BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO OXÍT SẮT TỪ (Fe3O4) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHIỆT PHÂN TIỀN CHẤT Fe(OH)3 TRONG ETHANOL TUYỆT ĐỐI VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH ENZYME TRYPSIN TRÊN BỀ MẶT HẠT NANO Fe3O4 QUA CẦU NỐI APESGLUTARALDEHYDE

Hạt nano oxít sắt từ Fe3O4 được sử dụng phổ biến vào nhiều ứng dụng điều trị và chẩn đoán trong y sinh học với các chức năng như: chất mang thuốc, tác nhân sinh nhiệt, hạt từ trong kít l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO OXÍT

DỤNG THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH ENZYME TRYPSIN TRÊN

APES-GLUTARALDEHYDE

Niên khóa: 2004-2008 Sinh viên thực hiên : ĐINH QUANG ĐỈNH

Tháng 09/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO OXÍT

DỤNG THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH ENZYME TRYPSIN TRÊN

LỜI CẢM TẠ

Lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin dành cho cha me tôi những người đã có công sinh thành dưỡng dục để tôi có được ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn :

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi trong suốc thời gian học tập

Các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy trong suốc bốn năm qua

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng và cô Nguyễn Thị Như Quỳnh đã tạo điều kiện cho

và tận tình huớng dẫn tôi trong suốc thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn sau sắc đến anh Bùi Thanh Phước và các anh chị ở Phòng Thí Nghiệm Nano, Trung Tâm R&D, Khu Công Nghệ Cao Tp HCM đã nhiệt tình hỗ trợ tôi về chuyên môn

Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Thanh Tuyền, bạn Trang Hoàng Nam và bạn Trần Khánh Nam cùng những người bạn thân thiết khác đã giúp đỡ tôi trong suốc thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Tháng 09 năm 2008 Đinh Quang Đỉnh

iii

TÓM TẮT

ĐINH QUANG ĐỈNH, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 09/2008 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO OXÍT SẮT TỪ (Fe 3 O 4 ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHIỆT PHÂN TIỀN CHẤT Fe(OH) 3 TRONG ETHANOL TUYỆT ĐỐI VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH ENZYME TRYPSIN TRÊN BỀ MẶT HẠT NANO Fe 3 O 4 QUA CẦU NỐI APES- GLUTARALDEHYDE

GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG VÀ CN NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH

Phòng các chất có hoạt tính sinh học, viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp HCM

Hạt nano oxít sắt từ Fe3O4 được sử dụng phổ biến vào nhiều ứng dụng điều trị và chẩn đoán trong y sinh học với các chức năng như: chất mang thuốc, tác nhân sinh nhiệt, hạt từ trong kít ly trích, tinh sạch…

Chúng tôi sử dụng phương pháp nhiệt phân tiền chất Fe(OH)3 trong ethanol tuyệt đối ở 2000C trong 30 phút với axít oleic làm chất cách ly hạt để tổng hợp hạt nano

Fe3O4 có kích thước khoảng 25nm với hình dạng, kích thước không đồng nhất

Chúng tôi tiến hành cố định thành công enzyme trypsin lên bề mặt hạt nano Fe3O4

qua cầu nối APES-Glutaraldehyde với hiệu suất 28,75% Sau khi cố định, enzyme trypsin vẫn còn giữ được 52,37% hoạt tính so với enzyme tự do trong dung dịch

Từ khóa: hạt nano từ tính

iv

Fe 3 O 4 BY APES-GLUTARALDEHYDE BRIDGES

Supervisor: Ph.D NGUYEN TIEN THANG and NGUYEN THI NHU QUYNH

Fe3O4 nano particles are used commonly to a large number of biotechnological and medicinal applications: drug carrier, thermal generator in the cancer treatment method, magnetic bead in the isolating and purificating kits …

We have made the about 25 nm magnetide nanoparticles (Fe3O4) by using themalysis precursor Fe(OH)3 in absolute ethanol at 2000C in 30 minutes and oleic acide as seperating agent These preparated magetical nanoparticle have a large size distribution and unstable shape

We immobilize succesfully enzyme trypsin on Fe3O4 nanopartile’s surface with 28,75% effect and remain 52,37% trypsin’s activity

Keyword : magnetical nanoperticle

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Mục đích 2

1.4 Nội dung thực hiện 2

1.5 Hạn chế của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vật lý từ và tính chất từ của vật liệu 3

2.1.1 Moment từ nguyên tử 3

2.1.2 Các dạng từ tính của vật liệu 3

2.1.2.1 Vật liệu nghịch từ 3

2.1.2.2 Vật liệu thuận từ 4

2.1.2.3 Vật liệu sắt từ 5

2.2 Vật liệu nano từ và những ứng dụng của vật liệu nano trong y sinh học 7

2.2.1 Vật liệu nano từ 7

2.2.2 Những ứng dụng của vật liệu nano trong y sinh học 8

2.2.2.1 Những ứng dụng in vivo 8

2.2.2.2 Ứng dụng in vitro .12

2.3 Các phương pháp chế tạo hạt nano từ tính sử dụng trong y sinh học 12

2.3.1 Phương pháp đồng kết tủa 13

2.3.2 Phương pháp vi nhũ tương 13

2.3.3 Phương pháp nhiệt phân muối phức cơ kim 14

3.3.4 Phương pháp glycothermal 15

2.4 Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron microscope) .15

2.4.1 Tương tác giữa tia electron và bề mặt khối vật liệu 15

2.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - Cấu trúc thiết bị và nguyên lý vận hành 16

2.4.2.1 Nguyên lý vận hành thiết bị SEM 16

2.4.2.2 Cấu trúc thiết bị SEM 16

vi

2.5 Tổng quan về enzyme trypsin 17

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 23

3.1.1 Thời gian 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 Vật liệu 23

3.2.1 Hóa chất 23

3.2.1 Thiết bị 23

3.3 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Nội dung 24

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.2.1 Nội dung thứ nhất: Vai trò của ethanol đối với khả năng hình thành

các dạng oxít sắt trong giai đoạn nung tiền chất Fe(OH)3 25

3.3.2.2 Nội dung thứ hai: Các yếu tố ảnh hưởng đến phẩm chất của hạt nano Fe3O4 26

3.3.2.3 Nội dung thứ ba: Ứng dụng gắn kết protein trypsin lên bề mặt

hạt nano Fe3O4 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33

4.1 Tạo hạt nano Fe3O4 theo quy trình nhiệt phân Fe(OH)3 trong ethanol tuyệt đối 33

4.1.1 Nguyên lý hình thành hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp nhiệt phân Fe(OH)3 trong môi trường ethanol tuyệt đối 33

4.1.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hình dạng hạt 36

4.1.2.1 Ảnh hưởng của chất cách ly hạt sử dụng trong giai đoạn nung mẫu nung tiền chất Fe(OH)3 36

4.1.2.2 Ảnh hưởng của dung môi dùng tổng hợp Fe(OH)3 38

4.1.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất phản ứng 40

4.2 Cố định trypsin lên bề mặt hạt nano Fe3O4 43

4.2.1 Hiệu suất cố định trypsin lên bề mặt hạt nano Fe3O4 43

4.2.1.1 Cơ chế gắn kết protein enzyme trypsin lên bề mặt hạt nano Fe3O4 43

4.2.1.2 Hiệu suất gắn trypsin lên hạt nano Fe3O4 44

4.2.2 Hoạt tính còn lại của trypsin sau khi cố định trên hạt nano Fe3O4 45

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Moment từ nguyên tử 3

Hình 2.2 Trật tự moment từ nguyên tử khi không có từ trường ngoài và khi có từ trường ngoài 4

Hình 2.3 Đường cong từ trễ của vật liệu sắt từ 5

Hình 2.4 Vùng từ (domain) và sự thay đổi chiều vector từ hóa Bm giữa các domain 6

Hình 2.5 Moment từ mạng lưới của vật liệu antiferromagnetism FeGe 6

Hình 2.6 Moment từ mạng lưới của vật liệu ferrimagnetism GdCo5 6

Hình 2.7 Đường cong từ trễ của hạt nano Fe3O4 thể hiện tính siêu thuận từ 8

Hình 2.8 Cơ chế phân biệt mô lành tính và tế bào căn trong hạch bạch huyết 9

Hình 2.9 Hạt nano sắt từ chứa đoạn mRNA probe bắt cặp đặc hiệu với mRNA tạo ra từ tế bào bệnh Thể lai giữa mRNA prober (chứa hạt nano sắt từ) và mRNA của tế bào bệnh ảnh MRI cho phép phân biệt tế bào bệnh và tế bào lành 10

Hình 2.10 Thuốc được dẫn vào mô bệnh thông qua ống dẫn và hướng di chuyển của hạt nano từ được điều khiển bởi nam châm đặt trên mô bệnh 10

Hình 2.11 Phương pháp hyperthermia trong chữa trị ung thư 11

Hình 2.12 Hệ thống thiết bị điều trị ung thư bằng phương pháp hyperthermia 11

Hình 2.13 Quy trình ly trích kháng nguyên bằng hạt nano từ gắn kháng thể 12

Hình 2.14 Sơ đồ nguyên lý phản ứng đồng kết tủa tạo hạt nano Fe3O4 13

Hình 2.15 Phản ứng đồng kết tủa xảy ra trong hạt vi nhũ tương 14

Hình 2.16 Tương tác giữa tia electron sơ cấp và bề mặt khối vật liệu 16

Hình 2.17 Sơ đồ cấu trúc thiết bị SEM 17

viii

Hình 2.18 Hốc kỵ nước chứa Asp189 với oxianion tương tác tĩnh điện với nhóm mang điện dương trên Lysine và Arginine của cơ chất quyết định tính đặc hiệu cơ chất của

trypsin 18

Hình 2.19 Khởi đầu phản ứng xúc tác bằng sự tấn công ái nhân của cặp electron không liên kết trên nguyên tử O của Ser195 với ion carbocartion C+ của liên kết peptide trên cơ chất hình thành phức Michaelis 19

Hình 2.20 Sự dịch chuyển electron làm cắt đứt liên kết C-O trong liên kết peptide trên cơ chất 20

Hình 2.21 Bẻ gãy liên kết peptide và hình thành phức trung gian acetyl-enzyme 20

Hình 2.22 Giải phóng đầu amine (NH2) 21

Hình 2.23 Sự tấn công ái nhân của cặp electron không liên kết trên nguyên tử O của phân tử H2O vào carbocartion trên nhóm acetyl liên kết với Ser195 21

Hình 2.24 Sự chuyển vị Proton 22

Hình 2.25 Giải phóng đầu carboxyl và phục hồi trung tâm phản ứng của trypsin 22

Hình 3.1 Dịch huyền phù Fe(OH)3 nung trong bình Kjeldahl 100ml trên bếp nung 2000C 25

Hình 4.1 Fe3O4 màu đen sẫm và Fe2O3 màu nâu đỏ 35

Hình 4.2 Fe3O4 (a) và Fe2O3 (b) dưới tác động của từ trường nam châm 36

Hình 4.3 MF06 (không có axít oleic) phóng đại 100.000 lần 37

Hình 4.4 MF07 (có axít oleic) phóng đại 100.000 lần 37

Hình 4.5 MF06 (trong ethanol) phóng đại 100.000 lần 38

Hình 4.6 MF07 (trong H2O) phóng đại 100.000 lần 39

Hình 4.7 MF11 phóng đại 30.000 lần 40

Hình 4.8 MF11 phóng đại 100.000 lần 41

Hình 4.9: MF11 phóng đại 150.000 lần 41

ix

Hình 4.10 Sơ đồ tóm lược quy trình tổng hợp hạt nano Fe3O4 và cố định trypsin lên hạt nano Fe3O4 42 Hình 4.11 Cơ chế cải biến bề mặt hạt nano Fe3O4 bằng APES và glutaraldehyde

Cơ chế phản ứng cố định protein 43 Hình 4.12 Phân tử lysine và phân bố vị trí các amino acid lysin trên phân tử enzym trypsin 44 Hình 4.13 Tương quan vị trí giữa bộ ba amino acid của trung tâm phản ứng trong phân

tử trypsin với sự phân bố vị trí của 10 phân tử lysine 46

x

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chứng minh ảnh hưởng của ethanol đối

với sự hình thành từng loại oxít sắt 26

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm chứng minh khả năng cách ly hạt nano

Fe3O4 của axít oleic 27

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hình dạng

hạt nano Fe3O4 27

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm để tìm sự ảnh hưởng của nồng độ

chất phản ứng 28

Bảng 3.5 Chuẩn bị dung dịch albumine chuẩn 30

Bảng 3.6 Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn 31

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát sản phẩm nung Fe(OH)3 trong các điều

kiện khác nhau 33

N R Rao, A Muller and A K Cheetham, 2000)

Nhiều lĩnh vực khoa học kỹ thuật đã ứng dụng rộng rãi các thành tựu từ công nghệ vật liệu nano: trong lĩnh vực điện tử nano đã cho ra đời các thế hệ vi mạch xử lý tốc độ cao hay các thiết bị lưu trữ thông tin với dung lượng lớn đến tetrabyte (ổ cứng máy tính), các tính chất cơ lý ưu việt của nanocomposite tạo ra các loại vật liệu có tính bền nhiệt và bền cơ học cao với khối lượng nhẹ hơn rất nhiều so với các hợp kim thép hay nhôm truyền thống (P M Ajayan, L S Schadler and P V Braun, 2003) Trong ngành năng lượng, xúc tác nano Pt-Rh (Platinium-Rhutenium) đã làm tăng đáng kể hiệu suất

và tuổi thọ của pin nhiên liệu giúp mở rộng phạm vi ứng dụng của pin nhiên liệu trong đời sống hằng ngày

Trong y sinh học, với nhiều ứng dụng của hạt nano từ tính đã giúp tăng cường đáng kể hiệu quả chẩn đoán và chữa trị Nhờ vào tính tương thích sinh học cao của các dạng oxít sắt (γ-Fe2O3 và Fe3O4) mà hạt nano chế tạo trên nền vật liệu này được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng y sinh Trong đó, chủ yếu là hạt nano Fe3O4 Có thể chia những ứng dụng này làm 2 hướng (Sungho J, 2003):

 Ứng dụng in vitro: dẫn truyền thuốc, hyperthermia và tác nhân tương phản MRI

(Magnetic Resonance Imaging)

 Ứng dụng in vivo: chủ yếu là dùng các hạt nano Fe3O4 được cải biến bề mặt với các tác nhân tương ứng cho từng ứng dụng như: DNA, RNA dùng ly trích đặc hiệu các nucleotide trong dịch mẫu, kháng nguyên hoặc kháng thể để ly trích, tinh sạch các protein quan tâm, vi khuẩn, virus… trong mẫu phân tích

1

Từ những phát triển mạnh mẽ của công nghệ vật liệu nano, chúng tôi thực hiện đề

tài “ Bước đầu nghiên cứu tổng hợp hạt nano oxít sắt từ (Fe 3 O 4 ) bằng phương

pháp nhiệt phân tiền chất Fe(OH) 3 trong môi trường ethanol tuyệt đối và thử

nghiệm cố định enzyme trypsin trên bề mặt hạt nano Fe 3 O 4 qua cầu nối APES

-Glutaraldehyde” dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng và

CN Nguyễn Thị Như Quỳnh Qua đề tài này, chúng tôi mong muốn được tiếp xúc với

ngành công nghệ vật liệu nano và từng bước ứng dụng nó trong các lĩnh vực khác nhau

của ngành công nghệ sinh học tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu đề tài

Thực hiện tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp nhiệt phân tiền chất

Fe(OH)3 trong môi trường ethanol tuyệt đối

Ứng dụng cố định trypsin trên bề mặt hạt Fe3O4 qua cầu nối

APES-Glutaraldehyde

1.3 Mục đích

Làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về điều chế hạt nano Fe3O4 và mở

rộng ứng dụng sang các lĩnh vực khác của công nghệ sinh học tại Việt Nam

như: thú y, xử lý môi trường, bộ kít xét nghiệm phân tử, tách chiết tế bào…

1.4 Nội dung thực hiện

 Xây dựng quy trình nung Fe(OH)3 cho phép tổng hợp γ-Fe2O3 hay Fe3O4

theo yêu cầu

 Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến hình dạng và kích thước hạt nano

Fe3O4 tổng hợp từ phương pháp nhiệt phân tiền chất Fe(OH)3 trong ethanol

tuyệt đối

 Chứng minh hạt nano Fe3O4 tổng hợp được có khả năng cố định trypsin

thông qua cầu nối APES-Glutaraldehyde và trypsin sau khi cố định trên hạt

vẫn còn hoạt tính

1.5 Hạn chế của đề tài

Do thời gian, kiến thức chuyên môn, trang thiết bị hóa tổng hợp và thiết bị phân

tích có giới hạn nên chúng tôi chưa hoàn thành tốt một số chỉ tiêu sau:

 Chứng minh về nguyên lý phản ứng hóa học của phản ứng nhiệt phân tiền chất

Fe(OH)3 trong môi trường ethanol tuyệt đối

 Chưa khống chế tốt chất lượng hạt

2

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vật lý từ và tính chất từ của vật liệu

2.1.1 Moment từ nguyên tử

Electron chuyển động trên obital xung quanh hạt nhân nguyên tử sinh ra moment

từ obital electron (Pm ) và chuyển động tự xoay quanh trục sinh ra moment từ spin electron (Pms) Các moment từ nguyên tử là nguyên nhân gây nên tương tác từ của vật liệu (Lương Duyên Bình, 1998)

Hình 2.1 Moment từ nguyên tử

2.1.2 Các dạng từ tính của vật liệu

Căn cứ vào đặc tính từ hóa của vật liệu khi đặt trong từ trường ngoài có thể phân loại các vật liệu từ như sau: nghịch từ (diamagnetism), thuận từ (paramagnetism) và sắt từ (ferromagnetism) Ngoài ra, trong nhóm sắt từ còn có thêm 2 dạng là: ferrimagnetism và antiferromagnetism

2.1.2.1 Vật liệu nghịch từ

Cấu tạo từ những nguyên tử mà obital hóa trị đã được lấp đầy (không có electron độc thân) Nên moment từ sinh ra do chuyển động của từng electron sẽ triệt tiêu lẫn nhau theo từng cặp trong cùng 1 obital, do đó moment từ nguyên tử Pm = 0, tức là vật

3

liệu không được từ hóa Dưới tác động của từ trường ngoài (B0) làm xáo trộn chuyển động của electron trên quỹ đạo của nó gây ra sự từ hóa (Pm ≠ 0), vector từ độ (J) ngược hướng với vector B0 ,độ từ hóa χm < 0 và rất nhỏ (χm khoảng -10-7) Hiệu ứng nghịch

từ rất phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các hợp chất hữu cơ, khí hiếm (Ar, Kr, Xe ), các ion có cấu trúc electron giống khí hiếm (Na+,K+, F-,Cl- ) Trong chất thuận

từ và sắt từ cũng có hiệu ứng nghịch từ nhưng không đáng kể (Lương Duyên Bình, 1998)

2.1.2.2 Vật liệu thuận từ

Vật liệu thuận được cấu trúc từ những nguyên tử có chứa electron độc thân trong obital hóa trị của chúng Do đó, khi không có từ trường ngoài thì moment từ nguyên tử

Pm đã khác 0 (Pm ≠ 0), tức là vật liệu đã được từ hóa Tuy nhiên, do dao động nhiệt và

do cấu trúc khối vật liệu mà các moment từ riêng lẽ không tương tác được với nhau để tạo thành moment từ mạng lưới, cho nên moment từ trên toàn khối vật liệu là bằng 0 Dưới tác động của từ trường ngoài B0, các moment từ sắp xếp trật tự hơn theo chiều từ trường thu được vector từ độ dương (J > 0) tức là bị hút bởi từ trường Tuy nhiên, độ

từ hóa χm rất nhỏ (10-3 – 10-5) Các chất thuận từ như: kim loại kiềm, không khí, Al, Pt Vật liệu sắt từ cũng thể hiện tính thuận từ khi nhiệt độ trên nhiệt Curie của vật liệu Khi đó dao động nhiệt làm phá vỡ tương tác từ mạng lưới tạo thành các moment

từ riêng lẽ (Lương Duyên Bình, 1998)

Hình 2.2 (a) Trật tự moment từ nguyên tử khi không có từ

trường ngoài và (b) khi có từ trường ngoài

4

2.1.2.3 Vật liệu sắt từ

Giống như vật liệu thuận từ, vật liệu sắt từ cũng có moment từ nguyên tử Pm Tuy nhiên, các moment từ riêng lẽ tương tác với nhau và hình thành moment từ mạng lưới thậm chí khi không cần có từ trường ngoài Do đó, độ từ hóa của vật liệu sắt từ rất cao (χm khoảng 103-106) Vật liệu sắt từ gồm có : Fe, Co, Ni, Sm và các hợp chất, hợp kim của chúng

Trong khối vật liệu sắt từ tồn tại các cấu trúc vi mô được gọi là những vùng từ (domain), mỗi vùng từ được từ hóa đến mức bảo hòa và tạo thành 1 vector từ hóa Bm Giữa các vùng từ khác nhau sẽ có định hướng vector Bm khác nhau và ngăn cách nhau bởi vách vùng (domain walls) Do cấu trúc vùng từ, nên vật liệu sắt từ có sự biến thiên khả năng từ hóa theo cường độ từ trường ngoài được miêu tả bởi đường cong từ trễ (Lương Duyên Bình, 1998)

Hình 2.3 Đường cong từ trễ của vật liệu sắt từ

5

Hình 2.4 (A) Vùng từ (domain) và (B) sự thay đổi chiều vector từ hóa B m giữa các domain

Vật liệu antiferromagnetism cũng có khả năng hình thành moment từ mạng lưới Tuy nhiên các moment từ này đối song nhau và triệt tiêu nhau nên moment từ tổng bằng không ((K H J Buschow, F R de Boer 2004)

Vật liệu ferrimagnetic cũng tồn tại các moment từ mạng lưới đối song Nhưng triệt tiêu không hoàn toàn nên vẫn còn tồn tại moment từ tổng (K H J Buschow, F R de Boer 2004)

Hình 2.6 Moment từ mạng lưới của vật liệu ferrimagnetism GdCo 5

Hình 2.5 Moment từ mạng lưới của vật

liệu antiferromagnetism FeGe

6

2.2 Vật liệu nano từ và những ứng dụng của vật liệu nano trong y sinh học

2.2.1 Vật liệu nano từ

Hạt nano từ tính được chế tạo từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau, từ đơn chất kim loại (Co, Ni, Fe ) đến hợp kim (Pt/Fe, Co-Sm ) Và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: thiết bị lưu trữ thông tin (ổ cứng máy tính), nam châm vĩnh cữu công suất lớn, y sinh học như: chất gây tương phản trong kỹ thuật MRI (Magnetic Resonance Imaging), hạt sinh nhiệt trong điều trị ung thư, chất mang dẫn thuốc… Với kích thước ở mức độ nanomet (thường nhỏ hơn 10 nm) các hạt nano từ có thể xem như chỉ chứa 1 vùng từ (domain) Nên với nhiệt độ dưới nhiệt Curie thì dao động nhiệt cũng đủ năng lượng để phá vỡ moment từ mạng lưới, tính chất giống như vật liệu thuận từ chỉ khác nhau là trong vật liệu thuận từ (paramagnetism) thì những moment

từ riêng lẽ là của từng nguyên tử còn trong vật liệu siêu thuận từ là của từng domain nên được gọi là vật liệu siêu thuận từ (superparamagnetism) Vật liệu siêu thuận từ có đường cong từ trễ như hình 2.7

Hầu hết các hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh học đều được chế tạo từ nguyên liệu sắt hoặc các loại oxít sắt do tính tương thích sinh học và hoàn toàn vô hại đối với cơ thể khi sử dụng ở hàm lượng thấp Trong đó, những loại hạt nano oxít sắt từ (Fe3O4) hoặc hạt nano từ có cấu trúc Fe/FexOy được dùng rộng rãi nhất nhờ vào tính trơ của lớp oxít có thể bảo vệ hạt tránh các tác nhân ăn mòn và nhờ vào lớp hydroxít (OH) bên ngoài có được do phản ứng của các ion Fen+ (n = 2 , 3) bề mặt hạt với các phân tử H2O xung quanh giúp hạt có thể dể dàng thực hiện các phản ứng gắn kết với các hoạt chất sinh học (protein, DNA, RNA ) một các trực tiếp hoặc gián tiếp

Một nguyên nhân quan trọng khác cũng cần phải nói đến, đó là tỉ lệ giữa diện tích

bề mặt/thể tích (S/V) vô cùng lớn của các hạt nano Chính nhờ ưu thế này mà hạt nano trở thành một công cụ hiệu quả trong bước trích ly các hợp chất sinh học có hàm lượng thấp đến rất thấp với hiệu suất cao

7

Hình 2.7 Đường cong từ trễ của hạt nano Fe 3 O 4 thể hiện tính siêu thuận từ

2.2.2 Những ứng dụng của vật liệu nano trong y sinh học

Những ứng dụng của hạt nano từ trong y sinh học có thể được phân làm 2 nhóm:

những ứng dụng in vivo và những ứng dụng in vitro

2.2.2.1 Những ứng dụng in vivo:

a Tác nhân gây tương phản (contrast agent) trong phương pháp MRI

(Magnetic Resonance Imaging) (Leslie L., Nitin N and Gang B 2005) :

- Hạt nano có tính sắt từ (ferromagnetic) và hạt nano có tính siêu thuận từ (superparamagnetic) có khả năng tăng cường khả năng phục hồi (relaxation) proton H+ của nước (trên 10 lần) là tác nhân tạo ảnh cộng hưỡng từ trong phương pháp MRI

- Chẩn đoán lâm sàn và tiền lâm sàn các khối u ác tính (Hình 2.8): mô gan bình thường (đặc biệt là tế bào Kupffer) có khả năng tích lũy một số lượng lớn hạt nano sắt từ (80-150nm) (AMI-25), cho hình ảnh màu đen trong phương pháp MRI Trái lại, các mô gan tổn thương do ung thư loại thải hoàn toàn các hạt nano sắt, cho hình ảnh màu trắng trong phương pháp MRI Các loại hạt nano sắt

từ có kích thước siêu nhỏ (20-40nm) (AMI-227) được tích lũy ở hạch bạch

8

huyết và tủy xương nên được sử dụng trong việc phân biệt giữa mô lành tính và các tế bào di căn ở hạch và tủy xương

- Để tăng cường tính đặc hiệu trong phương pháp MRI sử dụng tác nhân tương phản nano sắt từ , các hạt sắt từ được gắn thêm các probe đặc hiệu (kháng thể đơn dòng, DNA, RNA ) cho đối tượng cần xét nghiệm (Hình 2.9)

Hình 2.8 Cơ chế phân biệt mô lành tính và tế bào căn trong hạch bạch huyết (A) các tế bào đại thực bào chứa đầy các hạt sắt từ (do quá trình bám không đặc hiệu) được các mô hạch lành tính thu nhận,tạo các đóm đen trong ảnh MRI Trái lại, các tế bào di căn không chứa đại thực bào (do không phải là mô hạch) nên không chứa hạt sắt từ,tạo các đóm trắng trong ảnh MRI.(B) ảnh MRI của hạch bạch huyết, dấu mủi tên trong ảnh bên phải (MRI sử dụng hạt nano sắt từ) cho thấy các vết di căn không thể phát hiện bằng MRI thông thường (ảnh trái)

b Hạt nano sắt từ được phủ 1 lớp chất cải biến đặc tính bề mặt (silica, carboxyl, biotin, avidin, dextran ) có tính tương thích sinh học và có tách dụng như thể mang các loại dược phẩm Bằng một từ trường mạnh có thể di chuyển các hạt

từ theo dòng máu đến vị trí cần điều trị trong cơ thể Phương pháp này giúp hạn chế liều lượng thuốc trong 1 lần sử dụng đồng thời giúp cho các mô lành tránh tác dụng phụ của thuốc (Hình 2.10) (P Tartaj, M del P Morales, 2003)

9

Hình 2.9 (A) hạt nano sắt từ chứa đoạn mRNA probe bắt cặp đặc hiệu với mRNA tạo ra từ tế bào bệnh.(B) thể lai giữa mRNA prober (chứa hạt nano sắt từ) và mRNA của tế bào bệnh (C) ảnh MRI cho phép phân biệt tế bào bệnh và

10

thể tiêu diệt các tế bào ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào lành (Q A Pankhurst et al, 2003)

Hình 2.11 Phương pháp hyperthermia trong chữa trị ung thư

Hình 2.12 Hệ thống thiết bị điều trị ung thư bằng phương pháp hyperthermia

11

2.2.2.2 Ứng dụng in vitro

Nếu lớp phủ bề mặt hạt nano sắt từ gắn kết với các probe (RNA,DNA, kháng nguyên, kháng thể) có thể sử dụng để trích ly đặc hiệu tác nhân sinh học mong muốn một cách nhanh chóng và hiệu quả (Pedro T et al, 2003)

Hình 2.13 Quy trình ly trích kháng nguyên bằng hạt nano từ gắn kháng thể

2.3 Các phương pháp chế tạo hạt nano từ tính sử dụng trong y sinh học

Hạt nano oxít sắt từ chủ yếu được tổng hợp bằng phương pháp hóa ướt (wet chemical routes) Trong những phương pháp này, quá trình hình thành tinh thể hạt trải qua 2 giai đoạn: giai đoạn hình thành hạt nhân ngưng tụ và giai đoạn phát triển hạt Khi 2 giai đoạn này được tách biệt tốt trong quá trình phản ứng thì độ đồng nhất kích thước hạt càng cao (Jongnam P., Jin J., Soon G K., Youngjin J and Taeghwan H., 2007)

Hiện nay, có một số phương pháp phổ biến để tổng hợp nano oxít sắt từ trong dung dịch như: phương pháp đồng kết tủa, phương pháp vi nhũ tương, phương pháp nhiệt phân muối phức cơ kim, phương pháp glycothermal… Sau đây chúng ta sẽ điểm qua một vài phương pháp đó

12

Oxi hóa

Deproton hóa Deproton hóa

Hình 2.14 Sơ đồ nguyên lý phản ứng đồng kết tủa tạo hạt nano Fe 3 O 4

Chất hoạt động bề mặt được sử để ổn định kích thước hạt nhũ tương Bằng cách điều chỉnh hàm lượng nước, loại dung môi và hàm lượng chất phản ứng có thể khống

13

chế được kích thước hạt nhũ tương và từ đó điều chỉnh được kích thước hạt Phương pháp này rất linh hoạt Bằng cách sử dụng những hạt vi nhũ có kích thước vô cùng nhỏ (1-50nm) làm môi trường phản ứng nên hạt nano Fe3O4 thu được có kích thước rất nhỏ (≈ 15nm) và hạn chế sự sai biệt về hình dạng, độ phân bố kích thước hẹp Tuy nhiên, sản phẩm thu được chứa nhiều chất hoạt động bề mặt và yêu cầu thể tích phản ứng lớn hơn phương pháp đồng kết tủa thông thường để tạo ra cùng 1 lượng sản phẩm (A K Guptaa, and M Guptab, 2004)

2.3.3 Phương pháp nhiệt phân muối phức cơ kim

Hình 2.15 Phản ứng đồng kết tủa xảy ra trong hạt vi nhũ tương

Phản ứng phân hủy các phức cơ kim (oleate, acetate, acetylacetonate, carbonyl ) của các kim loại (Fe, Mn, Co, Ni, Zn ) ở nhiệt độ cao (2400C-3700C) Thông qua sự sai biệt về nhiệt phản ứng giữa các giai đoạn phân hủy của hợp chất cơ kim có thể tách biệt hiệu quả giai đoạn hình thành nhân ngưng tụ và giai đoạn phát triển hạt nên hạt thu được có độ đồng nhất kích thước rất cao Tuy tiến hành ở nhiệt độ cao, sử dụng các tiền chất và dung môi hữu cơ có độc tính cao nhưng qua nhiều cải tiến (đặc tính tiền chất, dung môi) phương pháp hứa hẹn là một phương pháp hiệu quả kinh tế để chế tạo các tinh thể hạt nano yêu cầu tính đồng nhất kích thước cao (chất bán dẫn) (J Park

et al, 2004)

14

3.3.4 Phương pháp glycothermal

Phương pháp này được tiến hành bằng cách nung Fe(OH)3 trong 1,4-butanediol, etylenglycon, 1,3-propadiol… ở nhiệt độ 210-2700C trong 8 giờ Cơ chế của phản ứng này chưa được làm rõ Theo nhóm tác giả Dong-Sik Bae, Kyong-Sop Han, Seung-Beom Cho, Sang-Heul Choi 1998 phương pháp này có ưu điểm là:

- Tạo trực tiếp Fe3O4 từ Fe(OH)3 ở nhiệt độ thấp hơn phương pháp nhiệt phân truyền thống Do đó, ngăn chặn được quá trình calcin hóa-quá trình chuyển dạng từ phase vô định hình (amorphous) thành pha tinh thể-nên giảm được quá trình ngưng kết giữa các hạt với nhau

- Yêu cầu về trang thiết bị và thao tác thực hiện đơn giản

- Có thể tạo được các hạt nano oxít có chất lương tốt

2.4 Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron microscope)

2.4.1 Tương tác giữa tia electron và bề mặt khối vật liệu

Khi khối vật liệu được chiếu bởi tia electron – electron sơ cấp (primary electron) -

sẽ thu được các dạng bức xạ như:

- Electron thứ cấp (secondary electrons) có năng lượng < 50eV

- Electron Auger thu được khi nguyên tử bề mặt khối vật liệu chuyển từ trạng thái kích thích về trạng thái cơ bản

- Electron tán xạ ngược có năng lượng gần bằng năng lượng của tia electron chiếu tới

- Bức xạ ánh sáng, tia X, phonon và nhiều dạng tín hiệu khác

Những dạng tín hiệu này được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau: xây dựng hình ảnh, mô hình nhiễu xạ hoặc dữ liệu phổ học phục vụ cho các nghiên cứu định

tính, bán định lượng và định lượng các thông số của vật liệu (Nan Y and Zhong L

W., 2005)

15

Hình 2.16 Tương tác giữa tia electron sơ cấp và bề mặt khối vật liệu

2.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - Cấu trúc thiết bị và nguyên lý vận hành 2.4.2.1 Nguyên lý vận hành thiết bị SEM

Khi chùm tia electron sơ cấp được bắn từ súng electron vào một trường cao thế (10-50kV) trong môi trường chân không sẽ được điều khiển bởi các thấu kính từ hướng chùm tia đến tương tác với mẫu tạo ra các bức xạ tín hiệu Những tín hiệu này được ghi nhân bởi các bộ cảm biến đặc trưng cho từng loại bức xạ Những tín hiệu này

được xữ lý và dùng để điều khiển hệ thống hiển thị hình ảnh (Nan Y and Zhong L

W., 2005)

2.4.2.2 Cấu trúc thiết bị SEM

Thiết bị SEM gồm các bộ phận như:

- Súng electron: cung cấp nguồn electron thứ cấp

- Hệ thống thấu kính từ: điều khiển hướng đi của chùm electron

- Cuộn quét: điều khiển chùm tia electron sơ cấp quét qua toàn bộ bề mặt mẫu

- Hệ thống cảm biến: ghi nhận các tín hiệu bức xạ từ mẫu đo

16

Hình 2.17 Sơ đồ cấu trúc thiết bị SEM

2.5 Tổng quan về enzyme trypsin

Về cơ bản, enzyme protease được phân thành 2 nhóm là aspartic protease và serine protease Nhóm serine protease gồm các enzyme như: trypsin, chymotrypsin, elastase, thrombin, subtilisin và plasmin Nhóm aspartic protease gồm có: pepsin, chymosin, cathepsin D, renin và HIV-1 protease

Do trypsin được sử dụng trong khóa luận nên chúng tôi sẽ phân tích cụ thể hơn

về serine protease và trypsin mà không đề cập tới aspartic protease

Nhóm serine protease đặc trưng bởi amino axít serine đóng vai trò quan trọng trong bộ 3 xúc tác gồm: His57, Asp102 và Ser195 Mỗi amino axít trong bộ 3 này có vai trò cụ thể như sau:

- Asp102 có nhiệm vụ định hướng cho His57

- His57 có nhiệm vụ cho nhận proton (H+) trong phản ứng xúc tác phân cắt liên kết peptide

17

- Ser195 là amino axít hình thành liên kết cộng hóa trị với gốc acyl (-C=O) trong liên kết amine của cơ chất để khởi động phản ứng phân cắt

Mỗi enzyme có những vị trí cắt đặc hiệu khác nhau Chymotrypsin nhận dạng cơ chất qua các amino axít như : Phenylalanine, Tyrosine hoặc Tryptophan với chuỗi bên hương phương Elastase cắt đặc hiệu tại Alanine có chuỗi bên kỵ nước kích thước nhỏ

Riêng trypsin sẽ cắt ở các vị trí có Lysine và Arginine với chuỗi bên mang điện dương Trypsin được phân tiết bởi tuyến tụy dưới dạng tiền enzyme bất hoạt là trypsinogen có trọng lượng phân tử 34kDa Sau khi trypsinogen được cắt bỏ đoạn polypeptide chứa 6 amino axít từ đầu N trở thành dạng có hoạt tính là trypsin trọng lượng 23,8kDa

Cơ chế đặc hiệu cơ chất của trypsin được quyết định bởi một hốc kỵ nước chứa Asp189 với oxianion sẽ tương tác tĩnh điện với nhóm mang điện dương trên Lysine hoặc Arginine của cơ chất

Hình 2.18 Hốc kỵ nước chứa Asp189 với oxianion tương tác tĩnh điện với nhóm mang điện dương trên Lysine và Arginine của cơ chất quyết định tính đặc hiệu cơ chất của trypsin

Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết peptide (-NH-CO-) tại trung tâm phản ứng của trypsin (Jennifer T.,2004 ):

18

Khi chưa phản ứng với cơ chất, trong bộ 3 amino axít của trung tâm phản ứng có 2 liên kết hydro giữa gốc COO- của Asp102 với N1-H trong vòng imidazole của His57

và N3 trong vòng imidazol của His57 với OH của Ser195 (Hình 2.19)

Bước 1 (Hình 2.19): Sự tấn công ái nhân

Cặp electron không liên kết trên nguyên tử O của nhóm OH trên Ser195 tấn công

ái nhân vào ion carbocartion (C+) trên liên kết peptide của cơ chất gây nên:

- Hình thành liên kết cộng hóa trị (O-C) giữa Ser195 và cơ chất

- Hình thành ion O- tại liên kết peptide trên cơ chất

- Liên kết O-H trên Ser195 bị phá vỡ do cặp electron liên kết σ bị hút về phía nguyên tử O để bù lại cặp electron không liên kết đã tham gia hình thành liên kết (O-C) với cơ chất Đồng thời cặp electron không liên kết trên nguyên tử N thứ 3 của His57 sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị N-H với điện tích dương định vị trên nguyên tử N (Hình 2.20)

Kết quả bước 1 hình thành nên phức Michaelis

Tấn công ái nhân (nucleophyl)

Bước 2 (Hình 2.20, Hình 2.21): Bẻ gãy liên kết peptide

Liên kết NH vừa được hình thành giữa N thứ 3 trên His57 với H trên Ser195 sẽ tạo liên kết hydro với nguyên tử N trong liên kết peptide hình thành phức trung gian tetraheral

Hình 2.19 Khởi đầu phản ứng xúc tác bằng sự tấn công ái nhân của cặp electron không liên kết trên nguyên tử O của Ser195 với ion carbocartion C+ của liên kết peptide trên cơ chất hình thành phức Michaelis

Liên kết peptide trên cơ chất