XÂY DỰNG KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY THANH THẤT (Ailanthus triphysa)

Nuôi cấy in vitro - Môi trường Murashige và Skook cải tiến 1/2 MS với nồng độ khoáng đa lượng còn 1/2 thích hợp với việc nhân chồi và tạo rễ cây Thanh thất in vitro.. ...19 Thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH

CÂY THANH THẤT (Ailanthus triphysa)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2004 - 2008

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THÀNH DANH

Tháng 9/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY

THANH THẤT (Ailanthus triphysa)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN NGUYỄN THÀNH DANH

Tháng 9/2008

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

 TS Vương Đình Tuấn đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 Cô Chu Thị Thanh Vân người đã không tiếc công sức chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

 Công lao to lớn của cha mẹ đã không ngại cực khổ để nuôi con khôn lớn và cho con được ăn học tới ngày hôm nay

 Cảm ơn KS Phạm Văn Bốn, KS Nguyễn Xuân Cường, KS Lê Vũ Huyền Thanh đã giúp đỡ tôi rất nhiều và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Tôi cũng xin gởi lời cám ơn đến chị Hương, anh Nam

 Các bạn bè thân yêu của tôi đã chia sẻ cùng tôi bao khó khăn trong lúc thực tập

Sinh viên thực tập

Nguyễn Thành Danh

TÓM TẮT

Nguyễn Thành Danh , Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2008 “Xây

dựng kỹ thuật nhân giống vô tính Thanh thất (Ailanthus triphysa)” Đề tài được

tiến hành từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008 tại Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ

Giáo viên hướng dẫn: TS Vương Đình Tuấn

Nội dung

1 Nhân giống vô tính Thanh thất trong điều kiện in vitro Sử dụng chồi nách và hạt

Thanh thất làm nguồn vật liệu ban đầu

2 Nhân giống vô tính bằng giâm hom trong điều kiện iv vivo Tiến hành trên cây

Thanh thất một tuổi, bốn tuổi và sáu tuổi

Kết quả

1 Nuôi cấy in vitro

- Môi trường Murashige và Skook cải tiến (1/2 MS) với nồng độ khoáng đa lượng

còn 1/2 thích hợp với việc nhân chồi và tạo rễ cây Thanh thất in vitro

- Trong tạo chồi chất điều hòa sinh trưởng là Benzyl adenine (BA) với nồng độ là 3mg/l cho hiệu quả tạo chồi cao

- Sự tạo rễ chồi được tiến hành trên môi trường ½ MS bổ sung Indol butyric acid (IBA) nồng độ 0,5 mg/l cho kết quả tốt nhất

SUMMARY

Nguyen Thanh Danh Nong Lam University, HCM city, September, 2008

“Development of propagation techniques of Ailanthus triphysa” The thesis was

studied from 3/2008 to 9/2009 at the Forest Science Sub-lnstitute of South Vietnam

Supervisor: Ph.D Vuong Dinh Tuan

Contents

1 In vitro propagation of Ailanthus triphysa has been studied Axillary and seed

were used as the rearched materials

2 In vivo propagation of Ailanthus triphysa

Results

1 In vitro propagation

- A haff-strength of Murashige and Skoog basal medium was observed as the

best medium for shoot and root induction

- Among the various cytokinins supplemented to the basal medium, N6

-benzylladenine (BA) at 3,0 mg/l was better for shoot production

- Rooting of microshoots was successfully accomplished in a half-strength of

Murashige and Skoog medium supplemented with 0,5 mg/l indole-3-butyric acid

2 In vivo propagation

- In vivo propagation of Ailanthus triphysa was successfully obtained by treating

the cut branhes of one year old sapling with IBA (100 ppm) and a result of

eighty - nine percentage root induction was recorded

- However, in order to reduce the cost of rooted seedling, a dose of 2,5 mg/ml of

a commercial rooted products (N3M) was also recommended with high percentage of root induced, seventy – eight percentage

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

CHƯƠNG 1 :MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 1

1.2.1 Mục đích 1

1.2.2 Yêu cầu 1

1.3 Giới hạn đề tài .2

1.4 Thời gian và địa điểm 2

CHƯƠNG 2 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Thanh thất (Ailantus triphysa) 3

2.1.1 Vị trí và phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Giá trị kinh tế 3

2.1.4 Tình hình nghiên cứu 4

2.2 Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro 5

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng 6

2.3.1.Chất điều hoà sinh trưởng 6

2.3.2 Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng 6

2.4 Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống thực vật in vivo 8

2.4.1 Khái quát về kỹ thuật giâm hom 8

2.4.2 Các yếu tố quan trọng trong giâm hom 8

CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 11

3.1.1 Vật liệu 11

3.1.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ 11

3.1.1.2 Môi trường nuôi cấy 11

3.1.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro 111

3.1.3 Môi trường nuôi cấy in vitro 12

3.1.3.1 Vật liệu 12

3.1.3.2 Phương pháp khử trùng mẫu 12

3.1.3.3 Cấy mẫu 12

3.1.4 Phương pháp thí nghiệm 12

3.1.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của một số môi trường nuôi cấy cơ bản đến khả năng sống và ra chồi của mẫu thân 14

3.1.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại chất kích thích sinh trưởng trên môi trường 1/2MS đến sự phát sinh chồi 14

3.1.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thanh thất in vitro 14

3.2 Phương pháp giâm hom in vivo 14

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 14

3.2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 14

3.2.2 Thí nghiệm 15

CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thí nghiệm in vitro

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của một số môi trường nuôi cấy cơ bản đến khả

năng sống và ra chồi của mẫu thân .16

Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng của các loại chất kích thích tăng trưởng trên môi trường 1/2MS đến sự phát sinh chồi .17 Thí nghiệm 3 : Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ

của chồi Thanh thất in vitro 19 Thí nghiệm in vivo

Khảo sát ảnh hưởng các loại chất kích thích ra rễ tác động đến khả năng ra rễ của cây

Thanh thất trong điều kiện in vivo 20

Thảo luận 22 CHƯƠNG 5: NHẬN XÉT VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Nhận xét 23 5.2 Đề nghị 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IBA : Indol butyric acid

2,4-D : 2,4-Dichlorophenol acetic aicd

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 kết quả nuôi cấy mẫu thân trong các loại môi trường cơ bản khác nhau sau 5 tuần theo dõi 16 Bảng 4.2 Kết quả tạo chồi trong môi trường có chất điều hòa sinh trưởng sau 5 tuần theo dõi 17

Bảng 4.3 Kết quả theo dõi khả năng ra rễ của cây Thanh thất in vitro trên môi trường

½ MS 19 Bảng 4.4a Kết quả theo dõi việc tạo rễ mẫu hom cây Thanh thất 1 tuổi 20 Bảng 4.4b Kết quả theo dõi việc tạo rễ mẫu hom cây Thanh thất 4 tuổi 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Sự nẩy chồi trong môi trường ½ MS 17

Hình 4.2 Sự tạo chồi ở các môi trường khác nhau 18

Hình 4.3 Rễ Thanh thất in vitro 19

Hình 4.4 Hom Thanh thất tạo rễ sau 42 ngày theo dõi 21

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề

Cây Thanh thất (Ailanthus triphysa) (Dennst) Alston là một loài cây gỗ có giá

trị kinh tế với nhiều ứng dụng trong một số ngành sản xuất như : sản xuất diêm, đóng tàu, và dược phẩm…Thanh thất có khả năng sống và thích nghi tương đối rộng đặc biệt là khả năng chịu được khô hạn Vì vậy Thanh thất nên được đưa vào cơ cấu trồng rừng ở một số tỉnh như : vùng duyên hải miền trung, nam Tây nguyên, và miền Đông nam bộ Để chủ động cung cấp nguồn cây giống Thanh thất chất lượng cao cho việc trồng rừng việc tìm ra các biện pháp nhân giống vô tính hỗ trợ cho kỹ thuật nhân giống

hữu tính là hết sức cần thiết Do đó đề tài :“Xây dựng kỹ thuật nhân giống vô tính

cây Thanh thất (Ailanthus triphysa) ” được tiến hành

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nhân giống vô tính in vitro

- Bước đầu xác định môi trường nuôi cấy cơ bản và một số sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thích hợp cho nhân giống Thanh thất trong điều

kiện in vitro

Nhân giống vô tính in vivo

- Bước đầu tìm được chất kích thích ra rễ thích hợp để tạo rễ và cây hoàn

chỉnh

1.2.2 Yêu cầu

Nhân giống vô tính in vitro

- Môi trường nuôi cấy và chất ĐHST có hiệu quả tốt trong tạo cây in vitro Nhân giống vô tính in vivo

- Tỉ lệ ra rễ cao

- Rễ phát triển tốt

- Cây tạo được khỏe mạnh, có thể trồng ra hiện trường sau giai đoạn vườn ươm

1.3 Giới hạn đề tài

Do thời gian có hạn nên chưa thực hiện được thí nghiệm đưa cây con Thanh

thất in vitro ra vườn ươm và chưa khảo sát được sự phát triển của cây giâm hom trồng

ngoài hiện trường

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2008 đến tháng 8/2008 tại Phân viện Khoa học Lâm nghiệp Nam bộ, số 1 – Pham Văn Hai - Phường 1 -Quận Tân Bình- Tp.Hồ Chí Minh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây Thanh thất (Ailantus triphysa)

Thanh thất (Ailanthus triphysa) là cây đại mộc cao khoảng 15 - 20m, đường

kính khoảng 1,2m vỏ trắng, lá dài 40 - 60cm, thể diệp không tuyến, không lông mặt trên,có lông hoe hay vàng mặt dưới.Chùm tụ tán ở nách lá,dài 25 - 45cm, hoa cao 5 –

6 mm,đơm thành chùm,cánh hoa 5,tiểu nhụy 10, nhụy cái lép Dực quả không lông,láng,dài 5-8 cm,hột tròn dẹp Vỏ xám nâu, có mùi hắc Lá kép lông chim 1 lần lẻ, dài từ 50-100cm, thường tập trung ở đầu cành Cuống lá mầu nâu hồng phủ lông mềm, rải rác đốm nâu nhạt Lá chét 11 - 35 đôi, mọc gần đối, các lá chét ở giữa tương đôi lớn Phiến lá hình trứng ngọn giáo, đầu nhọn dần, đuôi lệch, dài 7 - 12cm, rộng từ 2 - 4,5 cm, mép nguyên, nách gân lá phía gốc có 1 túm lông nhỏ Cuống lá chét dài 0,5-1cm Lá rụng có mầu đỏ Hoa tự hình chùm viên chuỳ ở đầu cành hay nách lá Hoa tạp tính, đài hợp gốc, phía ngoài phủ lông Cánh tràng 5 xếp vòng, mầu xanh vàng Nhị mười, dài băng cánh tràng Quả kín có cánh, dài 5,5 cm, rộng 1,7 cm, cuống dài 2 cm Cây ưa sáng thường mọc ở ven rừng hoặc chỗ trống Cây có khả năng chịu hạn tốt Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng thứ sinh ở các tỉnh từ Bắc tới Nam.( Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000))

Cây Thanh thất được trồng chủ yếu ở Ấn Độ Phân bố ở độ cao 60 – 1500 m so với mực nước biển Nhiệt độ trung bình năm 27oC, lượng mưa trung bình năm 1920

mm Thích hợp với đất pha cát, thoát nước tốt (www worldagroforestrycentre org)

2.1.3 Giá trị kinh tế

Thanh thất là cây đa tác dụng Gỗ Thanh thất có thể dùng để đóng tầu, sản xuất diêm, bè cá, phụ tùng vũ khí,… Ngoài ra, Thanh thất còn được trồng làm cảnh, lấy bóng mát (www worldagroforestrycentre org)

Ở Ấn Độ, cây Thanh thất là một trong những cây quan trọng trong ngành sản xuất diêm và gỗ dán Trong số 14 loài cây có thể sản xuất gỗ dán ở Ấn Độ, thì gỗ Thanh thất cho chất lượng tốt nhất Ở những nơi công nghiệp gỗ và công nghiệp ván bị thiếu hụt nguyên liệu người ta đang tiến hành trồng thâm canh cây Thanh thất với chu

kì 10 năm Chương trình Lâm nghiệp xã hội của chính phủ một số bang cũng rất chú trọng đến việc phát triển cây Thanh thất để cung cấp nguyên liệu cho ngành sản xuất diêm (www.fao.org)

Thanh thất còn là cây quan trọng việc trồng rừng.Vỏ cây, nhựa cây, rễ cây có khả năng chữa bệnh có giá trị làm thuốc.Tán lá của cây có thể được dùng làm phân

bón hay thức ăn cho gia súc

2.1.4 Tình hình nghiên cứu

Trong nước

Mặc dù là cây có giá trị kinh tế khá cao nhưng việc nghiên cứu về cây Thanh

thất (Ailanthus triphysa) ở nước ta còn rất hạn chế

Năm 1998, Trung tâm Giống và Kỹ thuật giống cây trồng Phú Yên đã tiến hành thu hái hạt ngoài tự nhiên gieo ươm và trồng thử nghiệm thành công tại Trạm thực nghiệm giống Lâm nghiệp Bình Kiến (TP Tuy Hoà)

Năm 2002 Phân viện KHLN Nam Bộ trồng thử nghiệm 4 ha cây Thanh thất tại Trạm Thực nghiệm Lâm nghiệp Tân Phú, thuộc xã Tân Hòa – Đồng Phú – Bình

Phước Phương thức trồng thuần loài

Trên thế giới

Trên thế giới có khá nhiều kết quả nghiên cứu về cây Thanh thất (Ailanthus triphysa) tập trung chủ yếu ở vùng cận xích đạo mà chủ yếu là ở Ấn Độ

- Nhân giống vô tính in vitro cây Thanh thất, bằng phương pháp sử dụng các

cotyledonary (D`Silva và D`Souza (1992)).Nhưng nghiên cứu này chưa thành công.-

Nghiên cứu nhân nhanh cây Thanh thất trong điều kiện in vi tro Natesha và

Vijayakumar.(2000) đã sử dụng chồi nách cây Thanh thất 3, 4 tuổi Tác giả đã ghi nhận: môi trường MS có bổ sung BA (3mg/l) cho khả năng tạo chồi cao, chồi Thanh thất ra rễ tốt nhất khi tiến hành trên môi trường ½ MS có bổ sung IAA(4mg/l) và IBA (0,4 mg/l)

2.2 Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của

cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất

Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nguồn gene quý hiếm

Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng nuôi cấy một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo sẽ được tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất Từ những thập niên 30 của thế

kỷ 20, người ta đã nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt, 1939) Các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe,

1980, 1988) Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ

của các nhân tố nói trên, hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986)

2.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật Ở nước ta ngành này đã được nghiên cứu và phát triển từ những năm 70 của thế

kỷ 20 Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển trên cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:

- Đó là tính toàn năng (totipotency) của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác

để phục tráng các giống cây có giá trị kinh tế cao

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực, cây cảnh, cây lâm nghiệp

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống

- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa

- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thế của tế bào

Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật

2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng

Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật

Về đại cương các chất điều hòa sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất

kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy in vitro thì sự

cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng với nhau là điều cần thiết

2.3.2 Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng

Hiện nay 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trưởng

Auxin

Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực

Chức năng của auxin

- Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thước của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào như cellolose, pectin…

- Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới

- Kích thích sự hình thành rễ

Auxin làm tăng độ kéo dài của tế bào do tác động của chúng lên vách tế bào (Torry và csv, 1981) Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993)

Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981) (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Cytokinin

Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003) Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô

Đặc điểm của cytokinin

Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng ngọn và hướng gốc Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure

Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và BAP

Chức năng của cytokinin

- Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào

- Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi

- Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa

- Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn

Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi

Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián

tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro Một tỷ lệ

thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước

Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo

mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì tùy vào mẫu cấy và yêu cầu của từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng được dùng một cách hợp lý

2.4 Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống in vivo

2.4.1 Khái quát về kỹ thuật giâm homGieo hạt là một kỹ thuật được sử dụng

rộng rãi trong lĩnh vực nông lâm nghiệp nhưng nó cũng không phải thích hợp cho tất

cả các loại cây nhất là cây gỗ Do vậy để đảm bảo, nâng cao chất lượng của các cây con người ta thường sử dụng các kỹ thuật nhân giống sinh dưỡng (bao gồm giâm hom

và nuôi cấy in vitro)

Trong giâm hom, một phần của cây được tách rời khỏi cây mẹ sẽ được tạo rễ

và chồi, sau đó tạo cây hoàn chỉnh (Dương Công Kiên, 2002)

2.4.2 Các yếu tố quan trọng trong giâm hom

Chọn cây mẹ

Đây là một yếu tố rất quan trọng cần được chú ý Khả năng tái sinh, phát triển của cây con phụ thuộc rất lớn ở việc chọn gốc mẹ Khả năng giâm hom cũng tùy thuộc vào loài thực vật thậm chí ngay trong một giống cây hay một loài; các cá thể cũng cho phản ứng ra rễ khác nhau Để có hiệu quả cao, ben cạnh những đặc điểm vượt trội nên chọn cây có phản ứng ra rễ tốt với các kích thích tố bên ngoài

Giá thể trồng

Sự ra rễ bắt đầu từ bên trong giá thể mà thành phần giá thể cần đảm bảo một số yêu cầu.Giá thể được sử dụng như chất đỡ cơ học đối với đoạn hom nhưng cũng cần giữ được ẩm độ và độ thoáng khí cần thiết cho sự sống và sự ra rễ của cành giâm

Có nhiều vật liệu được sử dụng làm giá thể bao gồm: các chất thoát nước (cát, perlite, polystyrene); các chất cho phép sự thoáng khí (perlite, silicate); các chất giữ nước (đất mùn, vermiculite) Để có một giá thể tốt người ta thường trộn các chất này

lại với nhau để tao hỗn hợp thích hợp cho loại cây mong muốn

Chất kích thích tăng trưởng

Trong giâm hom, đoạn hom được nhúng vào các kích thích tố (auxin) để kích thích quá trình ra rễ, khả năng phát triển của mẫu

Các loại auxin thông dụng đuợc sử dụng rộng rãi bao gồm:

 IAA (Indole-3-acetic acid): chất tự nhiên rất hoạt động Rất dễ bị phân hủy, di chuyển nhanh trong cây Thường được sử dụng ở nồng độ cao

 IBA (Indole-3-butyric acid): ổn định hơn, ít hòa tan, di chuyển kém dễ dàng hơn trong các mô, hoạt động tại chỗ Hiệu quả và được dùng ở nồng độ thấp hơn

 NAA ( -Naphtalene acetic free acid): gần giống tính chất của IBA nhưng

nó cần được sử dụng thận trong hơn do ranh giới an toàn giữa liều hữu ích và độc hại

rất hẹp, phổ hiệu quả của nó hơi khác và người ta sử dụng nó tùy theo loài cây

Ngay sau khi được xử lý hormone, các cành giâm được cấy vào giá thể ra rễ,

và giữ trong điều kiện độ ẩm bão hòa , thích hợp cho việc kích thích tạo rễ

Môi trường xung quanh nuôi nhân hom

 Nhà lưới: giâm hom được tiến hành trong nhà lưới có độ phủ bóng râm, tránh ánh sáng và gió trực tiếp, duy trì ẩm độ cao, tạo điều kiện cho cành hom ra rễ và phát triển tốt nhất

 Ẩm độ: điểm chính yếu cần tránh là sự mất nước của mẫu hom từ lúc trích lấy cho đến lúc thành cây hoàn chỉnh Thực tế việc khô héo sẽ ảnh hưởng đến sự ra rễ hoặc thậm chí dẫn đến việc chết của các mẫu hom Do đó việc duy trì ẩm độ bằng các phương pháp khác nhau là hết sức cần thiết

 Nhiệt độ: sau ẩm độ nhiệt độ là vấn đề quan trọng cần quan tâm Nhiệt độ của giá thể cần được duy trì hợp lý để kích thích tạo rễ (cần lưu ý nhiệt độ cao sẽ làm cho hệ vi sinh vật phát triển và gây ra việc thối nhũn cây)

 Ánh sáng: Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh là việc ra rễ được hoàn hảo hơn một khi thực vật giâm hom nhận được một số lượng quan trọng hơn về ánh sáng Sự cải thiện này là do sự gia tăng hoạt động quang hợp, hàm lượng chất glucide tan cao hơn và dẫn đến việc ra rễ tốt hơn

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Hạt và cây Thanh thất được thu từ trạm thực nghiệm lâm nghiệp Tân Phú của phân viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Nam bộ

3.1.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, …

Dụng cụ: panke, kéo, dao cấy, ống nghiệm, bình thuỷ tinh, đĩa petri, đèn cồn…

3.1.1.2 Môi trường nuôi cấy in vitro

- Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường Murashige và Skoog (1962, MS) cải tiến, Llooyd và McCown (1981, WPM), Gupta và Durzan (1985, DCR) Trong đó môi trường ½ MS là môi trường MS mà thành phần đa lượng được giảm đi một nửa

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng là BA, IBA (mg/l)

3.1.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày

Nhiệt độ 25  2oC

Cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux