NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN PROTEIN TRÙN QUẾ

Sản phẩm protease thu được sau tủa được xác định điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu để ứng dụng vào thủy phân protein trùn quế.. Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng quan t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ

CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis

VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN

PROTEIN TRÙN QUẾ

Niên khóa: 2004 – 2008 Sinh viên thực hiện: TIÊU THỊ NGỌC THẢO

Tháng 9/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ

CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis VÀ

ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN

PROTEIN TRÙN QUẾ

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG TIÊU THỊ NGỌC THẢO ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT

Tháng 9/2008

iii

LỜI CẢM ƠN

 Xin được gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và các anh chị trong gia đình đã

luôn quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập xa nhà

 Xin cảm ơn ban chủ nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý

thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 Xin được gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS Trương Phước Thiên

Hoàng và ThS Nguyễn Như Nhứt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và

tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

 Cảm ơn các anh chị làm việc tại công ty TNHH Gia Tường đặc biệt là các

anh chị trong phòng thí ngiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong

thời gian thực tập tốt nghiệp tại công ty

 Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn gắn bó, chia sẻ và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập vừa qua

iv

TÓM TẮT

Tiêu Thị Ngọc Thảo, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận protease từ canh trường nuôi cấy

Bacillus subtilis và ứng dụng trong thủy phân protein trùn quế” Đề tài được thực hiện

tại phòng thí nghiệm chi nhánh công ty TNHH Gia Tường từ 04/03/2008 đến 30/07/2008

Giáo viên hướng dẫn:

ThS Trương Phước Thiên Hoàng

ThS Nguyễn Như Nhứt

Chúng tôi sử dụng tác nhân tủa là ethanol 96% để thu nhận protease từ canh

trường nuôi cấy B subtilis Sản phẩm protease thu được sau tủa được xác định điều

kiện nhiệt độ và pH tối ưu để ứng dụng vào thủy phân protein trùn quế Ngoài ra, chúng tôi đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân nguồn protein này

Kết quả nghiên cứu cho thấy:

 Sử dụng tác nhân tủa là ethanol 96% với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và ethanol là 1:2, thời gian tủa là 40 phút sẽ thu hồi được chế phẩm protease có hoạt tính cao nhất

 Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động thủy giải protein của chế phẩm protease lần lượt là 50oC và 7,6

 Hiệu suất thủy phân lên đến 97,84% khi sử dụng nồng độ cơ chất bột trùn quế là 15%, hoạt độ protease bổ sung vào là 2UI/ml và thời gian thủy phân

là 18 giờ

v

ABSTRACT

TIEU THI NGOC THAO, Nong Lam University of Ho Chi Minh City

Graduating thesis topic: “Study on collecting protease from Bacillus subtilis

solid state culture and applying for hydrolysing redworm protein” This thesis was carried out at the laboratory of the branch of Giatuong Co Ltd from 03/2008 to 07/2008

We used 96% ethanol as a precipitation factor to collect protease from the

Bacillus subtilis culture Protease product was got after precipitating, was determined

optimal temperature anh pH in order to use for hydrolyze redworm protein We also surveyed some factors effected on this hydrolysis process

Our result showed that:

 Suitable volume ratio of extracted enzyme and 96% ethanol is 1:2 and optimal precipitation time is 40 minutes

 Optimal temperature and pH in order to hydrolyze casein of the protease product are 50oC and 7,6 respectively

 Hydrolysis efficiency of the protease product reaches to 97,84% when substrate concentration was 15%, added protease activity is 2UI/ml and hydrolysis time is 18 hours

vi

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xii

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH xiii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm của loài B.subtilis 3

2.1.3 Cấu trúc bộ gene của B.subtilis 6

2.1.4 Sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên 6

2.1.5 Các sản phẩm từ B.subtilis 7

2.1.6 Tác hại của B.subtilis 9

2.1.7 Ứng dụng của B.subtilis 9

2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease 10

2.3 Tổng quát về protease 11

2.3.1 Sơ lược lịch sử 11

2.3.2 Giới thiệu chung 14

2.3.3 Phân loại protease 14

2.3.4 Chức năng sinh học của protease vi khuẩn 16

vii

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease 17

2.3.5.1 Nhiệt độ 17

2.3.5.2 pH 17

2.3.5.3 Thời gian hoạt động của enzyme 18

2.3.5.4 Bản chất protease 18

2.3.5.5 Chất hóa học 18

2.3.5.6 Độ bền hoạt tính protease 18

2.4 Ứng dụng của protease vi sinh vật 19

2.4.1 Trong xử lý rác 19

2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm 20

2.4.3 Trong công nghiệp nước giải khát 21

2.4.4 Trong công nghiệp thuộc da 21

2.4.5 Trong mỹ phẩm 21

2.4.6 Trong nông nghiệp 21

2.4.7 Trong công nghiệp dược phẩm và y học 21

2.5 Sự thủy phân protein 22

2.5.1 Các phương pháp thủy phân 22

2.5.1.1 Thủy phân bằng acid 22

2.5.1.2 Thủy phân bằng kiềm 23

2.5.1.3 Thủy phân bằng enzyme 23

2.5.2 Những thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 23

2.6 Giới thiệu về trùn quế 23

2.6.1 Phân loại 23

2.6.2 Đặc điểm cấu tạo 24

2.6.2.1 Đặc điểm hình thái 24

2.6.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái 24

2.6.2.3 Đặc điểm sinh sản 24

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 26

3.2 Vật liệu 26

3.2.1 Giống vi sinh vật 26

viii

3.2.2 Nguyên liệu 26

3.2.3 Các môi trường dùng trong thí nghiệm 26

3.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 26

3.3.1 Dụng cụ, thiết bị 26

3.3.2 Hóa chất 26

3.4 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp thí nghiệm 27

3.5.1 Tinh sạch sơ bộ protease từ canh trường nuôi cấy 27

3.5.1.1 Khảo sát tỷ lệ thích hợp để tủa protease bằng ethanol 96% 27

3.5.1.2 Khảo sát thời gian tủa 28

3.5.2 Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease 28

3.5.2.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 28

3.5.2.2 Xác định pH tối ưu 29

3.5.3 Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản chế phẩm enzyme 29

3.5.4 Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn Quế bằng chế phẩm protease 29

3.5.4.1 Khảo sát nồng độ cơ chất 29

3.5.4.2 Khảo sát nồng độ enzyme bổ sung 30

3.5.4.3 Khảo sát thời gian thủy phân 30

3.5.5 Ứng dụng thủy phân cơ chất với các điều kiện đã chọn được 30

3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 31

3.7 Tóm tắt quá trình thí nghiệm 31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả so sánh hoạt tính protease của chủng Ba01 khi nuôi trong điều kiện thí nghiệm và nuôi trên khay 32

4.2 Kết quả tinh sạch sơ bộ protease với tác nhân tủa là cồn 33

4.2.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa 33

4.2.2 Kết quả khảo sát thời gian tủa 35

4.3 Kết quả xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme 37

4.3.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease 38

4.3.2 Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease 39

ix

4.4 Kết quả khảo sát điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản chế phẩm protease

thu được 40

4.5 Kết quả khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân 42

4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân 43

4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzyme lên quá trình thủy phân 46

4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 48

4.9 Ứng dụng chế phẩm protease trong thủy phân bột trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn được 51

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC

HSTP Hiệu suất thủy phân

tỷ lệ tủa cồn khác nhau 34

Bảng 4.3: Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hiệu suất thu hồi hàm lượng protein ở

những thời gian tủa khác nhau 36

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính protease do chủng Ba01

tổng hợp 38

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính protease do chủng Ba01

tổng hợp 39

Bảng 4.6: Hoạt độ protease của chế phẩm thu được ở các điều kiện bảo quản và

thời gian bảo quản khác nhau 41

Bảng 4.7: Thành phần các loại đạm có trong bột trùn quế dùng để thủy phân 42 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân protein

Bảng 4.12: Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa hai sản phẩm bột đạm thủy phân

từ nguyên liệu trùn quế 52 Bảng 4.13: Hàm lượng các amino acid hòa tan có trong hai sản phẩm thủy phân 53

xii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Hoạt tính protease và hàm lượng protein của canh trường khi

nuôi cấy ở điều kiện thí nghiệm và nuôi trên khay 33

Biểu đồ 4.2: Hiệu suất thu hồi hoạt độ với các tỷ lệ tủa cồn khác nhau 34

Biểu đồ 4.3: Hiệu suất thu hồi protein với các tỷ lệ tủa cồn khác nhau 35

Biểu đồ 4.4: Hiệu suất thu hồi hoạt độ protease ở các thời gian tủa khác nhau 36

Biểu đồ 4.5: Hiệu suất thu hồi protein ở các thời gian tủa khác nhau 37

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính chế phẩm protease 41

Biểu đồ 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan 43

Biểu đồ 4.8: Ảnh hưởng của hoạt độ enzyme lên hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan 48

xiii

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính protease do

chủng Ba01 tổng hợp 39

Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính protease do chủng Ba01 tổng hợp 40

Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan 51

DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bacillus subtilis 3

Hình 2.2: B.Subtilis ở giai đoạn tạo bào tử 4

Hình 2.3: Một dạng khuẩn lạc của B.subtilis trên môi trường thạch đĩa 5

Hình 2.4: Cấu trúc bộ gene của B.subtilis 6

Hình 2.5: Natto- một sản phẩm lên men từ B.subtilis chứa nhiều protein và vitamin 10

Hình 2.6: Sơ đồ quá trình phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật 20

ấy khi ở ngoài cơ thể sống Chính nhờ đặc điểm quan trọng này mà enzyme ngày càng được ứng dụng nhiều hơn trong cuộc sống

Một nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nền công nghiệp enzyme chính là các vi sinh vật - những nhà máy sản xuất enzyme Với đặc điểm phát triển cực kỳ nhanh và có khả năng tiết enzyme ngoại bào có hoạt lực cao nên ta có thể thu được một lượng lớn enzyme trong một thời gian ngắn Ngoài ra, ta còn có thể tận dụng các phế thải của ngành công nghiệp khác để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

do đó chi phí sản xuất được giảm xuống đáng kể

Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong nhiều nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, nghiên cứu khoa học… Trong công nghiệp, protease có thể được bổ sung trực tiếp vào thức ăn nhằm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi hoặc sử dụng để thủy phân các loại protein khác nhau tạo sản phẩm chứa hàm lượng amino acid hòa tan cao để bổ sung vào khẩu phần dinh dưỡng cho người hoặc gia súc So với phương pháp thủy phân bằng acid thì việc sử dụng protease có nhiều ưu điểm hơn hẳn như: không độc hại, không làm mất đi một số amino acid trong quá trình thủy phân

Trong phạm vi và thời gian cho phép chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu thu nhận protease từ Bacillus subtilis và ứng dụng trong thủy phân protein

trùn quế”

2

1.2 Mục đích

Thu nhận protease tinh sạch sơ bộ từ Bacillus subtilis, xác định các điều kiện tối

ưu cho quá trình thủy phân protein trùn quế để thu nhận bột đạm có hàm lượng amino acid hòa tan cao

1.3 Yêu cầu

 So sánh và đánh giá điều kiện nuôi cấy thí nghiệm và pilot lên hoạt độ protease

do Bacillus subtilis tổng hợp

 Tinh sạch sơ bộ protease từ canh trường nuôi cấy Bacillus subtilis

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein trùn quế của chế phẩm protease thu được

 Ứng dụng thủy phân thử nghiệm để thu sản phẩm bột đạm có hàm lượng amino acid hòa tan cao

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis

2.1.1 Phân loại

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis

2.1.2 Đặc điểm của loài Bacillus subtillis

Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí

hay kỵ khí tùy ý Thường được tìm thấy trong đất

Có khả năng di động, sinh nội bào tử Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 đến 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 đến 3,0 μm Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang

Hình 2.1: Bacillus subtilis

(URL: http://images.dailytech.com/nimage/4011_Bacillus%20subtilis.jpg)

Khi nhuộm sơ, thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non B subtilis

không có không bào khi phát triển trên môi trường thạch có glucose Sống trên môi

4

trường thạch chứa glucose cũng tốt như trên môi trường thạch không có chứa glucose

và phát triển tốt nhất trên môi trường chứa bột đậu nành

Nang bào tử dẹp, trụ tròn, nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào Bào tử rộng 0,6 – 0,9 micron, dài 1,0 – 1,5 micron, có dạng hình elip hay hình cầu, vách bào tử mỏng, phần nhiều được tạo thành trong vòng 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo được một bào tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm

Những đặc điểm của loài trực khuẩn này cho phép chúng sống được trong nhiều sinh cảnh, bao gồm những kiểu giới hạn như cát, sa mạc, những con suối có nhiệt độ cao, môi trường đất ở Bắc Cực Ngoài ra, trong nhóm này có thể có loài ưa nóng, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa acid, ưa muối hay có thể phát triển ở những môi trường có

pH, nhiệt độ và nồng độ muối mà ít sinh vật nào có thể chịu được

Đặc điểm biến dị: theo Smith và Gordon, sự tạo thành bào tử tốt hơn nếu trên môi trường thạch thô hay thạch tinh bột có bổ sung chất chiết từ đất

Hình 2.2: Bacillus subtilis ở giai đoạn tạo bào tử

Khi cấy trên mặt thạch nghiêng có glucose, khuẩn lạc mịn, phát triển đều hơn

ở môi trường thạch không có glucose, đôi khi có màu hồng nhạt hay nâu

5

Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn lạc mọc tốt, đều, mịn

và mật độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành

Khi nuôi B subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng pepton hóa

một cách chậm chạp và làm pH môi trường chuyển sang kiềm Khi cấy ria trên mặt thạch sữa sẽ tạo vùng thủy phân casein rộng

Hình 2.3: Một dạng khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường thạch đĩa

(URL:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/f/ff/Bacillus_subtilis_colonies

jpg/200px-Bacillus_subtilis_colonies.jpg)

Trong môi trường lỏng có NaCl, B subtilis phát triển tốt ở nồng độ NaCl 7%,

một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có 10 – 12% NaCl

Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc mọc khá phong phú, uốn nếp hay gấp thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu Đặc điểm biến dị: mỏng, mềm, mịn, có vài nốt sần

Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium) Thường không sinh acid từ lactose

Thủy phân tinh bột tạo acetylmethyl carbinol Khi ủ ở 37oC cho kết quả tốt hơn khi ủ ở 32oC Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrite từ nitrate Trong điều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate

Các yếu tố về nhiệt độ: nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 – 40oC Nhiệt độ cao

nhất mà B subtilis có thể tồn tại là 50oC Tuy nhiên nhiều giống chỉ chịu được nhiệt

độ 40oC Không cần bổ sung các yếu tố phụ khác trong quá trình tăng trưởng

6

2.1.3 Cấu trúc bộ gene của Bacillus subtilis

Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B subtilis

và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn

Bộ gen của B subtilis chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4500 gen Trong số đó, chỉ

có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào

Hình 2.4: Cấu trúc bộ gene của Bacillus subtilis

(URL:http://wishart.biology.ualberta.ca/BacMap/cgview_linked_maps/NC_000

964/png/1_1.png)

2.1.4 Sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên

Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất của loài Bacillus mà chúng có thể tạo

ra những quần thể ở nhiều sinh cảnh khác nhau, từ môi trường đất, trên côn trùng và trên cơ thể người

Người ta đã chứng minh rằng các loài Bacillus có tập tính ăn lẫn nhau Chúng

dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo bào tử Nhưng cách này làm tiêu tan khá nhiều năng lượng Một

7

cách đơn giản hơn là sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh và thu lấy nội quan của chúng, giúp một số cá thể sống khỏe mạnh khác tiếp tục sống sót

để chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn

B subtilis có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ (cho

gia súc ăn) nên có tên gọi là “trực khuẩn rơm cỏ” Chúng còn phân bố rộng rãi trên bề

mặt các loại hạt và các sản phẩm chế biến từ các loại hạt đó Trong bột mì, B subtilis

chiếm khoảng 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử

Người ta nhận thấy rằng nhóm vi khuẩn B subtilis có mặt khắp nơi: các

nguyên liệu dùng để sản xuất như bột mì, bột gạo, muối hột… tới các thực phẩm

truyền thống như các loại mắm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao… B subtilis

đóng vai trò đáng kể về mặt lợi cũng như mặt hại trong quá trình biến đổi sinh học

2.1.5 Các sản phẩm từ Bacillus subtilis

B subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống

để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase, hemicellulase, glucanase…

Bảng 2.1: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và ứng

dụng

Enzyme Nhiệt độ

tối thích ( o C)

pH tối thích Phản ứng Ứng dụng α-amylase 60 5,0 – 6,0 Thủy phân liên kết

α-glucoside trong tinh bột và những polysaccharide khác tạo ra các dextrin và oligosaccharide

Trong ngành công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc…

8

β-glucanase 35 - 55 6,0 – 7,0 Thủy phân liên kết

β-1,6- glucoside của β-glucan tạo

ra những chất có phân tử lượng thấp hơn

Được ứng dụng trong ngành công nghiệp thức ăn gia súc, y dược, điều trị các bệnh về tiêu hóa

một thành phần của hemicellulose

Tăng khả năng hòa tan NPG,ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bia và thức

ăn gia súc

Hemicellulase 45 - 55 5,0 – 6,0 Thủy phân liên kết

β-1,4- glucoside của cellulose, β-1,4- glucan, α-arabinoside, 1,3-β-D-Xylans và những polysaccharide khác

Giảm độ nhớt trong tiêu hóa, tăng khả năng hòa tan NPG, tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose và giá trị năng lượng trong thức ăn,được ứng dụng bổ sung vào thức ăn gia súc

Protease 40 6,2 – 7,4 Thủy phân liên kết

peptid của protein

và các polypeptide, tạo các peptide có phân tử lượng thấp hơn, các amino acid

Được ứng dụng trong nông nghiệp, tận dụng phế liệu giàu protein, ứng dụng trong y học, công nghiệp chế biến thực phẩm, bột dinh dưỡng cho trẻ em…

9

Ngoài ra, người ta còn thu được một số kháng sinh từ B subtilis:

 Subtilin (Jansen Hirschman, 1944)

 Bacillin (Foster và Wooddruff, 1954)

 Subtenolin (Hirschhorn, Bucca và Thayer, 1948)

 Bacillomycin (Landy, Warren, Rosenman và Colio, 1948)

B subtilis còn được dùng để tổng hợp một số chất khác

2.1.6 Tác hại của Bacillus subtilis

Do có bào tử chịu nhiệt cao nên B subtilis có thể gây hỏng một số thực phẩm

hộp, làm chúng có mùi thối chua rất khó chịu

B subtilis không tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có đường

B subtilis là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa, bánh ngọt, chocolate, kẹo

có nhân, nhất là khi các sản phẩm nói trên được bảo quản ở khí hậu nóng B subtilis

gây bệnh “chảy nhớt khoai tây” và bệnh “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên năm 1885 nên từ đó chúng có tên là “trực khuẩn khoai tây”

2.1.7 Ứng dụng của Bacillus subtilis

B subtilis được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như bổ sung vào thức ăn cho gia súc B subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm

lượng khá lớn (15 – 20%) từ tinh bột nên được ứng dụng trong sản xuất lysine

Trong y dược, B subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột do lị trực trùng,

đắp các vết thương lở loét ngoài da

Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây

bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae… Người ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium) Khả năng này được ứng

dụng trong kiểm soát sinh học

Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc;

bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi

Hệ enzyme của B subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa

Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại

10

Một chủng B subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được dùng trong

sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như Cheonggukjang của Hàn Quốc

Hình 2.5: Natto - một sản phẩm lên men từ Bacillus subtilis

chứa nhiều protein và vitamin

(URL:http://www.bookmice.net/darkchilde/japan/japan/natto.jpg)

2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease

Protease có ở tất cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên, sự phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan Một số loài, cơ quan và

mô của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng

Sau khi được tổng hợp, protease có thể được tiết ra ngoài tế bào gọi là enzyme ngoại bào hoặc tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường gọi là enzyme nội bào và chỉ có thể nhận được các enzyme này sau khi đã phá vỡ tế bào

Một số protease ngoại bào đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong nông nghiệp và y học Một số vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có thể được dùng để sản xuất protease

cơ lá lách, tim, cơ thận,

dạ non( mô cơ)

- Cathepsin A, B, C và D

- Leucinaminopeptidase

- Enzyme nội bào

- Huyết tương (máu)

12

Trong các enzyme của hệ tiêu hóa, protease được nghiên cứu sớm hơn cả

 Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt

 Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzyme này

 Năm 1857, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm, nhưng chế phẩm này còn lẫn nhiều enzyme và protein khác

 Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp thụ trên colodion đã tách được trypsin với amylase tụy tạng Phương pháp hấp thụ chọn lọc của Danilevxki có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme cũng như protein

 Năm 1961, Brucke cũng tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết

 Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin)

Ngoài các enzyme tiêu hóa, người ta cũng đã có những nghiên cứu bước đầu về các protease trong máu Schmidt (1869 - 1872) đã nêu ra giả thuyết rằng trong máu

có enzyme fibrin (ngày nay gọi là frombin) tham gia trong quá trình làm đông máu Tác giả đã tách enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn so với protease động vật

 Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ một số loại hạt đậu (hạt đại mạch, bông) đều có hoạt động phân giải protein

 Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain

Đến nửa đầu thế kỷ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptide hydrolase khác như:

 Bromeline protease có trong các phần khác nhau của cây dứa (Willstatter, Grassmann, Ambros; 1926)

 Cathepsxin protease của mô cơ động vật (Willstatter Bamann, 1929)

13

 Calierein peptidyl peptide hydrolase của tuyến tụy, nước bọt (Kraut, Frey, Werk, 1933)

 Ficin protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938)

Từ 1930 đến nay, sau khi Sumner (1926) kết tinh được urease từ đậu tương, người ta đã kết tinh được hàng loạt các protease Nhờ kết tinh được enzyme, nhận được enzyme có độ tinh khiết cao nên người ta đã nghiên cứu được cấu trúc phân tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hóa lý và tính đặc hiệu của các protease Đến nay, người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease như: papain, trypsin, chymotrypsin, subtilizin… Tuy nhiên, còn nhiều vấn đề chưa rõ ràng về tính chất đặc hiệu của các protease Vì vậy, việc phân loại và xác định tên hệ thống của chúng cũng đang còn có những khó khăn nhất định

Từ 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh chế protein và enzyme nên người ta đã tách được các dạng khác nhau của nhiều protease Ví dụ như:

 Năm 1959, Ryle và Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên DEAE – cellulose đã tách được hai phần trong chế phẩm pepsin lợn là pepsin B và pepsin C Năm 1965, Ryle dùng phương pháp điện di trên gel tinh bột đã phát hiện được tính không đồng nhất của pepsin B Năm 1967, Ryle và Lee đã tách được pepsin D khỏi pepsin B

 Trước 1950, người ta đã phát hiện được cathepsin B (Fruton và Bergmann, 1939); cathepsin C (Gutmann và Fruton, 1948) từ thận và lá lách bò Nhưng mãi đến năm 1960 mới tinh chế được enzyme này Keilova và Keil (1969) đã hoàn thiện phương pháp tinh chế cathepsin B khi sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên CMC và DEAE – cephadex lọc qua gel cephadex Metrione Neves và Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel cephadex kết hơp với sắc ký trao đổi ion nhận được chế phẩm cathepsin C khá đồng nhất

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ 1918 đến 1919, Waksmann đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong những năm gần đây, số công trình nghiên cứu vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease động vật và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần

mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế

 Hiện diện trong tế bào (protease nội bào)

 Được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào)

Cho đến nay, các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào

Vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lý tưởng, vì nó có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động - thực vật do:

- Tốc độ sinh sản của vi khuẩn rất nhanh Ta có thể thu được một khối lượng lớn tế bào trong khoảng thời gian ngắn Vì thế, ta có thể sản xuất được số lượng lớn chế phẩm protease

- Hoạt tính protease của một số chủng vi khuẩn khá cao, nên khả năng phân giải protein thành các hợp chất đơn giản của chúng cao, giúp cho tế bào dễ đồng hóa

- Nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease thường rẻ tiền, dễ kiếm

- Có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để thu được hiệu suất cao trong sản xuất

- Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn các nguồn khác

Bởi lẽ đó, trong những năm gần đây các chế phẩm protease của vi khuẩn đã dần dần thay thế các chế phẩm protease lấy từ động vật và thực vật

Trong tự nhiên, thịt, cá, sữa và các hợp chất giàu đạm là môi trường lý tưởng tốt cho nhiều loài vi khuẩn có hoạt tính protease phát triển tốt

2.3.3 Phân loại protease

Căn cứ vào cơ chế phản ứng, dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, pH hoạt động thích hợp… Hartley (1960) đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

Serine protease

Gồm có 2 họ protease chính:

15

 Họ chymotrypsin: bao gồm các enzyme của động vật có vú như: chymotrypsin, trypsin, elastase…

 Họ substilisin: bao gồm các enzyme vi khuẩn như substilizin

Hai amino acid tham gia vào trung tâm hoạt động là serine và histidine

Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Cysteine protease

Bao gồm các protease thực vật như: papain, bromelin…

Trung tâm hoạt động có hai amino acid: cysteine và histidine

Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Aspartic protease

Hầu hết đều thuộc họ pepsin gồm: pepsin, chymosin và protease của vi nấm Trung tâm hoạt động có 3 amino acid: 2 aspartic acid và 1 tyrosine

Metallo protease

Bao gồm các họ protease của vi khuẩn, vi nấm

Trung tâm hoạt động có chứa nguyên tố kim loại như: Zn, Mg, Co…

Tuy nhiên, theo một số tác giả: Burgum, Prescott 1965, Moriha 1967… có nhiều protease mang tính chất trung gian giữa các nhóm kể trên, nhất là giữa nhóm 1

Dixon phân loại protease theo tác động vào vị trí liên kết peptide trong phân tử protein:

 Exopeptidase: protease cắt nối peptide ở phía đầu dây protein

 Endopeptidase: protease cắt nối peptide phía trong dây protein

Năm 1974, Morihara phân loại protease của vi sinh vật theo tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi insulin đã bị oxy hóa

cả với các gốc amino acid ở xa liên kết bị thủy giải (đặc hiệu thứ cấp)

Các enzyme trong một nhóm, có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu những ảnh hưởng giống nhau của tương tác thứ cấp Thông thường, các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp ít hơn và ngược lại Protease vi sinh vật cũng như protease thực vật không có tính đặc hiệu cao như protease động vật Do đó, dưới tác dụng của protease vi sinh vật, protein bị thủy giải triệt để hơn

2.3.4 Chức năng sinh học của protease vi khuẩn

Theo nhiều tác giả thì protease ngoại bào và protease nội bào của vi khuẩn có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật

Các nhóm protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác

có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật có thể dễ dàng hấp thụ Một số dẫn liệu cho thấy các đột biến vi sinh vật mất khả năng tiết protease ngoại bào không thể sử dụng nguồn protein làm nguồn đạm dinh dưỡng Quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình tổng hợp chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường có chứa một lượng lớn amino acid

Các nhóm protease nội bào: thường là peptidase và một số protease Các enzyme này có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào chất và chỉ tìm thấy ở môi trường xung quanh sau khi tế bào bị

17

phá vỡ Cho đến nay, các protease nội bào đang còn được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ hết vai trò của chúng trong tế bào Theo Hiroshi (1976) thì protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào Chúng có thể giúp hoàn thành một số chức năng sau:

 Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S… giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường

Sự phân giải các peptide phân tử bé còn có vai trò loại trừ tác dụng độc hại của

nó đối với tế bào vì một số peptide phân tử bé có thể là kháng nguyên gây kìm hãm

sự sinh trưởng của vi sinh vật

 Các protease nội bào có thể tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme Điều này có ý nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử

Nhiệt độ hoạt động thích hợp của protease vi khuẩn trong khoảng 30 – 50oC

Đa số hoạt độ của protease vi khuẩn mạnh nhất ở 40oC Tuy nhiên, một số protease ở vài chủng vi khuẩn có nhiệt độ hoạt động thích hợp cao hơn Nhiệt độ hoạt động thích hợp của một protease vi khuẩn không cố định mà có thể thay đổi tùy theo cơ chất, pH môi trường, thời gian tác dụng…

Ở nhiệt độ cao hơn, hoạt động của protease giảm vì nhiệt độ cao làm hỏng cấu trúc enzyme Nhiệt độ mà protease bị mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC đa số protease vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không

bị mất hoạt độ Do đó, hoạt động của protease có thể tăng lên khi tăng nhiệt độ Tuy nhiên, cũng có một số protease bị mất hoạt độ trong quá trình làm đông khô

2.3.5.2 pH

Hoạt độ protease phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường Đó là vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease

18

Đa số protease vi khuẩn bền ở pH trung tính: 6,2 – 7,4 pH thích hợp cho hoạt động của nhiều protease gần bằng 7 Điều đáng lưu ý là pH thích hợp cho hoạt động của protease ở ngoài tế bào không nhất thiết phải trùng với pH môi trường bên trong

tế bào

2.3.5.3 Thời gian hoạt động của enzyme

Thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thông thường hoạt tính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60 –

82 giờ tuy nhiên hoạt tính protease sẽ giảm dần Hoạt động protease chỉ mạnh trong

khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn Ví dụ: protease do B subtilis tổng hợp

hoạt động tốt nhất trong khoảng 46 – 68 giờ

2.3.5.4 Bản chất protease

Các protease cố định thường có hoạt độ cao hơn protease tự do vì các protease

cố định ít chịu ảnh hưởng của các chất khác trong dung dịch môi trường nuôi cấy Nói chung, protease cố định bền với các yếu tố gây biến tính hơn protease hòa tan

2.3.5.5 Chất hóa học

Dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protease: acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nồng độ cao, protease bị mất hoạt tính

2.3.5.6 Độ bền hoạt tính của enzyme

Trong công nghiệp enzyme, người ta luôn chú ý đến yếu tố quan trọng khác bên cạnh hoạt độ protease vi sinh vật, đó là độ bền hoạt tính của protease

 Serine protease

Bền trong giới hạn pH rộng hơn cả, từ 5 - 10 ở điều kiện nhiệt độ thấp Các serine protease bị mất hoạt độ nhanh chóng ở nhiệt độ lớn hơn 60oC (Keay và cộng sự 1970)

 Các metallo protease

Thường là protease của vi sinh vật, có độ bền hoạt tính thấp nhất trong các loại protease Do đó, chúng có thể bị phân hủy ít nhiều trong quá trình nuôi cấy và có thể mất hoàn toàn hoạt tính trong quá trình tinh chế (Hagihara, 1960)

Nói chung, các metallo protease bền trong phạm vi pH 6 – 9 và bị mất hoạt độ nhanh chóng khi thay đổi pH ngoài phạm vi này

19

Thêm canxi vào môi trường làm tăng độ bền của các enzyme Theo Ohta (1967), canxi có tác dụng giữ vững cấu trúc không gian thích hợp cho hoạt động xúc tác của các metallo protease Meconn (1964), Druker và Borkers (1971) cho rằng Canxi còn

có vai trò ngăn ngừa tác dụng tự phân hủy của các enzyme này Theo Tauru (1966), canxi cũng có tác dụng làm bền metallo protease đã mất kẽm Tác dụng làm bền của canxi cũng thể hiện rõ đối với Thermolysin (Tajma và tập thể, 1967)

 Các acid protease

Khá bền trong phạm vi pH acid (từ 2 – 6) Trong môi trường acid các protease này khá bền với nhiệt

2.4 Ứng dụng của protease vi sinh vật

Hiện nay, protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xử lý rác, công nghiệp, nông nghiệp, y dược, nghiên cứu khoa học…

2.4.1 Trong xử lý rác

Một trong những vấn đề cấp bách đặt ra cho các đô thị lớn là vấn đề quản lý các chất hữu cơ và rác thải Phần lớn rác thải hằng ngày được trút xuống đường phố hoặc các dòng nước, đây là nguồn gốc lây lan của bệnh tật Trong rác, vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày Các hợp chất của các ngành công nghiệp độc hại cùng tất cả rác thải lắng đọng lại đã ngấm vào đất, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe nhân dân trong vùng

Một trong những biện pháp tốt để xử lý rác có hiệu quả và kinh tế nhất là chế biến thành phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun Việc sản xuất phân bón hữu cơ từ rác nhờ vi sinh vật là 1 giải pháp có thể thực hiện được trong hoàn cảnh nước ta hiện nay

Ở đây, người ta vận dụng quá trình phân hủy chất hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên Ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy nguồn protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ

Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy triệt để protein tạo các sản phẩm đơn giản chứa nitrogen hoặc không có nitrogen: indole, scatole, phenol, acid béo, NH3,

CH4, CO2, O2 Ta có thể biểu thị quá trình phân hủy các sản phẩm thịt, cá, sữa, hạt… bằng sơ đồ sau (hình 2.6):

20

Hình 2.6: Sơ đồ quá trình phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật

Tóm lại, protease vi khuẩn giữ vai trò quan trọng trong cuộc sống con người Các nhà khoa học ngày càng khám phá được nhiều công dụng của protease vi khuẩn Protease thực sự là những nhà máy xử lý và chế biến rác hữu cơ có công suất cực kỳ lớn Mặt khác, protease góp phần cung cấp một lượng lớn dưỡng chất cho đất - chủ yếu là các chất đạm mà thực vật dễ sử dụng Rõ ràng, protease là những nhân tố quan trọng tham gia giải quyết nạn ô nhiễm môi trường - một hiểm họa toàn cầu

2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm

Protease được sử dụng trong quá trình chế biến cá Ở mang cá, đặc biệt ở ruột

cá, nguồn vi sinh vật rất phong phú Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá… protease có trong ruột cá thủy phân một phần protein của cá… Trong nhiều trường hợp, protease còn làm tăng thêm hương vị của sản phẩm

Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt sau khi chế biến Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng rõ rệt hương vị của sản phẩm

21

Phương pháp thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sậm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác

Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da… và để sản xuất các thức ăn kiêng

Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomát Protease làm phomát chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomát khác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin Vì thế, ta có thể giảm giá

thành sản xuất phomát Protease này có thể thu từ B.mesentericus

Ngoài ra, người ta còn dùng protease vi khuẩn để thu casein dùng trong các ngành kỹ thuật khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu… Protease cũng được dùng trong sản xuất chao và các dịch thủy phân

2.4.3 Trong công nghiệp nước giải khát

Protease được sử dụng để làm trong bia và nước quả Ngoài ra, protease cũng được dùng trong sản xuất rượu Ở đây nó sẽ phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột

2.4.4 Trong công nghiệp thuộc da

Protease còn được dùng để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng của da Vì vậy, da thu được sẽ mềm

và sạch lông hơn Tại Việt Nam, chế phẩm bromelin đã được ứng dụng trong thuộc da tại nhà máy da Thụy Khê – Hà Nội, kết quả sử dụng bromelin cho thấy hiệu quả sử dụng rất tốt

2.4.5 Trong mỹ phẩm

Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, kem đánh răng… do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở bệnh viện… khá tốt

2.4.6 Trong nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng

22

thức ăn, có thể tiến hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng protease để xử lý sơ bộ thức ăn

2.4.7 Trong công nghiệp dược phẩm và y học

Sản xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng Protease được sử dụng để sản xuất các thuốc tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme Protease được dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch Protease được dùng để làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp…

2.5 Sự thủy phân protein

Phản ứng thủy phân là phản ứng phân giải các chất có sự tham gia của nước Trong quá trình thủy phân protein, các phân tử protein hút nước và các liên kết peptide

bị phá hủy Trong giai đoạn đầu ta nhận được các peptide có phân tử thấp, các phân tử này lại tiếp tục được phân giải đến các amino acid (amino acid là sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân protein)

Có nhiều phương pháp khác nhau để thủy phân protein như sử dụng acid, kiềm hoặc enzyme Mỗi tác nhân có ưu nhược điểm khác nhau

2.5.1 Các phương pháp thủy phân protein

2.5.1.1 Thủy phân bằng acid

Là phương pháp thủy phân được sử dụng nhiều nhất Trong công nghiệp, thường sử dụng HCl vì HCl là acid mạnh nên sự thủy phân xảy ra nhanh hơn Ngoài

ra HCl có đặc tính bay hơi nên dễ loại ra khỏi sản phẩm sau thủy phân

Sự thủy phân protein bằng acid tuy có hiệu suất cao nhưng nếu không khống chế thời gian, nhiệt độ, nồng độ acid thì HCl sẽ trở thành tác nhân phá hủy những amino acid kém bền vừa mới sinh ra

Một nhược điểm nữa của phương pháp thủy phân bằng acid là lượng tryptophan bị mất đi đáng kể, cystine và threonine cũng bị mất một phần

Tùy theo mục đích nghiên cứu mà người ta thủy phân trực tiếp mẫu phân tích hay chiết rút protein thuần khiết ra khỏi mẫu vật rồi mới tiến hành thủy phân

23

Sau khi thủy phân bằng HCl 20% thì dung dịch thủy phân có thể được dùng để xác định hàm lượng của hầu hết các amino acid không thay thế ngoại trừ tryptophan

vì nó bị phân hủy hoàn toàn khi thủy phân protein bằng acid

Theo Diemair W và Neu H thì thời gian thích hợp để thủy phân là 12 giờ vì với thời gian này đủ để thủy phân protein hoàn toàn và các amino acid chưa bị tác động nhiều

Sự thủy phân được tiến hành bằng áp suất bình thường và nhiệt độ từ 120-

125oC trên bếp cách dầu

2.5.1.2 Thủy phân bằng kiềm

Sử dụng NaOH hoặc Ba(OH)2 để thủy phân protein Phương pháp này có tốc

độ thủy phân nhanh hơn so với thủy phân bằng acid đồng thời tránh được tryptophan

bị phân hủy Tuy nhiên sự thủy phân bằng kiềm ít được sử dụng, mà kiềm thường được dùng để định dạng tryptophan trong sản phẩm thủy phân bằng acid

Phương pháp này có nhược điểm là làm cho arginine, cystine, cystein, serine bị phân giải làm cho các amino acid mất đi hoạt tính quang học của nó Do đó, phương pháp này không áp dụng trong sản xuất công nghiệp vì không có ý nghĩa kinh tế

2.5.1.3 Thủy phân bằng enzyme

Sự thủy phân bằng enzyme diễn ra nhẹ nhàng, các sản phẩm cuối cùng được bảo vệ tốt Nhưng sự thủy phân bằng enzyme cũng có những trở ngại khiến người ta ít

sử dụng phương pháp này Ví dụ: trong sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân ngoài các amino acid là hàng loạt các peptide thấp, các peptide này có thể không bị phân giải đến cùng; ngoài ra enzyme cũng là protein nên nó cũng tự phân giải để cho

ra các amino acid

2.5.2 Những thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân

Sự thủy giải các nối peptide có thể chia thành hai pha:

Pha nhanh (pha hoạt động): xảy ra ở giai đoạn đầu Trong suốt giai đoạn này, một

số peptide bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được phóng thích vào dung dịch

Pha chậm (pha yên tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu như đi vào giai đoạn ít thay đổi đến khi xem như không còn sự thủy phân xảy ra nữa

2.6 Giới thiệu về trùn quế

24

2.6.1 Phân loại

Trùn quế còn gọi là trùn đỏ hay giun đỏ

Ngành: Annelida Lớp: Oligochaeta Bộ: Opisthopora Họ: Megascolecidae Giống: Perionyx

Loài: Perionyx Excavatus

2.6.2 Đặc điểm cấu tạo

2.6.2.1 Đặc điểm hình thái

Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, dài khoảng 10 - 15 cm, thân hơi dẹt, đường kính tròn thân 1,5 - 2 mm Trùn quế có màu từ đỏ đến màu mận chín tùy theo

độ tuổi, nhạt dần về phía bụng, con trưởng thành có màu mận chín và có sắc ánh kim

Cơ thể có hình thon dài, hai đầu hơi nhọn, bao gồm nhiều đốt

Trùn nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều

vi sinh vật cộng sinh được thải ra ngoài dưới dạng phân rất giàu dinh dưỡng

2.6.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái

Trùn quế rất hoạt động, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, có thể thích nghi ở nhiệt độ cao, độ mặn và điều kiện khô hạn, nhiệt độ thích hợp là 25 - 30oC, độ ẩm từ

70 - 80%, pH từ 7 - 7,5

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao và tỷ lệ C/N thấp thì hấp dẫn hơn Vì thế, chúng không tiêu hóa nguồn rác có tỷ lệ C/N cao như rơm, rạ, bã mục, mạt cưa, các hợp chất hóa học có gốc polyphenol, tanin, benzen, tinh dầu sẽ gây độc cho trùn

Trùn quế thuộc nhóm trùn đất chuyên chuyển hóa chất thải hữu cơ trên lớp mặt Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, nơi có nhiều chất hữu

cơ thối rữa, hiện diện ít ở các đồng ruộng canh tác, vì thế chúng không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài khác

2.6.2.3 Đặc điểm sinh sản

mm, sau 15 - 20 ngày trưởng thành, sau 2,5 tháng bắt đầu sinh sản

Trùn quế thành thục sớm (3 - 4 tháng), tái sản xuất nhanh (2 - 3 thế hệ trong 1 năm), cho sinh khối cao (nuôi đúng kỹ thuật năng suất có thể đạt trung bình từ 1 - 5 kg/m2/tháng hay 120 - 180 tấn tươi/ha/năm, khả năng chịu đựng chuyên chở tốt, đóng gói đơn giản

Trùn quế sinh sản rất nhanh, bình quân 1 lần/tuần, trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam từ 1 cặp trùn ban đầu tạo ra từ 1000 - 1500 cá thể trong 1 năm

26

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm chi nhánh công ty TNHH Gia

Tường, tỉnh Bình Dương

Thời gian thực hiện từ 04/03/2008 đến 30/07/2008

3.2 Vật liệu

3.2.1 Giống vi sinh vật

Chủng giống Bacillus subtilis 01 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm chi

nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bỉnh Dương

3.2.2 Nguyên liệu

Giá đậu, cám bắp, bã đậu nành ép dầu, bột trùn quế

3.2.3 Các môi trường dùng trong thí nghiệm

- Môi trường giữ giống: môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (phụ lục 1.1)

- Môi trường nhân giống: môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (phụ lục 1.2)

- Môi trường sinh tổng hợp protease: môi trường bắp đậu nành (phụ lục 1.3)

D-glucose, pepton, agar, NaCl, CaCO3, DAP, NaOH, H2SO4, KH2PO4,

Na2HPO4, Folin, tricloroacetic acid, casein…

3.4 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu

- Phương pháp nuôi cấy B subtilis (phụ lục 2.1)

- Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (phụ lục 2.2)

27

- Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (phụ lục 2.3)

- Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease (phụ lục 2.4)

- Phương pháp Anson xác định hoạt tính enzyme protease (phụ lục 2.5)

- Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein (phụ lục 2.6)

- Phương pháp tinh sạch sơ bộ protease (phụ lục 2.7)

- Phương pháp xác định nitrogen tổng số theo phương pháp Kjeldahl (phụ lục 2.8)

- Phương pháp xác định nitrogen formol theo phương pháp Sorensen (phụ lục 2.9)

- Phương pháp xác định nitrogen NH3 bằng phương pháp chưng cất (phụ lục 2.10)

- Phương pháp xác định độ ẩm (phụ lục 2.11)

3.5 Phương pháp thí nghiệm

3.5.1 Tinh sạch sơ bộ protease từ canh trường nuôi cấy

3.5.1.1 Khảo sát tỷ lệ thích hợp để tủa protease bằng ethanol 96%

Canh trường thu nhận được từ nuôi cấy bán rắn, tiến hành tủa để thu protease

với tác nhân tủa được chọn là ethanol 96%

Thu dịch enzyme từ canh trường Làm lạnh đồng thời dung dịch enzyme và

ethanol ở nhiệt độ 0 – 4oC

Tiến hành tủa ở các tỷ lệ khác nhau:

Cho từ từ ethanol vào dung dịch enzyme và khuấy đều, giữ lạnh trong 30 phút,

ly tâm 5000vòng/phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa

Hòa tan kết tủa thu được vào dung dịch đệm Sorensen pH 7,6 và định mức

thành 10ml Dung dịch này được xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson

và xác định hàm lượng protein theo phưong pháp Lowry Dựa vào tổng hoạt tính và

tổng hàm lượng protein trong dung dịch này để tính hiệu suất tủa và từ đó chọn được

tỷ lệ tủa tốt nhất