ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B) VÀ VIÊM GAN SIÊU VI C (HEPATITIS C) TRÊN NGƯỜI ĐẾN KHÁM SỨC KHỎE TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY TỪ THÁNG 4 ĐẾN THÁNG 7 NĂM 2008

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 4/2008 đến tháng 10/2008 tại phòng Huyết thanh Miễn dịch học – bệnh viện Chợ Rẫy gồm các nội dung:  Sử dụng kỹ thuật ELISA để xét nghiệm viêm gan siêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B) VÀ VIÊM GAN SIÊU VI C (HEPATITIS C) TRÊN NGƯỜI ĐẾN KHÁM SỨC KHỎE TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY

TỪ THÁNG 4 ĐẾN THÁNG 7 NĂM 2008

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 - 2008

Sinh viên thực hiện: HUỲNH THANH HỒNG

Tháng 10/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B) VÀ VIÊM GAN SIÊU VI C (HEPATITIS C) TRÊN NGƯỜI ĐẾN KHÁM SỨC KHỎE TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY

TỪ THÁNG 4 ĐẾN THÁNG 7 NĂM 2008

ThS NGUYỄN VŨ PHONG

Tháng 10/2008

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ :

 Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô

đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học tại trường

 Ban Giám đốc phòng Nghiên cứu Khoa học và phòng Huyết thanh Miễn dịch học của bệnh viện Chợ Rẫy đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp

 Bác sĩ Trần Thị Thanh Nga và các anh chị Kỹ thuật viên phòng Huyết thanh Miễn dịch học tại bệnh viện Chợ Rẫy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm cho em trong thời gian tiến hành đề tài

 Thầy Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện

HUỲNH THANH HỒNG

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

HUỲNH THANH HỒNG, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2008 “Ứng dụng kỹ thuật ELISA khảo sát tình hình nhiễm viêm gan siêu vi B (Hepatitis B) và viêm gan siêu vi C (Hepatitis C) trên người đến khám sức khoẻ tại bệnh viện Chợ Rẫy từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2008”

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 4/2008 đến tháng 10/2008 tại phòng Huyết thanh Miễn dịch học – bệnh viện Chợ Rẫy gồm các nội dung:

 Sử dụng kỹ thuật ELISA để xét nghiệm viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu

vi C trên những người đến khám sức khoẻ tại bệnh viện Chợ Rẫy

 Thống kê số liệu xét nghiệm, từ đó xác định tần suất nhiễm viêm gan siêu vi

B và tần suất nhiễm viêm gan siêu vi C; đồng thời xem xét mối liên hệ của viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C với giới tính và độ tuổi

Các kết quả thu được:

 Tần suất HBsAg (+) và Anti-HCV (+) lần lượt là 3,58 % và 1,2 % Không tính đến 12 trường hợp dương tính yếu (10 trường hợp ở kit Monolisa HBsAg Ultra và

2 trường hợp Monolisa Anti-HCV Plus) vì chưa có kết luận rõ ràng vệ bệnh

 Không tìm thấy mối liên hệ giữa tần suất viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C với giới tính trong nghiên cứu này

 Tần suất nhiễm viêm gan siêu vi B của nhóm người 20 – 30 tuổi là thấp hơn hai nhóm người dưới 20 tuổi và nhóm người trên 30 tuổi

 Tần suất nhiễm viêm gan siêu vi C ở nhóm người trên 30 tuổi cao hơn so với nhóm người dưới 30 tuổi

SUMMARY

HUYNH THANH HONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh city, Octorber

2008 The title “Using ELISA technique assess actual situation of infection Hepatitis B and Hepatitis C of people who have a medical check-up in Cho Ray hospital” was carried out from April to October, 2008 at Department of Serum Immunobiology in Cho Ray hospital

Its contents comprised:

 Using ELISA technique detected Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) and antibody Hepatitis C virus (anti-HCV)

 Using received statistical data to assess relationship between risk factors (including age and gender) and Hepatitis B virus, Hepatitis C virus infection of people who have a medical check-up in Cho Ray hospital

Results of this survey were:

 The rate of HBsAg (+) and anti-HCV (+) was 3.58 % and 1.2 %, respectively Not including ten cases in test kit Monolisa HBsAg Ultra and two cases

in test Monolisa Anti-HCV Plus for weak positive results

 Have no relationship between risk factors and Hepatitis B virus, Hepatitis C virus in this study

 Serum positive for HBsAg was found in people aged 20 to 30 lower than in others

 Serum positive for Anti-HCV was found in people aged 30 and over higher than in others

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình, bảng x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 1

1.2.1 Mục đích 1

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về gan 3

2.1.1 Cấu trúc gan 3

2.1.2 Chức năng gan 4

2.1.3 Các bệnh lý thường gặp ở gan 4

2.2 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi B và C 6

2.2.1 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi B 6

2.2.2 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C 6

2.3 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi B và C trên thế giới 7

2.3.1 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi B trên thế giới 7

2.3.2 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi C trên thế giới 8

2.4 Sơ lược về HBV 9

2.4.1 Cấu trúc HBV 9

2.4.1.1 HBsAg 9

2.4.1.2 HBcAg 10

2.4.1.3 HBeAg 10

2.4.1.4 DNA HBV 10

2.4.2 Genotype HBV 12

2.4.3 Chu trình xâm nhiễm của HBV 12

2.5 Sơ lược về HCV 13

2.5.1 Cấu trúc HCV 13

2.5.2 Genome của HCV 13

2.5.3 Chu trình xâm nhiễm của HCV 16

2.5.4 Tính đa dạng di truyền của HCV 16

2.6 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi B và C 17

2.6.1 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi B 17

2.6.1.1 Phòng ngừa viêm gan siêu vi B 17

2.6.1.2 Điều trị viêm gan siêu vi B 17

2.6.2 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi C 18

2.6.2.1 Phòng ngừa viêm gan siêu vi C 18

2.6.2.2 Điều trị viêm gan siêu vi C 18

2.7 Kỹ thuật ELISA 19

2.7.1 Đôi nét về lịch sử ra đời 19

2.7.2 Nguyên tắc 19

2.7.3 Các dạng Elisa cơ bản 20

2.7.3.1 Elisa trực tiếp (Direct Elisa) 20

2.7.3.2 Elisa gián tiếp (Inirect Elisa) 20

2.7.3.3 Sandwich Elisa 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3 Dụng cụ, thiết bị 22

3.4 Hóa chất xét nghiệm 22

3.4.1 Bộ kit Monolisa HBsAg-Ultra (Bio-Rad) 22

3.4.2 Bộ kit Monolisa Anti-HCV PLUS version 2 (Bio-Rad) 23

3.4.3 Test nhanh SD HCV, Standard Diagnostic Inc (Korea) 24

3.4.4 Test nhanh Abbott DetermineTM HBsAg 24

3.5 Phương pháp xét nghiệm 25

3.5.1 Chuẩn bị mẫu huyết thanh 25

3.5.2 Xét nghiệm HBsAg với bộ kit Monolisa HBsAg-Ultra 25

3.5.2.1 Quy trình xét nghiệm 25

3.5.2.2 Phương pháp đọc kết quả 26

3.5.3 Xét nghiệm sử dụng kit Monolisa Anti-HCV Plus 28

3.5.3.1 Quy trình xét nghiệm 28

3.5.3.2 Phương pháp đọc kết quả 30

3.5.4 Xét nghiệm với test nhanh Abbott DetermineTM HBsAg 30

3.5.5 Xét nghiệm với test nhanh SD HCV 31

3.5.6 Phương pháp xử lí số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Phương pháp đọc kết quả xét nghiệm HBsAg bằng kit Monolisa HBsAg-Ultra 32

4.2 Phương pháp đọc Kết quả xét nghiệm Anti-HCV bằng kit Monolisa Anti-HCV Plus version 2 35

4.3 Tần suất HBsAg (+) 37

4.4 Ảnh hưởng của giới tính đến tần suất HBsAg (+) 38

4.5 Ảnh hưởng của độ tuổi đến tần suất HBsAg (+) 38

4.6 Tần suất Anti-HCV(+) 39

4.7 Ảnh hưởng của giới tính đến tần suất Anti-HCV (+) 40

4.8 Ảnh hưởng của độ tuổi đến tần suất Anti-HCV (+) 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

Chương 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 Ab : Antibody

 Ag : Antigen

 ALT : Alanine aminotransferase

 AST : Aspartate aminotransferase

 CDC : National Center for Disease Control and Prevention

 COV : Cut off value

 DMSO : Dimethyl sulfoxide

 ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

 HBcAb : Hepatitis B core antibody

 HBcAg : Hepatitis B core antigen

 HBeAb : Hepatitis B e antibody

 HBeAg : Hepatitis B e antigen

 HBsAb : Hepatitis B surface antibody

 HBsAg : Hepatitis B surface antigen

 WHO : World Health Organization

 CDC : National Center for Disease Control and Prevention

D ANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG

Hình 2.1 Vị trí gan trong cơ thể 3

Hình 2.2 Gan bình thường và gan bị xơ 5

Hình 2.3 Bản đồ phân bố tình hình lây nhiễm HBV trên thế giới 7

Hình 2.4 Bản đồ phân bố tình hình lây nhiễm HCV trên thế giới 8

Hình 2.5 Cấu trúc HBV 9

Hình 2.6 Cấu trúc HBsAg 10

Hình 2.7 Cấu trúc genome của HBV 11

Hình 2.8 Chu trình xâm nhiễm của HBV 13

Hình 2.9 Cấu trúc và genome của HCV 14

Hình 2.10 Chu trình xâm nhiễm của HCV 16

Hình 2.11 Quy trình thực hiện ELISA gián tiếp 20

Hình 2.12 Mô hình sandwich trong Sandwich ELISA 21

Hình 3.1 Bộ kit Monolisa HBsAg Ultra (Bio-Rad) 23

Hình 3.2 Test nhanh SD HCV 24

Hình 3.3 Test nhanh Abbott DetermineTM HBsAg 24

Hình 3.4 Nhỏ mẫu huyết thanh xét nghiệm HBsAg 26

Hình 3.5 Thêm chất cộng hợp vào các giếng 26

Hình 3.6 Ủ plate HBsAg với chất cộng hợp 27

Hình 3.7 Rửa plate ở chế độ HBsAg Plus 27

Hình 3.8 Thêm dung dịch tạo màu 27

Hình 3.9 Ủ tối 27

Hình 3.10 Thêm dung dịch dừng phản ứng 27

Hình 3.11 Đưa plate vào máy đo màu 27

Hình 3.12 Nhỏ dung dịch pha loãng HCV 28

Hình 3.13 Nhỏ mẫu huyết thanh xét nghiệm Anti-HCV 28

Hình 3.14 Rửa mẫu ở chế độ HCV lần 1 29

Hình 3.15 Ủ plate HCV sau khi nhỏ enzyme 29

Hình 3.16 Thêm dung dịch tạo màu 30

Hình 3.17 Đọc kết quả trên test nhanh Determine 30

Hình 3.18 Đọc kết quả trên test nhanh SD HCV 31

Hình 4.1 Kết quả OD xét nghiệm HBsAg ngày 29/05/2008 32

Hình 4.2 Test nhanh Determine mẫu số 12 33

Hình 4.3 Plate xét nghiệm HBsAg ngày 29/05/2008 34

Hình 4.4 Kết quả OD xét nghiệm Anti-HCV ngày 16/07/2008 36

BẢNG TRANG Bảng 2.1 Tần suất viêm gan siêu vi C ở các vùng trên thế giới 8

Bảng 3.1 Mô hình plate ELISA HBsAg 26

Bảng 3.2 Mô hình plate ELISA Anti-HCV 28

Bảng 4.1 Kết quả xét nghiệm HBsAg 37

Bảng 4.2 Tần suất HBsAg (+)trong một số nghiên cứu khác 37

Bảng 4.3 Thống kê số người có HBsAg (+) theo giới tính 38

Bảng 4.4 Thống kê số người có HBsAg (+) theo độ tuổi 39

Bảng 4.5 Kết quả xét nghiệm Anti-HCV (+) 39

Bảng 4.6 Tần suất Anti-HCV (+) trong một số nghiên cứu khác 39

Bảng 4.7 Thống kê số người có Anti-HCV (+) theo giới tính 40

Bảng 4.8 Thống kê số người có Anti-HCV (+) theo độ tuổi 40

Trong các bệnh về gan thì viêm gan do siêu vi được coi là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và là vấn đề y tế toàn cầu Theo báo cáo của WHO, hiện nay có khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã và đang nhiễm viêm gan siêu vi B, trên 400 triệu người bị viêm gan siêu vi B mãn tính và có khoảng 3% dân số thế giới (khoảng 170 triệu người) nhiễm viêm gan siêu vi C mãn tính

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành bệnh viêm gan siêu vi B và C cao Theo WHO năm 2000, tần suất nhiễm viêm gan siêu vi B vào khoảng 5 - 15%, hàng năm có khoảng 35.000 người tử vong vì những bệnh liên quan đến viêm gan siêu vi B Trong khi đó tần suất nhiễm HCV theo thống kê năm 1997 là 6,1%

Vì vậy việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời đúng cách là việc làm rất cần thiết

để ngăn ngừa sự lây lan và bùng phát của bệnh viêm gan siêu vi B và C Được sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh và bệnh viện Chợ Rẫy Tp.Hồ Chí Minh, tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu : “Ứng dụng

kỹ thuật ELISA khảo sát tình hình nhiễm viêm gan siêu vi B (Hepatitis B) và viêm gan siêu vi C (Hepatitis C) trên người đến khám sức khỏe tại bệnh viện Chợ Rẫy từ tháng

4 đến tháng 7 năm 2008”

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

 Sử dụng kỹ thuật ELISA để xét nghiệm viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu

vi C trên những người đến khám sức khỏe tại bệnh viện Chợ Rẫy

 Thống kê số liệu thu được, từ đó xác định tần suất nhiễm viêm gan siêu vi B

và tần suất nhiễm viêm gan siêu vi C; đồng thời xem xét mối liên hệ của bệnh viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C với giới tính và độ tuổi

1.2.2 Yêu cầu

 Thành thạo thao tác thực hành kỹ thuật ELISA với 2 bộ kit Monolisa

HBsAg Ultra (Bio-Rad) và Monolisa Anti-HCV Plus (Bio-Rad)

 Thống kê, phân tích và đánh giá số liệu bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B

và viêm gan siêu vi C theo giới tính và độ tuổi

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về gan

2.1.1 Cấu trúc gan [47]

Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất của cơ thể người, nằm ở mạn sườn phải, trong

ổ bụng, bên dưới cơ hoành Gan mềm, màu đỏ sẫm, nặng khoảng 1,2 - 1,6 kg ở người trưởng thành

có các nhánh động mạch gan, tĩnh mạch cửa và ống mật Tiểu thuỳ gồm một mạch ở trung tâm và các tế bào gan toả ra từ mạch này như nan hoa

Máu đến gan qua 2 con đường: dòng máu giàu oxy từ tim đến động mạch gan

và dòng máu giàu chất dinh dưỡng từ dạ dày, ruột đến tĩnh mạch cửa gan Các mạch máu này chia thành các mao mạch nhỏ đi đến cung cấp chất dinh dưỡng và oxy cho các tế bào gan Nhờ đó, gan nhận được nguồn dinh dưỡng cũng như các sản phẩm phụ

của quá trình tiêu hoá thức ăn Lượng máu đến gan chiếm khoảng 1/3 lượng máu của

cơ thể Các tĩnh mạch gan dẫn lưu máu từ gan và đổ trực tiếp vào tĩnh mạch chủ dưới

Gan có khả năng tái tạo các mô bị mất một cách tự nhiên, chỉ cần còn khoảng 25% tổng thể tích gan là gan có khả năng tự tái tạo trở lại thành một gan nguyên vẹn

2.1.2 Chức năng gan [28]

Gan đảm nhận hơn 500 nhiệm vụ khác nhau trong cơ thể:

 Gan tổng hợp mật và chứa trong túi mật trước khi đưa vào tá tràng Mật giúp nhũ hóa chất béo tại tá tràng để lipase của tụy biến đổi dễ dàng hơn thành các acid béo và glycerol, những chất này sau đó sẽ được hấp thụ vào máu

 Gan tham gia vào quá trình chuyển hoá carbohydrate: tổng hợp glycogen, phân giải insulin và các hormone khác

 Gan cũng tham gia vào quá trình chuyển hoá lipid

 Gan sản xuất các yếu tố đông máu thiết yếu như: prothrombin, fibrinogen, heparin và các chất kháng đông

 Gan giúp loại bỏ acid amin dư thừa

 Gan phân giải hemoglobin, tạo sắc tố mật là bilirubin và biliverdin

Cho đến nay chưa có một cơ quan nhân tạo hay thiết bị nào có thể đảm trách toàn bộ chức năng của gan Vì tầm quan trọng đó mà mọi bất thường dẫn đến bệnh lý

ở gan đều gây ảnh hưởng ít nhiều đến hoạt động sống của cơ thể

2.1.3 Các bệnh lý thường gặp ở gan

Gan có nhiều bệnh lý, thường gặp là các bệnh sau:

 Các bệnh vàng da (hay còn gọi là hoàng đản): là biểu hiện của tình trạng tăng chất bilirubin trong máu Nguyên nhân gây vàng da rất đa dạng, chủ yếu là do u đường mật ngoài gan, ung thư đầu tụy, sỏi đường mật, viêm gan cấp do virus,… [26]

 Gan nhiễm mỡ (còn gọi là thoái hoá mỡ gan): Đó là tình trạng mỡ tích tụ trong gan > 5% trọng lượng gan Gan nhiễm mỡ có thể do nghiện rượu, bệnh béo phì, bệnh tiểu đường, hội chứng Reye,… [34]

 Áp xe gan: Là tình trạng nhiễm trùng gây ra ổ mủ bên trong gan, do:[27]

 Amibe: thường là biến chứng của bệnh amibe ở ruột

 Các vi khuẩn sinh mủ xâm nhập gan qua đường mật, tĩnh mạch cửa, động mạch gan

 Nấm

 Lao gan: Do trực khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây ra

 Bọc sán lá gan: Do nhiễm sán lá gan lớn (ở Việt Nam chủ yếu là Fasciola hepatica, Fasciola gigantica) hay do sán lá gan nhỏ (chủ yếu do giống Clonorchis)

làm gan có một hoặc nhiều bọc sán lá gan, thường mỗi bọc lớn chứa nhiều bọc nhỏ lẫn trong chất dịch màu mật [40]

 Viêm gan: Là tình trạng viêm và hoại tử tế bào gan Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như virus, rượu, thuốc, chất độc, rối loạn chuyển hoá, Ở nước ta, nguyên nhân gây viêm gan phổ biến là do virus Các loại virus gây viêm gan bao gồm

virus gây viêm gan A, B, C, D, E, G, Cytomegalovirus, Herpes simplex, Varicella zoster, Epstein-Barr,… và chỉ có virus gây viêm gan B, C, D là có khả năng gây viêm

gan mãn tính và xơ gan nhiều nhất Trong đó viêm gan B và C là quan trọng nhất do

có nguy cơ cao tiến triển thành xơ gan và ung thư gan

 Xơ gan: Là một bệnh mãn tính, trong đó tổn thương tế bào gan do viêm, hoại tử và thoái hóa tế bào lan tỏa Theo thời gian, các mô xơ sẽ thay thế mô gan lành, làm biến đổi cấu trúc bình thường của gan thành cấu trúc dạng nốt bất thường Những nguyên nhân dẫn đến xơ gan là do siêu vi B, C, D, suy dinh dưỡng, nhiễm trùng,…[35]

Hình 2.2 Gan bình thường (trái) và gan bị xơ (phải)

( http://www.vietduchospital.edu.vn/news_detail.asp?ID=10&CID=2&IDN=7025 )

 Ung thư gan: Ung thư gan nguyên phát (thường tiến triển từ viêm gan siêu

vi B và C) đứng hàng thứ 5 trong số các loại ung thư trên toàn cầu, gây tử vong cho khoảng một triệu người hàng năm.[37]

2.2 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi B và C

2.2.1 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi B [20]

Vào những năm 1880, một số bệnh nhân bị vàng da (biểu hiện của viêm gan) sau khi được chích ngừa bệnh đậu mùa Từ đó, người ta tin rằng bệnh viêm gan cũng

có thể lây qua máu Họ đưa ra giả thuyết có 2 loại viêm gan: Loại thứ nhất là vi khuẩn viêm gan nhiễm độc (infectious hepatitis virus) lây qua thức ăn và nước uống; Loại

thứ hai lây qua máu do vi khuẩn viêm gan huyết thanh (serum hepatitis virus)

Những năm 1940, MacCallum, một y sĩ chuyên khoa rối loạn gan đã phát hiện virus viêm gan siêu vi B (Hepatitis B virus - HBV) Ông nhận thấy những binh sĩ Anh sau khi được tiêm vaccine trị sốt vàng da sau đó đều bị viêm gan Vào thời điểm này vaccine trị sốt vàng da đều được chế từ huyết thanh người Từ đó ông cho rằng một dạng virus viêm gan đã nhiễm qua những binh sĩ này từ máu đã nhiễm bệnh Ông gọi bệnh nhiễm trong trường hợp này là viêm gan B hay viêm gan huyết thanh

Năm 1963, Baruch Blumberg phát hiện một loại kháng thể trong máu hai người

Mỹ bị xuất huyết Kháng thể này chống lại một loại kháng nguyên từ một thổ dân Úc Kháng nguyên này được xác định là kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg)

Năm 1970, HBV được nhận diện dưới kính hiển vi điện tử bởi nhà khoa học Dane Phân tử HBV này có kích thước 42 nm, có một vỏ bọc bên ngoài chứa kháng nguyên HBsAg một nhân bên trong gồm chất DNA và một lõi gọi là HBcAg

Bác sĩ BlumBerg sau đó đã hợp tác với Irving Millman (một nhà vi sinh) đã phát triển kỹ thuật phát hiện HBV trong mẫu máu, kỹ thuật này sau đó trở thành phương pháp để sàng lọc máu nhiễm HBV Sau đó họ đã nghiên cứu, điều chế vaccine chống viêm gan siêu vi B và đoạt giải Nobel y học vào năm 1976

2.2.2 Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C [10]

Viêm gan siêu vi C đã xuất hiện từ rất lâu Đến giữa thập niên 1970, Alter và cộng sự nhận thấy máu sau khi được sàng lọc viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi

A vẫn có khả năng gây viêm gan Ông gọi các trường hợp bệnh đó là viêm gan không

A không B (non-A non-B hepatitis, NANBH)

Năm 1975, tinh tinh (chimpanzée) được sử dụng thành công trong việc làm mô hình nghiên cứu tác nhân gây NANBH

Năm 1989, Michael Houghton, Qui-Lim Choo, George Kuo (Chiron) và Daniel

W Bradley (CDC) và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật tạo dòng cDNA tái tổ hợp nhận dạng được tác nhân gây NANBH Đó là một phân tử RNA sợi đơn gồm khoảng 9400 nuclotide và được đặt tên là virus viêm gan C (Hepatitis C virus-HCV)

2.3 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi B và C trên thế giới

2.3.1 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi B trên thế giới [49]

Viêm gan siêu vi B có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới, ngay cả ở những nước phát triển như châu Âu và Mỹ Năm 2001, tại Mỹ có 7844 trường hợp bị nhiễm HBV có triệu chứng rõ rệt, CDC đã nhận định có khoảng 78000 người nhiễm HBV trên toàn nước Mỹ

Hình 2.3 Bản đồ phân bố tình hình lây nhiễm HBV trên thế giới [20]

Dựa theo tỉ lệ nhiễm HBV có thể chia thành 3 khu vực :

 Khu vực có tỉ lệ nhiễm thấp (< 2% dân số) gồm các nước thuộc châu Ðại Dương, Tây Âu, Bắc Âu, Bắc Mỹ và Trung Mỹ

 Khu vực có tỉ lệ nhiễm trung bình (2 - 7% dân số) gồm các nước Nam Mỹ, châu Âu (trừ phía Tây Âu và Bắc Âu), Nga, vùng Trung Cận Ðông, Nam Á, Bắc Phi

 Khu vực có tỉ lệ nhiễm cao (8 - 20% dân số) gồm châu Phi (trừ Bắc Phi),

Ðông Nam Á và Trung Quốc

2.3.2 Tình hình lây nhiễm viêm gan siêu vi C trên thế giới [48]

Bảng 2.1 Tần suất viêm gan siêu vi C ở các vùng trên thế giới

Vùng Tổng dân số

(triệu người)

Tần suất nhiễm viêm gan siêu vi C

(%)

Dân số nhiễm viêm gan siêu vi C (triệu người)

Theo ước tính của WHO thì 3% dân số thế giới (khoảng 170 triệu người) đang mắc phải căn bệnh viêm gan siêu vi C Tần suất HCV ở những vùng châu Phi, Địa Trung Hải, tây Thái Bình Dương cao hơn so với những vùng khác trên thế giới

HBV được bao bọc bởi một số loại protein gọi chung là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) Các protein bề mặt này bao bọc lớp nucleocapsid mà trung tâm là kháng nguyên lõi (HBcAg) và kháng nguyên e (HBeAg) DNA và DNA polymerase của HBV nằm trong lớp nucleocapsid này Ngoài ra còn có 1 số loại protein khác (như protein X) Vai trò của chúng chưa được xác định rõ và vẫn đang được nghiên cứu

2.4.1.1 HBsAg (Hepatitis B surface Antigen)

HBsAg là tập hợp của 3 loại protein S, M, L Trong đó protein S chiếm đa số, protein M chiếm 5 – 10% và protein L chiếm 20% Ở trong máu, HBsAg có thể tồn tại

ở 3 dạng:kết hợp với các thành phần khác tạo thành hạt virus hoàn chỉnh; hoặc tự kết hợp với nhau ở dạng cấu trúc hình cầu và cấu trúc hình ống

Hình 2.6 Cấu trúc HBsAg

( http://doctor.medscape.com/viewarticle/407965 )

2.4.1.2 HBcAg (Hepatitis B core Antigen)

Bản chất HBcAg là một protein nhưng không có đoạn peptide tín hiệu nên chúng không được tìm thấy trong máu Chỉ có dùng phương pháp sinh thiết gan mới

có thể phát hiện chúng một cách rõ ràng nhất

2.4.1.3 HBeAg (Hepatitis B e Antigen)

Chức năng của HBeAg đến nay vẫn chưa được xác định rõ Tuy nhiên, người ta thấy rằng số lượng HBeAg trong máu tăng cao khi HBV nhân lên trong cơ thể Do đó người được phát hiện có sự hiện diện kháng nguyên e này trong cơ thể thì nguy cơ lây nhiễm cao hơn người không phát hiện chúng trong máu

 Chuỗi ngắn nằm trong, ký hiệu là S, có tính cực (+), chiều dài thay đổi từ 50 – 100% so với chiều dài của mạch dài

Hình 2.7 Cấu trúc genome của HBV

( http://hepmon.com/view/?id=95 )

Trên genome của HBV có 4 khung đọc mở (Opening Reading Frame - ORF)

mã hoá cho 4 đoạn gen tương ứng, gồm:

 Gen pre-S1, pre-S2 và S: tổng hợp 3 loại protein của HBsAg

 Gen S tổng hợp protein S

 Đoạn S và Pre-S2 tổng hợp protein M

 Đoạn S, Pre-S1 và Pre-S2 tổng hợp protein L

 Gen pre-Core và Core: tổng hợp HBcAg và HBeAg

 Nếu quá trình dịch mã thực hiện suốt chiều dài của đoạn pre-Core và Core sẽ tổng hợp được HBeAg Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-Core

sẽ mã hóa tạo ra một đoạn peptide tín hiệu Đoạn peptide này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời giúp cho HBeAg hòa tan được trong huyết thanh Vì vậy HBeAg còn được gọi là kháng nguyên hòa tan

 Nếu quá trình dịch mã chỉ diễn ra hết đoạn core thì sẽ tổng hợp nên kháng nguyên lõi (HBcAg) HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trực tiếp trong huyết thanh người bệnh

 Gen P: tổng hợp enzyme DNA polymerase của virus

 Đầu tận cùng N của polymerase trong virus có một acid amin là Tyrosin tương đối cố định, được sử dụng làm primer cho quá trình tổng hợp DNA của virus

 Tiếp theo là vùng “khoảng trống” (spacer) có trình tự thay đổi, nó giúp cho enzyme không bị mất hoạt tính khi có đột biến xảy ra

 Kế đến là vùng có hoạt tính của men sao chép ngược, bao gồm một trình

tự các acid amin tương đối cố định là Asparagin

Tyrosin-Methionin-Asparagin- Đầu tận cùng C là vùng của enzyme Ribonuclease H (RNase H), có chức năng làm thoái biến mRNA trong lúc tổng hợp DNA

 Gen X: vai trò của gen này vẫn chưa được xác định chính xác Người ta cho rằng gen này liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào, do đó có ảnh hưởng đến tiến trình phát triển thành tế bào ung thư của tế bào gan nhiễm bệnh

2.4.2 Genotype HBV [42]

Hiện nay người ta đã tìm được 7 dòng HBV khác nhau Chúng được phân biệt dựa trên sự khác nhau của HBsAg

 Dòng A tìm thấy chủ yếu ở Bắc Mỹ, Đông Bắc châu Âu và Trung Phi

 Dòng B tìm thấy chủ yếu ở Tây Nam châu Á, Trung Quốc và Nhật Bản

 Dòng C tìm thấy chủ yếu ở Tây Nam châu Á, Trung Quốc và Nhật Bản

 Dòng D tìm thấy chủ yếu ở miền Nam châu Âu, Ấn Độ

 Dòng E tìm thấy chủ yếu ở châu Phi

 Dòng F tìm thấy chủ yếu ở châu Mỹ

 Dòng G tìm thấy chủ yếu ở Mỹ và Pháp

Mỗi dòng HBV lại được chia thành những serotype khác nhau

2.4.3 Chu trình xâm nhiễm của HBV [44]

Chu trình xâm nhiễm của virus vào các tế bào gan

 Khi HBV xâm nhập vào cơ thể, chúng sẽ vượt qua hệ thống bảo vệ và theo dòng máu đến gan Khi tiếp xúc được với tế bào gan, lớp vỏ của HBV sẽ bám chặt lấy

tế bào gan, sau đó tiêm phần lõi chứa vật chất di truyền (DNA) vào bên trong tế bào

 DNA của HBV sẽ di chuyển vào nhân của tế bào chủ

 DNA của HBV chuyển từ dạng vòng sang dạng cccDNA (covalently closed circular DNA)

 HBV tổng hợp mRNA từ cccDNA mRNA sau đó sẽ được phóng thích vào

tế bào chất của tế bào chủ

 Dịch mã tổng hợp các thành phần của HBV

 Các thành phần gắn kết lại với nhau tạo thành virus hoàn chỉnh phóng thích

ra bên ngoài tiếp tục tấn công vào các tế bào khác

Hình 2.8 Chu trình xâm nhiễm của HBV

( http://www.sin-italy.org/vecchiosito/jnonline/Vol15N2/113.html )

2.5 Sơ lược về HCV

2.5.1 Cấu trúc HCV [3, 4]

HCV thuộc họ Flaviviridae, giống Hepacivirus Hạt virus có hình cầu, đường

kính 45 - 65 nm, trọng lượng phân tử khoảng 4106 daltons

Vỏ ngoài virus có bản chất là lipoprotein, chứa các protein E1, E2 tạo thành phức hợp heterodimer, bao quanh một nucleocapsid có cấu trúc khối đa diện 20 mặt

2.5.2 Genome của HCV [3, 4]

Genome của HCV là một mạch đơn RNA (+) gồm 9400 nucleotid, gồm 3 vùng:

a Đầu 5’ không mã hoá (5’ NTR - nontranslated region) chứa khoảng 341 đến

344 nucleotid Đây là vùng ít biến đổi nhất của HCV, có một số cấu trúc uốn lượn (stemp-loop structures) gồm 27 nucleotide, có khả năng ức chế quá trình giải mã Vùng còn lại là vị trí gắn kết với ribosome để bắt đầu quá trình giải mã để tổng hợp polyprotein tiền chất (IRES- Internal ribosome entry site)

Hình 2.9 Cấu trúc và genome của HCV

( http://www.expertreviews.org/03006938h.htm )

b Vùng được mã hoá: nằm giữa hai vùng 3’ và 5’ Vùng này có 1 khung đọc

mở duy nhất, gồm khoảng 9379 đến 9481 nucletotide, mã hoá cho 1 protein tiền chất của virus gồm khoảng 3000 acid amin Polyprotein tiền chất này sẽ được các protease của HCV và các peptidase tín hiệu của tế bào vật chủ phân cắt thành các protein cấu trúc và không cấu trúc

 Các protein cấu trúc: được mã hoá bởi các gen C, E1, E2

 Protein capsid - protein C (21kDa): là thành phần cấu tạo của nucleocapsid, được cho là có khả năng điều hòa hoạt động các gen của tế bào vật chủ, ức chế sự chết tế bào , gây ung thư và ức chế sự sao chép của HBV và HIV

 Protein p17 (protein F): được sản xuất bởi dịch khung ribosome +2/-1 trong khung đọc C Protein này có trong tế bào chất, nhất là vùng quanh nhân, chức năng chưa rõ

 Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa): là hai protein được glycosyl hóa cao Chúng kết hợp với nhau tạo heterodimer, có liên quan đến việc gắn kết vào thụ thể để đi vào tế bào

 Protein p7 (7 kDa): gồm khảng 63 acid amin, chủ yếu có trong màng nội bào, có thể kết hợp với ty thể hay lưới nội bào tương, chức năng chưa rõ

 Các protein không cấu trúc:

 Protein NS2 (23 kDa): là thành phần của enzyme NS2-3 protease đặc hiệu phân cắt NS2/NS3, NS2 được phân cắt khỏi p7 bởi enzyme peptidase tín hiệu của tế bào chủ

 Protein NS3 (68 kDa): đầu N có hoạt tính serine protease, cắt chuỗi polyprotein tại các điểm NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/ NS5B Đầu C có hoạt tính RNA helicase, giúp mở xoắn RNA virus trong giai đoạn sao chép ban đầu

 Protein NS4 (NS4A và NS4B): NS4A (6 kDa) là một đồng yếu tố của NS3/4 protease NS4B (26 kDa) là một protein xuyên màng, có đầu C trong

tế bào chất và đầu N trong lưới nội bào tương

 Protein NS5 (gồm NS5A và NS5B): NS5A (56-58 kDa) có nhiều chức năng như quyết định tính nhạy cảm của HCV với IFN (interferon), phong tỏa hiện tượng chết tế bào qua TNF (Tumor Necrosis factor), ức chế chết tế bào hàng loạt qua trung gian P53,… NS5B (65 kDa) là enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA, có chức năng tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu RNA

c Đầu 3’ không mã hoá (3’ NTR - nontranslated region): gồm 3 vùng nhỏ

 Vùng không cố định: dài khoảng 28 – 42 nucleotide, vùng này có thành phần nuclotide không cố định

 Vùng poly U hay poly A: báo hiệu kết thúc quá trình phiên mã

 Đoạn X: gồm 98 nucleotide, ít biến đổi, là nơi khởi đầu tổng hợp sợi RNA, điều hòa quá trình giải mã, tạo sự ổn định cho RNA

2.5.3 Chu trình xâm nhiễm của HCV [11]

Hình 2.10 Chu trình xâm nhiễm của HCV

2.5.4 Tính đa dạng di truyền của HCV [3, 4]

Trình tự nucleotide trong bộ gen của HCV không chỉ khác nhau theo vùng địa

lý mà ngay trong cùng một bệnh nhân, người ta cũng nhận thấy bộ gen của các virus không hoàn toàn giống nhau Ở trong cùng một bệnh nhân nhiễm HCV, sau một thời

gian bệnh, trong huyết thanh có nhiều quần thể virus với số lượng khác nhau Các quần thể này gần giống quần thể ban đầu, chỉ khác nhau khoảng 5% hay ít hơn Nguyên nhân của hiện tượng này là do đột biến trong sao chép Khi bệnh tiến triển sang mãn tính thì các quần thể này sẽ đạt trạng thái cân bằng, số lượng, tốc độ nhân đôi cũng như khả năng đáp ứng với interferon của các quần thể khác nhau

2.6 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi B và C

2.6.1 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi B

2.6.1.1 Phòng ngừa viêm gan siêu vi B [38]

Hiện nay, bệnh viêm gan siêu vi B chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu, cách duy nhất là tiêm vaccine để phòng ngừa Vaccine viêm gan siêu vi B đã được phổ biến từ năm 1982, cho đến nay trên thế giới đã có hơn 1 tỷ liều được sử dụng Theo kiến nghị của WHO, hiện đã có hơn 160 nước đưa vaccine viêm gan siêu vi B vào chương trình tiêm chủng cho trẻ em Việc tiêm vaccine cũng được áp dụng cho người lớn có nguy

cơ mắc bệnh Tại Việt Nam, việc tiêm phòng vaccine đã được triển khai trên toàn quốc

từ năm 2003 Đến năm 2006 đã có 62/70 tỉnh, thành phố tiêm vaccine viêm gan B cho

trẻ em, đạt tỷ lệ trên 90% vaccine viêm gan B hiện có hai dạng: Vaccine huyết thanh

bản chất là HBsAg được tinh chế từ huyết thanh người nhiễm viêm gan siêu vi B mãn tính, và vaccine tái tổ hợp là dạng HBsAg tổng hợp nhờ nấm men hoặc tế bào động vật linh trưởng được chuyển gen mã hoá HBsAg Cả hai loại vaccine này giống nhau về hiệu quả đáp ứng, thời gian sử dụng, có thể được dùng thay thế cho nhau

Vaccine viêm gan B được xem là loại vaccine khá an toàn với tỷ lệ tác dụng phụ rất thấp Theo báo cáo của WHO thì các nghiên cứu đối chứng cho thấy, ngoại trừ đau tại chỗ tiêm, các tai biến như đau cơ và sốt ở nhóm tiêm vaccine không cao (< 10% ở trẻ em, dưới 30% ở người lớn) Không thấy có mối liên quan giữa vaccine viêm gan B và bệnh xơ cứng rải rác, hội chứng mệt mỏi mạn tính, viêm khớp, bệnh tự miễn, hen hay tiểu đường… Tỷ lệ sốc phản vệ chỉ là 1 - 2 trường hợp/ 1 triệu liều, thấp hơn nhiều so với Vaccine phòng sởi, quai bị, Rubella, bạch hầu, uốn ván…

2.6.1.2 Điều trị viêm gan siêu vi B [38]

Trong thập niên gần đây, y học đã có những thành tựu đáng kể trong việc phòng

và điều trị viêm gan siêu vi B Các loại thuốc điều trị mới tiếp tục ra đời cũng như các phương pháp điều trị biến chứng xơ gan ngày càng hoàn thiện hơn

Theo Hội nghị gan mật châu Âu lần thứ 43 năm 2008, những loại thuốc sau được công nhận trong điều trị viêm gan siêu vi B mãn tính

2.6.2 Phòng ngừa và điều trị viêm gan siêu vi C

2.6.2.1 Phòng ngừa viêm gan siêu vi C [41]

Hiện nay chưa có vaccine tiêm phòng viêm gan siêu vi C Cách duy nhất để phòng ngừa viêm gan siêu vi C là tự bảo vệ trước sự xâm nhiễm của virus

 Tránh sinh hoạt tình dục không an toàn với nhiều người hoặc với một người chưa rõ về tình trạng sức khỏe

 Không dùng chung kim tiêm hoặc các dụng cụ dùng ma túy khác Các dụng

cụ ma túy nhiễm bẩn gây ra khoảng một nửa số trường hợp viêm gan siêu vi C mới

 Tránh hít cocain

 Tránh xỏ lỗ hoặc xăm trên cơ thể trừ khi chắc chắn là dụng cụ đã tiệt trùng

2.6.2.2 Điều trị viêm gan siêu vi C [41]

Cho tới nay, vũ khí tốt nhất để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên của virus Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm interferon alfa-2b (Intron A), interferon alfa-2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infergen) Nhưng tác dụng của interferon khá thấp, chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp được điều trị

Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin (Virazole) - một thuốc kháng virus phổ rộng Ðiều trị thường mất từ 6 tháng đến 1 năm và tăng tỉ lệ thành công lên khoảng 40% số người được điều trị

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy một thuốc khác là interferon pegyl hóa (PEG), có hiệu quả gấp hai lần interferon thông thường Vào tháng 1 năm 2001, Cơ