KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN CHUYỂN VÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY PHONG LAN Dendrobium, CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum) CHUYỂN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN CHUYỂN VÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN CHUYỂN

VÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT

TRIỂN CÂY PHONG LAN Dendrobium, CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum)

CHUYỂN GEN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004-2008

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN KIM THOA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN CHUYỂN VÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT

TRIỂN CÂY PHONG LAN Dendrobium, CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum)

CHUYỂN GEN

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS.NGUYỄN HỮU HỔ NGUYỄN KIM THOA

KS LÊ TẤN ĐỨC

ThS NGUYỄN VŨ PHONG

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

 Tiến sỹ Nguyễn Hữu Hổ, Kỹ sư Lê Tấn Đức- Phòng Công Nghệ Gen- Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện

 Thạc sỹ Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường cũng như thực tập tốt nghiệp

 Các cô chú, anh chị cán bộ phòng Công Nghệ Gen -Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, tạo điền kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

 Các bạn bè thân yêu của lớp DH04SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Sinh viên thực hiện Nguyễn Kim Thoa

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN KIM THOA, ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ

MINH, tháng 9/2008 “KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN CHUYỂN

VÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỀN CỦA CÂY LAN

Dendrobium VÀ CÂY CÚC Chrysanthemum”

Đề tài được tiến hành tại Phòng Công Nghệ Gen - Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh

Hướng dẫn khoa học:

- TS Nguyễn Hữu Hổ, KS Lê Tấn Đức (Viện Sinh học Nhiệt đới)

- ThS Nguyễn Vũ Phong (Đại học Nông Lâm TP.HCM)

Nội dung nghiên cứu

- Kiểm tra sự hiện diện của gen gfp (phát sáng), gen ipt (chống lão hóa), gen gusA, gen kháng hygromycin bằng phương pháp PCR và phương pháp hóa

mô tế bào (đối với gen gusA)

- Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây phong lan và cây cúc chuyển gen trong nhà kính

Kết quả thu được

 Kiểm tra kết quả chuyển gen

- Có hiện diện của các gen chuyển như gen gus, gen gfp, gen kháng hygromycin, gen ipt thông qua sản phẩm PCR

- Phương pháp hóa mô tế bào cho kết quả nhuộm GUS với mẫu phong lan

Dendrobium nhưng không xuất hiện rõ ràng ở cây hoa cúc Chrysanthemum

mặc dù kết quả PCR cho thấy có sự hiện diện của gen này

- Chưa kiểm tra được biểu hiện của gen gfp và gen ipt vì chưa tạo hoa

 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển

Khả năng tăng trưởng của các nghiệm thức lan Dendrobium không có sự khác

biệt Tuy nhiên, các cây cúc chuyển gen sinh trưởng và phát triển tốt hơn, có sự khác

SUMMARY

NGUYỄN KIM THOA, Nong Lam University, “Detection the attendance of the

transferred gene and survey the growth and development of Dendrobium and Chrysanthemum ”, September, 2008 This thesis was carried out at the Gene technology

laboratory, Institute of Tropical Biology, Ho Chi Minh City

 Dectection of transferred gene

- The attendance and expression of transferred genes as gus gene, gfp gene, ipt gene, anti- hygromycin gene was confirmed by PCR

- In Dendrobium, result of gus activity assay is clear but it disappear in Chrysanthemum samples

- Flowers are not available for transferred genes expression

 Survey the growth and development of transgenics plants

We have the equivalence in growth for solutions in Dendrobium research However, in Chrysanthemum, transgenics plants develop better than non-transgenics

plants

MỤC LỤC

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt khóa luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các biểu đồ xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về cây phong lan Dendrobium 3

2.1.1 Sơ lược về cây phong lan Dendrobium 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3 Các tác động ngoại cảnh ảnh hưởng đến cây lan Dendrobium 6

2.1.4 Giá trị sử dụng 7

2.2 Sơ lược về hoa cúc (Chrysanthemum) 8

2.2.1 Vị trí phân loại 9

2.2.2 Nguồn gốc 9

2.2.3 Đặc điểm hình thái 10

2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh thái 11

2.2.5 Sâu bệnh 11

2.2.6 Giá trị văn hóa, dược liệu và kinh tế 11

2.3 Một số kết quả nghiên cứu về gfp 13

2.3.1 Tổng quan về GFP 13

2.3.2 Một số thành tựu trong công tác nghiên cứu chuyển nạp gen phát sáng gfp trong những năm gần đây 16

2.4.3 Những nghiên cứu chuyển gen ipt ở cây trồng 21

2.5 Tạo cây phong lan Dendrobium và cây hoa cúc chuyển gen 22

2.5.1 Tạo cây phong lan Dendrobium chuyển gen: 22

2.5.2 Tạo cây hoa cúc chuyển gen 23

2.6 Phương pháp kiểm tra gen chuyển 24

2.6.1 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 24

2.6.2 Phương pháp hóa mô tế bào (phương pháp thử GUS) 27

2.7 Kết luận 28

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 29

3.2 Vật liệu thí nghiệm 29

3.2.1 Giống 29

3.2.2 Hóa chất, thiết bị và vật liệu cần thiết 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Nội dung 1: Kiểm tra kết quả chuyển gen 30

3.3.1.1 Xác định sự hiện diện của gen bằng kỹ thuật PCR 30

3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây phong lan và cây cúc có chuyển gen 32

3.4.2.1 Bố trí thí nghiệm 32

3.4.2.2 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả ly trích DNA mẫu 35

4.2 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng phương pháp PCR: 35

4.3 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng phương pháp hóa mô tế bào (phương pháp thử GUS) 37

4.4 Kết quả khảo sát quá trình sinh trưởng và phát triển của cây có gen chuyển 38

4.4.1 Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Dendrobium 38

4.4.1.1 Chiều cao và tốc độ tăng trưởng chiều cao cây 38

4.4.1.2 Số lá và tốc độ ra lá của cây 40

4.4.1.3 Số giả hành và tốc độ tạo giả hành 41

4.4.2 Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây cúc Chrysanthemum 47

4.4.2.1 Động thái tăng trưởng chiều cao và tốc độ tăng trưởng chiều cao cây 47

4.4.2.2 Số lá và tốc độ ra lá của cây 49

4.4.2.3 Khả năng phân cành và chiều dài cành 51

4.4.2.4 Hoa của cây 53

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.1.1 Kiểm tra kết quả chuyển gen 55

5.1.2 Quá trình sinh trưởng và phát triển 55

5.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 gfp: green fluorescent protein

 bp: base pair

 PCR: polymerase chain reaction

 DNA: Deoxyribonucleic acid

 Taq: Thermus aquaticus

 TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid

 TE: Tris ethylene diamine tetra acetate

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Một số loại lan Dendrobium 4

Hình 2.2: Cúc Đại Đóa hoa vàng 9

Hình 2.3: Sứa Aequorea victoria 13

Hình 2.4: Green fluorescent protein 14

Hình 2.5: Cấu trúc của gfp 15

Hình 2.6: Cấu trúc của Fluorophone 15

Hình 2.7: Cơ chế phát sáng của Fluorophone 16

Hình 2.8: Chuột phát sáng 16

Hình 2.9: Một con lợn chuyển gen màu xanh bên cạnh con lợn thường 17

Hình 2.10: Tim phôi chuột phát sáng 18

Hình 2.11: Bướm phát sáng 18

Hình 2.12: Biểu hiện ipt trong các con đường tạo cytokinin 20

Hình 2.13: Bản đồ giới hạn vector plasmid pCAMBIA 1303 23

Hình 2.14: Chuyển gen bằng súng bắn gen 23

Hình 2.15: Sơ đồ mô tả sự chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium 24

Hình 4.1: Kiểm tra bằng PCR sự hiện diện của gen gfp trong cây phong lan 35

Hình 4.2: Kiểm tra bằng PCR sự hiện diện của gen gus trong 36

Hình 4.3: Kiểm tra bằng PCR sự hiện diện của gen kháng hygromicin trong (a): cây phong lan ; (b): cây cúc 37

Hình 4.4: Kiểm tra sự hiện diện của gen gus trong cây phong lan 37

Hình 4.5: Cây Dendrobium ở giai đoạn 7 ngày sau trồng 47

Hình 4.6: Cây Dendrobium ở giai đoạn 60 ngày sau trồng 47

Hình 4.7: Cúc ở giai đoạn 7 ngày sau trồng 53

Hình 4.8: Cúc ở giai đoạn 30 ngày sau trồng 53

Hình 4.9: Cúc ở giai đoạn 60 ngày sau trồng 54

Hình 4.10: Cúc ở giai đoạn 90 ngày sau trồng 54

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Một số loài sâu bệnh điển hình trên cây hoa cúc 12

Bảng 2.2: Thành phần thuốc thử GUS 27

Bảng 3.1: Thang chuẩn 1Kb 30

Bảng 4.1:Chiều cao trung bình của cây 38

Bảng 4.2: Tốc độ tăng trưởng chiều cao của cây 39

Bảng 4.3:Số lá trung bình của cây 40

Bảng 4.4: Tốc độ ra lá của cây 41

Bảng 4.5: Số giả hành trung bình của cây 42

Bảng 4.6: Tốc độ tạo giả hành của cây 42

Bảng 4.7: Số chồi trung bình của cây 43

Bảng 4.8: Tốc độ tạo chồi của cây 44

Bảng 4.9: Trọng lượng trung bình của cây 45

Bảng 4.10: Tốc độ gia tăng trọng lượng của cây 46

Bảng 4.11: Chiều cao trung bình của cây 48

Bảng 4.12: Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây 48

Bảng 4.13: Số lá trung bình của cây 49

Bảng 4.14: Tốc độ ra lá của cây 50

Bảng 4.15: Chiều dài trung bình cành cấp 1 51

Bảng 4.16: Tốc độ tăng trưởng chiều dài cành cấp 1 52

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1: Chiều cao trung bình của cây lan Dendrobium 39

Biểu đồ 4.2: Tốc độ tăng trưởng chiều cao trung bình của cây lan Dendrobium 39

Biểu đồ 4.3: Số lá trung bình của cây lan Dendrobium 41

Biểu đồ 4.4: Tốc độ tạo lá trung bình của cây lan Dendrobium 41

Biểu đồ 4.5: Số giả hành trung bình của cây lan Dendrobium 42

Biểu đồ 4.6: Tốc độ tạo giả hành của cây lan Dendrobium 43

Biểu đồ 4.7: Số chồi trung bình của cây lan Dendrobium 44

Biểu đồ 4.8: Tốc độ tạo chồi của cây lan Dendrobium 44

Biểu đồ 4.9: Trọng lượng trung bình của cây lan Dendrobium 46

Biểu đồ 4.10: Tốc độ gia tăng trọng lượng của cây lan Dendrobium 46

Biểu đồ 4.11: Chiều cao trung bình của cây hoa cúc 48

Biểu đồ 4.12: Tốc độ tăng trưởng chiều cao của cây hoa cúc 49

Biểu đồ 4.13: Số lá trung bình của cây hoa cúc 50

Biểu đồ 4.14: Tốc độ ra lá của cây hoa cúc 50

Biểu đồ 4.15: Chiều dài trung bình cành cấp của cây hoa cúc 51

Biểu đồ 4.16: Tốc độ tăng trưởng chiều dài cành của cây hoa cúc 52

Chương 1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, việc cải tiến giống cây trồng nhằm tạo ra giống mới mang nhiều đặc điểm mong muốn ngày càng được quan tâm Ngoài nhân giống hoa phục vụ sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, việc tạo giống mới như giống kháng bệnh (nấm, vi khuẩn, virus), giống có dạng cây nhỏ (mini) và đáp ứng các tiêu chuẩn đòi hỏi ngày càng cao của người tiêu dùng như hoa có màu sắc và đặc tính mới lạ, tươi lâu là những vấn đề đang được quan tâm nghiên cứu Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống như lai hữu tính, gây đột biến , phương pháp biến đổi gen đã và đang chứng tỏ là công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghiên cứu tạo giống và song hành với các phương pháp tạo giống truyền thống Đến nay đã có khá nhiều giống cây trồng chuyển gen được trồng trên diện rộng nhằm mục đích thương mại Tạo giống bằng công nghệ gen đã và đang được nghiên cứu tích cực trên đối tượng cây lan cũng như trên hoa cúc vì tạo giống bằng phương pháp lai hữu tính cần nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốn dùng lai tạo không phong phú

Gen gfp (green fluorescent protein) là hệ thống gen tinh vi gồm 2 hệ thống gen

tạo nên protein phát sáng GFP Gen này hứa hẹn sẽ được sử dụng nhiều hơn trong các

nghiên cứu khoa học do việc kiểm tra đơn giản hơn so với gen chỉ thị gus A Hơn nữa,

nó còn có thể sử dụng để đánh giá biểu hiện in vivo xác định các protein dung hợp, sự

vận chuyển các protein nội bào và sự định vị các tế bào đặc biệt trong hệ thống đa bào Hiện nay, gen này được nghiên cứu biến nạp và biểu hiện ở nhiều loại cơ thể sinh học

khác nhau như vi khuẩn, nấm, động vật có/không có xương sống và thực vật Ở lĩnh

vực chuyển nạp gen vào cây trồng, gen gfp được xem là gen chỉ thị sống (vital), mới và

có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghiên cứu

Gen ipt mã hóa enzyme isopentenyltransferase tham gia xúc tác trong phản ứng

quan trọng tổng hợp cytokinin Lượng cytokinin tăng cao trong mô thực vật góp phần làm chậm quá trình lão hóa

Đến nay, ở nước ta đã và đang ghi nhận những công trình chuyển các gen gfp và gen ipt vào cây hoa nói chung và cây hoa lan, cúc nói riêng Do vậy, nội dung đề tài này, chúng tôi tiến hành kiểm tra cây phong lan Dendrobium được chuyển nạp gen phát sáng gfp, và cây hoa cúc (Chrysanthemum)chuyển gen chống lão hóa ipt đồng thời

khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây con biến đổi gen trong nhà kính

 Mục đích đề tài

- Xác định sự hiện diện của gen gfp ở chồi, cây phong lan chuyển gen và gen ipt ở

chồi, cây hoa cúc chuyển gen nhằm đánh giá hiệu quả chuyển gen vào cây trồng

- Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây phong lan và cây cúc chuyển gen

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về cây phong lan Dendrobium

2.1.1 Sơ lược về cây phong lan Dendrobium

Hoa lan là một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị, không những góp phần tích cực vào việc nâng cao hiệu quả sử dụng lao động, đất, nước

và các nguồn lực khác, mà còn cải thiện chất lượng cuộc sống Vì vậy phát triển hoa lan là một xu thế trong sản xuất nông nghiệp ở các đô thị hiện nay và ngay cả trong tương lai Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp

trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu, muôn vẻ của các loài hoa như: Cattleya,

Hồ Điệp, Dendrobium, Vanda, Cymbidium Với khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có nhiều

điều kiện tự nhiên thích hợp với việc phát triển nhiều loại phong lan, địa lan, đặc biệt là

giống Dendrobium Lan Dendrobium không những đẹp mà còn có giá trị cao về mặt

kinh tế

Giống lan này được Olof Swartz đặt tên vào năm 1799, lúc đó chỉ có 6 loài, nay là

giống lan lớn thứ nhì của họ Lan với 1600 loài nguyên thuỷ Chữ Dendrobium có

nguồn gốc chữ Hy Lạp: Dendro nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio nghĩa là sống vì tất cả các

loài của Dendrobium đều là phụ sinh, sống bám trên cây khác

Hình 2.1: Một số loại lan Dendrobium

(Nguồn Trần Hợp, 2000)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Dendrobium có số lượng khá lớn, phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa

dạng, do đó không có một hình dạng chung nhất nào về hoa và dạng cây Nhìn chung,

lan thuộc giống Dendrobium đều có các bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá

và cơ quan sinh sản như hoa, trái

 Rễ: Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp

với nhiều điều kiện sống: Rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở đất Rễ của lan

Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát

và cây bị chết

 Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ

thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Thân nhẵn hay có nhiều vảy là do thoái hoá và một phần thẳng đứng mang lá Các lá này bao nhau hợp thành thân giả hay còn gọi là giả hành

 Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá

 Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân Hình dạng và cấu trúc lá rất da dạng Lá

có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại, mọng nước, nạc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của cây Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V, những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành

vảy Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt nói riêng và họ Orchidaceae nói

chung đôi khi trú lá vào mùa khô hạn sau đó ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi

 Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách Chồi hoa mọc từ các mắt

ngủ giữa các đọt lá trên thân ngọn và cả trên ngọn cây gọi Keikei Biểu hiện trước khi

ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng lá trước khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa

Hoa mọc thành chùm đơn hay chùm kép hay từng hoa riêng lẻ Cành hoa dang rũ

hay dạng thẳng đứng Giống Dendrobium có hoa lâu tàn, trung bình 1-2 tháng Thời

gian ra hoa có khi nở suốt năm Mặt khác số lượng cành hoa trên cây nhiều nên

Dendrobium được xem là giống chủ đạo để cung cấp lan cắt cành

Cấu trúc hoa thì cực kì phong phú và hấp dẫn về hình dạng và màu sắc, tuy nhiên luôn có điểm chung sau:

 Bao quanh có vòng và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng

 Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên Các cánh đài dựng đứng hay trải ra

 Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là cánh môi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn

 Sự đa dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rất lớn Cánh môi có các dạng như nguyên chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh

 Ở Dendrobium và hầu hết các chi phong lan khác có cấu trúc cột nhụy,

nằm chính giữa hoa là dấu hiệu cơ bản để định loại hoa phong lan Trong khoảng nhỏ của cột nhụy có đính một khối phấn có hàng trăm nghìn hạt phấn đính lại Khối phấn có thể chia thành hai hoặc bốn, được xếp thành đôi một trong khoang Thường có tinh bột, sáp hoặc có sừng cứng bao quanh khối phấn

 Trái: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát

 Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi–microspermeae) nên phôi hạt chưa phân hoá Sau 12-8 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm

2.1.3 Các tác động ngoại cảnh ảnh hưởng đến cây lan Dendrobium

 Ánh sáng: Rất cần thiết cho sự tăng trưởng và ra hoa Lượng ánh sáng cần

40 watt chiếu trực tiếp lên phía cây Có thể nói Dendrobium là loài ưa sáng (60 - 70%),

có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%

 Giá thể: Phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu.Có thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi lửa, xơ dừa hoặc

đá

 Nhiệt độ: Dendrobium ưa những vùng đất thấp và ấm áp như vùng khí hậu

nhiệt đới và cận nhiệt đới Cây trưởng thành cần sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm là 6-90C Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của Dendrobium là

ngày: 27-320C, đêm: 16-180C Trong điều kiện độ ẩm và thoáng khí tăng thì nhiệt độ

 Thay chậu: Lan Dendrobium trồng cỡ 2 năm thì giả hành phát triển, mọc

nhảy ra ngoài chậu, nên phải thay chậu Đồng thời, lúc đó ta nên tách chiết nhân giống

 Sâu bệnh: Việc bón phân hữu cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau một thời gian ngắn) là nguyên nhân chủ yếu gây nhiều sâu bệnh hại cây như gián, rệp, cồn trùng cắn phá, nấm và virus…

2.1.4 Giá trị sử dụng

 Giá trị sử dụng của lan ở 1 số nước trên thế giới:

Các vườn lan Dendrobium cắt cành tại các nước trên thế giới được tổ chức

trồng, thu hoạch, đóng gói và phân phối theo quy trình công nghiệp Các vườn lan ở đấy đều có trang web giới thiệu đầy đủ từ cơ sở trang trại, tên giống, giá cả từng mặt

Dendrobium được chọn làm giống chủ đạo trong ngành sản xuất lan cắt cành

do những ưu điểm sau:

- Siêng ra hoa, cho nhiều cành, số lượng hoa trên 1 cành nhiều (tối thiểu 6 hoa/cành), có phổ khí hậu sống rộng

- Số lượng loài lớn nên chủng loại sản phẩm rất đa dạng, dễ thay đổi theo thị hiếu của thị trường, rất được ưa chuộng, đặc biệt là trên thị trường Châu Á

 Giá trị y dược và thực phẩm:

Từ lâu cây lan đã được sử dụng trong y dược và thực phẩm Được liệt kê trong dược cổ điển Hy Lạp, Trung Quốc và vùng Tiểu Á, chúng được phơi khô, xắt nhỏ làm thuốc giảm đau và thuốc kích thích

Zhao C và cộng sự (2002) đã tách chiết được copacamphane, picrotoxane, alloarmadendrane sesquiterpene, glycoside và phenolic glycoside từ thân của

Dendrobium moniliforme Bên cạnh đó còn ly trích được 1 nhóm chất hóa học mới là

dendromoliside được đánh dấu từ A–D Bước đầu thử nghiệm cho thấy các chất này làm tăng số lượng tế bào B và ức chế tăng sinh tế bào T in vitro

(Nguồn http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12932145)

Gao J và cộng sự (2003) đã quan sát mô tuyến ức được nuôi trên môi trường

có chứa dịch chiết từ protocorm của Dendrobium thấy rằng trọng lượng mô tăng, làm

tăng khả năng của phagocyte và tốc độ biến đổi của lymphocyte (Nguồn

http://grande.nal.usda.gov/ibids/index.php?mode2=detail&origin=ibids_references&t herow=747220)

Một số bộ tộc ở Indonesia dùng Dendrobium sallacense nấu với cơm như

người Việt Nam ở đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa Ngoài ra lá và giả hành được dùng làm trà hoặc lấy sợi trong thân phơi khô để làm kiềng đeo tay

2.2 Sơ lược về hoa cúc (Chrysanthemum)

Cúc (Chrysanthemum) là một trong những loại cây trồng làm cảnh lâu đời và quan trọng nhất trên thế giới Sau khi du nhập vào Việt Nam, cúc trở thành một loại hoa khá phổ biến và được ưa chuộng Trong giới thực vật, họ hàng hoa cúc có thể xem

là đa dạng với nhiều loài khá đẹp và rất phổ biến nhiều nơi ở các nước thế giới năm

làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, tăng huyết áp Đặc biệt, cháo thuốc từ hoa cúc có tác dụng chữa đau mắt rất tốt

Hình 2.2: Cúc Đại Đóa hoa vàng 2.2.1 Vị trí phân loại

 Loài Chrysanthemum morifolium

(Nguồn Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003)

2.2.2 Nguồn gốc

- Cúc là một trong những loài hoa cảnh lâu đời và quan trọng nhất trên thế giới,

có nguồn gốc từ Trung Quốc Từ thế kỷ 15 trước công nguyên cúc đã được trồng ở Trung Quốc và đến thế kỷ thứ 8 sau công nguyên thì loài hoa này đã bắt đầu xuất hiện

ở Nhật Bản Mãi đến thế kỷ 17 hoa cúc mới du nhập vào các nước phương Tây

- Năm 1753, Karl Linnaeus - nhà thực vật học Thụy Điển đã kết hợp hai từ Hy

Lạp là chrys - nghĩa là màu vàng (màu sắc nguyên thủy của loài hoa này) và anthemom nghĩa là hoa để tạo thành tên Chrysanthemum

vàng, cánh tia hình nan hoa Nhưng ngày nay, với công nghệ khoa học hiện đại, hoa cúc không chỉ có màu vàng nguyên thủy như trước đây mà còn có rất nhiều màu sắc khác như vàng, trắng, xanh, đỏ, tím và kiểu dáng, kích cỡ cũng vô cùng phong phú

- Đối với Việt Nam, cây hoa cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15 và đến đầu thế

kỷ 19 đã hình thành một vùng chuyên canh nhỏ cung cấp cho nhân dân Hoa cúc vừa dùng để thưởng thức (ở Việt Nam, từ xưa, người dân đã biết dùng cánh hoa cúc tươi hoặc phơi khô để pha trà hay đơn giản là nấu nước uống), vừa phục vụ cho trang trí, cúng lễ và cũng được dùng làm dược liệu

2.2.3 Đặc điểm hình thái

- Rễ: Cúc có rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng mặt đất từ 5 - 20 cm

- Thân: Cúc thuộc dạng thân thảo nhỏ, mọc đứng hoặc bò, có nhiều đốt, giòn

dễ gãy, càng lớn thân càng cứng cáp hơn

- Lá: Thường là lá đơn, không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống

- Hoa: Giống như các thành viên của họ Asteraceae, cúc đặc trưng bởi cụm

hoa đầu do nhiều hoa nhỏ hợp thành Ngay trong một cụm hoa đầu nhiều khi cũng có

sự phân hóa của hoa: Những hoa ở ngoài nở trước, to hơn, không đều, thường hình lưỡi hoặc hai môi, có khi trở nên đơn tính hoặc vô tính, màu sặc sỡ làm nhiệm vụ hấp dẫn côn trùng Các hoa ở giữa nhỏ, nở sau, thường là những hoa hình ống, lưỡng tính, làm nhiệm vụ sinh sản

Hoa đầu của chi Chrysanthemum gồm hoa hình ống ở giữa và hoa hình môi ở

bìa Hoa đơn giản, không cọng, không đài (đài biến thành cụm lông tơ và tồn tại ở quả)

Phía ngoài mỗi cụm hoa đầu là các lá bắc xếp xít nhau làm thành tổng bao Tràng hoa dính ở trên phía bầu, phần dưới của ống tràng bao lấy gốc vòi nhụy

và tuyến mật Tràng có năm cánh hoa dính lại với nhau và có nhiều dạng khác nhau:

● Tràng hình ống với năm thùy bằng nhau (hoa hình ống)

● Tràng hình phễu với các thùy bằng hay không bằng nhau

- Quả: Quả đóng, chứa một hạt, mang chùm lông do đài tồn tại để phát tán hạt Hạt có phôi thẳng và lớn, không có nội nhũ

2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh thái

- Về đất trồng, do bộ rễ của cúc phát triển mạnh nhưng ăn nông nên đất phù hợp cho cúc là đất thịt nhẹ, tơi xốp, đặc biệt là đất phù sa mới, bề mặt bằng phẳng, thoát nước tốt, có độ pH khoảng 6 - 6,5

- Về nhiệt độ, đa số các giống cúc được trồng hiện nay đều ưa khí hậu ôn hòa, nhiệt độ dao động từ 150 - 200C hoặc nơi có độ cao 300 - 1000 m (so với mặt biển) (thích hợp với vụ thu đông), bên cạnh đó có một số giống chịu nhiệt cao hơn (30o –

35oC) được trồng ở các tỉnh phía Nam, đồng bằng sông Cửu Long

- Về ánh sáng, đây là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây cúc

vì nó cung cấp năng lượng cho quá trình quang hợp tạo chất hữu cơ cho cây Hơn nữa, ánh sáng còn ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và nở hoa của cúc Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn

- Về ẩm độ, cúc là loại cây trồng cạn, không chịu được úng, sinh trưởng tốt trên nền đất có độ ẩm từ 60 - 70% và những nơi có độ ẩm không khí 55 - 65% Nếu ẩm độ trên 80% cây sinh trưởng nhưng lá dễ bị mắc một số bệnh nấm

2.2.5 Sâu bệnh

Cũng như các loài cây trồng khác, cúc bị rất nhiều côn trùng, dịch bệnh tấn công Các loại côn trùng này phát sinh và phát triển quanh năm, đặc biệt vào giai đoạn thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều

2.2.6 Giá trị văn hóa, dược liệu và kinh tế

 Giá trị văn hóa và dược liệu

- Hoa cúc ngoài giá trị thẩm mỹ còn mang nhiều ý nghĩa biểu trưng cao quý ở các

quốc gia khác nhau như Trung Quốc, Nhật, Mỹ Do đó hoa cúc không thể thiếu được trong cuộc sống ở những nơi này

- Đối với người phương Đông, đặc biệt là người Trung Hoa, từ lâu đã biết sử dụng cúc như một dược liệu cổ truyền, có công dụng tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc, được dùng chủ yếu làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, tăng huyết áp

Bảng 2.1: Một số loài sâu bệnh điển hình trên cây hoa cúc

trắng

Nấm phấn trắng Oidium chrysanthemi Rab

Trên lá và những phần non của cây xuất hiện các chấm trắng, bệnh nặng lá khô héo và rụng,

nụ thối, hoa nhỏ, không nở hoặc

Nấm lưỡi liềm Fusarium

Vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith

Rễ thối, cây chết khô rũ xuống

Tuyến trùng

(Aphelenchoides fragariae Christie)

Lá nhỏ, xoăn lại hoặc mọc chùm, các đốt ngắn lại, phình lên

Sâu hại

cúc

Sâu khoang hại cúc

Helicoverpa armigera

Hb

Sâu non ăn lá, ăn nụ hoa Trên

lá non, chúng ăn khuyết, trên nụ chúng đục nụ ăn vào bên trong

(Nguồn Việt Chương, 1994)

 Giá trị kinh tế

- Hiện nay, cúc là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến nhất trên thế giới Tính đến năm 2003, thế giới đã có tới 600 giống cúc đang được trồng để phục vụ mục đích thương mại Ước tính kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc đạt 1,5 tỉ USD, đứng đầu là Trung Quốc (300 triệu USD), Hà lan (250 triệu USD), Nhật Bản (150 triệu USD)

- Xét về cơ cấu chủng loại tất cả các loại hoa trồng ở Việt Nam thì trước những năm 1997 diện tích trồng hoa hồng nhiều nhất (31%) nhưng từ năm 1998 trở lại đây diện tích trồng hoa cúc đã vượt lên (chiếm 42%, trong khi đó diện tích trồng hoa hồng chỉ còn 29,4%) Nguyên nhân là do hoa cúc dễ trồng và nhân giống nhưng lại cho hiệu quả kinh tế cao

2.3 Một số kết quả nghiên cứu về gfp

2.3.1 Tổng quan về GFP

Protein phát quang lục (green fluorescent protein) hay GFP là một protein

được khám phá bởi Shimomura (1962) từ con sứa biển Aequorea victoria GFP với

choromophore phát ra đã đem lại ma lực, sự quyến rũ vốn có bên trong và cả một giá trị

to lớn do tính dễ phát hiện trong cơ thể sống Chỉ mới ba năm sau đó, protein GFP từ chỗ ít được biết đến đã trở thành một trong những protein được nghiên cứu và khai thác rộng lớn trong y sinh học và trong tế bào học

Hình 2.3: Sứa Aequorea victoria

(Nguồn srv2.lycoming.edu; www.plantsci.cam.ac.uk)

Hình 2.4: Green fluorescent protein

(Nguồn http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm) Gen gfp có thể được chuyển vào và biểu hiện ở rất nhiều loài sinh vật từ vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, cho đến cả thực vật và động vật Chính vì thế mà gfp được

nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực công nghệ gen

 Gen gfp được dùng như là một marker trong để nhận biết kết quả chuyển

gen

 Gen gfp dùng để định vị vị trí gen

 Khảo sát sự chuyển động của tế bào đã được chuyển gen gfp

 Theo dõi sự sống chết của tế bào

 Tìm hiểu thông tin về sự hình thành cơ quan trong cơ thể từ những tế bào

đã được chuyển gen gfp

GFP có tất cả 238 acid amin, trong đó có một số đóng vai trò quan trọng trong việc khả năng phát sáng

GFP có cấu trúc “- can” bao gồm 11 sợi  đan chéo song song bao quanh 5 sợi

có cấu trúc cuộn xuắn  Trong cấu trúc cuộn xoắn đó có 20 vòng xoắn , 2 vòng xoắn

, 12 chỗ phình to, 7 chỗ có cấu trúc kẹp tóc Trong cấu trúc này tồn tại hợp chất fluorophone được hình thành từ sự tự xúc tác có tác dụng gây phát quang

Hình 2.5: Cấu trúc của gfp

(Nguồn www.bio.davidson.edu)

Fluorophone được chuyển hóa từ tripeptide- Ser65-Tyr66-Gly67

Hình 2.6: Cấu trúc của Fluorophone

Cấu trúc vòng giữa Ser 65 và Gly 67 được nối với chuỗi Tyr 66 cho phép thực hiện phản ứng oxi hoá ở mức năng lượng thấp

Sự phát sáng của GFP được thực hiện thông qua cơ chế tiếp nhận năng lượng của một protein khác và không cần sự có mặt của bất kì cofactor hay enzyme nào khác Khi nhận một photon ánh sáng có bước sóng thích hợp, phân tử fluorophone sẽ chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn và không bền Sau khoảng 10-9- 10-4giây, phân tử fluorophone đã kích thích sẽ chuyển về trạng thái ban đầu, đồng thời phát

ra photon có bước sóng lớn hơn bước sóng ban đầu, làm cho fluorophone phát sáng, ta

sẽ thấy cả phân tử GFP phát sáng

Sử dụng bước sóng kích thích tối đa 395 nm (UV) với một đỉnh sáng nhỏ tại bước sóng 475 nm (blue), ánh sáng xanh lục sẽ được biểu hiện ở bước sóng 508nm (green) làm phát ra ánh sáng màu xanh lá cây

Blue light

Green light

Hình 2.7: Cơ chế phát sáng của Fluorophone

(Nguồn Nguyễn Văn Uyển, 1995)

2.3.2 Một số thành tựu trong công tác nghiên cứu chuyển nạp gen phát sáng gfp trong những năm gần đây

 Ứng dụng quan trọng nhất của protein GFP là làm chất dò sinh học để minh họa cụ thể chi tiết các quá trình sinh học như quá trình tạo khối u trong cơ thể động vật, quá trình phân chia tế bào, quá trình cộng sinh tương tác với thực vật (như sự cộng sinh) hay phát hiện các virus xâm nhập Đặc biệt đối với tế bào thực vật, không thể sử dụng thuốc nhuộm và chúng không thấm được vào tế bào thực vật, GFP được sử dụng như một công cụ thăm dò quan trọng để kiểm tra những quá trình nội bào

 Gần đây nhà sinh học David Baltimore từng đoạt giải Nobel ở Viện công

nghệ California đã sử dụng phương pháp Lentivirus, vốn là họ hàng xa của virus HIV,

đã bị bất hoạt để đưa gen sứa vào phôi chuột Kết quả thí nghiệm cho thấy hơn 80% chuột sinh ra từ các phôi trên đều chứa protein đặc biệt của sứa Chúng phân tán khắp

cơ thể và làm cho những chú chuột bị phát sáng dưới tia UV

 Lợn phát sáng do chuyển gen: Các nhà khoa học Đài Loan đã nuôi cấy thành công 3 chú lợn phát ra ánh sáng huỳnh quang lục trong bóng tối, đánh dấu bước ngoặt tiềm năng trong việc nghiên cứu tế bào gốc Nhóm nghiên cứu đã chèn một protein (chiết tách từ một loài sứa) vào trong nhân của các tế bào phôi lợn, từ đó tạo ra 3 con lợn đực chuyển gene Những con lợn này phát sáng cả từ bên trong, bao gồm các nội tạng Nhóm hy vọng những con lợn này có thể giúp giới khoa học lần theo sự phát triển của các mô - nơi tế bào gốc được sử dụng để sửa chữa những nội tạng hỏng Công trình này sẽ có ích trong việc thúc đẩy nghiên cứu lâm sàng về tế bào gốc của người, vì về mặt di truyền người ta tin rằng lợn thuộc nhóm động vật gần gũi với người nhất

Hình 2.9: Một con lợn chuyển gen màu xanh bên cạnh con lợn thường

(Nguồn http://www.vnexpress.net/Vietnam/Khoa-hoc/2006/01/3B9E5FD1/)

 Chuột thí nghiệm có tim phát sáng: Theo thông tin từ trường Đại học Corney

-Welsh, các nhà khoa học của Mỹ và Nhật Bản đã nuôi được chuột thí nghiệm có tim phát sáng, phân tử huỳnh quang có canxi được cấy vào cơ tim của chuột thí nghiệm, và

bị kích hoạt khi cơ tim co bóp

Hình 2.10: Tim phôi chuột phát sáng

(Nguồn http://www.khoahoc.com.vn/view.asp?Cat_ID=4&news_id=4477)

 Tạo bướm phát sáng xanh: Các nhà khoa học Mỹ vừa tạo ra bươm bướm

phát sáng đầu tiên bằng cách bổ sung hai gen huỳnh quang của sứa vào DNA của bướm Loại bướm châu Phi chuyển đổi gen này phát ra ánh sáng xanh trong bóng tối Bằng cách này, các nhà khoa học sẽ tìm ra các gen đó và theo dõi cách chúng tiến hoá Các nhà nghiên cứu đã sử dụng một kỹ thuật gọi là tuyến mầm để lồng một gen mã hoá

protein phát sáng xanh vào trứng của bướm châu Phi Bicyclus anynana Quá trình này

tạo ra bướm đột biến, có gen phát sáng Sau đó, họ có thể nghiên cứu những đột biến đó khi bướm trưởng thành Cho tới nay, giới khoa học vẫn chưa thể nhận dạng những đột biến gen làm thay đổi hoa văn màu sắc trên cánh bướm

Hình 2.11: Bướm phát sáng

 Các tiến bộ trong công nghệ protein GFP cung cấp 1 phương tiện hữu hiệu đầy hứa hẹn để dò tìm, phát hiện các phân tử sinh học trong cơ thể sống Tuy còn quá sớm để mong chờ vào việc khai thác các ứng dụng của ngành khoa học còn non trẻ này nhưng rõ ràng hình ảnh sinh học là một kỹ thuật mới đầy hứa hẹn, có thể trợ giúp các ngành sinh học trong tương lai và protein GFP chính là công cụ đắc lực để phát triển ngành hình ảnh sinh học trong thời gian tới

2.4 Một số nghiên cứu về ipt

2.4.1 Tổng quan về quá trình lão hóa ở thực vật

Quá trình lão hóa ở lá là một pha trong chu kì phát triển của thực vật trong

đó các tế bào có những thay đổi về cấu trúc và trao đổi chất trước khi bước vào giai đọan chết Đó là giai đoạn quan trọng trong vòng đời ở thực vật giúp thực vật thích nghi tốt với môi trường bằng cách tái sử dụng chất dinh dưỡng chuyển đến các vùng phát triển mạnh

Quá trình lão hóa ở lá được cảm ứng dưới tác động của hàng loạt các yếu tố môi trường như  sự che sáng (shading), thiếu khoáng chất, hạn hán, nhiễm bệnh (pathogen infection) và do quá trình phát triển như  sự hình thành và phát triển hạt Ngoài ra, sự lão hóa ở lá xảy ra do yếu tố thời gian hay độ tuổi của nhiều loài thực vật

Các nghiên cứu về di truyền và sinh lý thực vật cho thấy lão hóa là một quá trình được điều khiển chặt chẽ Sự thay đổi của lá trong quá trình lão hóa dễ được nhận thấy bằng sự mất chlorophyll và hóa vàng dần (là kết quả của sự phân hủy chlorophyll)

Sự lão hóa ở lá bao gồm sự phân hủy protein, nucleic acid và màng tế bào, sự vận chuyển các sản phẩm phân giải đến các vùng khác của cây như vùng phát triển hạt, lá,

cơ quan dự trữ

Các nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy chương trình lão hóa có liên quan đến các biến đổi trong biểu hiện gen Lượng mRNA mã hóa các protein tham gia trong quá trình quang hợp giảm trong suốt quá trình lão hóa trong khi lượng mRNA mã hóa các protein liên qua đến quá trình lão hóa tăng đáng kể Hoạt động của một số enzyme tham gia trong quá trình lão hóa có thể có vai trò trong sự phân cắt và vận chuyển chất dinh dưỡng

Việc làm chậm quá trình lão hóa ở thực vật hay cơ quan của thực vật có ý

giảm hư hỏng các cụ mùa; tăng sự cố định carbon Từ đó có thể làm tăng hiệu suất, sản lượng hạt… Sự điều hòa quá trình lão hóa ở thực vật bằng cytokinin đã cho kết quả quan trọng trong nông nghiệp Lượng cytokinin tăng cao trong mô thực vật góp phần làm chậm quá trình lão hóa

Các nghiên cứu cây chuyển gen ức chế quá trình lão hóa tập trung vào việc

chuyển gen ipt vào thực vật Gen này mã hóa enzyme isopentenyltransferase tham gia

xúc tác trong phản ứng quan trọng tổng hợp cytokinin

Hình 2.12: Biểu hiện ipt trong các con đường tạo cytokinin

(Nguồn Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ, 1999-2000, NXB

Nông Nghiệp 2001)

2.4.2 Gen ipt

Polypeptide trong họ gene IPT được xác định ở các lọai vi khuẩn khác nhau và ở thực vật như họ Arabidopsis Các phân tử protein trong họ đều có trình tự chung: GxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx{57,60}[VLI][VLI]xGG[ST Trong đó:

x: bất cứ phân tử amino acid

[]: một trong các amino acid trong dấu []

X{m,n} số lượng từ m tới n đơn phân

Các phân tử trong họ IPT còn có điểm gắn ATP/GTP

Các gene được biết là mã hóa cho enzyme chuyển hóa nhóm isopentenyl

(isopentenyl group transferase) liên quan đến tổng hợp cytokinin bao gồm gene ipt (gene 4) trong vùng T-DNA và gene tzs trong vùng gây độc (vir region) của Ti-plasmid

etz của Pseudomonas, và gene ipt của Rhodococcus có hoạt tính DMAPP:AMP

ehtylallyl transferase in vitro

2.4.3 Những nghiên cứu chuyển gen ipt ở cây trồng

 Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs, 1996; Wang và cs,

1997 trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng cytokinin tăng lên

trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá và hoa

(Nguồn http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/53/376/1891)

 Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen ipt promoter SAG12 đối với

sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L cv ‘Evola’) chuyển gen", Tác giả Matthew S McCabe và cộng sự thực hiện chuyển gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

trên đối tượng lá mầm cây cải xà lách Kết quả cho thấy hàm lượng cytokinin tăng trong cây chuyển gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen

(Nguồn http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=125086)

 Chang và cộng sự, 2003 đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã yên thảo(Petunia hybrida cv ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả cho thấy hoa của các dòng

cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và kết quả còn cho thấy hoa cây chuyển nạp gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh, cần được xử lý ethylen với thời gian lâu hơn để cảm ứng sản sinh ethylen nội sinh và làm héo rũ cánh

hoa Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể sử dụng gen ipt trong nghiên cứu

chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily …

(Nguồn http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=15091615)

 Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng

(Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão suy SAG12"

do Ornella Calderini và cộng sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua

Agrobacterium tumefaciens

 Một nghiên cứu quan trọng gần đây nhất của hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản (Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được

hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá Các nhà nghiên cứu hy

vọng phát hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa màng do hạn hán và cho phép sản xuất lương thực tại các vùng thiếu nước

(Nguồn http://www.pnas.org/content/104/49/19631.full?ck=nck)

2.5 Tạo cây phong lan Dendrobium và cây hoa cúc chuyển gen

2.5.1 Tạo cây phong lan Dendrobium chuyển gen:

 Một số đặc điểm của pCAMBIA 1303:

 Có các vị trí cắt giới hạn duy nhất của nhiều enzym trên MCS (multiple

cloning sites – nằm giữa trình tự gusA và gen kháng Hygromycin) thuận lợi cho

việc tạo dòng

 Sự có mặt của các vùng rep và sta của pVS1 giúp các vector này ổn định trong A.tumefaciens ngay cả trong điều kiện không có chất chọn lọc

 Có mang gen gusA và gen mGFP5 là 2 gen chỉ thị giúp cho việc xác định

dòng plasmid dễ dàng và đơn giản qua thao tác nhuộm GUS và soi UV

 Có 2 gen kháng kháng sinh Kannamycin và Hygromycin để đánh giá hiệu quả chuyển gen Thực vật được chuyển gen sẽ biểu hiện protein GUS, GFP và tính kháng Kanamycin và Hygromycin Nhược điểm của pCAMBIA 1303 là

không có đoạn intron chèn vào trình tự mã hoá gen gusA; do đó gen này biểu

hiện trong vi khuẩn

 Bản đồ giới hạn của plasmid pCAMBIA 1303 như sau:

Hình 2.13: Bản đồ giới hạn vector plasmid pCAMBIA 1303

(Nguồn www.cambia.org)

 Sử dụng súng bắn gen chuyển plasmid pCAMBIA1303 vào hệ gen của cây

phong lan Dendrobium

Hình 2.14: Chuyển gen bằng súng bắn gen

(Theo Nguyễn Văn Uyển, 1995)

2.5.2 Tạo cây hoa cúc chuyển gen

 Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium để chuyển gen ở thực vật là phương

gen thực vật một cách chính xác và ổn định Agrobacterium đã mang gen cần chuyển

sẽ xâm nhập vào tế bào của mẫu cấy từ các vết thương ở mép, chuyển plasmid có mang gen cần chuyển Sau đó, những tế bào này sẽ được cho tái sinh tạo thành cây

đã chuyển gen mong muốn

Hình 2.15: Sơ đồ mô tả sự chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium

(Theo Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plamid

pVDH396 (kích thước 15890 bp), mang gen ipt (nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens) tạo enzyme isopentenyl transferase tham gia tổng hợp cytokinin

Plasmid pVDH396 có các trình tự sau:

 Gen ipt: Promoter pSAG12 (promoter senescence- associated gene 12 từ Arabidopsis thaliana), terminator Tnos (chống lão hóa )

 Gen kháng hygromicin hph: Promoter CaMV35S, terminator T35S

 Gen chọn lọc gusA: Có intron, promoter CaMV35S, terminator T35S

 Gen kháng kanamycin (KanR) cho việc chọn lọc vi khuẩn

2.6 Phương pháp kiểm tra gen chuyển

2.6.1 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

 Nguyên tắc: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch

DNA mẹ, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để tạo thành đoạn DNA mới Thật vậy, nếu

ta cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp với 2 đầu của hai mạch DNA của DNA mẹ ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa 2 đoạn mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA ta phải có các thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi chuyên biệt gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen

 Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR

- DNA khuôn (DNA template): Có thể là DNA kép đơn, hoặc RNA được tách chiết từ đối tượng nghiên cứu DNA khuôn phải có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp

- Mồi (primer): Lựa chọn các mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR Đoạn mồi là các oligonucleotid có độ dài từ 6 – 30 nucleotid,có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự hai đầu mạch khuôn

- Taq polymerase: Là DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến

tính và xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5' – 3' trong suốt quá trình phản ứng dưới

sự hiện diện của Mg2+

- Các deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới Nồng độ tối ưu của dNTP

thường dùng là 100 – 200 μM Tuy nhiên ở nồng độ thấp hơn thì Taq DNA polymerase

hoạt động chính xác hơn

- Dung dịch đệm: Quan trọng nhất là ion Mg2+ Mg2+ rất cần cho quá trình liên

kết các dNTPs, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của

DNA mạch kép Dung dịch đệm tiêu chuẩn chứa 50 mM KCl và khuếch đại tốt những đoạn DNA > 500 bp

 Thực nghiệm: Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1 Trong thành phần hỗn hợp phản ứng phải bao gồm các thành phần phản ứng của sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 940 – 95 0C trong vòng 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn biến tính

- Bước 2 Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi

- Bước 3 Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp là tốt nhất Thời gian tùy thuộc vào độ dài của phân tử DNA cần khuếch đại khoảng từ 30 giây cho đến nhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài

Một chu kỳ PCR gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng đôi số lượng mẫu của lần trước đó Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu

 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

- DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA tinh sạch tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt được kết quả cao với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng polymerase hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn giảm được sự khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một ưu điểm có thể kể đến của phương pháp PCR là khuếch đại được cả các mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết…

- Enzyme: Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I nhưng vì đây là enzyme không chịu được nhiệt độ cao nên thao tác phức tạp và không hiệu quả (phải thêm enzyme mới vào sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ

đã bị phân hủy do nhiệt độ), nhiệt độ lai thấp dẫn đến khuếch đại ký sinh rất cao Phương pháp PCR được cải tiến và đạt được hiệu quả cao với sự xuất hiện của

polymerase chịu nhiệt Taq polymerase không bị phân hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc

tác phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối

- Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc như: Chọn mồi không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, không có cấu trúc kẹp tóc Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách nhau quá xa, thành phần các baze phải cân bằng tránh sự lập lại nhiều lần các cặp GC Mồi phải đặc trưng cho đoạn gen cần khuếch đại và không

bằng trong thành phần các Nucleotid cũng có thể làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

- Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR: Thường không thực hiện vượt quá 40 chu kỳ/phản ứng PCR Do trong giai đoạn đầu của mỗi phản ứng PCR số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu Nhưng sau đó hiệu quả khuếch đại

sẽ giảm hẳn do nhiều nguyên nhân: Sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…

- Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của cùng một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị Ống nghiệm cho mỗi nghiên cứu cụ thể cũng phải cùng loại vì đặc tính truyền nhiệt của mỗi loại ống cũng khác nhau do khác nhau về vật liệu, hình dạng ống… ảnh hưởng lớn đến quá trình thực hiện phản ứng

2.6.2 Phương pháp hóa mô tế bào (phương pháp thử GUS)

 Dùng để kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA (uidA) mã hóa enzyme glucoronidase trong mô tế bào cây chuyển gen Gen gusA do tác giả Jefferson phân lập

β-từ vi khuẩn E.coli vào năm 1986 β-glucoronidase là một hydrolase xúc tác sự phân giải

các β-glucoronide, sản phẩm phân giải có màu xanh dương đặc trưng dễ nhận biết

(Theo sup-Fluorometer-To-Quantitate-GUS-Expression-In-Plant-Tissues-Bombarded-With- The-Biolistic(r)-sup-PDS-1000-He-System-from-Bio-Rad.html)

http://www.biocompare.com/technicalarticle/1188/Using-The-VersaFluor(tm)- Trong tự nhiên gen gusA dường như không hiện diện trong thực vật vì vậy gen gusA là một gen chỉ thị rất tốt trong chuyển gen vào thực vật Sản phẩm màu rất bền và

phản ứng rất ít chịu ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc quan sát Sản phẩm thử có thể được bảo quản lâu dài trong cồn 70%

 β-glucoronide thường dùng nhất trong phản ứng thử là X-Gluc cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) X-Gluc không màu, dưới tác dụng của enzyme β-

(5-bromo-4-glucoronidase sẽ chuyển sang màu xanh rất đặc trưng Có thể kiểm tra gen gusA qua

việc sử dụng nhiều loại mô khác nhau như mô sẹo, mảnh lá, đoạn thân…thậm chí ngay trên tế bào trần Có thể thu các số liệu định lượng bằng cách so màu trên quang phổ

Thành phần Chuẩn bị cho 100 ml thuốc thử

X-Gluc (mg) Chloramphenicol NaH2PO4 (1.0M) Methanol

pH

88.9 mg 10.0 mg 5.0 mg 20.0 % 7.0-8.0

2.7 Kết luận

Việc phân tích gen chuyển trên các đối tượng nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá kết quả chuyển gen, qua đó xác định được hiệu quả của các phương pháp được sử dụng