KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE, PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE, PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacill

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE,

PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis VÀ

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

PROBIOTIC

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 – 2008

Sinh viên thực hiện: HUỲNH MINH THƯ

Tháng 9/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE,

PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis VÀ

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

PROBIOTIC

CN TRẦN TỪ DUY

Tháng 9/2008

LỜI CẢM TẠ

 Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trương Phước Thiên Hoàng và anh Trần Từ Duy, người đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành tốt khóa luận

 Lời chân thành, xin cảm ơn ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

 Lời cảm ơn gởi đến bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, công

ty Gia Tường, khoa Chăn nuôi Thú y trường Đại học Nông Lâm đã cung cấp một số vật liệu cho tôi trong suốt quá trình thí nghiệm

 Cùng lời cảm ơn đến các anh Quân, Nguyên đã có những ý kiến xác thực để khóa luận được hoàn chỉnh

 Cảm ơn em Trí - người đã cùng tôi thực hiện thí nghiệm

 Xin cảm ơn tất cả những người bạn thân luôn bên tôi chia sẽ, giúp đỡ, động viên và đồng hành cùng tôi suốt quá trình học tập tại trường

 Ngàn lời biết ơn gởi đến ba má cùng gia đình kính yêu, người đã nuôi dạy con nên người

Huỳnh Minh Thư

TÓM TẮT

Huỳnh Minh Thư, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thực hiện đề tài

“Khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase, protease từ các chủng Bacillus subtilis

và thử nghiệm sản xuất chế phẩm probiotic” tại phòng Nghiên cứu và Ứng dụng,

Bộ môn Sinh hoá, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 5/5/2008 đến ngày 5/9/2008

Giáo viên hướng dẫn: Thạc sĩ Trương Phước Thiên Hoàng

Cử nhân Trần Từ Duy

Sử dụng phương pháp Heinkel xác định hoạt độ amylase, phương pháp Anson xác định hoạt độ protease để khảo sát thời gian nuôi cấy, mật độ giống, hàm lượng ion

Ca2+ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme Chế phẩm probiotic là kết quả

phối trộn hai canh trường nuôi cấy Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus

Ngoài ra, chế phẩm probiotic được kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục

lỗ thạch

Kết quả nghiên cứu cho thấy:

 Chủng Bs5 có khả năng tổng hợp enzyme amylase, protease cao nhất

trong 10 chủng Bacillus subtilis khảo sát

 Chủng Bs5 có thể tổng hợp enzyme cao nhất ở 60 giờ nuôi cấy với mật độ giống tối ưu là 107 tế bào/ml, hàm lượng ion Ca2+ thích hợp là 0,15%

 Trong 1g chế phẩm probiotic thử nghiệm có chứa 109 tế bào Bacillus

subtilis, 107 tế bào Lactobacillus acidophilus, 1,56% acid lactic, 1342,12

đơn vị amylase, 12,16 đơn vị protease

 Chế phẩm thử nghiệm có khả năng kháng E.coli, Salmonella,

Staphylococcus aureus trên môi trường thạch đĩa nhưng rất yếu

SUMMARY

Huynh Minh Thu, Agricultur and Forestry University of Ho Chi Minh City September, 2008

“RESEARCHING ABOUT THE HYDROLYSIS ENZYME SYSTEM:

AMYLASE, PROTEASE FROM Bacillus subtilis SPECIES AND PRODUCING

PROBIOTIC”

Supervisor: Master Truong Phuoc Thien Hoang and Tran Tu Duy

Using Heinkel method to define amilase’s activity, Anson method to estimate protease’s activity Both of them used to research affection of time culture, seed density, Ca2+ content to biosynthesis enzyme process Probiotic product is combination

of Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus and are texted antibacterian

Researching results:

 Species Bs5 have the highest enzyme amylase, protease synthesis possibility

among 10 Bacillus subtilis species

 Species Bs5 can be the best enzyme synthesis at time culture 60 hour, culture density 107 cell/ml, Ca2+ content 0.15%

 Have about 109 cell Bacillus subtilis, 107 cell Lactobacillus acidophilus, 1,56%

acid lactic, 1342,12 amylase activity, 12,16 protease activity

 Probiotic product can resist E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus are

culture on aga disk But the resistance is very weak

Keyword: Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, amylase, protease,

probiotic

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

DANH SÁCH MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH xiv

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xiv

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ xv

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ xv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis 3

2.1.2.1.Đặc điểm phân loại 3

2.1.2.2.Đặc điểm phân bố 3

2.1.2.3.Đặc điểm hình thái 4

2.1.2.4.Đặc điểm sinh hóa 4

2.1.2.5.Đặc điểm nuôi cấy 5

2.1.2.6.Bộ gen của Bacillus subtilis 5

2.1.2.7.Bào tử và khả năng tạo bào tử 5

2.1.3 Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi Bacillus subtilis 6

2.1.4 Tính đối kháng của Bacillus subtilis 6

2.1.4.1.Với đồng loại 7

2.1.4.2.Với vi sinh vật gây bệnh 7

2.1.5 Ứng dụng 7

2.1.5.1.Trong công nghiệp 7

2.1.5.2.Trong nông nghiệp 7

2.1.6 Tác hại của Bacillus subtilis 8

2.1.6.1.Đối với người 8

2.1.6.2.Đối với động thực vật 8

2.2 Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 8

2.2.1 Lịch sử phát hiện 8

2.2.2 Đặc điểm về Lactobacillus acidophilus 9

2.2.2.1.Đặc điểm phân loại 9

2.2.2.2.Đặc điểm phân bố 9

2.2.2.3.Đặc điểm hình thái 9

2.2.2.4.Đặc điểm sinh hóa 10

2.2.2.5.Đặc điểm nuôi cấy 10

2.2.3 Hoạt động trao đổi chất 11

2.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 11

2.2.4.1.Trong công nghiệp 11

2.2.4.2.Trong nông nghiệp 12

2.2.4.3.Trong bảo quản và chế biến thực phẩm 12

2.2.4.4.Trong y dược 12

2.2.5 Tác hại của Lactobacillus acidophilus 12

2.3 Khái quát về enzyme amylase 13

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu .13

2.3.2 Phân loại 13

2.3.3 Cơ chất của amylase 13

2.3.4 Nguồn thu nhận amylase 14

2.3.4.1.Amylase từ thực vật (malt) 14

2.3.4.2.Amylase từ vi sinh vật 14

2.3.5 Thu nhận amylase từ vi sinh vật 15

2.3.5.1.Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 15

2.3.5.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase 15

2.3.6 Ứng dụng của amylase 16

2.3.6.2.Công nghiệp dệt may 17

2.3.6.3.Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa 17

2.3.6.4.Trong y học 18

2.4 Khái quát về enzyme protease 18

2.4.1 Lịch sử nghiên cứu 18

2.4.2 Phân loại 18

2.4.3 Cơ chất 19

2.4.4 Các nguồn thu nhận protease 19

2.4.5 Ứng dụng 20

2.4.5.1.Trong chế biến thực phẩm 20

2.4.5.2.Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc 21

2.4.5.3.Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa 21

2.4.5.4.Trong công nghiệp da 21

2.4.5.5.Sản xuất insualin cho người từ insulin heo 21

2.4.5.6.Dịch thủy phân vi sinh vật 21

2.5 Khái quát về probiotic 22

2.5.1 Các định nghĩa về probiotic 22

2.5.2 Thành phần của probiotic 22

2.5.3 Tiêu chí chọn lựa vi sinh vật probiotic 22

2.5.4 Cơ chế tác động của probiotic 23

2.5.4.1.Tác động kháng khuẩn của probiotic 23

2.5.4.2.Tác động của probiotic lên biểu mô ruột 23

2.5.4.3.Tác động miễn dịch của probiotic 24

2.5.4.4.Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột 24

2.5.4.5.Tác động tăng khả năng hấp thu thức ăn của probiotic 24

2.5.5 Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của probiotic 24

2.5.6 Tác dụng của probiotic 24

2.5.7 Ứng dụng của probiotic 25

2.5.7.1.Chăn nuôi 25

2.5.7.2.Nuôi trồng thủy sản 25

2.5.7.3.Y học 26

2.5.8 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong và ngoài nước 26

2.5.8.1.Trong nước 26

2.5.8.2.Ngoài nước 27

2.6 Kết luận 27

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 28

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 28

3.1.1 Thời gian 28

3.1.2 Địa điểm 28

3.2 Vật liệu 28

3.2.1 Các chủng vi sinh vật nghiên cứu 28

3.2.1.1.Các chủng vi sinh vật khảo sát 28

3.2.1.2.Các chủng vi sinh vật kiểm định 29

3.2.2 Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy 29

3.2.2.1.Nguyên liệu 29

3.2.2.2.Môi trường nuôi cấy 29

3.2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

3.2.3.1.Thiết bị và dụng cụ 29

3.2.3.2.Hóa chất 30

3.3 Các phương pháp thực hiện trong đề tài 30

3.4 Phương pháp 30

3.4.1 Phương pháp định tính và sơ bộ định lượng hoạt độ enzyme amylase, protease bằng đường kính vòng phân giải 30

3.4.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase, protease của các chủng B subtilis 31

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme 31

3.4.4 Khảo sát mật độ giống cho vào nuối cấy 32

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ion Ca2+ 33

3.4.6 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis 33

3.4.7 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Lactobacillus acidophillus 34

3.4.8 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm 35

3.4.9 So sánh chế phẩm với các sản phẩm probiotic ngoài thị trường 35

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

4.1 Kết quả định tính và sơ bộ định lượng hệ enzyme amylase và protease của các chủng Bacillus subtilis 37

4.1.1 Kết quả vòng phân giải tinh bột 37

4.1.2 Kết quả vòng phân giải casein 39

4.2 Kết quả khảo sát hệ enzyme amylase và protease của các chủng B.subtilis 42

4.2.1 Đối với amylase 43

4.2.2 Đối với protease 44

4.3 Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy chủng Bacillus subtilis 5 45

4.3.1 Đối với amylase 46

4.3.2 Đối với protease 47

4.4 Kết quả khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy 49

4.4.1 Đối với amylase 49

4.4.2 Đối với protease 50

4.5.Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+ đến sinh tổng hợp enzyme 51

4.5.1.Đối với amylase 52

4.5.2.Đối với protease 53

4.6 Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis 54

4.7 Kết quả khảo sát chất mang bảo quản Lactobacillus acidophilus 55

4.7.1 Đối với mật độ tế bào 56

4.7.2 Đối với acid lactic 57

4.8 Kết quả phối trộn canh trường nuôi cấy B subtilis và L acidophilus 59

4.9 Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm 60

4.10.Kết quả so sánh chế phẩm với sản phẩm probiotic trên thị trường 64

4.10.1.Kết quả so sánh hệ enzyme và hàm lượng acid lactic 64

4.10.2.Kết quả so sánh mật độ tế bào 65

4.10.3.Kết quả so sánh tính kháng khuẩn 66

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68

5.1 Kết luận 68

5.2 Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

SE Standard error (sai số chuẩn)

CV Coefficient of Vestion (độ biến động số liệu)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 4

Bảng 2.2 Khả năng lên men một số loại đường của Lactobacillus acidophilus 10

Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa khác của Lactobacillus acidophilus 10

Bảng 2.4 Hàm lượng amylose và amylopectin ở một số dạng tinh bột 14

Bảng 2.5 Một số chủng vi sinh vật tổng hợp amylase 15

Bảng 2.6 Một số nguồn thực phẩm giàu protein 19

Bảng 2.7 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease 20

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn nghiên cứu 28

Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 29

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 1 30

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 2 31

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 3 32

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 4 33

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 5 33

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 6 34

Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm 8 35

Bảng 4.1 Kết quả biến thiên đường kính vòng phân giải tinh bột của 10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu 36

Bảng 4.2 Kết quả biến thiên đường kính vòng phân giải casein của 10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu 38

Bảng 4.3 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase của 10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu 42

Bảng 4.4 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease của 10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu 43

Bảng 4.5 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo thời gian nuôi cấy 47 Bảng 4.6 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo

thời gian nuôi cấy 47

Bảng 4.7 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo mật độ giống nuôi cấy 49

Bảng 4.8 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo mật độ giống nuôi cấy 50

Bảng 4.9 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo nồng độ Ca2+ 52

Bảng 4.10 Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo nồng độ Ca2+ 53 Bảng 4.11 Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis 55

Bảng 4.12 Biến thiên mật độ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 56

Bảng 4.13 Biến thiên hàm lượng acid lactic 58

Bảng 4.14 Kết quả xác định một số chỉ tiêu trong chế phẩm probiotic 59

Bảng 4.15 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn của chế phẩm probiotic thử nghiệm với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột 60

Bảng 4.16 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn của Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus với một số vi sinh vật gây bệnh 61

Bảng 4.17 Kết quả so sánh hoạt độ enzyme và hàm lượng acid lactic 64

Bảng 4.18 Kết quả so sánh số lượng tế bào trong chế phẩm 65

Bảng 4.19 Kết quả so sánh tính kháng khuẩn của chế phẩm 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 4

Hình 2.2 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 19

Hình 2.3 Cấu trúc 3D của α – amylase 13

Hình 2.4 Cấu trúc 3D của một protease serin 19

Hình 4.1 Hình vòng phân giải tinh bột và casein (1,2) 40

Hình 4.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm 66

Hình 4.3 Đường kính vòng phân giải của Bacillus subtilis 63

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Biến thiên đường kính vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis 38

Biểu đồ 4.2 Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của các chủng Bacillus subtilis 39

Biểu đồ 4.3 Biến thiên hoạt tính enzyme amylase của 10 chủng Bacillus subtilis 43

Biểu đồ 4.4 Biến thiên hoạt tính enzyme protease của 10 chủng Bacillus subtilis 45

Biểu đồ 4.5 Biến thiên logarit mật độ tế bào Lactobacillus acidophilus theo các phương pháp bảo quản 57

Biểu đồ 4.6 Biến thiên hàm lượng acid lactic theo các phương pháp bảo quản 58

Biểu đồ 4.7 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn 62

Biểu đồ 4.8 So sánh hoạt độ enzyme giữa các chế phẩm probiotic 64

Biểu đồ 4.9 So sánh mật độ tế bào giữa các chế phẩm probiotic 65

Biểu đồ 4.10 So sánh tính khánh khuẩn của chế phẩm 66

Sơ đồ 2.1 Cơ chế lên men lactic đồng hình 11

Sơ đồ 3.1 Quá trình tiến hành thí nghiệm 36

Sơ đồ 5.1 Qui trình sản xuất probiotic 69

vệ thực vật bừa bãi, sử dụng khoa học công nghệ tác động vào tự nhiên một cách không khoa học, đã gây ra nhiều hậu quả vô cùng nghiêm trọng Đặt biệt những năm gần đây, trong quá trình đẩy mạnh sản xuất, người ta đã sử dụng nhiều hơn các thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh ở gia cầm, gia súc, thủy hải sản Các kháng sinh này ít nhiều vẫn tồn đọng trong sản phẩm, dư lượng được thải vào tự nhiên và tất nhiên điều này sẽ tác động xấu đến hệ sinh thái tự nhiên và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người – đó là mối quan tâm hàng đầu của chúng ta

Nói đến đây, để thấy rằng không có gì là lợi ích tuyệt đối, tuy nhiên con người có thể điều chỉnh mặt tác hại đến mức thấp nhất Xuất phát từ yêu cầu thực tế cùng với sự phát triển của lĩnh vực Công nghệ sinh học, người ta bắt đầu nghiên cứu và đưa vào ứng dụng rộng rãi các thành tựu để phục vụ cho phát triển “nền nông nghiệp xanh”

như chuyển gen Bt kháng sâu bệnh, nhân giống in vitro sản xuất cây sạch bệnh, chế

phẩm sinh học (probiotic),…Trong hàng loạt các ứng dụng, chế phẩm probiotic được các ngành chăn nuôi gia cầm, gia súc, nuôi trồng thủy sản rất quan tâm, bởi lẽ chế phẩm này phần nào hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường khả năng tiêu hoá của vật nuôi đồng thời đem lại hiệu quả kinh tế cao

Vấn đề đặt ra ở hiện tại và trong tương lai là phải sản xuất nhiều hơn nữa, đa dạng hóa sản phẩm các chế phẩm sinh học, hạ giá thành đến mức thấp nhất, đồng thời nâng cao chất lượng, tính an toàn của sản phẩm để sử dụng rộng rãi hơn Không ngoài mục đích trên, dưới sự hướng dẫn của Ths Trương Phước Thiên Hoàng và CN Trần

Từ Duy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase,

protease từ các chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm sản xuất chế phẩm

probiotic”

1.2 Mục đích

Mục đích thực hiện đề tài là khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase và

protease của các chủng Bacillus subtilis Từ đó, nuôi cấy và phối trộn sinh khối với sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để thử nghiệm sản xuất chế phẩm

probiotic

1.3 Yêu cầu

Quá trình thực hiện đề tài cần phải giải quyết các yêu cầu sau:

 Khảo sát định tính, định lượng để chọn ra chủng Bacillus subtilis tổng hợp

amylase, protease cao nhất

 Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy: thời gian, mật độ giống, hàm lượng ion Ca2+ ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme nhằm chọn ra điều kiện nuôi cấy thích hợp

 Nuôi cấy và khảo sát phương pháp chất mang để thu chế phẩm Lactobacillus

acidophillus

 Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic từ Bacillus subtilis

và Lactobacillus acidophilus

 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chế phẩm probiotic

 So sánh với một số chế phẩm hiện bán ngoài thị trường

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi

tổ chức y học Nazi của Đức Lúc đầu, chúng được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lị

cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Năm 1949 – 1957, Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của

Bacillus subtilis Ngày nay, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi

trên thế giới (trích dẫn Bùi Thị Phi, 2007)

2.1.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis

2.1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli Bộ: Eubacillales

Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus

(trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)

2.1.2.2 Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi

Chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên, phần lớn chúng cư trú trong đất và rơm cỏ nên

còn được gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”, thông thường đất trồng trọt có khoảng

106 – 107 triệu CFU/g (trích dẫn Bùi Thị Phi) Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,

đất hoang thì sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Ngoài ra, chúng còn

có mặt trong các nguyên liệu để sản xuất bột mì, bột gạo, trong các thực phẩm như

mắm, tương, chao,…

2.1.2.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu gram dương,

kích thước 0,5 – 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di

động Sinh bào tử hình bầu dục, kích thước từ 0,8 – 1,8 m, bào tử có khả năng chịu

nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Bùi Thị Phi, 2007)

2.1.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Theo trích dẫn của Lý Kim Hữu (2005), đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis

được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

2.1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu là 370C, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát tiển trên hầu hết các môi trường dinh dưỡng cơ

bản: Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu;

trên môi trường canh TSB: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn,

lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006); trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính đến 3– 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên

tố vi lượng khác Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone)

2.1.2.6 Bộ gen của Bacillus subtilis

Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus

subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này Bộ gen chứa 4,2

mega-base, xấp xỉ 4100 gen Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được

dự đoán là thiết yếu Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào (theo tài liệu 33)

2.1.2.7 Bào tử và khả năng tạo bào tử

peptidoglycan,…Bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày,

tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non Đây là đặc điểm quan trọng trong

ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006)

 Khả năng tạo bào tử

Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại, nhiệt độ cao,…)

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

 Hình thành những búi chất nhiễm sắc

 Tạo tiền bào tử

 Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ

lý thuyết cho rằng việc tạo thành phức hợp của Ca2+ – DPA sẽ dẫn đến sự ngưng kết các polyme sinh học trong bào tử và do đó làm tăng khả năng chịu nhiệt của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2003)

2.1.3 Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi Bacillus subtilis

α–amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dextrin, malt,…

Protease: Ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp dày da, dệt, tận dụng phế liệu giàu protein, y học, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc

Ngoài ra, còn có β–glucanase, xylanase, phytase, hemicellulase,…cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thức ăn gia súc

2.1.4 Tính đối kháng của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:

subtilin, subtilisin A, TasA, sublancin, bacilisocin,…có khả năng kháng khuẩn và nấm rất hữu ích (trích dẫn Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007) Ngoài khả năng tổng hợp

kháng sinh, vi khuẩn Bacillus subtilis còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, do đó

chúng có tính đối kháng trên cả đồng loại và vi sinh vật gây bệnh

2.1.4.1 Với đồng loại

Khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, nó sẽ tiêu diệt những tế bào xung quanh để hút chất dinh dưỡng, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh

Ngoài ra, theo nghiên cứu của nhóm chuyên gia Đại học Havard (Mỹ), trong giai

đoạn sớm hình thành bào tử, một số vi khuẩn Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh giết

chết các tế bào bên cạnh, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành

bào tử tiêu thụ (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006)

2.1.4.2 Với vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn có trong đường ruột nên ngoài khả năng chịu

được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột, chúng còn có khả năng đấu

tranh chống lại các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột Vi khuẩn Bacillus subtilis phát

triển nhanh trong 24 giờ, do đó có thể cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống đồng thời tạo một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm và vi khuẩn gây bệnh bị ức

chế Theo Đặng Ngọc Phương Uyên (2007), Bacillus subtilis giúp chuột bạch chống

lại bệnh tiêu chảy xuất huyết do E.coli O157: H7

2.1.5 Ứng dụng

2.1.5.1 Trong công nghiệp

Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một số

sản phẩm cho công nghiệp như amylase, protease, aminoacid,…Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy rửa

2.1.5.2 Trong nông nghiệp

Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái

phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh; bổ sung trong thức

ăn để cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi

Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae Ngoài ra, Bacillus subtilis còn

ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch vì chúng có thể tiêu diệt

vi khuẩn gây thối rau quả (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007)

2.1.5.3 Trong y học

Một số chế phẩm sản xuất từ Bacillus subtilis có tác dụng chữa trị tiêu chảy và

một số bệnh đường ruột khác Theo nghiên cứu của Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự

(2005) thì vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng điều trị viêm xoang mũi trên chuột,

mở ra triển vọng lớn để ứng dụng trên người

2.1.6 Tác hại của Bacillus subtilis

2.1.6.1 Đối với người

Một số chủng Bacillus subtilis cũng như những họ hàng gần của nó là Bacillus

licheniformis, Bacillus pumulis, Bacillus megaterium có khả năng sản xuất lecithinase,

một enzyme có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ Tuy nhiên, vẫn chưa

có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người

Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có độc

tính thấp nhưng cũng có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như: viêm da, viêm đường hô hấp,…(trích dẫn Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007)

2.1.6.2 Đối với động thực vật

Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai Tuy

nhiên, chúng vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh

Bacillus subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharide của mô thực vật dẫn đến

thối củ ở khoai tây (bệnh “chảy nhớt khoai tây”) Gây những vết viêm loét trên một số cây rừng (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007)

Ngoài ra, Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa, bánh ngọt,

chocolate, kẹo có nhân, nhất là khi bảo quản chúng ở nơi khí hậu nhiệt đới như ở nước

ta (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007)

2.2 Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

2.2.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Sỹ, Scheele lần đầu tiên tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Sau đó, năm 1857, Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặt biệt gọi là vi khuẩn lactic Năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặc tên là

Bacterium lactic (nay gọi là Streptococus lactic) (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2003) Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân

của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này

2.2.2 Đặc điểm về Lactobacillus acidophilus

2.2.2.1 Đặc điểm phân loại (theo tài liệu 34)

Theo phân loại của Moro (1900), Hansen và Mocquoc (1970), Lactobacillus

acidophilus thuộc:

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Loài: Lactobacillus acidophilus

2.2.2.2 Đặc điểm phân bố

Lactobacillus acidophilus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trên bề mặt rau quả,

thức ăn gia súc đã lên men, trong ruột người và động vật máu nóng, trong âm đạo, sản phẩm lên men sữa, sản phẩm lên men chua,…(Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986)

2.2.2.3 Đặc điểm hình thái

Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn thuộc họ vi khuẩn lactic Tế bào hình que

đầu tròn, kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,5 – 6 µm, tế bào có thể đứng riêng lẽ hoặc tập trung, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn, không di động, không hình thành bào tử và cũng không có giáp mô Tế bào non bắt màu gram dương, tế bào già bắt màu gram âm

Hình 2.2 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

URL: http://suckhoecongdong.vn/News/uploads/News/pic/1200981215.nv.gif

2.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa (trích dẫn Phạm Đình Trúc Linh, 2007)

Lactobacillus acidophilus có một số enzyme phân giải một số loại đường và tạo

acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, ngoài ra còn tạo ra các khí H2, CO2

Bảng 2.2 Khả năng lên men một số loại đường của Lactobacillus acidophilus

Loại đường Lên men sinh

Lên men sinh acid

Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

2.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thường có đặc tính hiếu khí tùy nghi, phát

triển tốt ở 37 – 400C (không phát triển hoặc phát triển rất yếu ở nhiệt độ thấp hơn

200C), không sinh sắc tố hay độc tố, pH thích hợp 5,5 – 6,0 (trích dẫn Lê Văn Việt,

2007)

Trên môi trường thạch MRS agar, sau 48 giờ nuôi cấy ở 370C, xuất hiện những

khuẩn lạc nhỏ hình cầu, rìa dẹp, đường kính khoảng 0,25 mm, có màu vàng nhạt, ở

giữa hơi sậm màu Trên môi trường MRS broth, sau 48 giờ nuôi cấy ở 370C, môi

trường trở nên đục, có cặn lắng ở đáy

Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus acidophilus rất phức tạp, môi trường

chuẩn đòi hỏi giàu acid amin, vitamin như peptone, cao nấm men, cao thịt,…Môi trường thường sử dụng là MRS (trích dẫn Nguyễn Đức Duy Anh, 2004)

2.2.3 Hoạt động trao đổi chất

Lactobacillus acidophilus thuộc loại vi khuẩn lactic đồng hình, trong tế bào của

chúng có chứa enzyme aldolase và enzyme triosophotphate izomerase Khi lên men các loại đường chúng tạo ra acid lactic dạng D – L hoặc L, tích tụ lượng acid trong môi truờng lên tới 2,2% Ngoài ra còn một lượng rất nhỏ sản phẩm phụ như ethanol, acid acetic, CO2, (Nguyễn Lân Dũng và ctv 2003)

Lactobacillus acidophilus còn có khả năng tổng hợp một số bacteriocin như:

acidolin, acidophilin, lactacin B, lactacin F Các bacteriocin này có khả năng ức chế vi

khuẩn gây bệnh đường ruột Chính vì vậy, Lactobacillus acidophilus là một probiotic

được sử dụng phổ biến nhất (trích dẫn Phạm Đình Trúc Linh, 2007)

Cơ chế của quá trình lên men lactic đồng hình (Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986)

2.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Với những lợi ích của vi khuẩn lactic này mang lại mà nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học,…

2.2.4.1 Trong công nghiệp

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có khả năng tổng hợp acid lactic, có vị chua

dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo

acid, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm (Kiều Hữu Ảnh, 1999)

2.2.4.2 Trong nông nghiệp

Quá trình lên men lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuôi gia súc Nhờ ủ chua mà thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi nhưng không bị hao hụt về chất lượng dinh dưỡng Về mặt vitamin thì thức ăn sau khi ủ chua giàu vitamin hơn so với trước ủ chua (Nguyễn Lân Dũng và ctv 2003) Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Liễn và ctv, sử dụng quá trình lên men lactic để ủ chua phụ phẩm thủy sản dùng làm thức ăn gia súc có tác dụng tăng trọng tốt

2.2.4.3 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm

Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa

chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả, mặt khác hạn chế được

vi khuẩn gây thối Dùng sản xuất đậu phụ, dưa chua, lên men sữa chua, …(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.4.4 Trong y dược

Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa, sữa bột giàu canxi,…Theo bác sĩ

David Kesler, Lactobacillus acidophilus có thể làm tăng interferon gamma giúp hệ

thống miễn dịch chống lại bệnh tật (Bác sĩ Nguyễn Thị Lan)

Ngoài ra, acid lactic còn được ứng dụng trong công nghệ chất dẻo (poly acid lactic – PLA) thay thế chất dẻo truyền thống khó phân hủy, trong công nghệ mỹ phẩm như sản phẩm punosal (Mỹ) có tác dụng chống lại các vi sinh vật có mặt trên bề mặt

da, làm ẩm và làm sáng da (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.5 Tác hại của Lactobacillus acidophilus

Ngoài những tác dụng có lợi nêu trên, Lactobacillus acidophilus còn gây ra

những tác dụng có hại như bia, rượu vang, nước ngọt bị nhiễm vi khuẩn lactic nói chung sẽ gây hiện tượng vẩn đục, bị chua, sản sinh các chất làm mất phẩm chất của sản phẩm (Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986)

2.3 Khái quát về enzyme amylase

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Vào những năm 1811 – 1814, Kirhof (Nga) đã có những thực nghiệm đầu tiên

trên enzyme nói chung và amylase nói riêng Diatase (amylase) được tinh sạch từ malt

vào những năm 1833 bởi Payen và Persoz (Pháp) Sau này theo đề nghị của Duclo,

enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase Năm 1917, Boidin và Effont nghiên cứu

amylase của Bacillus subtilis và ứng dụng trong ngành dệt

2.3.2 Phân loại

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), amylase được chia làm 2 nhóm:

Endoamylase: gồm có α – amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme

khử nhánh gồm hai loại: khử trực tiếp là α – dextrin 6 – glucanohydrolase

(pullulanase); khử gián tiếp là oligo – 1,6 – glucosidase (transglucosidase) và amylo –

1,6 – glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi

polysaccharide

Exoamylase: gồm có β – amylase và γ – amylase (glucoamylase) Các enzyme

này thủy phân các liên kết từ bên ngoài của chuỗi polysaccharide

2.3.3 Cơ chất của amylase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật, chủ yếu có trong các loại củ như

khoai tây, khoai mì,…trong các hạt ngũ cốc Các loại tinh bột đều có khoảng

20 – 30 % amylose và 70 – 80 % amylopectin

Hình 2.3 Cấu trúc 3D của α - amylase

URL: http://www.polyenzyme.com/images/a-Amylase.jpg

Glycogen: là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật Glycogen được cấu tạo từ các phân tử glucose liên kết với nhau bởi liên kết 1,4 – glycoside và 1,6 – glycoside Glycogen có độ phân nhánh cao

Bảng 2.4 Hàm lượng amylose và amylopectin ở một số dạng tinh bột

Nguồn tinh bột Amylose (%) Amylopectin (%)

2.3.4 Nguồn thu nhận amylase

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), amylase chủ yếu được thu từ hai nguồn chính

là thực vật và vi sinh vật trong đó nguồn từ vi sinh vật tỏ ra ưu thế hơn

2.3.4.1 Amylase từ thực vật (malt)

Malt là từ chỉ trạng thái hạt đã nảy mầm Trong các hạt nảy mầm có chứa rất nhiều enzyme amylase, đặc biệt làm phần mầm Người ta thường thu malt ở đại mạch, thóc và ngô tuy nhiên malt từ đại mạch được ứng dụng rộng rãi và ưu việt hơn trong công nghiệp bia, còn malt thóc, ngô chủ yếu sản xuất ở các vùng nhiệt đới được làm mạch nha (sản xuất kẹo) và sản xuất nước giải khát lên men

Quá trình sản xuất malt gồm 5 bước sau: ngâm hạt, ủ cho hạt nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô Với cách làm này amylase thu được sẽ ở dạng thô, không tinh khiết

…

(Tổng hợp từ nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Trong công nghiệp, các biến chủng được tạo ra từ kỹ thuật công nghệ sinh học là những chủng có khả năng sinh tổng hợp nhiều amylase Đáng chú ý là những biến

chủng của nấm mốc như: Asp niger S, Asp niger S-4, Asp niger S-4-10, Asp usamii 3758-45, Asp oryzae 3-9-15, Asp.oryzae N475, Asp awamori 78-2, Asp niger URRL-333, Asp niger URRL-337,…(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.5 Thu nhận amylase từ vi sinh vật

2.3.5.1 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật

Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay

ngoài môi trường Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai

đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng Amylase ngoại bào được tổng hợp ở

tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase (Nguyễn Đức

Lượng, 2004)

 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Nguồn cacbon ảnh hưởng rất lớn đến sinh tổng hợp enzyme riêng biệt trong hệ amylase Để có hoạt lực α–amylase cao cần

6 % tinh bột, oligo – 1,6 – glucosidase cần 2 % tinh bột đối với Asp oryzae

Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường với lượng thích tổng hợp amylase này nhưng ức chế tổng hợp amylase khác Nguồn nitơ vô cơ có thể là các muối NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3,…nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô,…

Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng Một số acid amin khích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp amylase, một số thì ức chế, một số khác lại không ảnh hưởng

Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng

có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật

 Magie ảnh hưởng đến độ bền của enzyme

 Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase, bảo vệ amylase khỏi tác động của protease

 Coban cũng có tác dụng kích thích tổng hợp amylase của Bacillus subtilis

 Mangan, đồng, thủy ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật

 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không

nhỏ tới sự tạo thành amylase pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α–

amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8

Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng

hợp enzyme ở đa số Bacillus subtilis là 370C

Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật Theo Bùi

Thị Phi (2007), chế độ sục khí liên tục và nuôi cấy trong 48 giờ thì Bacillus subtilis sẽ

phát triển và cho enzyme tốt hơn các điều kiện thí nghiệm còn lại

2.3.6 Ứng dụng của amylase

Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay bởi ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt, thức ăn chăn nuôi,…

2.3.6.1 Trong công nghiệp thực phẩm

 Sản xuất rượu, bia từ tinh bột

Quá trình đường hóa có một vai trò đặc biệt quan trọng trong sản xuất rượu cồn Vài năm trở lại đây, chế phẩm amylase từ nấm sợi đã hoàn toàn thay thế malt và đem lại những kết quả sau:

 Tiết kiệm hàng chục tấn malt có chất lượng cao

 Tăng được hiệu suất rượu hóa do khả năng thủy phân triệt để

 Giảm được diện tích sản xuất, lao động và điện năng

Khác với quá trình sản xuất rượu, trong sản xuất bia, amylase chuyển hóa tinh bột không hoàn toàn, nghĩa là phải còn lại dextrin để tạo bọt và hương vị đặc trưng

 Sản xuất bánh, bánh mì

Trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ cốc nhưng hàm lượng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải thiện tính chất của bánh Người ta thêm 0,0002 – 0,0003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ làm cho bánh mì có hương

vị, màu sắc, độ xốp, ngọt, khi nướng bánh có mùi thơm và màu đẹp Tuy nhiên, trong sản xuất bánh mì, amylase vi khuẩn không được sử dụng nhiều do chúng có khả năng chịu nhiệt cao, khi tiến hành nướng bánh enzyme này vẫn tiếp tục thủy phân làm giảm chất lượng bánh (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

 Sản xuất glucose, maltose, siro fructose

Dịch giàu glucose được sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, sản xuất nước trái cây, làm mứt Glucose tinh thể được sử dụng trong y tế, trong khẩu phần dinh dưỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền

Siro fructose, maltose được dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lượng, bánh kẹo, nước quả và sản phẩm sữa

2.3.6.2 Công nghiệp dệt may

Làm mềm vải trong công nghiệp dệt, trong vải mộc có chứa 5% tinh bột và các tạp chất khác, để làm vải mềm có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm amylase khoảng 0,3 – 0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý là 5 – 15 phút ở 900C Phương pháp này không làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đảm bảo vệ sinh (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.3.6.3 Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa

Bổ sung α-amylase cùng với protease, cellulase, β-glucanase,… vào sinh khối cỏ

ủ chua nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi, tăng khả năng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng nhanh Amylase sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường, giúp quá trình tiêu hóa tinh bột tốt hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.3.6.4 Trong y học

Có rất nhiều nghiên cứu y học và lâm sàng liên quan đến amylase, lượng amylase cao luôn báo về nguy cơ viên tuyến tụy và có thể là một phản ứng phụ của thuốc chống HIV (theo tài liệu 38)

Amylase được sử dụng phối hợp với CoenzymeA, cytocrom C, ATP, carboxylase

để điều chế thuốc điều trị tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa (theo tài liệu 37)

2.4 Khái quát về enzyme protease

2.4.1 Lịch sử nghiên cứu (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Năm 1836, Schwann đã quan sát thấy khả năng phân giải protein của dịch tụy Năm 1857, Corvisart mới tách được enzyme này Đây được coi là chế phẩm enzyme protease đầu tiên trên thế giới

Năm 1874, Besaner đã công bố kết quả thí nghiệm nghiên cứu về protease từ đậu Năm 1879, Wartz cho rằng nhựa mũ đu đủ có khả năng phân giải protein

Đầu năm 1900, Rohm đã sử dụng protease trong công nghệ thuộc da Đến năm

1913, Rohm cũng là người đầu tiên sử dụng protease vào chất tẩy rữa

Từ những năm 1960, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease vi sinh vật, tuy nhiên, trước đó (1918 – 1919) Waknaam đã phát hiện ra khả năng phân giải protease của xạ khuẩn Cho đến nay, protease đã được nghiên cứu kỹ hơn và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

2.4.3 Cơ chất

Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein, chúng phân giải các liên kết peptid và sản phẩm tạo thành cuối cùng là các acid amin Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương,…

Bảng 2.6 Một số nguồn thực phẩm giàu protein

Nguồn protein Hàm lượng (%) Nguồn protein Hàm lượng (%)

(Tổng hợp từ nguồn internet)

2.4.4 Các nguồn thu nhận protease

Proteasse có trong cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật Một số thực vật dùng thu nhận protease như: đu đủ, sung, dứa, đậu ngựa,…; người ta cũng có thể thu nhận

từ nguồn động vật, chủ yếu trong các bộ phận tụy tạng, dạ dày bê, Song ngày nay, người ta quan tâm nhiều hơn đến nguồn protease từ vi sinh vật vì vi sinh vật có thể tổng hợp nhanh với một lượng lớn enzyme Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease mạnh như các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc Sau khi tổng hợp enzyme

có thể tiết ra ngoài tế bào hoặc tồn tại trong dịch cơ thể, để thu nhận enzyme cần phải phá vỡ tế bào

Hình 2.4 Cấu trúc 3D của một protease serin

URL: http://mbu.iisc.ernet.in/~mrnlab/protease.jpg

Bảng 2.7 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease

Str fradiae Str feacatis Str Rectus var proteolyticus

Aspergillus oryzae Asp niger

Asp owamori Asp.candidus Asp flavus Mucor pusilus Rhizopus niveus,

(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.4.5 Ứng dụng

Đối với thực tiễn sản xuất và đời sống, protease được ứng dụng rất rộng rãi từ công nghệ thực phẩm đến công nghệ môi trường, làm chất tẩy rữa, trong công nghệ thuộc da, sản xuất thức ăn gia súc,…

2.4.5.1 Trong chế biến thực phẩm

 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất nước chấm

Nước chấm lên men như tương, chao, nước mắm,… là sản phẩm của quá trình lên men phân giải nguyên liệu giàu protein động vật, thực vật nhờ tác dụng của acid, base, hoặc nhờ enzyme xúc tác quá trình lên men Sản phẩm tạo thành có hàm lượng acid amin rất cao Phương pháp lên men có những ưu điểm như thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, vốn đầu tư ban đầu không lớn, không gây độc cho người sản xuất và môi trường xung quanh

 Ứng dụng protease trong chế biến thịt

Trong chế biến thịt, người ta bổ sung 0,002% chế phẩm protease tinh khiết và đem ướt lạnh, bằng cách này thịt sẽ giữ màu tự nhiên lâu hơn Mặt khác, thịt được xử

lý bằng protease có hiệu suất hấp thụ cao hơn với thịt không xử lý (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Theo Lê Thị Thanh Mai và Nguyễn Kiêu Hùng, enzyme bromelin sẽ làm mềm thịt bò trong 5 phút nếu sử dụng 19,5 – 33,2 MCU/ml/cm2 dịch tích bề mặt của miếng thịt

 Ứng dụng trong chế biến sữa

Trong chế biến sữa (đặc biệt là trong sản xuất phomat) người ta sử dụng một khối lượng rất lớn enzyme đông tụ sữa Trước đây, ở các nước châu Âu thường sử dụng các loại protease động vật, ngày nay, người ta sử dụng các loại protease từ nhiều nguồn khác nhau Chính sự thay thế các loại enzyme từ vi sinh vật đã làm giảm giá thành sản phẩm chế biến từ sữa (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.4.5.2 Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc

Protease phân cắt liên kết peptid của phân tử protein, giúp tăng khả năng hấp thu lượng protein có trong thức ăn Việc kết hợp giữa protease với các enzyme khác như: amylase, phytase, cellulase,… giúp vật nuôi tăng trọng nhanh đem lại hiệu quả kinh tế cao

2.4.5.3 Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa (Trần Đức Lượng, 2002)

Từ năm 1913, enzyme đã được ứng trong sản xuất chất tẩy rửa tại nhà máy hóa chất Otto Rohm (Đức) Enzyme từ vi khuẩn được ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa

là protease (Bio 40) từ năm 1959 tại nhà máy Gebruder Schuyder (Thụy Điển)

2.4.5.4 Trong công nghiệp da

Việc sản xuất da động vật hiện nay hoàn toàn thủ công Enzyme protease có thể được ứng dụng vào một vài công đoạn của công nghiệp da bằng cách ngâm da thú trong dịch chứa enzyme ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 – 20 giờ, nhằm: Tách lông thú ra khỏi da và làm sạch da

2.4.5.5 Sản xuất insualin cho người từ insulin heo

Insulin của người và heo chỉ khác nhau một acid amin (threonin hay alanin) Trong công nghiệp sản xuất insulin cho người từ insulin từ heo người ta sử dụng hai loại enzyme là carboxypeptidase A và trypsine Các enzyme này tham gia quá trình chuyển hóa acid amin sao cho thành phần, số lượng, và trình tự của chúng giống như insulin của người (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.4.5.6 Dịch thủy phân vi sinh vật

Người ta sử dụng phức hợp nhiều enzyme trong đó có sự tham gia của protease

để phá huỷ tế bào nhằm giải phóng một số chất có giá trị bên trong tế bào Với việc phân giải vách tế bào nấm men giải phóng dịch chiết nấm men là nguyên liệu để sản xuất cao nấm men, một sản phẩm có giá trị

2.5 Khái quát về probiotic

2.5.1 Các định nghĩa về probiotic (Trần Thị Dân, 2005)

Thuật ngữ probiotic là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “dành cho cuộc sống” Khái niệm này bắt nguồn từ giả thuyết của Metchnikoff (Nga), cho rằng người nông dân Bulgari luôn sống rất khoẻ mạnh là vì họ thường xuyên dùng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic

Năm 1974, Parker là người đầu tiên dùng từ probiotic để chỉ các vi sinh vật như nấm men, vi khuẩn mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đường ruột của sinh vật chủ

Năm 1989, Fuler định nghĩa probiotic là những thành phần bổ sung vào thức ăn

để cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotic: Probiotic như là sự nuôi cấy riêng lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống mà ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật bản địa

Cũng năm 1992, Pollmann đề nghị chia probiotic làm hai loại chính: môi trường chứa vi sinh vật sống và sản phẩm lên men của vi sinh vật Đến nay, probiotic vẫn

dùng để chỉ bất kì sản phẩm chứa vi sinh vật sống để cải thiện hệ vi sinh vật nội tại 2.5.2 Thành phần của probiotic

Theo Trần Thị Dân (2005), thành phần của probiotic thông dụng nhất là các vi khuẩn sinh acid lactic, chúng được công nhận là an toàn bởi các cơ quan quản lý sức khỏe Số chủng vi sinh vật trong một chế phẩm có thể nhiều ít khác nhau, các chủng cũng có thể cùng loài hoặc khác loài, tuy nhiên đơn chủng được dùng nhiều hơn

Người ta cũng dùng bào tử của vi khuẩn như một probiotic, được báo cáo là kháng với acid dạ dày và nẩy mầm ở phần đầu của ruột để thành dạng hoạt động,

thường sử dụng là các chủng của giống Bacillus, Lactobacillus, nấm men,

Biridobacterium, Streptococcus, ít thông dụng hơn là một chủng đặt biệt của Clostridium butyricum

2.5.3 Tiêu chí chọn lựa vi sinh vật probiotic

Tiêu chí chọn vi sinh vật probiotic còn mang tính tùy ý, tiêu chí chung bao gồm nguồn gốc của chủng phân lập, sức sống, chế biến và bảo quản, sức đề kháng, khả năng kết dính và định vị lên tế bào niêm mạc ruột (Trần Thị Dân, 2005) Nói chung,

 Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ

 Dễ nuôi cấy, có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài

 Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ

 Sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng

 Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non

 Có tác dụng có lợi cho vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

2.5.4 Cơ chế tác động của probiotic

Probiotic tác động lên cơ thể vật chủ theo nhiều cách khác nhau, theo Trần Thị Dân (2005), Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007), trích dẫn của Nguyễn Đức Duy Anh (2004), chúng tôi tổng hợp tác động của probiotic gồm các nội dung sau:

2.5.4.1 Tác động kháng khuẩn của probiotic

Làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng nhiều

cơ chế khác nhau

 Tiết ra các chất kháng khuẩn:Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram dương và gram âm, gồm có các acid hữu cơ, hydroperocide, bacteriocin, Những hợp chất này không chỉ có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và sự tạo ra các độc tố

 Cạnh tranh với các nguồn bệnh vị trí bám dính vào đường ruột: Vi khuẩn probiotic ngăn cản sự cư trú của các vi khuẩn gây bệnh trên niêm mạc ruột cũng như các mô khác bằng cách cạnh tranh vị trí bám

 Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh:Các vi sinh vật probiotic phát triển nhanh hơn trong 24 giờ do đó chúng sẽ sử dụng hết nguồn dinh dưỡng trong môi trường làm cho vi sinh vật gây bệnh suy thoái do không đủ dinh dưỡng

2.5.4.2 Tác động của probiotic lên biểu mô ruột

Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

2.5.4.3 Tác động miễn dịch của probiotic

Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm.Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh

2.5.4.4 Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột

Probiotic giúp tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, điều này cũng phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết enzyme của sinh vật đường ruột

2.5.4.5 Tác động tăng khả năng hấp thu thức ăn của probiotic

Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: Chúng tham gia vào sự trao đổi chất của các chất dinh dưỡng như là cacbonhydrat, protein, lipid và khoáng

2.5.5 Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của probiotic

Theo Trần Thị Dân (2005), kết quả biến động khi dùng probiotic có thể do:

 Tình trạng dinh dưỡng và sức khỏe của đối tượng sử dụng

 Sự hiện diện của yếu tố gây stress

 Sự khác biệt về di truyền, tuổi giữa các đối tượng sử dụng

 Sức sống và tính ổn định của probiotic

 Tính đặc hiệu của probiotic

 Liều và số lần sử dụng

 Tương tác với thuốc khác

 Thiếu nghiên cứu kỹ lưỡng của các nhà khoa học

2.5.6 Tác dụng của probiotic

Theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007), probiotic tác dụng rất có lợi đối với cơ thể con người và động vật như:

 Có khả năng kháng ung thư

 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa

 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp lactose

 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh

 Kích thích hệ thống miễn dịch

 Giảm tiêu chảy ở động vật non (do virus rota)

 Giảm tác dụng của chất kháng sinh

 Trung hòa độc tố ruột

 Đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin nhóm B

 Giúp ngăn chặn những chổ loét trong hệ thống tiêu hóa

 Phòng chống và làm giảm sự tái phát nhiễm nấm âm đạo, viêm đường tiết niệu

và viêm bàng quang

 Ngoài ra, các căn bệnh đang được nghiên cứu để sử dụng probiotic bao gồm

ung thư ruột kết, tiêu chảy liên quan đến HIV và Helicobater pylori – một loại

vi sinh vật có thể dẫn đến phát triển vết loét

2.5.7.2 Nuôi trồng thủy sản

Kích thích tôm cá tiêu thụ triệt để nguồn thức ăn hơn, đồng thời cũng giúp cho tôm các phòng một số bệnh như bệnh phấn trắng, nhiễm trùng đường ruột tôm,… Cải thiện môi trường nước, loại amoni, oxy hóa sulfua, tiêu diệt vi sinh vật có hại hiện diện trong ao, kích thích tảo có lợi, phiêu sinh vật phù du có trong ao nuôi, tạo nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào cho tôm, cá (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)