,…( P Bhattacharyya, 2002)

Hình 2.1 Azotobacter vinelandii

(Nguồn: http://www.jic.ac.uk/SCIENCE/molmicro/Azot.html)

Vì Azotobacter có khả năng cố định N mạnh mẽ như vậy nên từ cuối thế kỷ 18

đã có nhiều nước nghiên cứu sử dụng chúng làm phân vi khuẩn (gọi là phân Azotobacterin) Việc sử dụng Azotobacterin cũng đang phát triển mạnh ở nhiều nước

và thu được kết quả Tuy nhiên sử dụng Azotobacterin không phải là vấn đề tiếp giống đơn giản, mà còn phải tạo điều kiện để chúng phát triển mạnh cố định được nhiều N, nghĩa là sử dụng kỹ thuật liên hoàn

Để chế tạo Azotobacterin trước hết ta nuôi thật nhiều Azotobacter trên môi

trường đặc hoặc lỏng có bơm không khí Sau đó đem trộn chúng với than bùn hoặc các chất nuôi dưỡng khác để chế thành bột Azotobacterin

Năm 1925, Beijerinck là người đầu tiên phát hiện và gọi chúng là Spirillium lipoferum, sau Beijerinck còn có Becking (1963), Dobereiner (1976) Terrand và ctv

đã đặt tên lại cho chúng là Azospirillum cho đến ngày nay Azospirillum có thể cố định

đạm khoảng 20 – 40 kg/ha (tương đương 20 – 40 N/g malate trong phòng thí nghiệm) khi kết hợp với rễ cây Những sản phẩm hormone của chúng là IAA, GA, cytokinins, một số vitamin và poly beta hydroxybutyric (PBH) ( P Bhattacharyya, 2002)

Azospirillum là vi khuẩn cố định N có hình xoắn ốc Chúng ưa ít oxy, là vi

khuẩn gram âm, hình que cong, chúng phân bố ở khắp nơi trong đất và rễ của một số

loại cây Azospirillum có khả năng sống cộng sinh cố định đạm ở vùng rễ các cây ngũ

cốc đặc biệt là cây lúa ( P Bhattacharyya, 2002)

Hình 2.2 Azospirillum brasilense

(Nguồn: Bergey, 1989)

Azospirillum lipoferum cho thấy sự tác động mạnh mẽ của nó qua sự tăng lượng

đạm và trọng lượng cũng như kích thước của củ carrot (Govedarica và ctv, 1993, 1994) và tăng lượng đường trong củ cải đường (Favilli và ctv, 1993) Khi chủng

Azospirillum với hạt giống thì có thể tiết kiệm đến 60 % lượng phân đạm (Macalintal

và Urgel, 1992) Sự kết hợp giữa Azotobacter và Azospirillum trên ruộng mía là tốt nhất (Navale và ctv, 1995) Azospirillum in vitro có thể sản xuất các hormone thực vật

như IAA, gibberellin, cytokinin (Losipenko và Ignatov, 1995; Patten and Glick, 1996; Rademacher 1994; sớm hơn có Bashan and Levanony, 1990), và ethylene (Strzelczyk

và ctv, 1994)

Vào những năm 1970, một nhóm vi khuẩn kí sinh trên và trong rễ cây trồng có

khả năng đối kháng cao và kích thích cây trồng phát triển được gọi là PGPR (Plant

Growth Promoting Rhizobacteria) được xác định, hầu hết những dòng vi khuẩn có đặc

tính trên thuộc loài Pseudomonas và Bacillus spp (Kloepper, 1986).

Pseudomonas fluorescens (Trevisan, 1889) thuộc giống Pseudomonas thường

là Gram âm, hình que, có nhiều lông roi P fluorescens là vsv phân giải lân, có sự trao

đổi chất rất linh hoạt, có thể tìm thấy vsv này trong đất hoặc nước Là vsv hiếu khí bắt

buộc nhưng đôi khi có khả năng sử dụng nitrate thay cho oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự

phát triển P fluorescens là khoảng 25 – 300C và pH = 7

Vi khuẩn P fluorescens kí sinh trong phần vỏ rễ cây trồng, giúp cho cây phát

triển nhanh và chống lại vsv gây hại, dẫn tới tăng năng suất (Lazarovits, 1997)

Pseudomonas sản sinh nhiều hợp chất hóa học có cấu trúc từ đơn giản tới phức tạp với

đặc tính như những chất kháng sinh, trong đó 2,4 – diacetylphloroglucinol (2,4 – DAPG) là hợp chất được xem có vai trò xác lập tính đối kháng Gen mã hóa

2,4 – DAPG, được gọi là PhlD Dòng P fluorescens T5 tạo Phl ở nồng độ 5 mg/ml

trong môi trường lỏng KB và có khả năng đối kháng cao với nấm Rhizoctonia solani

gây hại trên cây cà chua hiện đang được thương mại hóa tại Nhật Bản

Mew và Rosales (1984) đã phân lập từ ngoài đồng hai loài vi khuẩn phát huỳnh

quang và không phát huỳnh quang trên môi trường KB đối kháng với nấm

Rhizoctonia solani.

Gutter Son và ctv (1986) đã sử dụng dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

trong phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông

Những chủng vi khuẩn ở vùng rễ trong đó có loài Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum f sp Vasinfectium, Fusarium oxysporum f sp cubense, Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii, Sarocladium oryzae và Aspergilus flavus và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv Citri và Xanthomonas campestris pv Oryzae Các thí nghiệm tiếp theo cũng sử dụng nguồn vi khuẩn này

trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel, 1986) Còn vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens dòng HV37a được chứng minh rằng sinh ra ít nhất ba loại kháng sinh ức chế phát triển của nấm Pythium ulimun, được dùng phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông vải do nấm Pythium ulimun gây ra (Gutter Son, 1986)

Sivamani và Gnanamanickam (1988) đã xử lý cây chuối con Musa balbisiana

bằng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens trên bệnh héo rũ Kết quả bệnh ít

hơn, rễ cây phát triển tốt hơn và tăng chiều cao

Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens có huỳnh quang

và không có huỳnh quang phân lập từ rễ lúa ở miền Nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm

Rhizoctonia solani được thực hiện bởi Devi và ctv (1989)

Voisard và ctv (1989) cho biết cyanide sản xuất bởi Pseudomonas fluorescens

giúp ngăn chặn bệnh thối đen rễ thuốc lá

Lambert và ctv (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Serratia liquefacien và Bacillus sp có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ cây

bắp, lúa mạch, và xà lách xoong

Jee và Kim (1987) nghiên cứu sự đối kháng giữa vi khuẩn và nấm đối với mầm

bệnh héo rũ dưa leo Những chủng chính đã được chọn lọc là P fluorescens, P putida

và Seratia sp., nấm đối kháng thì có Giocladium sp., Trichoderma harzianum và Trichoderma viridae Trong môi trường agar lỏng, vi khuẩn đối kháng ức chế sự nảy mầm của bào tử Fusarium oxysporum f sp cucumerium từ 26 – 45 %, P fluorescens

là vi khuẩn có tính kìm hãm mạnh nhất

Theo Gnanamanickam và ctv (1992), những nhóm vi khuẩn đối kháng phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang được quan sát trong ống nghiệm có khả năng

kìm hãm nấm Rhizoctonia solani vì chúng có gene chitinase làm phân hủy chitin trong

vách tế bào sợi nấm Nhiều dòng vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển khuẩn ty,

ảnh hưởng đến sự sống của hạch nấm và bảo vệ cây lúa tránh được sự xâm nhiễm của nấm bệnh

Gogoi và Roy (1996) cho biết những dòng vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang phân lập ở Philippine được đánh giá là kháng với mầm bệnh đốm

vằn Rhizoctonia solani Giữa 9 dòng có hiệu quả thì 5 dòng được biết là Pseudomonas fluorescens, 1 dòng là Enterobacter

Theo Rindran và Vidhyaekaran (1996) những nòi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phát huỳnh quang phân lập từ vùng rễ cũng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani Một trong những dòng có hiệu quả nhất là PfAIR2, phân lập trên

than bùn được dùng để xử lý hạt, xử lý rễ, rải vào đất và phun lên lá

Mukhopadhyay và ctv (1996) cho biết khi phân lập từ mạ lúa được trồng từ hạt giống có khử trùng bề mặt, người ta tìm thấy 3 nòi hiện diện trên vỏ trấu hạt lúa là

Bacillus spp., Pseudomonas fluorescens và Enterobacter

Sử dụng P cepacia làm giảm bệnh mốc xanh sau thu hoạch do Penicillium digitatum trên trái chanh tới 80 % so với không chủng (Smilanick và Ricardodenis-

arrue, 1992) Tác động đối kháng của vi khuẩn được xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin

Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm

P carolinianum ở Ai Cập được kiểm soát bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng

P fluorescens Vi khuẩn đối kháng cao với nấm trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn

chế được bệnh khi áp dụng trong đất Hiệu quả kiểm soát khi trộn vi khuẩn vào đất cao hơn khi chủng vi khuẩn vào vùng rễ cây con trước khi đem trồng Tác động đối kháng

là do cạnh tranh về dinh dưỡng, siderophores, những chất có khả năng kháng khuẩn – HCN

2.2.4 Pseudomonas striata (theo Trúc, 2006)

Đất được chủng dòng vi khuẩn P striata đều làm tăng sinh khối và protein hữu

cơ trong đất, giúp đất trồng giàu dinh dưỡng hơn

2.3 Enzym trong đất

2.3.1 Định nghĩa enzyme (Đỗ Quý Hai và Lê Doãn Diên, 2007)

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Chúng có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

2.3.2 Enzyme trong đất (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2006)

Đất có thể có sự tồn tại của vsv Đất chứa đựng một số enzym tự do, sự bất động của enzyme ngoại bào được ổn định bởi mạng lưới ba chiều của những phân tử lớn và những enzyme bên trong tế bào vsv (Dick và Tabatabai, 1978) Enzyme là protein có khả năng xúc tác và thúc đẩy sự xảy ra các phản ứng hóa học mà không trãi qua sự thay đổi thông thường Những enzyme trong đất thì tương tự như các enzyme trong hệ thống khác Mức độ tác động của chúng phụ thuộc rất lớn vào pH, ion, nhiệt

độ và sự hiện diện hay vắng mặt của các yếu ố kìm hãm (Tabatabai, 1982)

2.3.3 Những nguồn của enzyme trong đất (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2006)

Cả vsv và thực vật trong đất đều phóng thích ra enzyme trong môi trường đất

Ribonucleases và alkaline phosphatase là một ví dụ, được tiết ra bởi Bacillus subtilis

với những điều kiện nhất định nào đó, pyrophosphatase và acid phosphatase có thể

hiện diện bên ngoài vách tế bào của Saccharomyces mellis Ảnh hưởng của những vsv

trong hoạt tính phosphatase đối với đất có vẻ như tạm thời và trong thời gian ngắn Dick và Tabatabai (1978) ủ đất với glucose và natri nitrate ở 22oC và số lượng vi khuẩn gia tăng hầu hết ở 36 giờ và sự gia tăng này đi kèm với sự gia tăng hoạt tính phosphatase Tuy nhiên hoạt tính này bị mất đi nhanh chóng, sau 21 ngày nó hoàn toàn

biến mất

Thực vật cũng được coi là một nguồn enzyme ngoại bào trong đất Tabatabai và

cộng sự (1988) đã mô tả rễ cây ngô (Zea mays) và đậu nành (Glycine max) chứa acid

phosphatase, nhưng không có hoạt tính của alkaline phosphatase Những rễ này được đặt trong dung dịch đệm vô trùng hay là nước từ 4 – 48 giờ Phosphatase được giải

phóng trong dung dịch

Những lượng enzyme chủ yếu được đưa vào bởi vsv hay rễ thực vật bị ức chế bởi những thành phần trong đất mà nhanh chóng bị phân hủy bởi protease trong đất Mặc dù hầu hết những enzyme này đưa vào trong đất đã bất hoạt nhưng cũng có một phần nhỏ những enzyme hoạt động có thể trở nên cố định trong đất Những nghiên cứu tổng hợp chỉ ra rằng phức hợp enzyme được tạo thành trong đất, hoạt tính của nó giảm

đáng kể, nhưng nó không hoàn toàn loại trừ (Dick và Tabatabai, 1987)

Thực vật có thể tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau Những enzyme này được thêm vào trong đất như là một tàn dư có thể vẫn còn hoạt tính Hoạt tính của

phosphatase trong đất đã được quan sát trong các vật liệu hữu cơ nhất định Do đó không có ngạc nhiên rằng những loại thực vật được trồng trên đất có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của đất, những thực vật cũng có thể ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme một cách gián tiếp Ở vùng rễ thì có hoạt tính enzyme nhiều hơn so với vùng

xa rễ Hoạt tính của enzyme được gia tăng khi nó thuộc các loại vi sinh vật đặc trưng hay rễ thực vật hoặc cả hai Những ảnh hưởng gián tiếp khác đến hoạt tính enzyme là

sự gia tăng số lượng hiện diện trong xác thực vật (Tabatabai, 1988)

2.3.4 Enzyme nitrogenase

Nitrogenase là enzyme tạo ra bởi một số vsv cố định đạm trong không khí N2 tương đối trơ vì nó được liên kết bằng nối ba bền vững Con người phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao, rất tốn kém (1000 – 4000oC, 200 – 1000 atm với những chất xúc tác rất đắt tiền) để phá vỡ mối liên kết ba của phân tử nitơ

hoặc:

Trong khi đó vsv với sự trợ giúp của hoạt tính enzyme nitrogenase lại phá vỡ mối liên kết ba của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện rất bình thường về nhiệt độ và áp suất Phân tử nitơ có năng lượng là 9,4 x 105 J/mol

Có thể nói quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3 có xúc tác của enzyme nitrogenase, khi có mặt của ATP

N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg.ATP +16O nitrogenase 2NH3 + H2 + 16 Mg.ADP + 16P

Nitrogenase được cấu tạo bởi hai thành phần:

Fe – protein có trọng lượng phân tử lượng khoảng 6 104

Mo – Fe – protein có trọng lượng phân tử lượng khoảng 2,2.105

2.3.5 Enzyme phosphatase

Phosphatase là một enzyme xúc tác loại bỏ một nhóm phosphate của cơ chất bởi phản ứng thủy phân những monoester của acid phosphoric thành một ion phosphate và một phân tử chứa một nhóm OH Phản ứng này là phản ứng nghịch của phản ứng gắn nhóm phosphate vào cơ chất bằng cách sử dụng phân tử ATP bởi những enzyme phosphatase và kinase Một trong những enzyme phosphatase có trong nhiều sinh vật là alkaline phosphatase Alkaline phosphatase là enzyme thủy phân xúc tác loại bỏ nhóm phosphate từ nhiều dạng phân tử, bao gồm những nucleotide, protein, and alkaloid Quá trình loại bỏ nhóm phosphate gọi là dephosphoryl

Tổ hợp enzyme – phosphatase có thể được chia thành hai nhóm chính: tổ hợp enzyme phosphatase liên kết với cysteine và tổ hợp phosphatase – metallo (phụ thuộc vào những ion kim loại)

Tổ hợp enzyme phosphatase liên kết với cysteine xúc tác thủy phân một liên kết phosphoester thông qua chất xúc tác trung gian là phospho – cysteine

Những chất chứa thành phần tích điện tự do hình thành một liên kết với phân tử phospho của những dạng bán phosphat, và liên kết P – O đang liên kết với nhóm phosphat sẽ liên kết với tyrosine để hình thành một dạng tích điện dương, bởi một acid amin tích điện dương và một phân tử ước Phân tử trung gian phospho – cnysteine

thủy phân tiếp một phân tử nước khác vì vậy sinh ra vị trí hoạt hóa cho phản

ứng dephosphoryl

Hình 2.4 Cơ chế tyrosine dephosphoryl hóa bởi tổ hợp enzyme – phosphatase

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatase)

2.4 Phân bón vi sinh

2.4.1 Khái niệm (Nguyễn Minh Hưng và ctv, 2007)

Cùng với chất hữu cơ, vsv tồn tại trong đất, nước và vùng rễ cây có ý nghĩa

quan trọng trong các mối tương tác giữa cây trồng, đất và phân bón Hầu như mọi quá

trình xảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vsv (quá trình

mùn hóa, khoáng hóa hợp chất hữu cơ, quá trình phân giải hoặc cố định chất vô cơ )

Vì vậy, vsv được coi là một yếu tố của hệ thống dinh dưỡng cây trồng tổng hợp

Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được

đặt tên là Nitragin: sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác tại một số nước

khác như Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914),…

Tại nhiều quốc gia, phân bón vsv được hiểu là các sản phẩm chứa các vsv tồn

tại dưới dạng tế bào đang sống hay gọi là tế bào sinh dưỡng hoặc bào tử hay vsv dạng

ngủ từ các chủng vsv có ích có khả năng cố định đạm hoặc chuyển hóa lân khó tan

thành lân dễ tiêu tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình dinh dưỡng của cây và

đất trồng

Định nghĩa (theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 6168 – 1996)

"Phân vsv (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vsv sống, đã được tuyển chọn có

mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo

nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các

hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân

vsv phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến ngư, động, thực vật, môi trường sinh

thái và chất lượng nông sản"

2.4.2 Phân loại (Nguyễn Minh Hưng và ctv, 2007)

Phân bón vsv được chia thành nhiều dạng khác nhau tùy theo công nghệ sản

xuất, tính năng tác dụng của vsv chứa trong phân bón hoặc thành phần các chất tạo nên

sản phẩm phân bón

2.4.2.1 Phân loại theo công nghệ sản xuất phân bón

Tùy theo công nghệ sản xuất, người ta có thể chia phân vsv thành hai loại như sau:

 Phân vsv trên nền chất mang khử trùng có mật độ vsv hữu ích lớn hơn

109 CFU/g (ml) và mật độ vsv tạp nhiễm thấp hơn một phần nghìn so với vsv hữu ích

Phân bón dạng này được tạo thành bằng cách tẩm nhiễm sinh khối vsv sống đã qua

tuyển chọn vào cơ chất đã được xử lý vô trùng bằng các phương pháp khác nhau Phân

bón vsv trên nền chất chất mang đã khử trùng được sử dụng dưới dạng nhiễm hạt, hồ

rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1 – 1,5 kg(lít)/ha canh tác

 Phân vsv trên nền chất mang không khử trùng được sản xuất bằng cách tẩm

nhiễm trực tiếp sinh khối vsv sống đã qua tuyển chọn, vào cơ chất không cần thông

qua công đoạn khử trùng cơ chất Phân bón dạng này có mật độ vsv hữu ích

106 CFU/g (ml) và được sử dụng với số lượng từ vài trăm đến hàng nghìn kg (lít)/ha

Đối với phân bón vsv trên nền chất mang không khử trùng, tùy theo thành phần

các chất chứa trong chất mang mà phân bón vsv dạng này được phân biệt thành

các loại:

o Phân hữu cơ vsv là sản phẩm phân hữu cơ có chứa các vsv sống đã được

tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử

dụng hay các hoạt chất sinh học góp phần nâng cao năng suất, chất lượng

nông sản

o Phân hữu cơ khoáng vsv là một dạng của phân hữu cơ vsv, trong đó có

chứa một lượng nhất định các dinh dưỡng khoáng

2.4.2.2 Phân loại theo tính năng tác dụng của các nhóm vi sinh vật chứa trong phân bón

Trên cơ sở tính năng tác dụng của các vsv chứa trong phân bón, phân vsv còn

được gọi dưới các tên:

 Phân vsv cố định nitơ (phân đạm vi sinh) là sản phẩm chứa các vsv sống cộng sinh với cây họ đậu (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen,…), hội sinh trong vùng rễ cây trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử dụng nitơ từ không khí, tổng hợp

thành đạm cung cấp cho đất và cây trồng

 Phân vsv phân giải hợp chất phospho khó tan (phân lân vi sinh) sản xuất từ các vsv có khả năng chuyển hóa các hợp chất phospho khó tan thành dễ tiêu cho cây trồng

sử dụng

 Phân vsv kích thích, điều hòa sinh trưởng thực vật chứa các vsv có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học có tác dụng điều hòa hoặc kích thích quá trình

trao đổi chất của cây

 Phân vsv chức năng là một dạng của phân bón vsv ngoài khả năng tạo nên các chất dinh dưỡng cho đất, cây trồng, còn có thể ức chế, kìm hãm sự phát sinh, phát triển

của một số bệnh vùng rễ cây trồng do vi khuẩn và vi nấm gây nên

 Phân vi sinh hỗn hợp là loại phân được sản xuất bao gồm nhiều loại vsv có khả năng sống cộng sinh và tham gia chuyển hóa nhiều loại cơ chất khác nhau Khi bón loại phân này xuống đất, tất cả các loại vsv trong loại phân này đều có khả năng phát

triển và đều chuyển hóa vật chất tạo ra nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cây trồng

2.4.2.3 Phân loại theo trạng thái vật lý của phân bón

Căn cứ vào trạng thái vật lý của phân bón, có thể chia phân bón vsv thành các

loại sau:

 Phân vsv dạng bột là dạng phân bón vi sinh, trong đó sinh khối vsv sống đã

được tuyển chọn và chất mang được xử lý thành dạng bột mịn

 Phân vsv dạng lỏng là một loại phân bón vi sinh, trong đó sinh khối vsv từ các

vsv tuyển chọn được chế biến tạo nên dung dịch có chứa các tế bào sống của chúng

 Phân vsv dạng viên được tạo thành khi sinh khối vsv được phối trộn và xử lý

cùng chất mang tạo thành các hạt phân bón có chứa các vsv sống đã được tuyển chọn

2.5 Chất mang (P Bhattacharyya, 2002)

Chất mang là chất để vsv được cấy tồn tại và (hoặc) phát triển, tạo điều kiện thuận lợi cho vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân bón vi sinh Một chất mang gọi là tốt thì phải trơ về mặt hóa học, là nguồn sống của vsv trong quá trình lưu trữ, có khả năng giữ ẩm và vsv hoàn toàn không chịu sự tác động của bất kỳ chất độc nào

Chất mang không được chứa chất có hại cho người , động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Sau khi đã phát triển trong môi trường, vsv được trộn đều với chất mang Một chất mang tốt chứa ít nhất 109 (tế bào/g chất mang) khi mới được chủng vsv vào , duy trì ở mức 108 (tế bào/g chất mang) sau 6 tháng thành phẩm và trước khi sử dụng, chất mang phải khô và nhuyễn

Vật liệu sử dụng làm chất mang phải dễ tìm, rẽ, và có số lượng lớn để không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất, giảm được chi phí sản xuất và sản xuất với số lượng lớn

2.5.1 Phân loại

Có 2 loại chất mang là chất mang thanh trùng và không thanh trùng

 Chất mang không thanh trùng chứa nhiều chất gây ô nhiễm hơn so với chất mang đã thanh trùng

 Chất mang đã thanh trùng bằng cách chiếu bức xạ hoặc thanh trùng bằng nhiệt

2.5.2 Thành phần và tính chất của một số loại chất mang

2.5.2.1 Đất

Đất là môi trường thích hợp nhất đối với vsv, bởi nó là nơi cư trú rộng rãi nhất của vsv, cả về thành phần cũng như số lượng so với các môi trường khác Sở dĩ như vậy vì trong đất nói chung và trong đất trồng trọt nói riêng có một khối lượng lớn chất hữu cơ Đó là nguồn thức ăn cho các nhóm vsv dị dưỡng, ví dụ như nhóm vsv các hợp chất carbon hữu cơ, nhóm vsv phân huỷ các hợp chất nitơ hữu cơ Các chất vô cơ có trong đất cũng là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vsv tự dưỡng Đó là các nhóm phân huỷ các chất vô cơ, chuyển hoá các chất hợp chất S, P, Fe,… (Lê Xuân Phương, 2007)

Do vsv được phân lập từ đất, vì vậy mà đất là vật liệu tối ưu nhất để mang các dòng vsv

Đất phù sa có biểu thị đặc thù của đất là tính xếp lớp, không xa với nguồn nước mạch hay nước ngầm và khá ảnh hưởng bởi tính chất và sự chu chuyển của chúng Về

độ phì nhiêu, hình thái phẩu diện thường gắn với các hệ thống sông: bản chất do chất lượng phong hóa từ thượng nguồn Nói chung trừ những đất phù sa chua mang sản phẩm từ đá mẹ giàu thạch anh thì nghèo, còn đại bộ phận có các chất dinh dưỡng như: hữu cơ, đạm, lân, kali, Ca2+, Mg2+ trung bình và khá; đặc biệt những phù sa mới, chưa khai thác nhiều thường giàu kali (Hội Khoa học Đất Việt Nam, 2000)

2.5.2.2 Tro trấu

Tro trấu là nguồn carbon, cũng là chất giúp môi trường thông thoáng, cung cấp oxy Ngoài ra tro trấu còn chứa các thành phần như: Fe2O3, SiO2, CaO, Al2O3, MgO,… cung cấp cho vsv trong quá trình lưu tồn trong phân vi sinh (Bronzeoak Ltd, 2003)

2.5.2.3 Phân heo hoai (M Pilar Bernal và Holger Kirchmann, 1992)

Là phân heo tươi được ủ cho hoai, trong 1 g phân heo có khoảng 446,6 mg C tổng số, 30,8 mg Nitơ tổng số, 22 mg P, 11,4 mg K và các thành phần như Mg, Na,… với pH khoảng 6,5 Đây là một môi trường khá tốt để sử dụng làm chất mang vi sinh vật

2.5.2.4 Trấu (P Bhattacharyya và HLS Tandon, 2002)

Trấu là sản phẩm phụ trong nông nghiệp và rất phong phú tại Việt Nam nói chung và vùng Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng Trấu chiếm khoảng 25 % trong cấu tạo hạt lúa Trong vỏ trấu có một số thành phần tiêu biểu như: 0,62 % N, 0,19 % P2O5, 1,50 % K2O

Trấu (vỏ trấu) dùng làm chất mang cho phân vi sinh giúp chất mang thông thoáng hơn cung cấp nhiều oxy cho những vsv hiếu khí

2.6 Một số loại phân bón vi sinh vật chủ yếu và tác dụng của chúng trong sản xuất nông, lâm nghiệp

2.6.1 Phân vi sinh vật cố định đạm

Mỗi vật chất tồn tại trong điều kiện thiên nhiên đều có một chu trình chyển hóa Nitơ cũng vậy, nó có chu trình chuyển hóa nhờ hàng loạt các loài vsv khác nhau Sự cố định nitơ từ không khí là một mắc xích trong quá trình chuyển hóa đó

2.6.1.1 Vòng tuần hoàn của Nitơ (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Nitơ chiếm khoảng 78,16 % (thể tích) hoặc 75,5 % (trọng lượng) không khí Loại nitơ này không được thực vật, động vật và con người đồng hóa trực tiếp vì nitơ ở dạng tự do này được liên kết hai phân tử nitơ nhờ ba dây nối rất bền vững (N ≡ N) Năng lượng của ba nối này vào khoảng 225 kcal/mol

Muốn phá vỡ liên kết ba này bằng con đường hóa học người ta phải thực hiện những phản ứng ở nhiệt độ từ 1000 – 4000oC Ví dụ:

CaCl2 + N2

1000oC

CaCN2 + C

1000 atm với sự xúc tác của oxy và cuối cùng tạo thành amoniac Từ sự phát hiện phản ứng này, loài người đã rất thành công trong sản xuất các loại phân nitơ từ không khí Lượng nitơ này đã phần nào bù đắp sự thiếu hụt nitơ trong đất do cây trồng lấy đi hàng năm Mặt khác, các nhà khoa học cũng tìm ra con đường khác nhận nitơ từ không khí trong điều kiện tự nhiên, bão hòa Con đường đó là sự cố định đạm từ vsv Trong thiên nhiên tồn tại rất nhiều loài vsv có khả năng thực hiện các quá trình này như

Azotobacter, Rhizobium… Một số vi sinh khác lại tham gia hàng loạt quá trình giải

phóng nitơ khỏi các hợp chất hữu cơ Như vậy, chính vsv tạo ra vòng tuần hoàn nitơ trong thiên nhiên Vòng tuần hoàn này tồn tại liên tục từ khi xuất hiện sự sống trên trái đất cho đến nay Toàn bộ chu trình chuyển hóa này bao gồm các quá trình sau:

Hình 2.5 Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên

[I] Quá trình cố định nitơ phân tử [II] Quá trình amôn hóa [III] Quá trình nitơrat hóa [IV] Quá trình phản nitơrat hóa ĐV: động vật, TV: thực vật

(Nguồn: Nguyễn Xuân Thành, 2003)

2.6.1.2 Tác dụng của phân vi sinh vật cố định đạm trong sản xuất nông lâm nghiệp (Nguyễn Minh Hưng và ctv, 2007)

Phân bón vsv Azotobacter có thể được coi là loại phân bón vsv được ứng dụng

sớm nhất Khi sống trong đất, chúng có khả năng hấp thụ nitơ không khí và làm giàu

nitơ cho đất Ngoài ra, Azotobacter không chỉ có khả năng cố định nitơ mà còn có khả

năng sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật như tiamin, acid nicotinic, acid pantotenic, piridoxin, một số vitamin và hoạt chất ức chế sự sinh trưởng, phát triển của một số vi nấm gây bệnh vùng rễ một số cây trồng

Phân vsv cố định đạm sản xuất từ Azospirillum Giống như Azotobacter, Azospirillum ngoài khả năng cố định nitơ còn có thể sinh tổng hợp một số hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật Hai giống Azospirillum được biết đến nay là Azospirillum lipoferum và Azospirillum brasilense Sản phẩm phân vsv cố định nitơ từ Azospirillum được nghiên cứu và đưa vào sử đụng tại nhiều nước trên thế giới Tại Ấn

Độ, sử dụng phân vsv cố định nitơ cho lúa, cao lương và bông làm tăng năng suất trung bình 11,4 %, 18,2 % và 6,8 % hay mang lại lợi nhuận 1015 rupi, 1149 rupi và

343 rupi/ha Tại Liên bang Nga, việc bón chế phẩm vsv cố định nitơ làm tăng năng suất khoai tây 12,8 tạ/ha; năng suất cà chua tăng 28,0 tạ/ha; năng suất ngô hạt tăng 22,4 tạ/ha; năng suất cây bắp cải tăng 75,2 tạ/ha

2.6.2 Phân vi sinh vật phân giải lân

Lân (phospho) là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng (N, P, K), là thành phần của acid nucleic, phytin, phospholipit Phospho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường, protein, lipid, vitamin của cây trồng Đặc biệt, lân là thành phần không thể thiếu của các phân

tử trao đổi năng lượng, kiểm soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quang hợp ) Lân có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng Thiếu lân, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục, bẩn, không sáng Thiếu lân, năng suất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Nguyễn Minh Hưng và ctv, 2007) Trong đất tồn tại hai dạng lân sau: