KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.) NUÔI CẤY IN VITRO

1.2.2 Yêu cầu - Ảnh hưởng của BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi từ vảy củ - Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng nhân cụm chồi - Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến sự hình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH

CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.)

NUÔI CẤY IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH

CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.)

NUÔI CẤY IN VITRO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS NGUYỄN NGỌC TRÌ ĐÀO THỊ THƯƠNG

Tháng 9/2008

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 Ths Nguyễn Ngọc Trì đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại trường

 Cô Khanh cùng các anh chị tại Bộ môn CNSH đã tận tình giúp đỡ, tạo điền kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

 Cảm ơn chị tôi, bạn bè tôi- những người luôn giúp đỡ và chia sẻ buồn vui

 Cuối cùng, con thành kính ghi ơn công lao của bố mẹ đã sinh thành, dạy dỗ và động viên con trong suốt bốn năm học này

Sinh viên thực hiện Đào Thị Thương

TÓM TẮT

ĐÀO THỊ THƯƠNG, “KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH

CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.) NUÔI CẤY IN VITRO”

Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Ngọc Trì

Đề tài được thực hiện từ 3/2008 đến 9/2008 tại phòng nuôi cấy mô - Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Nguyên liệu là vảy củ lily giống Sorbonne Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại

Đề tài gồm những thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp

từ vảy củ lily

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân cụm chồi

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường đến sự hình thành củ

Thí nghiệm 6: Khảo sát tỉ lệ sống, tỉ lệ nảy mầm của củ đem ra vườn ươm

Những kết quả đạt được:

1 Môi trường nuôi cấy tốt nhất cho sự tái sinh chồi từ vảy củ lily là môi trường ½ MS có

bổ sung BA 0,2 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l

2 Nhân chồi tốt ở môi trường MS bổ sung Kinetin 0,1 mg/l và NAA 0,1 mg/l

3 Nhân chồi tốt ở môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và TDZ 1 mg/l

4 Môi trường ½ MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 0,1 mg/l thích hợp nhất cho hình thành rễ

5 Môi trường nuôi cấy ½ MS bổ sung đường saccarose 75 g/l thích hợp cho hình thành

củ

6 Tỉ lệ sống của cây con 76,6 %, tỉ lệ nảy mầm cao nhất ở là củ nhỏ 66,7 %

SUMMARY

Dao Thi Thuong, September 2008 “A study some factor effect to shoot regeneration, root

and bulb formation lily (Lilium sp.) culture in vitro”

Guide teacher: Nguyen Ngoc Tri

The study has conducted in laboratory from March 2008 to September 2008, at Biotechnology department of Nong Lam University in Ho Chi Minh City The material is

scale bulbs of lily Sorbonne These experiments were laid out in randomized complete

design (RCD) with three replicates

Experiment 1: Effect of BA, TDZ and Kinetin concentration on directly shoot regeneration from lily scale bulbs

Experiment 2: Effect of Kinetin concentration on shoot multiplication

Experiment 3: Effect of NAA and TDZ concentration on shoot multiplication

Experiment 4: Effect of NAA concentration and activated charcoal on root formation Experiment 5: Effect of sugar and medium concentration on bulb formation

Experiment 6: Survival ratio of plantlet, germination ratio of bulb

The result of this study:

1 The best culture medium to directly shoot regeneration from scale bulbs is ½ MS supplemented with BA 0,2 mg/l and NAA 0,1 mg/l

2 The best culture medium to shoot multiplication is MS supplemented Kinetin 0,1 mg/l and NAA 0,1 mg/l

3 The best culture medium to shoot multiplication is MS supplemented NAA 1 mg/l and TDZ 1 mg/l

4 The best culture medium to root formation is ½ MS supplemented NAA 0,5 mg/l and

BA 0,1 mg/l

5 The best culture medium to bulb formation is ½ MS supplemented 75 g/l sugar

6 Survival ratio of plantlet is 76,6 %, germination ratio of small bulb is 66,6 %

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về cây Lily 3

2.2.1 Phân loại cây hoa Lily 3

2.1.2 Phân loại thực vật học 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 3

2.1.4 Phân bố và sinh thái học 4

2.1.5 Sản xuất và tiêu thụ trong và ngoài nước 4

2.1.5.1 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới 4

2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa Lily ở Việt Nam 5

2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 7

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy 7

2.2.3.1 Ánh sáng 7

2.2.3.2 Nhiệt độ 7

2.2.3.3 Môi trường in vitro 8

2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 8

2 3.1 Auxin 8

2 3.2 Cytokinin 8

2 3.3 Acid abscisic (ABA) 9

2 4 Các yếu tố khác 9

2.4.1 Nguồn carbon 9

2.2.4.2 Tác nhân tạo gel (gelling agent) 10

2.2.4.3 pH của môi trường 10

2.2.4.4 Than hoạt tính (Activated charcoal) 10

2.2.4.5 Tính thẩm thấu của môi trường 11

2.2.4.6 Aminoacid 11

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 11

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .16

3.1 Đối tượng thí nghiệm 16

3.2 Thời gian và địa điểm thưc hiện 16

3.3 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 16

3.3.2 Mẫu sử dụng, điều kiện và môi trường nuôi cấy 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu 17

3.4.1 Chuẩn bị môi trường 17

3.4.2 Tạo nguồn mẫu cấy ban đầu 17

3.4.3 Bố trí thí nghiệm 18

3.5 Chỉ tiêu theo dõi 22

3.5.1 Thí nghiệm tái sinh chồi 22

3.5.2 Thí nghiệm nhân cụm chồi 22

3.5.3 Thí nghiệm tạo rễ 23

3.5.4 Thí nghiệm tạo củ 23

3.5.5 Thí nghiệm vườn ươm 23

3.6 Xử lý số liệu 23

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily 24

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng tạo cụm chồi 29

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ và NAA đến khả năng tạo cụm chồi32 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ35 4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường nuôi cấy đến sự hình thành củ 38

4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tỉ lệ sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây và củ đem ra vườn ươm 43

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1:Hoa lily giốngsorbonne 3

Hình 2.2: Một số lily lai Phương Đông 6

Hình 3.4: A: Mẫu củ ban đầu, B: Phần gốc của vảy củ sau 2 tuần nuôi cấy 18

Hình 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy 28

Hình 4.2: Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tao cụm chồi lily 31

Hình 4.3: Ảnh hưởng TDZ và NAA đến khả năng tao cụm chồi lily 34

Hình 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ 37

Hình 4.5: Ảnh hưởng nồng độ đường và môi trường đến khả năng hình thành củ

42

Hình 4.6: Cây con và củ vườn ươm sau 4 tuần 43

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1a: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ

vảy củ lily sau 4 tuần nuôi cấy 24

Bảng 4.1b: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy 25

Bảng 4.1c: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy 25

Bảng 4.2: Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tao cụm chồi 29

Bảng 4.3: Ảnh hưởng TDZ và NAA đến khả năng tao cụm chồi 32

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ 35

Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ đường và môi trường đến khả năng hình thành củ .38

Ở nước ta, thị trường tiêu thụ hoa ngày càng gia tăng Cùng với các loại hoa khác, lily chiếm một phần không nhỏ bởi sức thu hút về màu sắc phong phú và hương thơm của loài hoa này Hiện nay hoa lily được trồng ở các vùng như Tam Đảo, Sapa, Mộc Châu, Đà Lạt, một số ít ở vùng đồng bằng…nhưng sản lượng chưa cao, chưa được trồng và nhân giống trên diện tích rộng như các loại hoa khác Những người trồng hoa không có sẵn củ giống do củ giống phải được bảo quản lạnh trong khoảng thời gian tùy theo loại giống từ

2 đến 6 tháng mới đem trồng, do đó họ phải mua củ giống nhập nội, giá hiện tại cho một

củ giống từ 7.000 - 10.000 đồng/củ tuỳ loại và màu sắc, do vậy sản phẩm của hoa thương phẩm là rất đắt

Những phương pháp nhân giống truyền thống chưa đáp ứng nhu cầu hiện nay do chất lượng củ giống chưa đảm bảo, tạo hoa thương phẩm không chất lượng, dễ mắc nhiều bệnh

Trên thị trường hoa lily hiện nay, muốn giảm giá hoa tiêu thụ thì trước tiên là giảm

giá nguyên liệu giống ban đầu Ứng dụng kĩ thuật hiện đại nuôi cấy mô in vitro có thể đáp

ứng các nhu cầu hiện nay với ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống, tạo số lượng nhiều, chất lượng nguồn giống ổn định, đồng đều, sạch bệnh, cây sinh trưởng và phát triển tốt, giá thành phù hợp với người trồng hoa và đáp ứng phù hợp thị hiếu nhiều người tiêu dùng

Xuất phát từ mục đích trên và được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hướng dẫn tận tình của ThS Nguyễn Ngọc Trì, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi, hình thành rễ và củ

lily (Lilium sp.) nuôi cấy in vitro”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Tái sinh chồi từ nguyên liệu ban đầu là vảy củ lily Hình thành rễ và củ từ chồi

1.2.2 Yêu cầu

- Ảnh hưởng của BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi từ vảy củ

- Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng nhân cụm chồi

- Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ, nồng độ đường và môi trường nuôi cấy đến sự hình thành củ

- Khảo sát tỉ lệ sống sót của cây con và tỉ lệ nảy mầm của củ ngoài vườn ươm

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây lily

2.1.1 Phân loại cây hoa lily

Hoa lily có thể phân loại theo nhiều cách khác nhau như: phân loại theo nguồn gốc xuất xứ, theo thời gian ra hoa và theo màu sắc hoa Năm 1982, Hiệp hội lily quốc tế đề ra

hệ thống phân loại lily trên cơ sở hệ thống phân loại của Anh năm 1963 Hệ thống này dựa vào nơi nguyên sản của bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa

mà quy các giống lily vào 8 nhóm: nhóm lily lai Châu Á, lily lai Tinh Diệp, lily lai hoa trắng, lai lily Châu Mỹ, lai lily thơm, lily lai loa kèn, lai Phương Đông và lily nguyên chủng (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003)

Hình 2.1: Hoa lily giống sorbonne

- Thân vảy: là phần phình to của thân tạo thành, nhiều vảy hợp lại trên cùng thân vảy, màu sắc thay đổi tùy loài và giống

- Rễ: gồm rễ thân và rễ gốc, rễ gốc là cơ quan hút nước và dinh dưỡng

- Lá: mọc rải thành vòng thưa, hình kim, xòe, lá to, nhỏ tùy thuộc vào giống, điều kiện trồng trọt Trên lá có 1 - 7 gân, gân giữa rõ ràng hơn, lá mềm và xanh bóng

- Củ con: nhiều củ con ở gần thân rễ, chu vi mỗi củ 0,5 - 3 cm

- Hoa: hình dáng hoa to, màu sắc hoa phong phú, hoa có 3 cánh, 3 đài hoa, 6 bao phấn (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003)

2.1.4 Phân bố và sinh thái học

Lily có nguồn gốc từ các đảo phía Nam Nhật bản Ở nước ta hiện có hai loài Loài

thứ nhất là cây bách hợp (L brownii F.E Brown var Colchsteri Wils) mọc hoang trên núi

đá, các đồi cỏ ở Bắc Thái, Cao Lạng Loài thứ hai là L poilanei Gagnep có ở đồi cỏ Sapa,

tỉnh Hoàng Liên Sơn

Lily là cây ưa khí hậu ôn đới hay cận nhiệt đới, ánh sáng ở mức trung bình, có thể chịu đựng nhiệt độ -2oC, nhiệt độ ban ngày không quá 22oC, nhiệt độ ban đêm 13 - 17oC

là thích hợp, lily ưa mọc đất ẩm thoáng, đất mùn, thoát nước tốt, pH thích hợp 5,5 - 7,0 Dinh dưỡng phải được cung cấp phù hợp, nhất là trong thời kì cây còn non (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003)

2.1.5 Sản xuất và tiêu thụ trong và ngoài nước

2.1.5.1Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới

Lily là một trong những hoa được ưa chuộng trên thế giới Năm 1997, Hà Lan có

356 ha lily, đứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt cành trồng bằng củ (sau tulip) Hiện

nay, mỗi năm Hà Lan trồng 18.000 ha hoa lily trong đó xuất khẩu 70 %

Nhật Bản là nước có truyền thống dùng hoa cắm và là một trong những nước tiêu thụ và nhập khẩu hoa cắt lớn nhất châu Á Nhật cũng là nước sản xuất hoa lớn, diện tích sản xuất hoa năm 1992 là 4.600 ha với 3.600 hộ, trong đó hoa lily đứng thứ 4

Những năm gần đây, Hàn Quốc cũng phát triển hoa mạnh Năm 2002, nước này có 15.000 ha trồng hoa, trong đó lily là loại cây có hiệu quả kinh tế cao nhất

Kenia là nước sản xuất hoa chủ yếu ở châu Phi, và là nước xuất khẩu hoa tươi lớn nhất châu lục này Hiện nay nước này có tới 3 vạn nông trường với hơn hai triệu người trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu sang châu Âu 65 triệu USD, riêng hoa lily chiếm

35 %

Ở Đài Loan, năm 2001 nước này có 490 ha trồng lily, xuất khẩu lily cắt cành đạt 7,4 triệu USD (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003)

2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa lily ở Việt Nam

Lily được trồng ở một số các tỉnh miền núi phía Bắc như Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sapa (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La), ở Đà Lạt (Lâm Đồng) với các tỉnh đồng bằng đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng Nói chung, so với các loại hoa khác thì hoa lily chiếm

tỉ lệ cả về diện tích và số lượng còn quá nhỏ Trong đó, Đà Lạt là nơi có diện tích trồng hoa lily nhiều nhất (chiếm khoảng 8 % trong tổng diện tích trồng hoa) (Đặng Văn Đông

và Đinh Thế Lộc, 2003)

Theo Đặng Văn Đông, hiện nay nhiều giống lily được ưa chuộng phân thành 4 nhóm chính: lai Á châu, nhóm lai Phương Đông, nhóm lily thơm và nhóm các loại hình khác Các giống lily đang được ưa thích ở nước ta gồm có: TIBER cho hoa màu nâu hồng, có 3 - 5 hoa/cành, hoa to, cây cao vừa phải (80 - 90 cm), SIBERIA cho hoa màu trắng, có 4 - 5 hoa/cành, hoa to, thấp cây (60 - 70 cm), ACAPULCO cho hoa màu hồng sẫm, có 3 - 5 hoa/cành, hoa vừa, cây cao 90 - 120 cm), SORBONNE cho hoa màu hồng nhạt, có 6 - 7 hoa/cành, hoa nhỏ, cây cao 90 - 120 cm và một số giống màu vàng, sọc hồng, lily thơm v.v (Nhà Nông, 2008)

Hình 2.2: Một số lily lai Phương Đông

2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Phạm Thành Hổ (2006), sự phát triển của nuôi cấy mô thực vật có thể chia làm 4 giai đoạn chính:

- GĐ I: (1902 - 1930) với những thử nghiệm ban đầu

- GĐ II: (1934 - 1954) năm 1937, Gautheret đã nuôi cấy thành công mô tế bào cà rốt Phát hiện vai trò các vitamin, chất kích thích sinh trưởng auxin, cytokinin

- GĐ III: (1957 - 1992) thực hiện tách và nuôi tế bào đơn Biết vai trò tỉ lệ cytokinin/auxin; tạo protoplast và tái sinh cây; tạo cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn và từ những năm 1980 là sự phát triển công nghệ gen thực vật

- GĐ IV: ứng dụng các thành tựu vào sản xuất quy mô lớn và diện rộng

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường thường được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm là môi trường MS với đầy đủ thành phần dinh dưỡng, khoáng, thuận lợi cho mẫu nuôi cấy Bao gồm:

- Nguyên tố đa lượng: K, N, S, P, Mg, Ca

- Nguyên tố vi lượng: Fe, Co, Mn, Bo, Zn, Cu, Mo

- Vitamin: thiamin (vitamin B1), pyridoxin (vitamin B6), glycine, nicotinic acid,

myo-Inositol

½ MS, ¼ MS là môi trường có hàm lượng khoáng đa lượng giảm ½, ¼

Môi truờng có bổ sung đường, agar, than hoạt tính và các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin hoặc auxin với nồng độ khác nhau

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy

2.2.3.1 Ánh sáng

Mẫu cấy được đặt trên môi trường chứa nguồn năng lượng sẵn sàng là đường, sẽ ít tùy thuộc vào quang hợp Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây nuôi cấy mô

2.2.3.2 Nhiệt độ

Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ Tuy có nhiều loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình nhưng hầu hết việc nuôi cấy thích hợp ở nhiệt độ 20 – 25oC

2.2.3.3 Môi trường in vitro

Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy Môi trường in vitro có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây

in vitro Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức độ quang hợp thấp không cân bằng

CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng hạn chế, Vì vậy cây con in

vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị về hình thái và chất lượng, mẫn cảm với stress ở

giai đoạn thuần hóa

Đặc tính của môi trường in vitro và phản ứng của cây con in vitro với môi trường

có mối tương quan Do đó việc kiểm soát môi trường in vitro được đặt ra để điều khiển sự

sinh trưởng (Dương Công Kiên, 2002)

2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng

2.3.1 Auxin

Auxin đầu tiên được phát hiện đó là hợp chất tương đối đơn giản: acid acetic là tác nhân của sự sinh trưởng kéo dài miền cận dưới đỉnh của bao lá mầm và thân cây (Nguyễn Như Khanh, 2006) Hiện nay các auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính

indol-3-Các loại auxin có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2 mg/l (ngoại trừ IAA ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng) Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy…mà tác động sinh lý của auxin kích thích sinh trưởng mô, hoạt hóa hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của

tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

2.3.2 Cytokinin

Kinetin được Skoog và Miller đặt tên sau khi tách ra từ 500 g DNA của tinh dịch

cá trích (clupea) Cytokinin nói chung là một nhóm các chất tự nhiên và nhân tạo có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro Các

cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có biểu hiện

dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy, cảm ứng sự hình thành chồi cây thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trưởng (Vũ Văn

Vụ và ctv, 2006)

Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 2 mg/l Ở những nồng

độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên, Kinetin

và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

TDZ là một chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp, không là dẫn suất của cytokinin nhưng có tác dụng như một cytokinin Các thí nghiệm trước đã cho thấy TDZ có tác dụng gấp 4 lần cytokinin Ở nồng độ thấp TDZ cảm ứng tái sinh trực tiếp từ mô, nồng độ cao cảm ứng tạo sẹo và phôi sinh dưỡng từ sẹo Vì TDZ bền, có họat tính cao nên thường được sử dụng trong nuôi cấy mô (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai, còn đa số trường hợp mẫu phải sử dụng phối hợp cả hai loại auxin và cytokinin

2.3.3 Acid abscisic (ABA)

ABA là hormone thực vật quan trọng, là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên Nó tác động như là chất điều hòa sinh trưởng âm tính, hoạt động trên sự rụng lá, điều tiết sự đóng

mở khí khổng, đặc biệt khi cây ở vào điều kiện môi trường bất lợi, đó cũng là hormone điều tiết trạng thái ngủ của hạt, chồi, củ Chất này được tìm ra đầu tiên trên thí nghiệm của sự rụng trái bông vải (Nguyễn Như Khanh, 2006)

Trong nuôi cấy in vitro, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây

và phần khác tùy vào điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khó khăn (Dương Công Kiên, 2002)

2.4 Các yếu tố khác

2.4.1 Nguồn cacbon

Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp, hoặc nếu có quang hợp thì cường độ cũng rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác…Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcarbon vào thành phần nuôi cấy

Loại hydratcarbon được sử dụng phổ biến là đường saccarose với hàm lượng 2 - 6

% (W/v) Những loại đường khác như: fructose, glucose, maltose, lactose, rafinose, sorbitol…chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

2.4.2 Tác nhân tạo gel (gelling agent)

Tác nhân tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Các môi trường đặc có chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường (25 - 30oC)

Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm một số polysaccharide có khối lượng phân tử cao, được lấy từ rong biển Các polysaccharide kết hợp với các phân tử H2O tạo thành polyme và đông lại thành gel ở nhiệt độ xấp xỉ 45oC

Trong thành phần của agar có chứa một số thành phần vô cơ: Cu, Fe, Mg, Mn, Cl, Zn và một số thành phần hữu cơ: acid hữu cơ, acid béo chuỗi dài…

Hàm lượng sử dụng của agar 0,5 - 10 % (W/v) tùy theo chất lượng của chúng và loại môi trường sử dụng (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

2.4.3 pH của môi trường

pH của đa số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 - 6, dưới 5,5

làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng Trong

quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh

ra acid hữu cơ (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

2.4.4 Than hoạt tính (Activated charcoal (AC))

Than hoạt tính được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp,…trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu

Than hoạt tính cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt chelat,

kẽm Hàm lượng sử dụng than hoạt tính là 0,2 - 0,3 % (W/v)

Than hoạt tính làm giảm hiệu quả các chất điều hòa sinh trưởng, làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có than hoạt tính, có thể kích thích sự hình thành, sinh trưởng của rễ, và là một trong những chất chống oxi hóa tốt (Vũ Văn Vụ

và ctv, 2006)

2.4.5 Tính thẩm thấu của môi trường

Trong nuôi cấy mô, hấp thụ nước của tế bào, mô bị chi phối bởi thế năng của nước trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm:

ra hiện tượng thủy tinh thể Đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

Theo Trigiano và Gray (2000), hydratcarbon đóng góp khoảng 50 - 70 % vào khả

năng thẩm thấu của môi trường, phần còn lại do muối dinh dưỡng và các thành phần khác gây ra Vì thế có thể thay đổi thẩm thấu của môi trường qua thành phần hydratcarbon (Vũ

Văn Vụ và ctv, 2006)

2.4.6 Aminoacid

Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoacid vì chúng giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái Tất cả các dạng tự nhiên của aminoacid (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ Trong đó glycine là aminoacid đơn giản nhất, nhưng là nguồn tổng hợp ra purin và một số thành phần cấu trúc của vòng porphyrin trong các phân tử chlorophyll (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)

2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Hoa lily đã được con người biết đến từ lâu nhưng những ứng dụng nuôi cấy mô lily

để nhân giống thương mại thì chỉ được thực hiện trong những thập niên gần đây

- Năm 1982, Shinsaku Takayama và Masanaru Misawa đã nghiên cứu ảnh hưởng

của cytokinin và auxin lên sự phát sinh hình thái in vitro Lilium auratum Lindl (một loài hoang dại ở Nhật Bản) và Lilium speciosum Thunb cv "Uchida" Nghiên cứu này đã chỉ

ra sự kết hợp NAA và Kinetin có hiệu quả tương hổ lẫn nhau BA có tác dụng sinh lý

mạnh trong phát sinh hình thái hơn Kinetin và hoạt tính của Kinetin ảnh hưởng bởi nồng

độ đường và môi trường MS

- Năm 1997, Qian Hou và ctv đã nuôi cấy Sego lily một loài lily hoang dại có nguồn gốc miền Tây nước Mỹ Ông đã thực hiện sự tái sinh chồi từ những phần cắt từ củ, nuôi cấy trên môi trường Schenk và Hildebrandt bổ sung 88 mM đường và 8,9 µM BA

Sự hình thành rễ đạt 94 % mỗi chồi, nuôi cấy ở nhiệt độ 13oC môi trường bổ sung 88 mM đường và 2,7 µM NAA Củ được hình thành từ chồi ở môi trường bổ sung 263 mM đường

- Năm 2000, Chang và ctv đã thực hiện quy trình nuôi cấy mô tái sinh thực vật

trên Lilium speciosum Thunb var gloriosoides Baker Mảnh mô từ hoa non (floret) được

cấy chuyền qua môi trường MS bổ sung 3 mg/l 2,4-D và 0,25 mg/l BA cho cảm ứng tạo

mô sẹo (callus) Mô sẹo có khả năng hình thành chồi, chúng được cấy chuyển sang môi trường tạo cây con có bổ sung 0,1 mg/l NAA, 1 g/l than hoạt tính và 170 mg/l Na2HPO4, nhân chồi trong 3 tháng Cuối cùng 6.000 cây con được tạo ra trong 9 tháng Khảo sát 200 cây con ngoài vườn ươm, tỉ lệ sống sót là 98 % sau 4 tuần theo dõi đã mở ra triển vọng cho nhân giống lily ở Nhật Bản

- Thí nghiệm của Bong Flee Han và ctv (2004), đã thực hiện vi nhân giống in vitro

Lilium longiflorum ‘Georgia’ nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA Sau 6 tuần, môi

trường được bổ sung với 2,2 µM BA có ảnh hưởng cao nhất hình thành chồi từ vảy củ Sự nhân chồi luôn đạt được hiệu quả cao trên môi trường bổ sung 2,2 µM BA và 2,9 µM IAA trong 8 tuần (9 chồi) Sự thêm vào môi trường lỏng bổ sung với 5 - 10 g/l than hoạt tính và 250 g/l đường đã kích thích sự hình thành và phát triển củ một cách đáng kể so sánh với việc không thêm vào môi trường lỏng

- Những năm gần đây, Gunta Jakobsone và ctv (2006) đã khảo sát các điều kiện

nuôi cấy ảnh hưởng sự phát sinh hình thái và đặc điểm sinh hóa của cây lily in vitro Ông

đã thực hiện thí nghiệm trên hai cây: Asiatic lily clone ‘NS-94’ và Trompet lily cv

‘Mezhare’ Thí nghiệm được thực hiện từ những phần cắt của vảy củ Thông số hình thái ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy, bảo quản nhiệt độ thấp, kéo dài thời gian tiền xử lí trước khi xử lí lạnh cũng như chế độ ánh sáng, nồng độ đường Thí nghiệm đã chỉ ra sự kéo dài khoảng thời gian tiền xử lý làm gia tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym peroxidase và

polyphenol oxidase trong củ con của ‘NS-94’ ở điều kiện ánh sáng yếu, ngược lại với kết quả của Mezhare với thời gian xử lý ngắn đặc biệt có ánh sáng mạnh

- Cùng năm 2006, một thí nghiệm khác của Nestor Curvetto và ctv, họ đã so sánh phương pháp nuôi cấy truyền thống với quy trình mới với sự bổ sung những nồng độ thay đổi 0,005; 0,01; 0,015 và 0,02 (%) p/v hydrogen perocide (H2O2) để kiểm soát mức độ ô

nhiễm in vitro và cấy chuyền Những củ con xử lí 0,02 % H2O2 đạt sinh khối cao hơn so

với các nồng độ xử lí khác, tốc độ tăng trưởng tương đối cao hơn phương pháp truyền thống, và chỉ ra trọng lượng tươi trung bình cao nhất Sinh khối cao của củ con là kết quả tốt khi chuyển ra vườn ươm

- Gần đây nhất, Pejman Azadi và Morteza Khosh-Khui (2007) đã nghiên cứu ảnh

hưởng của các yếu tố điều hòa tăng trưởng, nồng độ đường, mùa vụ, xử lí lạnh của Lilium

ledebourii (Baker) Boiss dùng củ từ ba vụ mùa khác nhau (mùa xuân, hè, đông) Môi

trường MS bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,1 BA và 6 % đường sucrose Kết quả trọng lượng tươi, chỉ tiêu rễ, tỉ lệ sống sót sau khi chuyển ra vườn ươm đã đạt kết quả tốt ở những củ thu hoạch sớm của vụ đông Những củ thu hoạch mùa hè cho số củ con/mảnh mô cao nhất Củ con vào cuối thời kì nuôi cấy được xử lí lạnh ở 4oC từ 2 đến 8 tuần, và sau chuyển cây ra vườn ươm trộn cát, than bùn, đất mục tỉ lệ 1:1:1, kết quả tốt cho củ thu hoạch mùa đông xử lí lạnh 8 tuần

2.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Cùng với các nghiên cứu trên thế giới thì những nghiên cứu trong nước cũng đã đạt một số thành công nhất định trong ứng dụng nuôi cấy mô lily tạo số lượng lớn giống chất lượng

- Năm 1998, Dương Tấn Nhật và ctv, đã tiến hành vi nhân giống lilium

longiflorum Thí nghiệm nuôi cấy nốt thân của những cây phát triển từ nuôi cấy đỉnh chồi

trước đó Sau 30 ngày, những cấu trúc tương tự như củ được tạo thành, cấu trúc đó gọi là

“pseudo bulblet” (củ giả) và trung bình có khoảng 32 pseudo-bulblet được hình thành trên tất cả nốt thân Nhân chồi được nuôi cấy ở môi trường ½ MS bổ sung 2,3 µM BA Chồi ra

rễ tốt nhất ở môi trường ½ MS bổ sung 1,1 µM NAA Thuần hóa trong nhà kính 3 tháng

và thử nghiệm ngoài vườn 8 tháng nhưng đó cũng chỉ dừng lại ở mức thử nghiệm chưa đưa ra áp dụng diện rộng

- Năm 2006, Dương Tấn Nhựt và ctv ở phân viện sinh học Đà Lạt, viện sinh học Nhiệt Đới, trường Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM vừa nghiên cứu thành công việc nhân giống hoa lily bằng “kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào, thiết lập hệ thống nuôi cấy

vô trùng bằng bioreactor” Thành công của việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bằng bioreactor trong nhân giống hoa lily, đã mở ra một khả năng tạo củ giống lily để có thể sản xuất số lượng lớn củ giống

Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong hệ thống bioreactor không phải bất kỳ giống hoa lily nào cũng có khả năng tạo củ Các giống lily lai có ưu thế về khả năng hình thành

củ trong hệ thống bioreactor, có khả năng sinh trưởng khá tốt, từ một củ con ban đầu, sau

3 tháng nuôi cấy sẽ tạo được khoảng 3 - 4 củ mới

- Cùng năm, Dương Tấn Nhựt và ctv đã tiến hành nuôi cấy vảy củ Lilium spp Sau

45 ngày nuôi cấy họ quan sát thấy trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l TDZ 100 % mẫu tạo chồi với số lượng chồi tối ưu 9 chồi/mẫu Trọng lượng tươi của chồi là 723,7 mg/chồi Sự tạo thành rễ tối ưu trong môi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, trung bình 32 rễ/chồi, chiều dài rễ là 60,7 mm/rễ, trọng lượng tươi là 1.340,5 mg/rễ

- Một thí nghiệm khác của Nguyễn Thị Phương Thảo và Nguyễn Quang Thạch (2005), họ đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào đối với vảy củ và

đoạn thân cây Lilium formolongo Vảy củ và đoạn thân được cắt với kích thước 1, 2, 3, 4,

5 mm cấy vào môi trường căn bản là MS + 0,25 mg/l α-NAA + 1 g/l than hoạt tính + 30 g đường có bổ sung Kinetin hoặc BA với các nồng độ thay đổi từ 0, 1, 5 và 10 mg/l, để kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái Khi sử dụng Kinetin, chồi tái sinh tốt nhất khi cắt mỏng vảy củ với kích thước 1 mm, nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l Kinetin và đối với đoạn thân, hiệu quả tạo chồi cao nhất khi mẫu cắt có kích thước 2 mm bổ sung 5mg/l Kinetin Khi sử dụng BA, chồi tái sinh tốt nhất khi cắt lớp mỏng vảy củ với kích thước 2 mm, nuôi cấy trên môi trường bổ sung 5 mg/l BA và với đoạn thân, hiệu quả tạo chồi cao nhất khi mẫu cắt có kích thước 1 mm ở vị trí ngọn có bổ sung 1mg/ BA

Tóm lại, cùng với sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô trên thế giới, những giống lily dần được phục hồi, gia tăng số lượng loài, giúp bảo quản nguồn giống quý và nhân số lượng nhiều Ở nước ta, hoa lily đang được người tiêu dùng ưa chuộng như vẻ đẹp và hương thơm quyến rũ của loài hoa này Công nghệ nhân giống lily đã và đang được

nghiên cứu và từng bước được áp dụng trồng thử nghiệm ra vườn ươm, nhưng giới hạn trong phạm vi hẹp là chỉ được thực hiện ở một số phân viện và trang trại nhỏ chưa được sản xuất ở quy mô lớn Vậy vấn đề này do đâu ?

Hiện nay diện tích trồng lily vẫn còn quá nhỏ so với các loại hoa khác, một phần

là do lily in vitro sản xuất trong nước có thể chưa đáp ứng đủ nhu cầu người trồng hoa,

chất lượng chưa đảm bảo, năng suất chưa cao, phần khác nguồn giống nhập nội chất lượng tốt nhưng giá nguồn giống còn cao, người trồng hoa cần vốn ban đầu cao Điều cần

thiết hiện nay là chúng ta phải tạo lượng giống in vitro chất lượng tốt hơn, nhiều, giá thấp hơn so với nguồn giống nhập nội Do đó, đẩy mạnh công tác nhân giống lily in vitro là

vấn đề cần thiết hiện nay để tạo nguồn giống sạch bệnh, đồng đều về chất lượng và số lượng

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đối tượng thí nghiệm

Đối tượng thí nghiệm là củ lily giống Sorbonne lai Đông Phương, màu hồng trắng

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008 tại phòng nuôi cấy mô

- Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Pence cấy, kéo, cán dao, lưỡi dao, giấy hấp, bông, nilông

- Chai nước biển: 500 ml, 100 ml

3.3.2 Mẫu sử dụng, điều kiện và môi trường nuôi cấy

Mẫu: Củ loại F1 được nhập từ Hà Lan do công ty TNHH Trang Trại Langbiang Farm số 42 Xô Viết Nghệ Tĩnh - Đà Lạt cung cấp Củ lily nảy mầm được 2 - 3 cm Sau khi mua về, củ được rửa sạch và bảo quản trong tủ lạnh 10oC

+ Điều kiện phòng nuôi cấy:

- Cường độ ánh sáng: 1.000 lux

- Nhiệt độ: 25 ± 20C

- Ẩm độ: 60 - 80 %

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

+ Điều kiện ngoài vườn ươm:

- pH môi trường trước khi hấp: 5,8

Ngoài ra còn sử dụng than hoạt tính, đường và các chất điều hòa sinh trưởng: BA, TDZ, Kinetin, NAA

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị môi trường

Tất cả môi trường đều phải được khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 1210C trong

25 phút

3.4.2 Tạo nguồn mẫu cấy ban đầu

Củ lily được lấy ra từ tủ lạnh, tách bỏ một số vảy bên ngoài, cắt bỏ rễ, rửa bằng xà phòng, sau đó rửa nhẹ dưới vòi nước chảy 1 - 2 giờ, để củ ráo nước và đưa mẫu vào trong

tủ cấy vô trùng

Đầu tiên, mẫu củ được tách riêng từng vảy và trục thân mầm Lau sạch vảy và trục thân mầm bằng cồn 70o sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp theo, ngâm mẫu với vitamin C trong 5 phút, rửa lại 3 lần nước cất vô trùng Tiếp tục khử trùng bề mặt mẫu cấy bằng HgCl2 1o/oo kết hợp 2 - 3 giọt Tween trong 5 – 7 phút, sau đó rửa lại mẫu 4

- 6 lần bằng nước cất vô trùng trong 30 phút Cuối cùng khử trùng bằng Javen (thương phẩm) tỉ lệ 1: 4 kết hợp 2 - 3 giọt Tween trong 10 phút và rửa lại bằng nước cất 3 lần Cắt mỗi vảy thành ba phần riêng biệt sau đó cấy từng phần của mẩu vào môi trường MS căn

bản, sau 2 tuần kiểm tra mẫu, loại bỏ mẫu nhiễm Mẫu không nhiễm và là phần gốc của vảy là nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm

MẪU BAN ĐẦU

Hình 3.4: A: Mẫu củ ban đầu, B: Phần gốc của vảy củ sau 2 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily

- Mục đích: khảo sát tác động của BA, TDZ, Kinetin đến sự tái sinh chồi trực tiếp

từ vảy củ lily

- Vật liệu: phần gốc của vảy củ được cắt thành 3 phần với kích thước 3*10 mm

- Môi trường sử dụng là môi trường 1/2 MS, nồng độ của BA, TDZ, Kinetin thay đổi 0,1, 0,2 mg/l, bổ sung 0,1mg/l NAA, 1mg/l glycine, 8 g/l agar, 30 g/l đường saccarose

Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy củ lily

Tổng NT: 7, tổng số bình: 63, tổng số mẫu: 189 Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ tái sinh chồi, số chồi, số lá, số rễ, chiều cao chồi, chiều dài

rễ, đường kính lá, đường kính thân, trọng lượng tươi

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân cụm chồi

- Mục đích: khảo sát sự thay đổi chất điều hòa tăng trưởng Kinetin (0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1 mg/l) đến khả năng nhân cụm chồi

- Vật liệu: chồi tái sinh ở thí nghiệm 1 làm nguồn nguyên liệu nhân chồi cho thí nghiệm này

- Môi trường sử dụng là MS bổ sung 0,1 mg/l NAA, 30 g/l đường saccarose và 8 g/l agar

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân cụm chồi

NT NAA (mg/l) Nồng độ Nồng độ Ki (mg/l)

NT2 0,1 0,1 NT3 0,1 0,3 NT4 0,1 0,5 NT5 0,1 0,7 NT6 0,1 1 Tổng NT: 6, tổng số bình: 54, tổng số mẫu: 162 Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, số lá/chồi, chiều cao cụm chồi

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi

- Mục đích: khảo sát sự thay đổi chất điều hòa tăng trưởng NAA đến khả năng

- Môi trường sử dụng là MS bổ sung 30 g/l đường saccarose, 8 g/l agar

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi

NT NAA (mg/l) Nồng độ

NT1 1 NT2 2 NT3 3 NT4 4 NT5 5 NT6 6 Tổng NT: 6, tổng số bình: 54, tổng số mẫu: 162 Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, số lá/chồi, chiều cao cụm chồi

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ

- Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, than hoạt tính đến sự hình

thành rễ

- Vật liệu: chồi được tạo ra ở thí nghiệm nhân cụm chồi là nguồn mẫu tạo rễ

- Môi trường sử dụng là MS, MS bổ sung 1 g/l than hoạt tính, 1/2 MS với những

nồng độ thay đổi của NAA (0,1, 0,5, 1 mg/l), BA (0,1 mg/l) Tất cả NT bổ sung 30 g/l đường saccarose, 8 g/l agar cho chồi hình thành rễ

Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ

NT Môi trường Than hoạt tính (g/l) NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường đến sự hình thành củ

- Mục đích: khảo sát hai yếu tố môi trường và đường ảnh hưởng đến hình thành củ

- Vật liệu: chồi được tạo ra ở thí nghiệm nhân cụm chồi là nguồn mẫu tạo củ

- Môi trường sử dụng MS, ½ MS, ¼ MS và nồng độ đường saccarose 75, 150, 225 g/l bổ sung 8 g/l agar cho chồi hình thành củ

Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường đến sự hình thành củ

NT Môi trường đường (g/l) Nồng độ

NT1 MS 75 NT2 MS 150 NT3 MS 225

Chỉ tiêu theo dõi: số củ nhỏ, trung, lớn

Thí nghiệm 6: Khảo sát tỉ lệ sống của cây con, tỉ lệ nảy mầm của củ in vitro đem ra

vườn ươm

- Mục đích: khảo sát tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây và củ in vitro đem

ra vườn ươm

- Vật liệu: củ in vitro sau khi lấy khỏi hệ thống nưôi cấy được rửa sạch agar, cắt bỏ

rễ dài, phân loại theo từng kích cỡ củ nhỏ, củ trung, củ lớn được xử lí với dung dịch GA3

ở nồng độ 2 mg/l trước khi trồng Cây con lily được tạo ra ở thí nghiệm nhân chồi được đem ra trồng cùng với củ

Thí nghiệm gồm 4 NT mỗi NT 10 cây con hoặc củ lặp lại 3 lần Môi trường trồng

là phân trùn, tro trấu và đất cát tỉ lệ 1:1:1 Đóng đất trồng vào các khay nhựa, chỉ đóng vừa đầy

Cách trồng: trồng cây con nông trên mặt khay, không trồng quá sâu và chặt Đối với củ, đặt củ xuống dưới bề mặt khay sau đó lấp đất ngập củ, ép chặt để củ và đất tiếp xúc nhiều với nhau, cuối cùng rải một lớp mùn cưa ở trên bề mặt để tạo độ ẩm cho củ nảy mầm

Sau khi trồng, tưới phun sương 2 lần/ngày trong tuần đầu, các tuần tiếp theo tưới 1 lần/ngày

Quan sát sinh trưởng và phát triển của cây con và củ với các chỉ tiêu: tỉ lệ sống của cây con và tỉ lệ nảy mầm của củ khi đem ra ngoài vườn ươm

3.5 Chỉ tiêu theo dõi

Thí nghiệm được theo dõi trong 4 - 8 tuần, tùy theo từng chỉ tiêu mà chúng tôi theo

dõi định kì hay cuối thời gian khảo sát thí nghiệm

3.5.1 Thí nghiệm tái sinh chồi:

+ Theo dõi định kì

- Tỉ lệ tái sinh chồi: (Số mẫu tái sinh chồi/Tổng số mẫu cấy ban đầu) * 100

- Số chồi/mẫu: Tổng số chồi hình thành/Tổng số mẫu cấy ban đầu

- Số rễ/mẫu: Tổng số rễ hình thành/Tổng số mẫy cấy ban đầu

- Số lá/chồi: Tổng số lá/Tổng số chồi

- Bề rộng lá (mm): Trung bình bề rộng lá lớn nhất của chồi ở mỗi mẫu

+ Theo dõi cuối kì

- Chiều cao chồi (mm): Trung bình từ gốc đến chóp lá cao nhất của chồi ở mỗi mẫu

- Chiều dài rễ (mm): Trung bình từ gốc tới chóp rễ dài nhất của mỗi mẫu

- Đường kính thân (mm): Trung bình đường kính của 3 mẫu trong 1 bình ngẫu nhiên

- Trọng lượng tươi mẩu mô (mg): Trung bình trọng lượng tươi 3 mẫu vảy củ trong một bình ngẫu nhiên

3.5.2 Thí nghiệm nhân cụm chồi:

+ Theo dõi định kì

- Số chồi/cụm: Tổng số chồi sau/Tổng chồi ban đầu

+ Theo dõi cuối kì

- Số lá/chồi: Tổng số lá/Tổng số chồi

- Chiều cao chồi (mm): Trung bình từ gốc đến chóp lá cao nhất của cụm chồi

3.5.3 Thí nghiệm tạo rễ:

+ Theo dõi định kì

- Số lượng rễ/mẫu: Tổng số rễ/Tổng mẫu cấy

+ Theo dõi cuối kì

- Chiều dài rễ (mm): Trung bình từ gốc tới chóp rễ dài nhất của mỗi mẫu

- Đường kính thân (mm): Trung bình đường kính thân của mỗi mẫu

- Trọng lượng tươi (mg): Trung bình trọng lượng tươi của mỗi mẫu

3.5.5 Thí nghiệm vườn ươm

- Tỉ lệ sống của cây con: Số cây con sống/Tổng cây ban đầu

- Tỉ lệ nảy mầm của củ: Số củ nảy mầm/Tổng củ ban đầu

3.6 Xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý thống kê trên máy vi tính bằng cách phân tích ANOVA một yếu tố, sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics 7.0

Chương 4

KẾT QUẢ

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi

trực tiếp từ vảy củ lily nuôi cấy in vitro

Trên cơ sở quá trình phát sinh chồi có liên quan mật thiết đến môi trường mà mẫu chồi mầm được nuôi cấy trực tiếp Dựa vào nồng độ môi trường nuôi cấy và sinh lý quá trình vận chuyển vật chất từ môi trường vào trong chồi mầm để giải thích sự hình thành

cơ quan xảy ra trên mẫu mô nuôi cấy (Trần Văn Minh, 2001) Cytokinin có vai trò trong

sự sự sinh tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non Vai trò của cytokinin không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin Sự kết hợp với tỉ lệ thích hợp của cytokinin và auxin cho hiệu quả cao đến sự tái sinh chồi từ mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002) Ở thí nghiệm này chúng tôi bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng cytokinin và auxin ở những nồng độ khác nhau của BA, TDZ và Kinetin cho cảm ứng mẫu vảy củ tái sinh chồi

Bảng 4.1a: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ

vảy củ lily sau 4 tuần nuôi cấy in vitro

NT Tỉ lệ tái

Bề rộng lá (mm)

 Ghi chú: các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu iện

sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05)

Bảng 4.1b: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ

vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy in vitro

NT Tỉ lệ tái sinh

Bề rộng lá (mm)

Bảng 4.1c: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ

vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy in vitro

NT Chiều cao chồi

(mm)

Chiều dài rễ (mm)

Đường kính thân (mm)

Trọng lượng tươi (mg)