PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Và việc nghiên cứu về sự tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để gia tăng phẩm chất cây lương thực hứa hẹn nhiều tiềm năng; trong đó vi khuẩn cố định nitơ l

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ

TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2004 – 2008

Sinh viên thực hiện: LÊ DUY HOÀNG CHƯƠNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ

TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS TS BÙI VĂN LỆ LÊ DUY HOÀNG CHƯƠNG Th.S KIỀU PHƯƠNG NAM

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Phó giáo sư, Tiến sĩ BÙI VĂN LỆ đã tạo

điều kiện thuận lợi để tôi có một môi trường học hỏi, nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt

nghiệp thật tốt

Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ KIỀU PHƯƠNG NAM đã tận tình hướng dẫn

và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm đề tài Thầy như một người anh, người bạn sẵn sàng

giúp đỡ và chia sẻ với tôi những lúc khó khăn, bế tắc khi thực hiện đề tài này

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến :

Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý

thầy cô trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt

những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt 4 năm học tại trường

Đặc biệt cảm ơn các bạn Minh Tuấn, Như Thùy, Ngọc Hà, Thành Trung, Minh

Thư, Thúy Loan, Phi Loan, Minh Trang, Phương Khánh, Bích Ngọc, Tuấn Cường, Hồng

Hạnh, Bích Nguyên lớp 04CS, em Hoàng Nguyên lớp 06CS trường Đại học Khoa Học

Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã thân thiện giúp đỡ và chia sẻ những buồn vui với tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Các bạn bè thân thương trong nhóm A Week Holiday và các bạn lớp CNSH

K30 đã cùng tôi san sẻ những niềm vui cũng như nỗi buồn trong những năm học đại học

Đặc biệt con cảm ơn Bố, Mẹ đã luôn chăm lo, ủng hộ, tin tưởng và là chỗ dựa

tinh thần vững chắc cho con để con vững bước đến ngày hôm nay

Lê Duy Hoàng Chương

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn cố định nitơ trên cây họ Đậu” được thực hiện

tại trại Thực nghiệm sinh học, phòng Sinh học phân tử - Lab B, trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008

* Mục tiêu đề tài:

 Phân lập những chủng vi khuẩn Azospirillum sp và vi khuẩn Bradyrhizobium sp

trên môi trường chọn lọc NFb, CRA và YEM, YEMA

 Tuyển chọn những chủng phân lập về khả năng cố định nitơ và kích thích thực vật tăng trưởng

 Định danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA kết hợp với một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa

* Kết quả:

 Phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng được trên các môi trường chọn lọc từ nguồn mẫu là rễ cây họ Đậu có nốt sần và đất ở vùng rễ được lấy ở Thủ Đức và vườn Quốc gia Nam Cát Tiên

 Chọn lọc được 8 chủng vi khuẩn vừa có khả năng cố định nitơ, vừa có khả năng phân tiết các loại phytohormone kích thích thực vật tăng trưởng

 Định danh được 8 chủng vi khuẩn thuộc 8 loài của 5 chi vi khuẩn cố định nitơ khác

nhau bao gồm: Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella oslensis, Bacillus acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia và Klebsiella sp

 Xác định môi trường NFb và CRA không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn

Azospirillum sp và môi trường YEM không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn Bradyrhizobium sp

 Hai cặp mồi thoái hóa PolF – PolR và nifHfor – nifHrev không hoàn toàn đặc hiệu với gene nifH của 8 chủng đã định danh

SUMMARY

The thesis was entitled “Isolation and identification of nitrogen – fixing

bacteria in Legumes” This thesis was carried out at Biologically Experimental House

and Lab B, University of Science, National University, Ho Chi Minh city, Vietnam, from March to September, 2008

Recently, global agriculture is facing food crisis caused by bad effects of increasing world population, natural calamity, and contaminated agricultural land or large-scale growing GMF (genetically modified food) For this problem, many methods were conducted in order to produce fertilizers for the aim of enhancement of botanical nutritional level, plant growth promotion, disease suppression, and/or environmental

amicability Microorganism fertilizer is a highlight Azospirillum sp and Bradyrhizobium

sp are rhizosphere bacteria possessing a great many of those properties for plant fertilizer applications Thus, in this thesis, our goal is isolation of new species of the two genera

 Selection of plant growth-promoting isolates

 Identification of the selective isolates by analysis of 16S rDNA sequence data

Results:

 Isolated 14 strains from NFb and CRA media, 11 strains from YEM and YEMA ones

 8 isolates were selected for their plant growth-promoting abilities

 Identified 8 isolates to belong to 8 different species of 5 varied genera They are nitrogen-fixing bacteria or plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) such as

Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella oslensis, Bacillus acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia and Klebsiella sp

 Drew the conclusion of the imperfectly selective NFb or CRA media for

Azospirillum sp and the incompletely selective YEM and YEMA ones for Bradyrhizobium sp

 The degenerated PolF-PolR and nifHfor-nifHrev primers were not specific for nifH

genes of 8 defined strains

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iii

SUMMARY iv

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ ix

DANH MỤC BẢNG xii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ xiv

Chương 1 MỞ ĐẦU 15

1.1 Đặt vấn đề 15

1.2 Mục tiêu 16

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17

2.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật 17

2.2 Thực vật họ Đậu 17

2.3 Quá trình cố định nitơ 18

2.3.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên 18

2.3.2 Quá trình cố định nitơ 19

2.4 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ 20

2.4.1 Phân loại 20

2.4.2 Đặc điểm 20

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên 22

2.5 Vi khuẩn chi Azospirillum 23

2.5.1 Lịch sử phát hiện 23

2.5.2 Phân loại 24

2.5.3 Sự phân bố 26

2.5.4 Cơ chế tương tác của Azospirillum với thực vật 28

2.5.5 Đặc điểm 30

2.5.5.1 Đặc điểm hình thái 30

2.5.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 30

2.5.5.3 Khả năng cố định nitơ 31

2.5.5.4 Vai trò và ứng dụng 32

2.6 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium 33

2.6.1 Lịch sử phát hiện 33

2.6.2 Phân loại 34

2.6.3 Sự phân bố 34

2.6.4 Đặc điểm 34

2.6.4.1 Khả năng cố định nitơ 35

2.6.4.2 Vai trò và ứng dụng 37

2.7 Gene nif 37

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

3.1 Bố trí thí nghiệm 38

3.2 Vật liệu thí nghiệm 38

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 38

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 38

3.2.3 Hóa chất 39

3.2.3.1 Các loại môi trường dùng cho thí nghiệm 39

3.2.3.2 Một số hóa chất khác 40

3.3 Phương pháp thí nghiệm 40

3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần 42

3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh vi khuẩn 42

3.3.1.2 Phân lập và làm thuần 42

3.3.1.3 Giữ giống 43

3.3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn 43

3.3.2.1 Quan sát hình thái và đo kích thước tế bào 43

3.3.2.2 Xác định Gram vi khuẩn 43

3.3.2.3 Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbon 45

3.3.3 Thí nghiệm 3: Định tính khả năng cố định nitơ bằng phản ứng hóa học 46

3.3.4 Thí nghiệm 4: Định tính và định lượng các loại phytohormone thô có trong dịch khuẩn 47

3.3.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin 47

3.3.4.2 Xác định hoạt tính Cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên tử diệp dưa chuột 49

3.3.4.3 Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên hạt xà lách 50

3.3.5 Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA 52

3.3.5.1 Ly trích DNA bộ gene vi khuẩn 52

3.3.5.2 Khuếch đại trình tự rDNA 16S của vi khuẩn bằng phản ứng PCR 54

3.3.5.3 Gửi mẫu giải trình tự và xử lý kết quả giải trình tự 56

3.3.6 Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR 56

3.3.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa 58

3.3.7.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý 58

3.3.7.2 Khảo sát một số đặc điểm sinh hóa 60

3.3.7.3 Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 63

3.3.8 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng định danh 65

3.3.9 So sánh độ tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj) 66

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67

4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần 67

4.1.1.1 Tăng sinh vi khuẩn 67

4.1.1.2 Phân lập và làm thuần 68

4.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn 69

4.2.1 Quan sát hình thái tế bào 69

4.2.2 Xác định Gram vi khuẩn 71

4.2.2.1 Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbon 72

4.3 Thí nghiệm 3: Định tính khả năng cố định nitơ bằng phản ứng hóa học 73

4.4 Thí nghiệm 4: Định tính và định lượng các loại phytohormone thô có trong dịch khuẩn 75

4.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin 75

4.4.2 Định lượng auxin thô, cytokinin thô và gibberellin thô 76

4.5 Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA của vi khuẩn 79

4.5.1 Kết quả tách chiết DNA bộ gene vi khuẩn 79

4.5.2 Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu 80

4.6 Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR 82

4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa 86

4.7.1 Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh lý 86

4.7.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh hóa 92

4.7.3 Kết quả định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 95

4.7.4 Kết quả định tính PHB 96

4.8 Kết quả giải trình tự và định danh 96

4.9 Thảo luận 109

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 113

5.1 Kết luận 113

5.2 Đề nghị 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC

EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid EPS Exopolysaccharide

EtOH Ethanol

g gram

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình Trang

Hình 2.1 – Hoa của một cây họ Đậu 18

Hình 2.2 – Chu trình nitơ trong tự nhiên 19

Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật 22

Hình 2.4 – Cây phát sinh loài (phylogenetic tree) của Azospirillum 26

Hình 2.5 – Mô hình về sự tương tác giữa Azospirillum và rễ thực vật 29

Hình 2.6 – Cơ chế tạo nốt sần của Bradyrhizobium sp 36

Hình 2.7 – Leghaemoglobin 36

Hình 3.1 – Các bước nhuộm Gram 44

Hình 3.2 – Khoảng đổi màu của Bromothymol blue 45

Hình 3.3 – Vị trí bắt cặp các mồi trên trình tự 16S rDNA 54

Hình 3.4 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA 55

Hình 3.5 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch gene nifH 57

Hình 3.6 – Sự chuyển màu của dung dịch chuẩn độ từ tím đỏ sang vàng cam 65

Hình 4.1 – Các ống nghiệm môi trường NFb sau 5 ngày tăng sinh 67

Hình 4.2 – Các ống nghiệm môi trường YEM sau 5 ngày tăng sinh 68

Hình 4.3 – Dịch khuẩn chủng 4415b có NH 4 + làm đổi màu giấy quỳ ẩm thành xanh 74

Hình 4.4 – Màu hồng do thuôc thử Salkowski phản ứng với auxin do chủng 4415b tiết ra trên giấy lọc có sinh khối vi khuẩn 75

Hình 4.5 – Sự khác biệt giữa tử diệp được xử lý với cytokinin thô và nước cất

(đối chứng – ĐC) 77

Hình 4.6 – Hình điện di DNA bộ gene của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu 79

Hình 4.7 – Kết quả điện di sản phẩm PCR DNA bộ gene 8 chủng nghiên cứu với cặp mồi 27F – 1525R 81

Hình 4.8 - Kết quả điện di sản phẩm PCR DNA bộ gene của 2 chủng 4453 và 4553 bằng cặp mồi 20F – 1500R 81

Hình 4.9 – Kết quả sản phẩm PCR với 3 cặp mồi 520F – 920R, 920F – 1525R

và 20F – 520R 82

Hình 4.10 – Kết quả điện di sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi PolF – PolR 83

Hình 4.11 – Kết quả điện di sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi nifHfor – nifHrev 84

Hình 4.12 – Sự phát triển của các chủng ở nhiệt độ tối ưu 91

Hình 4.13 – Kết quả định tính PHB của chủng 4415b và 4453 dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 460nm 96

Hình 4.14 – Cây phát sinh loài tổng quát của các chủng 4415b, 4485 và 4487 với các chủng chuẩn khác trong chi Bacillus 99

Hình 4.15 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4415b với các chủng trong chi Bacillus có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát 100

Hình 4.16 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4485 với các chủng trong chi Bacillus có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát 100

Hình 4.17 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4487 với các chủng trong chi Bacillus có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát 101

Hình 4.18 - Cây phát sinh loài cho chủng 4420c và các chủng thuộc chi

Pseudomonas 102

Hình 4.19 - Cây phát sinh loài chủng cho chủng 4453 và các chủng thuộc chi Moraxella 103

Hình 4.20 – Cây phát sinh loài tổng quát của chủng 4553 và 4574 với tất cả chủng chuẩn thuộc chi Klebsiella 105

Hình 4.21 - Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4553 với các chủng trong chi Klebsiella có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát 106

Hình 4.22 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4574 với các chủng trong chi Klebsiella có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát 106

Hình 4.23 - Cây phát sinh loài của chủng 4560 với các chủng chuẩn thuộc chi Burkholderia 108

Sơ đồ Trang

Sơ đồ 3.1 – Quy trình thí nghiệm 41

Sơ đồ 3.2 – Quy trình tách chiết các phytohormone từ dịch nuôi cấy vi khuẩn theo

phương pháp ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 51

Sơ đồ 3.3 – Quy trình ly trích DNA bộ gene vi khuẩn theo phương pháp CTAB 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 – Các cơ chế kích thích thực vật sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ ở

vùng rễ 23

Bảng 2.2 – Các loài Azospirillum sp đã được định danh (nguồn từ NCBI) 24

Bảng 2.3 – Độ tương đồng di truyền trình tự 16S rDNA của các loài

Azospirillum sp .25

Bảng 2.4 – Sự phân bố của Azospirillum sp .27

Bảng 2.5 – Những đặc điểm sinh lý và sinh hóa chính của Azospirillum sp 31

Bảng 2.6 – Các loài Bradyrhizobium sp đã được định danh (nguồn từ NCBI) 34

Bảng 2.7 – Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ 37

Bảng 3.1 – Các loại môi trường dùng cho thí nghiệm 39

Bảng 3.2 – Khảo sát sự tương quan giữa OD 530nm và nồng độ IAA (mg/l) 48

Bảng 3.3 – Định lượng auxin thô từ dịch nuôi cấy vi khuẩn 49

Bảng 3.4 – Nồng độ BA để xây dựng đường chuẩn 50

Bảng 3.5 – Các các cặp mồi dùng để khuếch đại trình tự 16S rDNA của vi khuẩn 54

Bảng 3.6 – Nhiệt độ bắt cặp t a o C tương ứng với từng cặp mồi 55

Bảng 3.7 – Các cặp mồi dùng để khuếch đại gene nifH 57

Bảng 3.8 – Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14 GNR 62

Bảng 4.1 – Danh mục các chủng vi sinh vật phân lập được trên 2 môi trường chọn lọc CRA và YEMA 69

Bảng 4.2 – Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật phân lập được trên

môi trường CRA và YEMA 70

Bảng 4.3 – Kết quả xác định Gram của 16 chủng vi khuẩn 71

Bảng 4.4 – Kết quả khảo sát khả năng biến dưỡng các nguồn carbon của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường CRA 72

Bảng 4.5 – Kết quả khảo sát khả năng biến dưỡng các nguồn carbon của các chủng vi khuẩn trên môi trường YEMA 73

Bảng 4.6 – Kết quả định tính NH 4 + trong dịch vi khuẩn 74

Bảng 4.7 – Kết quả định tính Auxin bằng thuốc thử Salkowski 75

Bảng 4.8 – Kết quả định lượng auxin thô, cytokinin thô và gibberellin thô trong các dịch khuẩn của 12 chủng vi khuẩn nghiên cứu 77

Bảng 4.9 – Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gene của 8 chủng nghiên cứu 80

Bảng 4.10 – Chú thích hình điện di 4.10 83

Bảng 4.11 – Chú thích hình điện di 4.11 84

Bảng 4.12 – Kết quả khảo sát nhiệt độ của 8 chủng nghiên cứu 90

Bảng 4.13 – Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên kit IDS 14GNR của 8 chủng nghiên cứu92 Bảng 4.14 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 5 chủng nghiên cứu phân lập trên môi trường CRA 93

Bảng 4.15 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý sinh hóa của 3 chủng nghiên cứu

phân lập trên môi trường YEMA 94

Bảng 4.16 – Kết quả định lượng nitơ tồng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp Kjeldahl 95

Bảng 4.17 – Độ dài trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu sau khi giải trình tự 96

Bảng 4.18 - Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn đã được công bố trên NCBI 97

Bảng 4.19 – Độ tương đồng di truyền của các chủng 4415b, 4485, 4487 với những có mối quan hệ gần nhất 101

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ

Biểu đồ 4.1 - Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của 8 chủng vi khuẩn 90

Biểu đồ 4.2 – Lượng nitơ tổng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu 95

Đồ thị Trang Đồ thị 4.1 – Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ IAA và OD 530nm 76

Đồ thị 4.2 – Đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l) 76

Đồ thị 4.3 – Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD 610nm và mật độ tế bào 86

Đồ thị 4.4 – Đường cong tăng trưởng của chủng 4415b 87

Đồ thị 4.5 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4420c 87

Đồ thị 4.6 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4453 87

Đồ thị 4.7 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4485 88

Đồ thị 4.8 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4487 88

Đồ thị 4.9 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4553 88

Đồ thị 4.10 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4560 89

Đồ thị 4.11 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4574 89

1 Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chịu sự tác động bởi tình trạng khắc nghiệt của thời tiết cũng như là hậu quả của

sự tăng dân số trên toàn cầu, thế giới đang đứng trước cuộc khủng hoảng lương thực trầm trọng Giá lương thực đang tăng nhanh, một châu Á giàu có hơn đang đòi hỏi nhiều lương

thực hơn, tuy nhiên vẫn không đủ lượng lương thực để đáp ứng [75] Do đó, nhiều biện

pháp và nghiên cứu đã được đề ra nhằm gia tăng lượng lương thực, thực phẩm một cách đáng kể cũng như gia tăng hàm lượng chất dinh dưỡng chính yếu như nguồn đạm, nguồn đường một cách tối đa để phần nào giúp giải quyết được vấn đề trên

Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của khoa học - công nghệ, nhiều giải pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất của cây trồng như sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học, và gần đây nhất khi đối mặt với cuộc khủng hoảng lương thực, nhiều quốc gia trước đây đã nghiêm cấm việc trồng thực vật biến đổi gene thì giờ đây đang xem xét việc tiến hành trồng đại trà và phổ biến những cây trồng biến đổi gene Những giải pháp trên tuy đem lại hiệu quả nhanh chóng trước mắt trong việc cải thiện năng suất, gia tăng phẩm chất cây trồng; tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như gây ô nhiễm môi trường, thoái hóa đất nông nghiệp, ảnh hưởng xấu đến sự đa dạng sinh học và tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi Ngoài ra, do tình trạng ô nhiễm môi trường hiện đang là vấn đề chung cấp bách của các quốc gia trên thế giới nên việc xây dựng một nền nông nghiệp năng suất cao nhưng bền vững và thân thiện với môi trường đã trở thành một xu hướng mới trên toàn cầu Và việc nghiên cứu về sự tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để gia tăng phẩm chất cây lương thực hứa hẹn nhiều tiềm năng; trong đó vi khuẩn cố định nitơ là đối tượng điển hình Bên cạnh khả năng cố định nitơ để thực vật hấp thu giúp tăng hàm lượng đạm cho cây, một số vi khuẩn

cố định nitơ như Azospirillum, Herbaspirillum, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Gluconoacetobacter,… còn có khả năng phân tiết ra các chất kích thích tố thực vật –

phytohormon, sản xuất siderophore, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế

sự phát triển của mầm bệnh; qua đó, kích thích sinh trưởng thực vật Trong đó, các loài

Azospirillum là những vi khuẩn cố định nitơ đầu tiên được phân lập từ rễ thực vật thân

thảo và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực

vật; cũng như Bradyrhizobium sp là những loài vi khuẩn quang dưỡng ở rễ cây họ Đậu,

mang nhiều đặc tính ưu việt của chi vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh

Trên thế giới, vi khuẩn cố định nitơ đã được nghiên cứu vào khoảng đầu thế kỷ 19, mặc dù vậy, tiềm năng ứng dụng của chúng vẫn chưa được khám phá hết Ở nước ta, việc nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ đã phổ biến và hiện nay trên thị trường phân bón trong nước đã có nhiều chế phẩm phân vi sinh cố định đạm ra đời Tuy nhiên, việc nghiên cứu

vi khuẩn cố định nitơ ở nước ta chỉ tập trung vào những giống phổ biến, có khả năng cố

định nitơ mạnh như Rhizobium, Azotobacter mà ít nghiên cứu những giống khác ngoài

khả năng cố định nitơ còn có tác dụng kích thích sinh trưởng cây trồng Ngoài ra, nguồn

đa dạng sinh học của nước ta khá phong phú nên việc tìm kiếm, nghiên cứu và sử dụng những loài vi khuẩn cố định nitơ mới có những tiềm năng mới là rất cần thiết

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Phân lập và định danh vi khuẩn cố định nitơ trên cây họ Đậu”

1.2 Mục tiêu

 Phân lập và tuyển chọn những vi khuẩn có khả năng cố định nitơ và có đặc tính

kích thích sinh trưởng thực vật thuộc chi Azospirillum và Bradyrhizobium

 Định danh tìm kiếm loài mới để ứng dụng sản xuất phân vi sinh

2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Nitơ là thành phần cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, enzyme, acid nucleic, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật dao động từ 1 – 3% Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò quan trọng bậc nhất đối với đời sống thực vật Nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của cây trồng Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất cây trồng Cây sinh trưởng mạnh, thân

lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có thu hoạch [63], [64]

2.2 Thực vật họ Đậu

Thực vật họ ĐậU, tên khoa học Leguminosae (Fabaceae) – là họ lớn thứ 2 của thực vật có hoa với 650 chi và 18000 loài Nhiều cây trong họ này làm lương thực cho con người và gia súc như cây Đậu Hà-lan, Đậu cô-ve, Đậu tương… hoặc làm phân xanh như

cỏ ba lá, muồng Ngoài ra một số cây trong họ này được dùng trong mục đích cải tạo đất

bị thoái hóa, phục hồi, cải tạo môi trường sinh thái như keo, bồ kết ba gai Một số chi trong họ này như Mimosa, Delonix, Acacia… là các loại cây cảnh Đặc biệt, một số loài còn có tính chất dược học hoặc diệt trừ sâu bọ

Một đặc điểm nổi bật của các loài cây thuộc họ Đậu là chúng là các loại cây ký chủ cho nhiều loài vi khuẩn cố định nitơ ở rễ của chúng [67]

Trong giới Thực vật, vị trí phân loại của các cây

họ Đậu như sau:

2.3.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên

Khí nitơ chiếm khoảng 80% trong bầu khí quyển Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật sống đều không thể sử dụng được dạng nitơ này Khí nitơ này có thể được các vi sinh vật

cố định nitơ biến đổi thành dạng ammonia (NH3) – dạng nitơ mà hầu hết thực vật trong tự nhiên sử dụng để tạo ra amino acid, protein, nucleic acid và những thành phần khác chứa nitơ cần thiết cho sự sống Cũng như carbon, nitơ trong tự nhiên cũng có chu trình chuyển hóa Giữa chu trình nitơ và không khí có sự trao đổi thường xuyên: nitơ phân tử chuyển thành dạng nitơ kết hợp do các quá trình cố định nitơ sinh học, do tác dụng của điện và cố định quang học [65], [79], [69]

Chu trình nitơ trong tự nhiên có 2 giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ

Giai đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do,… sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ

NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Ở giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các chủng vi

khuẩn nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter để chuyển NH3 thành nitrat (NO3-) – dạng thích hợp nhất để cho cây trồng hấp thu [79]

Hình 2.2 – Chu trình nitơ trong tự nhiên [70]

N 2 + 8H + + 8e− + 16 ATP → 2NH 3 + H 2 + 16ADP + 16 Pi [54]

Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi 2 thành phần, đó là protein

có phân tử nhỏ Một thành phần gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II Thành phần kia gọi là protein sắt – molybden (Mo-Fe protein) còn gọi

là thành phần I Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đếu rất mẫn cảm với oxy,

vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [9]

Sự cố định nitơ sinh học có thể xảy ra trên nhiều đối tượng trong tự nhiên như tảo

lam, địa y và vi sinh vật sống tự do trong đất Tuy nhiên, sự cố định nitơ ở những sinh vật

này chỉ cung cấp một lượng đáng kể NH3 cho hệ sinh thái tự nhiên mà hầu hết không có ý

nghĩa nhiều đối với ngành nông nghiệp Chúng cung cấp khoảng dưới 5kg nitơ/hecta một

năm Trong khi đó, sự cố định nitơ ở cây họ Đậu cung cấp khoảng từ 28kg đến 84kg nitơ/

hecta một năm ở hệ sinh thái tự nhiên, và khoảng vài trăm kg trong ngành nông nghiệp [43]

2.4 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

2.4.1 Phân loại

Vi khuẩn cố định nitơ được phân thành 3 nhóm nhỏ: vi khuẩn sống cộng sinh, vi

khuẩn sống tự do và vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ Tuy nhiên, sự phân biệt giữa

3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định nitơ

tương tác với thực vật thì vẫn chưa được được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn

được xếp vào nhiều nhóm [54]

2.4.2 Đặc điểm

- Vi khuẩn sống cộng sinh là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ

theo kiểu 2 bên cùng có lợi Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh

dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình

là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ ĐậU Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn

và thực vật được xem như là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi

khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn

gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu; hay là những thành viên của xạ

khuẩn chi Frankia – là những vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên

cây thân gỗ, cây 2 lá mầm và cây bụi Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu

được phân loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến như

là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia) Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu

được phân loại thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium [54]

- Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn tương

tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng

sinh chuyên biệt Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter, Pseudomonas và Clostridium [54]

- Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao

đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật Để phân biệt được vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủ yếu dựa vào mức độ tương tác Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố định nitơ bởi những vi khuẩn sống tự do nhưng lại chịu sự ảnh hưởng trực tiếp của cây trồng Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác bắt buộc Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa quá trình cố định nitơ cộng sinh và tự do Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận của rễ cây thực vật đến những vi khuẩn sống nội sinh trong

mô tế bào thực vật Để quá trình cố định nitơ tương tác có thể diễn ra cần những yêu cầu sau đây: 1) thực vật ký chủ; 2) vi khuẩn cố định nitơ; 3) chất nền thực vật; 4) môi trường thích hợp để enzym nitrogenase hoạt động; và 5) quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng Một số chi vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác

điển hình như: Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbaspirillum, và Klebsiella

Vi khuẩn cộng sinh cư trú ở vùng gian bào

(Endosymbionts)

Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh tạo nốt sần trên rễ cây họ Đậu

Vi khuẩn cư trú ở vùng ngoại bào (Ectosymbionts)

Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật bậc thấp

Vi khuẩn bên trong mô cây chủ (Endophytes)

Ví dụ: Herbaspirillum sp ở cây mía

Vi khuẩn chỉ sống trên bề mặt cây

Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella cư trú ở vùng rễ thực vật

Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật [54]

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên

Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây trồng Tuy nhiên, bên cạnh đó các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như:

- Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase, hay tạo ra các phytohormone như auxin, cytokinin và gibberellin [20], [44], [54]

- Giảm tác động có hại của các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ [44], [54]

Bảng 2.1 – Các cơ chế kích thích thực vật sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ ở

vùng rễ [44]

Cố định nitơ Hút các ion Sắt, kẽm và các nguyên tố vi lượng khác Phosphate

Tạo ra hormone thực vật Auxin, cytokinin, gibberellin, ethylene Thay đổi sự phát triển của thực vật

ACC deaminase Elicitors

2.5 Vi khuẩn chi Azospirillum

2.5.1 Lịch sử phát hiện

Vào năm 1922, Beijerinck – nhà vi sinh vật học và thực vật học người Hà Lan đã

phát hiện một chủng vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có

nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn Ông nhận thấy rằng khi dùng môi trường trên để nuôi cấy chủng vi khuẩn mới này thì có sự gia tăng hàm lượng nitơ, trong khi đó, trong môi trường không có chủng này thì không có biểu hiện như vậy Do chủng vi khuẩn này dễ nuôi cấy trên môi trường muối khoáng với acid hữu cơ, cũng như có hình dạng

giống với Spirillum trong những điều kiện nhất định, Beijerinck đã xem chủng này là một thành viên của chi Spirillum và là vi sinh vật trung gian kết nối giữa chi Spirillum và Azotobacter Ban đầu, ông đặt tên chủng mới này là “Azotobacter Spirillum”, nhưng sau

đó lại đổi tên thành “Spirillum lipoferum” Năm 1932, Schroder đã tiến hành nghiên cứu lại về S lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi chứng minh sự cố định nitơ bởi những

chủng vi khuẩn thuần, và vì thế chủng này đi vào quên lãng trong nhiều năm Vào năm

1963, Becking đã phân lập được một vi sinh vật tương tự với S lipoferum có khả năng cố

định nitơ rõ rệt Mười năm sau đó, Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ

phân lập được từ mẫu đất của Italy là Spirillum lipoferum và chứng minh được khả năng

cố định nitơ của chủng này trong canh trường lỏng có bổ sung một lượng nhỏ cao nấm men Vào năm 1978, Tarrand và cộng sự đã công bố trong tài liệu nghiên cứu khóa phân

loại di truyền một loài vi khuẩn tên là “Azospirillum lipoferum”, bởi vì loài này có độ

tương đồng di truyền cũng như có nhiều đặc điểm tương ứng với mô tả của Beijerinck về

S lipoferum, đặc biệt là chúng hình thành những tế bào có hình dạng giống với Spirillum

trong điều kiện nhất định [20]

Cho đến tháng 6 năm 2008, đã có 12 loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum được

định danh theo nguồn từ ngân hàng dữ liệu gene NCBI Tên các loài vi khuẩn đã được định danh được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.2 – Các loài Azospirillum sp đã được định danh (nguồn từ NCBI)

STT Tên loài Tác giả và năm công bố

rDNA, Stoffels và cộng sự (2001) đã chứng minh rằng 7 loài thuộc chi Azospirillum đã

được phân lập, cũng như Skermanella và Rhodocista tạo thành một nhóm Riêng

A brasilense, A lipoferum, A doebereinerae, A largimobile và A halopraeferens hình

thành một nhóm phụ, trong khi A irakense, A amazonense và Rhodocista tạo thành nhóm

phụ thứ hai (hình 3.4) Skermanella được xem là hình thành một nhóm phụ thứ ba Hàm

lượng G+C DNA cho những loài này trong khoảng 64 – 71 mol% Và độ tương đồng di

truyền trình tự 16S rDNA giữa các loài nằm trong cùng một nhóm phụ là khoảng 93,6 – 96,6% và giữa các loài của 2 nhóm phụ là 90,2 – 90,6% Bên cạnh việc dùng trình

tự 16S rDNA để định danh các loài trong chi Azospirillum bằng sinh học phân tử,

Kirchhof và Hartmann còn phân tích trình tự 23S rDNA Tuy nhiên, độ tin cậy khi dùng

trình tự 23S rDNA không cao như trình tự 16S rDNA [20]

Bảng 2.3 – Độ tương đồng di truyền trình tự 16S rDNA của các loài

Azospirillum sp [20]

Hình 2.4 – Cây phát sinh loài (phylogenetic tree) của Azospirillum [20]

2.5.3 Sự phân bố

Trong tự nhiên, Azospirillum tập trung ở vùng rễ, gốc và lá của nhiều cây trồng

trên toàn thế giới, phân bố từ vùng khí hậu nhiệt đới ẩm đến vùng khí hậu nóng (bảng 2.3) Ở miền nhiệt đới ẩm có thể phát hiện được chi này với mật độ khoảng từ 105 – 107 vi khuẩn/gram đất hay rễ ở những cây trồng như mía, ngũ cốc, cỏ Kallar,… Bên cạnh đó, có

thể phân lập được từ 30 – 90% A brasilense và A lipoferum từ mẫu đất và rễ [20], [54]

Do hầu hết các chủng Azospirillum tập trung ở bề mặt và một số ít ở bên trong rễ,

thân và lá (bên trong mô thực vật sống), vì vậy mà chúng được gọi là “vi khuẩn cố định nitơ không bắt buộc” Thuật ngữ này dùng để phân biệt với những chủng vi khuẩn cố định

nitơ bắt buộc mà đại diện trong đó là Gluconacetobacter diazotrophicus – vi khuẩn được

tìm thấy sống nội sinh trong cây mía [20]

Bảng 2.4– Sự phân bố của Azospirillum sp [20]

Các loài

Azospirillum sp Thực vật ký chủ Quốc gia phân lập

Cỏ làm thức ăn gia súc Brazil, Trung nam Mỹ, Nam Phi

Cây họ ĐậU Nhiều quốc gia

Cây xương rồng Mexico Cây ngũ cốc chính (lúa) Ấn Độ, Ai Cập, Phillipines, Pháp Nước sông, hồ Úc

A brasilense &

A lipoferum

Thực vật C4 (Miscanthus và Spartina)

Đức

A doebereinerae Miscanthus Đức

A halopraeferens Cỏ Kallar Punjab/Pakistan

Cỏ làm thức ăn gia súc Brazil Lúa, lúa mì, bắp, Sorgum Brazil

Cọ (Bactris gasipeas) Brazil (Amazon)

Ở cây bắp, Azospirillum tập trung ở vùng rễ, lớp vỏ ngoài và lớp vỏ trong và ở

phần trụ giữa Sự xâm nhiễm vào lớp vỏ bên trong và phần trụ giữa xảy ra khi không có các tế bào vi khuẩn ở lớp mô bên ngoài Vi khuẩn có thể xâm nhiễm đầy những mạch mô mộc thứ cấp Ban đầu, sự xâm nhiễm xảy ra ở nhánh rễ và lan rộng theo chiều dọc vào

trong rễ chính Khi nuôi cấy kê ngọc trai và cỏ Guinea, có thể tìm thấy Azospirillum bên

trong lớp nhầy (mucigel) của rễ và gắn chặt với lông rễ Vi khuẩn xâm nhập vào rễ thông qua lông hút và không gian trống được tạo nên bởi sự bong tróc lớp biểu mô và phần rễ

nhú ra bên ngoài Bên cạnh đó, Azospirillum còn được tìm thấy trong lớp gian bào và nội

bào của mô rễ với số lượng lớn [20]

2.5.4 Cơ chế tương tác của Azospirillum với thực vật [20]

Ở vùng rễ thực vật luôn rò rỉ những chất dinh dưỡng dư thừa, những chất này nằm trong đất xung quanh vùng rễ và dẫn dụ nhiều vi khuẩn tự do trong đất đến sử dụng, trong

đó có Azospirillum; và vi khuẩn trong đất sử dụng những chất này như nguồn carbon cung

cấp năng lượng cho chúng Theo Van Bastelaere và cộng sự (1999) trong chất dinh dưỡng

rò rỉ ở thực vật có một loại protein acid 40 kDa gọi là SbpA – protein hướng hóa

(chemotaxis) đóng vai trò giúp A brasilense phát hiện và di chuyển đến những nơi có

nguồn đường như D – fructose, L – arabinose, và D – galactose Một yếu tố khác quan

trọng liên quan đến việc di chuyển của Azospirillum là nồng độ oxy (gradient oxy) Yếu

tố này rất cần thiết cho vi khuẩn xác định được nơi thích hợp nhất để tiến hành cố định nitơ trong điều kiện kỵ khí Michiels và cộng sự (1991) cho rằng sau khi di chuyển đến rễ

thực vật, Azospirillum sp gắn bám vào rễ, quá trình này gồm 2 giai đoạn : giai đoạn 1,

từng tế bào vi khuẩn đơn lẻ hút bám nhanh, một cách lỏng lẻo vào rễ nhờ lông roi ở đầu; giai đoạn 2, vi khuẩn kết hợp lại thành khối gắn chặt vào rễ, giai đoạn này phụ thuộc vào

sự sản xuất polysaccharide ngoại bào Theo Burdman và cộng sự (1998), sự sản xuất

polysaccharide ngoại bào liên quan đến quá trình kết tụ của những tế bào Azospirillum

Ngoài ra, Castellanos và cộng sự (1998) cho rằng một số protein giống lectin trên vách tế

bào của Azospirillum có thể có liên quan đến quá trình nhận biết và định cư của vi khuẩn

tại bề mặt rễ thực vật Bên cạnh đó, người ta đã phát hiện được một loại protein màng

ngoài khoảng 42 kDa ở loài A brasilense Theo Burdman và cộng sự, 1999, trong điều

kiện phát triển nào đó, những protein màng ngoài này tương tác với polysaccharide ngoại bào (EPS), dẫn đến hiện tượng các tế bào vi khuẩn kết tụ lại với nhau Sau khi gắn bám vào bề mặt rễ, vi khuẩn tiến hành tương tác với thực vật ký chủ Trong quá trình tìm kiếm

những gene của Azospirillum liên quan đến quá trình tương tác với thực vật, người ta đã

phát hiện ra được những trình tự tương đồng với gene chv ở A tumefaciens, gene nod và gene hsn ở Rhizobium Đó là gene chvB và nodPQ ở loài A brasilense Tuy nhiên, chức năng của những gene này trong sự tương tác giữa Azospirillum – thực vật ký chủ vẫn

chưa được sáng tỏ

Mặc dù cơ chế tương tác giữa Azospirillum và thực vật ký chủ đã được nghiên cứu

nhiều nhưng vẫn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên, tác giả Del Gallo và Fendrick (1994) đã đề nghị một mô hình về cơ chế tương tác như sau:

Hình 2.5 – Mô hình về sự tương tác giữa Azospirillum và rễ thực vật [20]

Sự gắn bám giai đoạn 1

Vi khuẩn tạo những sợi PS (polysaccaride)

Sự gắn bám giai đoạn 2

Xuất hiện tế bào dị hình

Vi khuẩn tiếp tục trao đổi những phân tử tín hiệu và có thể di chuyển vào trong lông hút của

2.5.5 Đặc điểm

2.5.5.1 Đặc điểm hình thái

Theo như mô tả của Krieg và Dobereiner (1984), Azospirillum sp có dạng hình

que mập cong, có kích thước 0,8 – 1 x 25μm, có nang PHB, và những tế bào cố định nitơ

có thể đạt 50% trọng lượng khô tế bào Tế bào di động nhờ một tiêm mao đơn ở đầu

Nhiều tiêm mao phía sau có chiều dài ngắn hơn được quan sát thấy ở A lipoferum và

A brasilense khi nuôi cấy trên môi trường thạch mềm Khi nuôi cấy trên môi trường thiếu

dinh dưỡng thì thấy xuất hiện những dạng tế bào giống nang, hay chữ C không di động ở

loài A lipoferum và A brasilense; tuy nhiên, nếu nuôi cấy trên môi trường có nguồn

carbon là fructose thì chúng có hình dạng xác định Theo Berg (1979), Umali-Garcia và cộng sự (1980), tế bào hình chữ C giúp cho việc bảo vệ nitrogenase khỏi oxy không khí Còn theo Sadasivan và Neyra (1985), tế bào hình chữ C có khả năng chịu được sự khô nóng hơn những tế bào sinh dưỡng, và vì vậy, chúng được xem là những nang thật (true

cyst) Những tế bào giống như nang ở loài A brasilense được phát hiện thấy ở vùng rễ

cây lúa mì [20]

2.5.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Thông thường tế bào Azospirillum là Gram âm nhưng với A brasilense có Gram

biến đổi [20]

Azospirillum là vi khuẩn hiếu khí điển hình khi có sự hiện diện của hợp chất nitơ

và nó có khả năng của một vi khuẩn cố định nitơ chỉ trong điều kiện vi hiếu khí và thiếu hụt nitơ [20]

Theo Stephan và cộng sự (1984), ở loài A brasilense và A lipoferum, NO3- có thể thay thế O2 trong quá trình hô hấp, và dưới điều kiện kỵ khí, chúng sẽ tạo ra N2 và N2O

Và khi đó, quá trình sinh trưởng kỵ khí cũng như sự cố định nitơ sẽ diễn ra [20]

Theo Tarrand và cộng sự (1978), loài A lipoferum có khả năng sinh trưởng kém

trên môi trường có nguồn carbon là glucose hay fructose Nguồn cơ chất carbon thích hợp

nhất với tất cả các loài Azospirillum là những acid hữu cơ như L – malate, succinate,

để phân lập và nuôi cấy, bởi vì loài này nhạy cảm với pH kiềm được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường sử dụng acid hữu cơ Một số đặc điểm sinh lý,

sinh hóa chính của chi Azospirillum được tóm tắt trong bảng 2.5

Bảng 2.5 – Những đặc điểm sinh lý và sinh hóa chính của Azospirillum sp [20]

2.5.5.3 Khả năng cố định nitơ

Azospirillum sp có thể chuyển hóa nitơ không khí thành ammonia (NH3) trong điều kiện kỵ khí ở mức nitơ thấp thông qua hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase

Azospirillum chỉ cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí Nồng độ oxy hòa tan tối ưu là

khoảng 0,2 kPa, tuy nhiên tùy vào chủng và loài mà có thể sống được trong điều kiện oxy khác nhau Nếu nồng độ oxy hòa tan thay đổi đến mức 2,0 kPa sẽ gây ra sự ức chế gián tiếp hoạt tính của nitrogenase, tuy vậy, hoạt tính của enzyme có thể phục hồi khi nồng độ oxy về mức tối ưu Khi những tế bào vi khuẩn tiếp xúc với nồng độ oxy quá cao có thể gây ra sự ức chế không thể hồi phục và khi đó sẽ phá hủy phức hợp nitrogenase không bền Tương tự như vậy, nếu vi khuẩn sống trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn thì cũng sẽ gây ra sự bất hoạt hoạt tính của nitrogenase [20]

Hầu hết những nghiên cứu di truyền và sinh hóa về quá trình cố định nitơ ở

Azospirillum được tiến hành trên A brasilense Chan và cộng sự (1980) cho rằng trong điều kiện cố định nitơ, khả năng biến dưỡng hydro tăng lên ở A brasilense Trong khi đó,

Fu và Knowles (1989) đã chứng minh rằng hydro xúc tác cho quá trình cố định nitơ khi

tiến hành nuôi cấy Azospirillum trong môi trường có ít nguồn carbon [20]

Theo Hartmann và Kleiner (1982) trong điều kiện thiếu hụt nitơ, Azospirillum sử

dụng một hệ thống vận chuyển cần năng lượng để tìm và hấp thụ ammonium (NH4+) Ammonium được tái sử dụng trong trường hợp này có khuynh hướng thấm ra ngoài qua màng tế bào theo cơ chế khuếch tán NH3 Sự đồng hóa ammonium được thực hiện theo con đường glutamine synthetase/glutamate oxoglutarate aminotransferase (GS/GOGAT) trong điều kiện thiếu nitơ Khi ammonium đã ở mức cao, đủ lượng amino acid có thể biến

dưỡng thì con đường glutamate dehydrogenase (GDH) diễn ra Ở loài A lipoferum và

A amazonense, khi sử dụng những amino acid như glutamate hay aspartate làm nguồn

carbon và nitơ duy nhất, chúng phân tiết NH4+ và hạn chế quá trình cố định nitơ (sự khử

acethylene) Ngược lại, A brasilense lại tiếp tục cố định nitơ khi có sự hiện diện nhiều

những amino acid ngoại bào và sẽ không tiết ammonium Ở điều kiện không có nitơ,

những chủng Azospirillum hoang dại sẽ không phân tiết ammonia ở điều kiện nuôi cấy

bình thường [20]

2.5.5.4 Vai trò và ứng dụng

Azospirillum ngoài khả năng cố định nitơ, còn có khả năng khử nitrat, tạo ra acid

abscisis (ABA), sản xuất siderophore và những phân tử tín hiệu không xác định có thể giúp quá trình trao đổi chất và tăng khả năng hút NO3-, P2O5 và K+ của thực vật bằng cách

làm rễ cây phát triển dài ra Điều này có thể do Azospirillum có thể sử dụng enzyme

pectinase phân giải pectin để làm mềm lớp phiến mỏng trên rễ nên tăng khả năng hút khoáng [19], [25]

Ngoài ra, có thể thu nhận được 3 loại phytohormone từ dịch nuôi cấy Azospirillum,

đó là: Auxin, Cytokinin và Gibberellin (GA3) [54] Azospirillum đóng vai trò quan trọng

trong việc kích thích rễ phát triển Theo Fallik và cộng sự (1989), ở rễ cây bắp được trộn

với chủng Azospirillum tìm thấy một lượng lớn IAA và IBA nhiều hơn ở những cây trồng

đối chứng GA3 được tìm thấy ở dạng acid tự do trong rễ của những cây trồng từ hạt được

trộn với A lipoferum [20]

Bên cạnh đó, Holguin và Glick (2001) đã chứng minh được những chủng

A brasilense tiếp hợp có biểu hiện gene ACC-deaminase, kích thích sự phát triển của cây

cải dầu và cà chua ACC-deaminase là enzyme phân cắt 1-aminocyclopropane - tiền chất

ethylene, giúp giảm hàm lượng chất ức chế ethylene ở thực vật Theo Glick và cộng sự

(1998), sự thay đổi nồng độ hormone ethylene ở cây trồng là một cơ chế hữu hiệu kích

thích thực vật tăng trưởng [54]

2.6 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium

2.6.1 Lịch sử phát hiện

Bradyrhizobium sp thuộc chi lớn Rhizobium Chi Rhizobium đã được Beijerinck

phân lập từ năm 1886 từ nốt sần một số cây Đậu Năm 1963, Manil đã chia các vi khuẩn

Rhizobium thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: Rhizobium leguminosa (Đậu Hà Lan), R trifolii (cỏ ba lá), R phaseoli

(Đậu cô ve, Đậu xanh)

- Nhóm 2: Rhizobium lupini (mục túc, linh lăng)

- Nhóm 3: Rhizobium lupini (Đậu đũa, lupin), R japonicum (Đậu nành) với nhiều

loài phụ Nhóm này hiện nay được định danh lại là Bradyrhizobium

Gộp nhóm 1 và 2 thành nhóm Rhizobium mọc nhanh Nhóm 3 gọi là Bradyrhizobium

là những chủng mọc chậm [66], [71]

Cho đến tháng 6 năm 2008, đã có 9 loài thuộc chi Bradyrhizobium đã được định danh

theo nguồn từ ngân hàng dữ liệu gene NCBI Tên các loài vi khuẩn đã được định danh

được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.6 - Các loài Bradyrhizobium sp đã được định danh (nguồn từ NCBI)

STT Tên loài Tác giả và năm công bố

1 B japonicum Kirchner 1896, Jordan 1982

Tương tự như Rhizobium, Bradyrhizobium là vi khuẩn sống trong đất nhưng cộng

sinh với nốt sần của rễ cây họ Đậu [71]

2.6.4 Đặc điểm

Là vi khuẩn hình que, gram âm, hiếu khí, không sinh bào tử, kích thước 0,5 – 0,9

x 1,2 - 3µm, chuyển động nhờ nhung mao và tiêm mao ở cực

Nhiệt độ tối ưu là 25 – 30oC Khoảng pH từ 5,0 – 8,5

Khi hình thành nốt sần thì vi khuẩn biến dạng (có hiện tượng đa hình thái), nó thay đổi hình dạng tùy theo lứa tuổi và điều kiện sống Khi còn non chúng là trực khuẩn nhỏ

bé, không có bào tử, di động nhờ tiêm mao Trong quá trình phát triển, chúng sẽ chuyển thành hình cầu và những dạng phân nhánh hình chữ Y, chữ V gọi là thể vi khuẩn (Bacteroids) [71], [66]

2.6.4.1 Khả năng cố định nitơ

Sự cố định nitơ của chi Rhizobium liên quan đến quá trình hình thành nốt sần ở rễ

Các nốt sần ở rễ liên quan đến quá trình truyền tín hiệu giữa vi khuẩn và cây trồng, vi khuẩn cảm ứng với tín hiệu do cây phát ra, thường là các flavonoid, đồng thời có sự sản xuất các phân tử tín hiệu lipochitooliglsaccharide thường được gọi là các yếu tố Nod (Nod

factor) [54] Tuy nhiên, với Bradyrhizobium, sự hình thành nốt sần ở cây họ Đậu thủy sinh Aeschynomene thì không tạo ra yếu tố Nod Có ý kiến cho rằng, có sự hiện diện của

yếu tố trao đổi khác đã thay thế yếu tố Nod [62], [71]

 Cơ chế tương tác tạo nốt sần của Bradyrhizobium [79]

Ban đầu, vùng đất ở rễ có sự rò rĩ của một số hợp chất hóa học do cây tiết ra, dẫn

dụ vi khuẩn Bradyrhizobium sống tự do trong đất di chuyển đến vùng rễ Vi khuẩn tiến

hành tương tác với bề mặt rễ để nhận ra thực vật ký chủ chuyên biệt, nếu đúng là thực vật

ký chủ chuyên biệt, vi khuẩn gắn chặt vào rễ Lúc này, rễ tiết ra flavonoid để truyền cảm

ứng tín hiệu cho những gene nod của vi khuẩn hoạt động để hình thành nốt sần trên cây

Quá trình hình thành nốt sần được diễn ra liên tục đều đặn và khi đó vi khuẩn và thực vật

ký chủ tiến hành trao đổi những hợp chất hóa học với nhau Khi đã bám vào rễ, vi khuẩn

sẽ phân tiết yếu tố Nod, yếu tố này làm lông rễ cong lại, vi khuẩn bắt đầu xâm nhập vào

rễ thông qua đường xâm nhiễm (infection thread) ở đầu rễ Đường xâm nhiễm này do tế bào rễ tự tạo ra để đáp ứng lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn Trong đường xâm nhiễm, vi khuẩn sinh trưởng liên tục để tạo yếu tố Nod, yếu tố này sẽ kích thích tế bào lông rễ ngày càng phát triển to ra và cuối cùng hình thành nên nốt sần Trong các nốt sần có hàng

nghìn vi khuẩn Bradyrhizobium sống tự do, hầu hết chúng ở dạng bất định (misshapen) và

được gọi là thể vi khuẩn Một phần màng tế bào thực vật ký chủ sẽ bao bọc lại những thể

vi khuẩn Cấu trúc này được gọi là thể cộng sinh (symbiosome) và trong thể cộng sinh,

quá trình cố định nitơ sẽ diễn ra Bên trong nốt sần, vi khuẩn kiểm soát nồng độ oxy bởi leghaemoglobin – một loại protein có mang sắt, màu đỏ, có chức năng tương tự haemoglobin trong máu, đó là gắn với oxy Điều này sẽ giúp nồng độ oxy ở mức vừa đủ

để không làm bất hoạt enzyme nitrogenase

Hình 2.6 – Cơ chế tạo nốt sần của Bradyrhizobium sp [74]

Hình 2.7 – Leghaemoglobin [73]

2.6.4.2 Vai trò và ứng dụng

Bên cạnh khả năng cộng sinh cố định đạm, Bradyrhizobium sp còn có khả năng

tạo ra IAA, sản sinh siderophore, HCN, hòa tan phosphat và giúp tăng khả năng hút chất

khoáng [27] Đồng thời, Bradyrhizobium japonicum có khả năng phân tiết cytokinin trong canh trường nuôi cấy [26] Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn của Bradyrhizobium (Arachis) sp còn có tiềm năng kiểm soát sinh học (biocontrol), chống lại Macrophomina phaseolina gây bệnh thối mục than (charcoal rot) trên cây Đậu phọng [27] Đặc biệt hơn, Theo Loon (2007), có thể sử dụng vi khuẩn thuộc chi Bradyrhizobium để tạo tính kháng

(ISR và SAR) cho thực vật ký chủ [44]

2.7 Gene nif

Gene nif là gene mã hóa cho phức hợp enzyme nitrogenase và những enzyme khác liên quan đến quá trình cố định nitơ, gene nif có trình tự bảo tồn giống nhau ở những vi sinh vật cố định nitơ Mặc dù vậy nhưng sự điều hòa biểu hiện gene nif là khác nhau giữa các loài vi sinh vật cố định nitơ Có hơn 20 loại gene nif khác nhau có chức năng vai trò khác nhau, trong đó 3 gene quan trọng nhất là gene nifH, nifD và nifK giữ vai trò mã hóa

những thành phần chính của enzyme nitrogenase [74]

Bảng 2.7 – Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ [74]

nifH Nhường điện tử cho dintrogenase trong quá trình chờ nitrogenase hoạt động nifD FeMo bị che lấp bởi nifD – tiểu đơn vị α của nitrogenase

nifK Nhóm P xuất hiện ở bề mặt của nifK – tiểu đơn vị β của nitrogenase

3 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Bố trí thí nghiệm

- Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008

- Các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên cơ sở Linh Trung – Thủ Đức, Bộ môn Vi sinh và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

Gia TP.Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

- Nguồn mẫu thí nghiệm là 8 mẫu rễ có nốt sần và 8 mẫu đất ở vùng rễ của một số

cây họ Đậu như: Trinh nữ (Mimosa pudica), Đậu biếc (Clitoria ternatea), Sục sạc (Crotalaria zanzibar), Tràng quả (Desmodium clovisii), Mai dương (Mimosa pigra), Điên điển (Sesbania javanica), Đậu ma nước (Pueraria phaseoloides), Đậu ma cạn (Pueraria phaseoloides) ở Thủ Đức và trong rừng Quốc gia Nam Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai)

- Hạt giống dưa chuột (dưa leo) và xà lách được mua tại công ty Trang Nông, 2F Lê Quang Sung, quận 6, TP.Hồ Chí Minh

 Máy đo pH (Orion 420A)

 Máy đo quang phổ (Gene Quantpro)

 Máy lắc tròn

 Máy vortex (Ika Works MS 1)

 Máy ly tâm (Anke TDL 80 - 2B)

 Máy ly tâm lạnh (Hettcih Zentrifugen Universal 32R)

 Máy PCR Techine

 Máy cất đạm Parnas - Warger