Khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng nấm gây bệnh cây của hoạt chấtt chiếtt xuấtt từ nhân hạt cây Neem (Azadirachta indica A.juss)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆPKHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM GÂY BỆNH CÂY CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ NHÂN HẠT CÂY NEEM Azadirachta indica A.Juss Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS

BỘ GIÁO DỤ ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP H

T XUẤT TỪ NHÂN HẠT CÂY

achta indica A.Juss)

Ệ SINH HỌC

n: NGUYỄN THỊ TUYẾT NGA

Lớp: DH04SH

Sinh viên thực hiệ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM GÂY BỆNH CÂY CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ NHÂN HẠT CÂY

NEEM (Azadirachta indica A.Juss)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS.TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN THỊ TUYẾT NGA

Tháng 09/2008

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình học tại trường

 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

 Cử nhân Nguyễn Thị Hiểu Yến, bạn Trần Châu Quang đã nhiệt tình hợp tác, chia

xẻ với tôi những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

 Các quý Thầy, các Cô, Chú, Anh, Chị đang công tác tại Viện Sinh học Nhiệt đới, đặc biệt là thầy Vũ Văn Độ đã nhiệt tình cung cấp một số tài liệu, dụng cụ thí nghiệm và đóng góp ý kiến liên quan đến đề tài

 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

 Tình yêu thương giúp đỡ của cha mẹ

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tuyết Nga

TÓM TẮT

NGUYỄN THỊ TUYẾT NGA, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đề

tài “Khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng nấm gây bệnh cây của hoạt chấtt chiếtt

xuấtt từ nhân hạt cây Neem (Azadirachta indica A.juss)” được tiến hành tại Phòng

Các Chất có Hoạt tính Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới thời gian từ ngày 01/04/2008 đến 22/08/2008 Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng kháng 2 loài

nấm gây bệnh cây Sclerotium rolfsii và Fusarium oxysporum của hoạt chất chiết xuất

từ nhân hạt cây Neem

Nội dung nghiên cứu:

Đánh giá tỷ lệ dầu thu được bằng phương pháp ép nguội từ nhân hạt Neem đã qua quá trình bảo quản 8-11 tháng

Trích ly hoạt chất sinh học từ bánh dầu Neem, định lượng azaicrachtin trong dầu Neem và trong bánh dầu Neem

Khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây đối với 2 loài nấm: Sclerotium rolfsii và

Fusarium oxysporum của dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem

Những kết quả đạt được:

Thu nhận dầu từ nhân hạt Neem bằng phương pháp ép nguội trên máy Komet Xây dựng quy trình ly trích hoạt chất limonoid từ dầu Neem và bánh dầu Neem để định lượng hàm lượng AZRL

Khảo sát hàm lượng limonoid trong Neem và bánh dầu Neem

Bước đầu đánh giá nồng độ của hoạt chất ảnh hưởng đến sự ức chế sinh trưởng nấm gây bệnh cây

So sánh được sự chênh lệch của hàm lượng limonoid trong dầu Neem và bánh dầu Neem

SUMMARY

NGUYEN THI TUYET NGA, Nong Lam university of Ho Chi Minh city The

thesis: “Surveying antifungal activity of the extracts from Neem (Azadirachta

indicaA.juss) kernels seed in inhibiting the growth of phytopathogenic”

This thesis was carried out at Bioactive Compounds Department, Institute of Tropical Biology from 04/01/2008 to 22/08/2008

The aims of this research were studying the competence of the extracts from

Neem seed in inhibiting the growth of Sclerotium rolfsii and Fusarium oxysporum

The achieved results were:

Receiving oil from Neem seed by pressing Neem seed with Komet machine Establishing the process of extracting limonoid from Neem oil and Neem cake

Surveying the concentration of limonoid in Neem oil and Neem cake

Assessing the concentration of the extracts affects the inhibiting of the growth

of phytopathogenic

Comparing the diference between the limonoid concentration of Neem oil and the limonoid concentration of Neem cake

The content of the thesis:

Accessing the rate of received oil by pressing Neem kernel by Komet machine Extract the bioactive compounds from Neem cake

Finding the concentration of limonoid of Neem oil and Neem cake

Surveying antifungal bioactivity of Neem kernel seed to two phytopathogenic fungis:

Sclerotium rolfsii and Fusarium oxysporum

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ x

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích 2

1.3.Yêu cầu 2

1.4.Giới hạn của đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Tổng quan về cây Neem 3

2.1.1.Tên và phân loại 4

2.1.2.Đặc điểm thực vật học 4

2.1.3.Phân bố địa lý .5

2.1.4.Công dụng của cây Neem 5

2.2.Sơ lược về tình hình nghiên cứu cây Neem 6

2.2.1.Trên thế giới 7

2.2.2.Ở Việt Nam 8

2.3.Hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem 8

2.3.1.Các nghiên cứu về tác dụng kháng nấm gây bệnh cây của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem 8

2.3.2.Hoạt chất triterpenoid có trong hạt Neem 9

2.4 Bệnh cây và đặc điểm của một số loài nấm

gây bệnh cây dùng trong nghiên cứu 11

2.4.1 Giới thiệu 11

2.4.2 Đặc điểm sinh học của một số loài nấm gây bệnh cây sử dụng trong nghiên cứu .12

2.4.2.1 Nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở đậu phộng [3;13;14] 12

2.4.2.2 Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng ở cây khoai tây [3;13;14] 13

2.4.3 Một số biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây do nấm [3;13;14] 14

Chương 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1.Vật liệu nghiên cứu 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Thu nhận dầu Neem và bánh dầu Neem từ nhân hạt Neem 16

3.2.2 Xác định độ ẩm nhân hạt .16

3.2.3 Li trích hoạt chất triterpenoid trong bánh dầu Neem 17

3.2.4 Li trích hoạt chất trong dầu Neem để định lượng AZRL 18

3.2.5 Xác định hàm lượng hoạt chất limonoid tổng (AZRL) bằng phương pháp so màu 19

3.2.5.1 Xây dựng đường chuẩn 20

3.2.5.2 Định lượng AZRL trong dầu Neem 21

3.2.5.3 Định lượng AZRL trong bột giàu hoạt chất AZRL 21

3.2.6 Khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây .21

3.2.6.1 Đối tượng nấm gây bệnh cây 21

3.2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính 22

3.2.6.3 Tính toán 22

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả thu nhận dầu Neem 24

4.2 Kết quả li trích hoạt chất từ bánh dầu Neem để định lượng AZRL .25

4.3.Hàm lượng AZRL trong dầu Neem và trong hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem 26

4.4.Hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây của hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem và dầu Neem 26

4.4.1.Hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm Sclerotium rolfsii 26

4.4.1.1So sánh hoạt tính ức chế sinh trưởng theo dãy nồng độ của dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem 26

4.4.1.2So sánh hoạt chất ức chế sinh trưởng theo từng nồng độ giữa dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu 27

4.4.2.Hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm Fusarium oxysporum 28

4.4.2.1So sánh hoạt tính ức chế sinh trưởng theo dãy nồng độ của dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem 29

4.4.2.2So sánh hoạt chất ức chế sinh trưởng theo từng nồng độ giữa dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu 30

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1.Kết luận 31

5.2.Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC

YES Yeast Extract - Sucrose

ĐKTN Đường kính tơ nấm theo dạng tỏa tròn

SE Sai số chuẩn

HCLT Hoạt chất ly trích

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Một số hình ảnh về cây Neem Phụ lục Hình2.2 Năm hợp chất limonoid chính 10

Hình 2.3 Một số hình ảnh của nấm Sclerotium rolfsii Phụ lục Hình 2.4.Một số hình ảnh về nấm Fusarium oxysprum Phụ lục Hình 3.1 Các công đoạn thu nhận dầu Neem thô Phụ lục

Hình3.2 Sơ đồ ly trích hoạt chất từ bánh dầu Neem 18

Hình 3.3.Sơ đồ ly trích hoạt chất limonoid từ dầu Neem 19

Hình 3.4 Đường chuẩn biểu diễn độ hấp thu vs nồng độ dung dịch Azadirachtin chuẩn y

= 8,7014 + 0,0001 20 Hình 3.5 Li trích – định lượng AZRL trong dầu Neem Phụ lục

Hình 4.1 Sơ đồ thí nghiệm 23 Hình 4.2 Bột giàu hoạt chất AZRL 25

Đồ thị 4.1 Tác dụng ức chế sinh trưởng (%) nấm Sclerotium rolfsii của dầu Neem và hoạt

chất ly trích từ bánh dầu Neem theo dãy nồng độ 27

Đồ thị 4.2 Tác động ức chế sinh trưởng (%) nấm Sclerotium rolfsii của các sản phẩm so

sánh theo từng nồng độ xử lý 28

Đồ thị 4.3 Tác dụng ức chế sinh trưởng (%) nấm Fusarium oxysporum của dầu Neem và

hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem theo dãy nồng độ 29

Đồ thị 4.4 Tác động ức chế sinh trưởng (%) nấm Fusarium oxysporum của các sản phẩm

so sánh theo từng nồng độ xử lý 30

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng hoạt chất AZRL ở các phần

khác nhau của cây Neem 11 Bảng 4.1 Kết quả thu nhận dầu Neem

bằng máy KOMET 24 Bảng 4.2 Hàm lượng AZRL trong các sản phẩm

chiết xuất từ nhân hạt Neem 26

Bảng 4.3 Đường kính tơ nấm (mm) và tác dụng ức chế sinh trưởng (%) nấm Sclerotium

rofsii 27

Bảng 4.4 Phần trăm (%) ức chế sinh trưởng nấm Sclerotium rolfsii của dầu Neem và hoạt

chất ly trích từ bánh dầu Neem theo từng nồng độ xử lý 28 Bảng 4.5 Đường kính tơ nấm (mm) và tác dụng ức chế sinh trưởng (%)

nấm Fusarium oxysporum 29 Bảng 4.6 Phần trăm (%) ức chế sinh trưởng nấm Fusarium oxysporum

của dầu Neem và hoạt chất ly trích từ bánh dầu Neem theo từng nồng độ xử lý 30

Ưu điểm của phương pháp phòng ngừa hóa học là kết quả nhanh chóng và tác dụng trên phổ rồng nên được rất nhiều nhà làm nông ưa dùng Tuy nhiên, việc lạm dụng quá mức các thuốc bảo vệ thực vật trong một thời gian dài đã dẫn đến sự mất cân bằng sinh thái, gây hại đối với những loài côn trùng có lợi, làm ô nhiễm môi trường, và nguy hiểm nhất

là sự tồn dư một lượng thuốc hóa học trong nông phẩm gây nhiễm độc cho người tiêu dùng

Do những nguyên nhân trên, các phương pháp bảo vệ thực vật có tính thân thiên với môt trường, không gây hại cho con người đã lần lượt được nghiên cứu và đưa ra ứng dụng Một trong những hương nghiên cứu đó là sử dụng các hợp chất trong tự nhiên từ cây cỏ để làm nguồn sản xuất bảo vệ thực vật

Cây Neem (Azadirachta idica A.Juss) được trồng phổ biến nhiều quốc gia trên thế

giới vì có khả năng sinh trưởng tốt ở những vùng đất thiếu dinh dưỡng và đặc biệt là các hoạt chất thứ cấp từ cây Neem có khả năng phòng trừ các loài sâu bệnh hiệu quả Cây Neem đã được du nhập vào nước ta từ khoảng năm 1981, và được trồng với diện tích khá lớn hơn 3000 ha ở các tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuân Nhân hạt Neem chứa hàm lượng dầu khá cao khoảng 35-45% và các hoạt chất sinh học trong nhân hạt không những có tác dụng gây ngán ăn và xua đuổi nhiều loài côn trùng có hại mà còn có khả năng ức chế một

số loài nấm gây bệnh cây

Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Thầy:PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng nấm gây bênh cây

của hoạt chất chiếtt xuất từ nhân hạt cây Neem (Azadirachta indica A.juss)”

1.4 Giới hạn của đề tài

Số lượng sản phẩm dùng để khảo sát hoạt tính kháng nấm còn hạn chế

Chưa so sánh được hoạt tính kháng nấm của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt Neem với các sản phẩm diệt nấm khác

Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn từ 01/04/2008 đến 22/08/2008 nên chưa khảo sát đầy đủ hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt Neem

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây Neem

2.1.1 Tên và phân loại

Tên gọi: Azadirachta indica

Bộ: Rutales (bộ cam)

Bộ phụ: Rutineae Họ: Meliaceae

Họ phụ: Meliodene Nòi: Melieae

Chi: Azadirachta

Loài: Azadirachta indica

Cây Neem có rất nhiều tên chung hoặc tên địa phương theo từng vùng Trong tiếng Anh, cây Neem có các tên gọi như Nim, Neem tree, Indian lilac, Paradise tree,… nhưng “ Neem tree” là tên gọi phổ biến nhất Cây Neem có những tên gọi khác nhau và đa dạng ở các nước trồng loại cây này lâu đời như ở Limba, Limbo ở Ấn Độ, Nimmi ở Pakistan, Dadao India ở Thailand, riêng ở Việt Nam cây Neem còn có tên gọi là xoan Ấn Độ hay xoan chịu hạn để phân biệt với cây xoan ta (Melia azedarach).[19]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

Cây Neem (Azadirachta indica) là loài cây thường xanh, cây phát triển nhanh,

chiều cao trung bình 10-20m, cây có thể cao lên tới 40 m nếu ở điều kiện thuận lợi Chu

vi trung bình của cây 2,5 m và chu vi ở điều kiện thuận lợi là 3,5 m Neem là cây có lá xanh quanh năm, nhưng ở điều kiện khắc nghiệt trong thời kỳ khô hạn kéo dài, cây có thể

bị rụng hết lá, cành bị khô gãy

Lá: lá Neem dài từ 3-8 cm, kép lông chim một lần, mép hình răng cưa

Hoa: Mọc ở cuống lá, màu trắng, có hương thơm, cuống ngắn, lưỡng tính Một hoa thường dài 5 – 6 cm, rộng 8 – 11 mm Cánh hoa rời, xếp lợp, phủ đầy lông mịn Bầu noãn

3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, đính noãn hình trụ Cây thường ra hoa vào khoảng thời gian từ tháng 3 tới tháng 5

Quả: Quả thuộc loại quả hạch, hình bầu dục, kích thước khoảng 1,4 – 2,8 x 1,0 – 1,5 cm Quả phát triển trong vòng 1 – 2 tháng Quả non có màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng Người ta thường thu hái quả trên cây để tránh giảm chất lượng khi quả rụng xuống đất

Hạt và sự nảy mầm: Hạt gồm vỏ cứng và nhân Nhân hạt chứa khoảng 35 – 45% dầu Trong điều kiện tự nhiên hạt thường rụng xuống đất và nảy mầm sau 8 – 15 ngày, tỉ

lệ nảy mầm theo dạng này rất cao [4,19]

2.1.3 Phân bố địa lý

Neem xuất hiện trên khắp các châu lục ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Neem là cây đặc trưng ở vùng phía bắc Banglades, Ấn Độ và Pakistan Parmar B.S (1986) thông báo, ở Ấn Độ có 14 triệu cây, nhưng theo một nguồn gốc tài liệu khác, ở Ấn

Độ có đến 20 triệu cây Neem được trồng rộng rãi ở hơn 30 quốc gia như Nepan, Srilanca, Iran, Quatar, bang Florida ở Bắc Mỹ, Brazil… Trong thế kỷ 20 cây Neem cũng đã được

di thực đến nhiều quốc gia thuộc khu vực Trung và Nam Mĩ, đặc biệt được trồng rất nhiều

ở Haiti, Cộng hòa Dominica và Nicaragoa Ở Châu Á, cây Neem được trồng ở nhiều nơi như Bangladesh, Burma, Cambodia, Indonesia, Malaysia, Pakistan, Thái Lan, Yemen, Trung Quốc Ở Việt Nam cây Neem được trồng từ năm 1981 [4,11,19]

2.1.4 Công dụng của cây Neem

Do cây Neem là loài cây có tính chịu hạn rất cao cho nên nó có ý nghĩa rất lớn về mặt sinh thái Trên thế giới nhiều nới trồng cây Neem với mục đích như phủ xanh đất đồi trọc, cải tạo đất hoang quá, góp phần tái sinh rừng Ngoài ý nghĩa to lớn trên, cây Neem còn đóng vai trò hữu ích trong đời sống con người với nhiều ứng dụng khác nhau Công dụng của cây Neem thể hiện trên từng bộ phận của cây

Rễ: Dịch chiết từ rễ được sử dụng làm thuốc trị bệnh ngoài da, bệnh suy nhược cơ thể

Thân cây: Thân Neem sử dụng trong trang trí nội thất rất được ưa chuộng do tính kháng nấm và chống mối mọt tốt, màu sắc đẹp Gỗ Neem sử dụng làm chất đốt cũng rất tốt

Vỏ cây: Dịch chiết vỏ cây Neem được dùng làm thuốc chữa đau răng, bệnh sốt rét, bệnh vàng da hoặc dùng trong công nghiệp nhuộm Vỏ cây có chứa nimbin, nimbidin, nimbinin nên cũng được dùng để điều chế thuốc bảo vệ thực vật và một số thuốc trị bệnh ngoài da

Lá: Lá Neem chứa nhiều hợp chất như nimbin, nimbinene, nimbadiol, nimbolide v.v… có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho người và gia súc Tại một số vùng ở Ấn

Độ, nông dân thường cho gia súc ăn lá Neem để gia tăng sự tiết sữa Nhiều nơi còn dùng

lá Neem làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán, viêm nhiễm đường ruột

Quả: Quả Neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn được hoặc sử dụng trong công nghệ lên men Quả Neem dùng làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường tiết niệu, bệnh trĩ Quả khô ngâm nước có thể trị được một số bệnh ngoài da Nước quả tươi khi phun lên cây có thể xua đuổi nhiều loài côn trùng

Nhân: Nhân hạt Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dùng làm thuốc giảm đau, thuốc sát trùng, thuốc ngừa thai Trong nhân hạt Neem có chứa rất nhiều dầu có thể sử dụng trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, xà phòng, thuốc trừ sâu và nhiều ngành công nghiệp khác

Bánh dầu Neem: Bánh dầu Neem chứa khoảng1,00 – 1,40% hợp chất sulfur, 1,5 – 2,5% N, khoảng 0,7 – 1,2% P2O5 và 1,2 – 1,5% K2O Bánh dầu Neem là nguồn phân hữu

cơ rất tốt, vừa có tác dụng cung cấp dinh dưỡng cho cây, vừa diệt được các loài tuyến trùng, kiến, mối trong đất và có khả năng ức chế quá trình nitrat hóa trong đất làm tăng hiệu quả sử dụng đạm cho cây trồng [4,19]

2.2 Sơ lược về tình hình nghiên cứu cây Neem

2.2.1 Trên thế giới

Do ứng dụng rộng rãi của cây Neem trong đời sống người dân và có mặt trong các bài thuốc dân gian ở Ấn Độ cho nên từ năm 1880 các nhà khoa học Ấn Độ đã chú ý, quan tâm nghiên cứu về cây Neem Cuối những năm 1920, các nhà khoa học Ấn Độ đã có những nghiên cứu đầu tiên về cây Neem nhưng kết quả của họ chưa được đánh giá cao

Năm 1959, nhà côn trùng học người Đức Heinrich Schmutterer nhận thấy cây Neem là cây duy nhất không bị châu chấu tấn công trong nạn dịch châu chấu ở Sudan Từ

đó ông bắt đầu quan tâm, nghiên cứu những hoạt chất có trong cây Neem

Năm 1968, Morgan và cộng sự lần đầu tiên cô lập và xác định được công thức cấu tạo của azadirachtin, hợp chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với côn trùng trong cây Neem

Tiếp theo sau đó là hàng hoạt những nghiên cứu của Siddiqui, Jacobson, Kraus Wolfgang, Saxena và các nhà khoa học trên thế giới về đặc điểm phân loại, hình thái, sinh trưởng và phát triển, về các hoạt chất trong Neem từ việc li trích, xác định công thức cấu tạo, xác định hoạt tính, ảnh hưởng của những hoạt chất này trên các loài côn trùng tới việc tổng hợp hóa học các hợp chất đó và ứng dụng trong các lĩnh vực như y sinh thái môi trường, bảo vệ thực vật, y học, trong công nghiệp mỹ phẩm v.v…

Từ năm 1980 đến năn 2005, 8 hội nghị khoa học quốc tế về Neem đã được tổ chức Qua những hội thảo này, các nhà khoa học đã khẳng định giá trị của cây Neem trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, diệt trừ sâu mọt, nấm mốc

Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ Neem cũng phát triển rất đa dạng Từ những năm 1980 đã có một số patent sản xuất các sản phẩm từ Neem đã được đăng kí tại Mỹ, Nhật Bản và các nước Châu Âu Patent đầu tiên là quy trình tách chiết các hoạt chất trong

vỏ cây của tập đoàn Terumo được đăng kí tại Mỹ năm 1983 Năm 1985 Robert Larson đăng kí tại Mỹ quy trình tách chiết các hoạt chất trong hạt Neem, năm 1988 patent này được áp dụng để sản xuất các sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật tại Ấn Độ Tính đến năm

2005, số lượng patent sản xuất các sản phẩm từ Neem chính thức đăng kí ở Mỹ là 54, ở

minh là về quy trình sản xuất thuốc bảo vệ thực vật, chăm sóc sức khỏe 13%, thuốc thú y 5%, công nghiệp 5%, mĩ phẩm 6%, còn lại là các lĩnh vực khác.[19]

2.2.2 Ở Việt Nam

Theo Nguyễn Tiến Thắng và cộng sự (2003) [10,11], tháng 2/1981 Giáo sư Lâm Công Định sau khi đi dự hội thảo về lâm nghiệp tại Senegal đã mang một số hạt giống Neem về nước và trồng tại tỉnh Bình Thuận và Việt hóa tên cây là “xoan chịu hạn” để phân biệt với cây xoan ta Sau đó một số giống xoan chịu hạn khác đã khác từ Ấn Độ đã được du nhập vào nước ta Cả hai giống này bước đầu được trồng tại hai tỉnh Ninh Thuận

và Bình Thuận, đến nay đã phát triển được hơn một ngàn hecta

Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự đã tiến hành phân lập được azadirachtin

từ hạt Neem trồng tại Việt Nam, đạt độ tinh sạch 92% và tiến hành thử nghiệm, đánh giá

tác động gây ngán ăn của hoạt chất này lên sâu khoang hại rau (Spodoptera litura) [12]

Kết quả cho thấy azadirachtin trong hạt Neem trồng tại Việt Nam có hoạt tính gây ngán

ăn khá mạnh Nhóm nghiên cứu trên cũng đã thử nghiệm xác định hoạt lực của chế phẩm HBVTV1 có thành phần chính là dịch chiết từ hạt Neem trên sâu hại rau cho thấy đạt kết quả tốt

Vũ Văn Độ và cộng sự trong năm 2004 cũng đã thực hiện tách chiết và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt Neem trồng tại Việt Nam, sử dụng dung môi chiết là ethanol và methanol Kết quả đã thu được 600 mg azadirachtin đạt độ tinh sạch 95% từ 1 kg hạt Neem [19]

Lê Thị Thanh Phượng đã khảo sát ảnh hưởng xua đuổi và làm biến và gây chết ngài gạo của dầu Neem và dịch chiết từ Neem, kết quả cho thấy dầu Neem và dịch chiết

từ Neem trồng tại Việt Nam ảnh hưởng xua đuổi, gây biến thái và gây chết rất mạnh đối với ngài gạo [14]

Vũ Văn Độ và cộng sự tiến hành khảo sát hàm lượng 3 hoạt chất chính là azdirachtin, nimbin, salanin trong dầu Neem và hạt Neem trồng tại Việt Nam đã xác định khả năng thu dầu Neem bằng phương pháp ép nguội hạt Neem đạt khoảng 29,68 đến 39,40% so với khối lượng hạt [19]

Trần Kim Qui và cộng sự (2005) tiến hành xây dựng quy trình trích li limonoid bằng dung môi hữu cơ từ lá, hạt, dầu cây xoan chịu hạn và xác định hàm lượng tổng các chất có quan hệ với azadirachtin A (AZRL), đã xác định được hàm lượng AZRL trong lá Neem khô là 0,25%; trong hạt khô 1,5%; trong dầu 0,35%; trong bột bánh dầu 0,2% [14]

Các công trình nghiên cứu về cây Neem tại Việt Nam cho đến nay chủ yếu tập trung vào việc khảo sát các đặc tính liên quan đến cây Neem trồng tại Việt Nam, trích li

và tinh sạch hoạt chất có hoạt tính sinh học từ các bộ phận khác nhau của cây Neem đồng thời đi sâu nghiên cứu và khai thác ứng dụng của cây Neem

2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem

2.3.1 Các nghiên cứu về tác dụng kháng nấm gây bệnh cây của sản phẩm chiết xuất

từ cây Neem

Ngoài tác dụng xua đuổi, tạo cảm giác ngán ăn, gây chết với các loại côn trùng gây hại mùa màng… [1,12,15,21,25].Các họat chất chiết xuất từ cây Neem còn có tác dụng ức chế sự hoạt động, sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh ở người và động vật, và hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây

Dầu Neem chiết xuất từ nhân hạt Neem có tác dụng làm giảm đáng kể sự sinh

trưởng của nấm Pyricularia ozyzae (tác nhân gây bệnh cháy lá ở lúa) trong điều kiện

in vitro [21] Dầu Neem cũng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng nấm Drechslera oryzae (gây bệnh đốm lá ở lúa), Alternaria tenuis (gây bệnh đốm lá ở rau)[27]

Nghiên cứu về việc bổ sung bánh dầu Neem vào đất đã làm giảm tỷ lệ mắc bệnh

héo rũ ở hoa Crossandra do nấm Fusarium solani, giảm quá trình tiến triển của bệnh rũ ở dừa do nấm Ganoderma lucidum, giảm tỷ lệ mắc bệnh thối rễ ở đậu nành nấm

Macrophomina phaseolina; giảm tỷ lệ chết của hạt bông vải trước và sau khi nảy mầm do

nhiễm nấm Rhizoctonia soloni [26]

Trong sản phẩm chiết xuất thô từ xoan chịu hạn bằng methanol có các hợp chất limonoid như epoxyazadiradione, azadiradione, salannin, và nimbin… Hoạt tính của từng hợp chất trên khi sử dụng riêng rẽ không cho tác dụng hoặc có tác dụng rất ít lên sự kháng nấm, nhưng khi sử dụng các hợp chất này ở dạng phối trộn hay dạng chiết xuất thô, chúng lại thể hiện họat tính kháng nấm [25]

2.3.2 Hoạt chất triterpenoid có trong hạt Neem

Các nhà khoa học đã trích ly được khoảng 300 hợp chất từ hạt Neem Nhóm hợp chất có mặt nhiều nhất(chiếm một phần 3 trong số các hoạt chất trong cây xoan chịu hạn)

là nhóm hợp chất triterpenoid Trong nhóm hợp chất triterpenoid trên, azadirachtin (AZ)

là hoạt chất được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học trên 25 năm nay do đặc tính gây ngán ăn của nói đối với ấu trùng Ngoài hoạt chất azadirachtin ra, các họat chất trong nhóm hoạt chất triterpenoid như salannin, nimbin, metratriol, nimonol, và isomeldenin có tác dụng xua đuổi, tạo cảm giác ngán ăn, diệt trứng, ấu trùng, ức chế sinh trưởng nhiều loài vi sinh vật… Các hoạt chất có hoạt tính tương tự với AZ được gọi chung là nhóm AZRL (total azadirachtin – related limonoids) hay còn gọi là nhóm hợp chất limonoid gồm có khoảng 30 hợp chất Trong AZRL có 5 hợp chất chính azadirachtin (nay gọi là azadirachtin A), salannin, nimbin, meliantriol, nimbinin Ngoài ra, nhóm AZRL còn có 10 hợp chất khác có cấu trúc sườn tương tự với azadirachtin được gọi tên là azadirachtin B, C, D, E, F, G, H, I, K, L và khoảng 15 hợp chất dẫn xuất của salannin, nimbin, meliantriol [18,22,23,24,32]

AZADIRACHTINA

R1= tigloyl ; R2 = acetyl ; R3 = OH

Hình 2.2 Năm hợp chất limonoid chính

Hàm lượng AZRL khác nhau ở các phần khác nhau của cây Neem được ghi nhận ở bảng 1.1.[19]

Bảng 2.2 Hàm lượng hoạt chất AZRL ở các phần khác nhau của cây Neem

đó gây ra, làm giảm sự phát triển và năng suất của cây trồng [20]

Các loại bệnh cây đều do những tác nhân nhất định nào đó gây ra Người ta chia các tác nhân gây bệnh cây làm hai nhóm: nhóm tác nhân phi sinh vật và nhóm tác nhân sinh vật

Tác nhân phi sinh vật gây bệnh cây là những yếu tố tự nhiên, yếu tố điều kiện ngoại cảnh bất lợi làm phát sinh quá trình bệnh lý ở cây gọi là bệnh không truyền nhiễm (bệnh sinh lý)

Tác nhân sinh vật gây bệnh cây là thể sống bao gồm các loại ký sinh vật như virus, vi khuẩn, dịch khuẩn bào, nấm cũng như các loại rong tảo, tuyến trùng

và thực vật thượng đẳng ký sinh Những sinh vật này gây ra bệnh, gọi là bệnh truyền nhiễm [20]

Để phòng trừ bệnh cây người ta sử dụng biện pháp bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học phòng trừ bệnh cây nhằm nâng cao năng suất, phẩm chất cây trồng, góp

phần bảo vệ môi trường và là cơ sở phát triển cho một nền nông nghiệp sinh thái bền vững Phòng và trừ là hai mặt không tách rời nhau của việc bảo vệ cây trồng Phòng bệnh là việc áp dụng các biện pháp có tác dụng ngăn ngừa sự lây nhiễm ban đầu của vật ký sinh và tăng cường sức sống, sức đề kháng cho cây trồng Chữa trị bệnh (trừ bệnh) là việc áp dụng các biện pháp chủ yếu tác động trực tiếp đối với tác nhân gây bệnh nhằm loại bỏ hoặc ức chế sự hoạt động của chúng Phòng bệnh là chính, trừ bệnh phải kịp thời, phải kết hợp giữa phòng và trừ bệnh cây trồng trong hệ thống quản lý dịch hại tổng hợp [20]

2.4.2 Đặc điểm sinh học của một số loài nấm gây bệnh cây sử dụng trong nghiên cứu

2.4.2.1 Nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở đậu phộng

b Đặc điểm sinh học của nấm Sclerotium rolfsii

Nấm S.rolfsii có sợi nấm trắng phát triển, đa bào, hạch non màu trắng, hạch già màu nâu, tương đối tròn đồng đều có đường kính 1-2 mm Nấm S.rolfsii là loại nấm đa

thực, phạm vi ký chủ rộng, phá hoại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có những cây trồng quan trọng như khoai tây, cà, đậu, đay, thuốc lá

Nấm S.rolfsii phần lớn có nguồn gốc trong đất, trong tàn dư của cây bệnh trong

phân rác Nó còn tồn tại trong nông phẩm ví dụ ở của khoai tây và hạt đậu phộng

Nấm S.rolfsii trực tiếp xâm nhập qua vết thương ở biểu bì mà phát triển thành

đám sợi trắng ở cổ rễ, gốc thân làm mô bệnh bị thối mục và làm cây chết khô Nấm

S.rolfsii phá hoại tia củ đậu phộng trong đất, làm tóp thối củ, làm hại mốc, mất sức

nảy mầm khi gieo và làm cây bị bệnh

Bệnh héo rũ phát triển mạnh ở điều kiện canh tác có nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt, làm cây sinh trưởng kém Bệnh tồn tại trong suốt quá trình phát triển của cây,