Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương bằng HPLC

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các thuốc nói chung và celecoxib nói riêng, yêu cầu quan trọng là phải có quy trình phân tích định lượng t

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU HUY KIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU HUY KIÊN

Mã sinh viên: 1301215

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Thị Thuận

2 TS Lê Đình Chi Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa Dược

2 Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, lời đầu tiên em xin

gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Thị Thuận thuộc Bộ môn Hóa

Dược và TS Lê Đình Chi thuộc bộ môn Hóa phân tích-Độc chất Trường Đại học Dược

Hà Nội – những người đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực

hiện khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn tiếp theo đến ThS Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung

tâm đánh giá tương đương sinh học, chị Phan Thị Nghĩa cùng toàn thế cán bộ công nhân

viên tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung

Ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ, chỉ bảo em tận tình trong suốt quá trình thực hiện

khóa luận

Cuối cùng, em xin cảm ơn những người thân, bạn bè đã luôn bên em, động viên em

hoàn thành khóa luận này

Do thời gian thực hiện cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn

nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được

hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 26 tháng 04 năm 2018

Sinh viên

Chu Huy Kiên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Tổng quan về celecoxib 2

1.1.1 Cấu tạo 2

1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học 2

1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng 2

1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định 4

1.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 4

1.2.1 Giới thiệu 4

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 4

1.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 6

1.2.4 Các đại lượng đặc trưng 6

1.2.5 Định lượng bằng HPLC 8

1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng HPLC 8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 12

2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất 12

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 12

2.3.2 Khảo sát và xây dựng phương pháp 14

2.3.3 Thẩm định phương pháp 15

2.4 Ứng dụng thực tế 19

2.5 Phương pháp xử lý kết quả 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 21

3.1.1 Các điều kiện cố định 21

3.1.2 Các điều kiện khảo sát 21

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 23

3.1.4 Phương pháp chính thức 24

3.2 Thẩm định phương pháp 25

3.2.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu 25

3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 26

3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 27

3.2.4 Độ đúng, độ lặp lại 29

3.2.5 Giới hạn định lượng dưới LLOQ 31

3.2.6 Độ ổn định 31

3.2.7 Nhận xét 35

3.3 Ứng dụng thực tế 36

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

NSAIDs Thuốc giảm đau hạ sốt chống viêm không steroid

SKD Sinh khả dụng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT 8

Bảng 2 1: Bảng nồng độ các mẫu QC 13

Bảng 2 2: Cách chuẩn bị đường chuẩn 13

Bảng 2 3: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ 14

Bảng 3 1: Kết quả khảo sát các dung môi chiết 24

Bảng 3 2: Kết quả xác định độ chọn lọc, đặc hiệu 26

Bảng 3 3: Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống 27

Bảng 3 4: Số liệu khảo sát đường chuẩn (Spic – mAu*s) 28

Bảng 3 5: Kết quả xác định hệ số weighting 28

Bảng 3 6: Kết quả khảo sát đường chuẩn 29

Bảng 3 7: Kết quả độ đúng, độ lặp lại trong ngày 29

Bảng 3 8: Kết quả độ đúng, độ lặp lại khác ngày 30

Bảng 3 9: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 31

Bảng 3 10: Kết quả độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc CELE ở -400C 32 Bảng 3 11: Kết quả độ ổn định dung dịch IS thời gian dài ở nhiệt độ 2-80C 32

Bảng 3 12: Kết quả độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông–rã 33

Bảng 3 13: Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng thời gian ngắn 33 Bảng 3 14: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ LQC 34

Bảng 3 15: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ HQC 34

Bảng 3 16: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler 35

Bảng 3 17: Kết quả xây dựng đường chuẩn 36

Bảng 3 18: Nồng độ CELE trong HT người theo thời gian 37 Bảng 3 19: Các kết quả nghiên cứu nồng độ CELE trong HT người trước đó 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1: Công thức cấu tạo CELE 2

Hình 1 2: Sơ đồ hệ thống HPLC 5

Hình 1 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký 6

Hình 3 1: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong MeOH 21

Hình 3 2: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong huyết tương 21

Hình 3 3: Sắc ký đồ của FELO (a) và hỗn hợp CELE, FELO (b) trong MeOH 22 Hình 3 4: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 80:20 22

Hình 3 5: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 70:30 22

Hình 3 6: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 60:40 23

Hình 3 7: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS 25

Hình 3 8: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ LLOQ 25

Hình 3 9: Sắc ký đồ huyết HT có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ khoảng giữa đường chuẩn (500 ng/ml) 26

Hình 3 10: Đồ thị nồng độ CELE trong HT người theo thời gian 37

1

1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là một trong những nhóm thuốc được dùng phổ biển và cũng là nhóm thuốc được kê đơn rộng rãi nhất với hàng chục triệu người dùng trong một ngày trên toàn thế giới [5] Tuy vậy, hạn chế lớn nhất của nhóm thuốc này là tác dụng phụ trên tiêu hóa [1], [2], [5] Nhiều giải pháp để hạn chế tác dụng phụ này đã được sử dụng nhưng các giải pháp này đều có những hạn chế nhất định Việc tìm ra 2 đồng dạng COX-1 và COX-2 của men COX (cyclooxygenase) tham gia tổng hợp các protaglandin (PG) từ acid arachidonic đã mở ra hướng mới để khắc phục tác dụng phụ trên đường tiêu hóa của các NSAIDs Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 làm giảm PG gây viêm song vẫn duy trì quá trình tổng hợp các PG bảo vệ đường tiêu hóa, từ đó làm giảm các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa [1], [2] Tuy nhiên, do sự gia tăng nguy cơ huyết khối và nhồi máu cơ tim [1], một số NSAIDs ức chế chọn lọc COX-

2 đã bị rút khỏi thị trường Hiện nay chỉ còn celecoxib, parecoxib, etoricoxib được lưu hành, trong đó celecoxib được sử dụng rộng rãi nhất [2] Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa; các bệnh thấp khớp, viêm xương khớp… chiếm tỉ lệ khá cao nên nhu cầu về các NSAIDs nói chung và celecoxib nói riêng khá lớn

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các thuốc nói chung và celecoxib nói riêng, yêu cầu quan trọng là phải có quy trình phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học Trong đó, phương pháp thông dụng nhất là

sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC để định lượng celecoxib trong huyết tương còn hạn chế

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương bằng HPLC“ với các nội dung chính sau:

1 Xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương

2 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

3 Ứng dụng xác định nồng độ celecoxib trong một số mẫu huyết tương người

2

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về celecoxib

1.1.1 Cấu tạo

- Công thức phân tử: C17H14F3N3O2S [13], [16], [20]

- Trọng lượng phân tử: 381,4 g/mol [13], [16], [20]

- Công thức cấu tạo: [13], [16]

Hình 1 1: Công thức cấu tạo CELE

- Tên khoa học:

4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]-benzensulfonamide [16], [20]

1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học

- Cảm quan: Dạng bột kết tinh hoặc vô định hình, màu trắng hoặc vàng nhạt [16]

- Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 160°C

- Độ tan: Celecoxib rất ít tan trong nước (3-7µg/ml; pH = 7,0; 40oC); tan tốt trong methanol, methylene chloride, cloroform và aceton [16] Celecoxib ở dạng vô định hình

dễ tan hơn dạng kết tinh

- pKa: pKa = 11,1; độ tan thay đổi theo pH của môi trường hòa tan

1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng

Dược động học

Hấp thu: Hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa [1], [2], [3] Thức ăn chứa nhiều chất béo làm tăng thời gian đạt Cmax trong huyết tương (tăng 1-2 giờ so với lúc đói) [3] Cmax

thường đạt ở 3 giờ sau khi uống một liều duy nhất 200 mg lúc đói và trung bình bằng

705 nanogam/ml [3] Ở người trên 65 tuổi, Cmax tăng 40-50%

Phân bố: Vd khoảng 400 lít ( khoảng 7,14 lít/kg), thuốc phân bố nhiều vào mô Ở nồng độ điều trị,celecoxib gắn mạnh với protein huyết tương [1], [2], [3], [9]

3

Chuyển hóa: Celecoxib được chuyển hóa chủ yếu ở gan bởi isoenzym CYP450 2C9 thành các chất chuyển hóa không có hoạt tính dược lý như các thuốc ức chế enzym COX-1 và COX-2 [1], [2], [3], [9]

Thải trừ: T1/2 trong huyết tương của celecoxib sau khi uống lúc đói là 11 giờ [1], [9]

và hệ số thanh thải (Cl) trong huyết tương khoảng 500 ml/phút [3] T1/2 của thuốc kéo dài ở người suy thận là 13,1 giờ và suy gan là 11 giờ hoặc 13,1 giờ [3] Celecoxib thải trừ khoảng 27% trong nước tiểu, 57% trong phân, dưới 3% liều được thải trừ không thay đổi [3], [9]

Phản ứng viêm và vai trò của enzym COX

Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương, gồm

4 yếu tố biểu hiện bên ngoài: sưng, nóng, đỏ, đau và gây ra các rối loạn chức năng cơ thể Khi bị tổn thương, màng tế bào giải phóng ra phospholipid màng [1] Dưới tác dụng của phospholipase A2, chất này bị chuyển thành axit arachidonic [1] Tiếp theo

đó dưới tác dụng của cyclooxygenase (COX), axit này bị chuyển hóa thành các prostaglandin [1] Tác dụng của prostaglandin tùy thuộc vào vị trí tác dụng Khi được tạo ra tại nơi viêm, prostaglandin làm tăng tình trạng viêm cục bộ và làm tăng sự mẫn cảm với đau Ngược lại, đối với màng nhày của dạ dày và ruột, prostaglandin có tác dụng bảo vệ và tăng tưới máu màng nhày

Có 2 loại enzym COX:

- COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh hoàn… có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, tham gia vào quá trình sản xuất các PG sinh lý, tạo chất nhày bảo vệ dạ dày [1], [2]

- COX-2 được phát hiện ra vào năm 1991, enzym này có ở hầu hết các mô với nồng

độ thấp, ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm, có chức năng thúc đẩy quá trình viêm [1], [2]

Do đó, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 sẽ có tác dụng chống viêm mạnh mà ít gây tác dụng phụ như: viêm loét dạ dày, tá tràng, xuất huyết dạ dày,… [1], [2]

Tác dụng dược lý của celecoxib:

Celecoxib là 1 thuốc chống viêm không steroid, ức chế COX-2 mạnh hơn COX-1 từ

100 đến 400 lần, có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt [1], [2]

Cơ chế tác dụng: Ức chế tổng hợp prostaglandin, chủ yếu thông qua tác dụng ức chế COX-2 Celecoxib không ức chế COX-1 với các nồng độ điều trị ở người, nên ít có nguy

4

cơ gây các tác dụng phụ (xuất huyết, viêm loét dạ dày, kéo dài thời gian chảy máu), nhưng có thể gây các tác dụng phụ ở thận tương tự như các NSAIDs khác Celecoxib có thể làm tăng nguy cơ huyết khối mạch máu ở một số bệnh nhân vì ức chế tổng hợp PG (một chất kháng huyết khối) và không tác động đến thromboxan A2 (một chất dễ gây huyết khối) [3]

1.1.3.1 Tác dụng không mong muốn

ADR của celecoxib ở liều thường dùng nói chung nhẹ và có liên quan chủ yếu đến đường tiêu hóa Một số phản ứng phụ thường gặp là nhức đầu, rối loạn tiêu hóa, choáng váng, viêm ruột, viêm dạ dày, dị ứng, thiếu máu, viêm phế quản, viêm gan, vàng da; hiếm hơn có thể phù mạch, sốc phản vệ [3]

ADR khiến phải ngừng dùng thuốc nhiều nhất gồm: khó tiêu, đau bụng [3]

Mẫu phân tích hòa tan trong pha động được đưa vào cột, các thành phần trong mẫu

sẽ bị pha tĩnh giữ lại Cho pha động liên tục chảy qua cột, các thành phần đó sẽ di chuyển trên cột theo pha động với các tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau tùy thuộc vào lực tương tác giữa pha tĩnh - pha động và chất tan [4]

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính sau đây:

Bộ phận cấp pha động: Thường gồm các dung môi được chứa trong các bình kín riêng biệt Các dung môi cần được lọc và đuổi khí trước khi bơm vào cột Pha động có

5

thể là hỗn hợp nhiều dung môi và có 2 cách dùng pha động rửa giải là đẳng dòng (thành phần pha động không đổi trong quá trình sắc ký) và gradient (thành phần pha động thay đổi theo chương trình đã định) [4]

Bơm: Để bơm pha động vào cột phân tích Bơm phải có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên, đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 ÷ 5,0 ml/phút và phải chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn) [4]

Hệ tiêm mẫu:

Để tiêm mẫu phân tích vào cột phân tích trong quá trình sắc ký [4]

Cột phân tích: Cột phân tích là cột chứa pha tĩnh, là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột phân tích có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký Cột bảo vệ dùng để loại một số thành phần trong pha động và trong mẫu phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký [4]

Detector: Dùng để phát hiện chất phân tích dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang Detector cần đáp ứng nhanh và lặp lại,

độ nhạy cao, ổn định, khoảng hoạt động tuyến tính rộng [4]

Tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát hiện và định lượng Trong đó, detector hấp thụ phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS được dùng phổ biến nhất vì thích hợp cho nhiều loại chất và không quá đắt

Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu: Thường là hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống, có thể kèm theo thiết bị in dữ liệu

Hình 1 2: Sơ đồ hệ thống HPLC

6

1.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Trong quá trình sắc ký các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan cũng khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc ký

Vì vậy, trong quá trình sắc ký, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các mối tương tác: giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1), giữa chất phân tích và pha động (F2), giữa pha tĩnh và pha động (F3)

Hình 1 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi ba lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột [4]

1.2.4 Các đại lượng đặc trưng

Thời gian lưu (tR)

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột phân tích sẽ bị lưu giữ ở trong cột (pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời gian tính

từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại [4]

Ý nghĩa: Chủ yếu dùng để định tính

chất phân tích

pha độngpha tĩnh

F3

7

Hệ số phân bố (K)

Tốc độ di chuyển chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K [4]:

K = CS / CM

Với CM , CS lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha động và pha tĩnh

Ý nghĩa: K càng lớn, chất tan di chuyển pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp

có hệ số K khác nhau càng nhiều càng dễ tách nhau [4]

Hệ số dung lượng (k’)

Hệ số dung lượng k’ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu [4]

k’ = ( CS.VS)/(CM.VM) k’ = K.VS/VM

Trong đó: VS, VM là thế tích pha tĩnh và pha động

Ý nghĩa: Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, khó xác định chính xác thời gian lưu Nếu hệ số k’ quá lớn, quá trình rửa giải diễn ra quá dài

Giá trị tối ưu: Nên chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 đến 5 [4]

Hệ số chọn lọc (α)

Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B [4]:

α = KB / KA Trong đó: KA, KB là hệ số phân bố 2 chất A, B (theo quy ước, KB > KA )

Ý nghĩa: Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α > 1 Tuy nhiên nếu

α lớn quá, thời gian phân tích sẽ kéo dài [4]

Giá trị tối ưu: α dao động trong khoảng từ 1,05 đến 2 [4]

Độ phân giải (Rs)

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao Độ phân giải của 2 pic chất A và B được tính theo công thức sau [4]:

R =[(t ) − (t ) ]

1

2(W + W )Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của 2 chất A, B

WA, WB là độ rộng pic chất A, B

8

Ý nghĩa: RS càng lớn, 2 pic chất càng tách xa nhau Nhưng nếu RS quá lớn, quá trình phân tích sẽ kéo dài Điều kiện để 2 pic chất tách rõ nhau trên sắc ký đồ là RS ≥ 1,3 [4] 1.2.5 Định lượng bằng HPLC

Phương trình cơ bản để định lượng

Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương trình

cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc ký (diện tích hoặc chiều cao) của chất với nồng độ C của chúng được bơm vào cột phân tích

H = a.C + b

S = a.C+ b Trong đó:

H : Chiều cao pic sắc ký của chất

S : Diện tích pic sắc ký của chất

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn Việc lựa chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích

1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng HPLC

Bảng 1 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT

TLTK Phương pháp

phân tích

Điều kiện sắc ký (cột, pha động, IS, detector …) Xử lý mẫu

[18] HPLC-UV

Cột: Nucleosil-NO2 (150 x 4,6mm; 5µm) Pha động:

Hexan : CH2Cl2 : isopropyl alcohol = 70:25:5 Flow: 1,4 ml/phút

Detector: UV 260 nm IS: Chất có cấu trúc tương tự CELE

Chiết pha rắn

[19] HPLC-FL

Cột: Prontosil C18 AQ (150 x 3mm, 3µm) Pha động: H2O : MeCN = 40:60

Flow: 0,35 ml/phút Detector: Huỳnh quang (bước sóng kích thích 240nm, bước sóng phát xạ 380 nm)

Chiết lỏng - lỏng bằng chloroform

9

IS: pyrazol-1-yl]benzene-sulfonamide

[12] HPLC-UV

Cột: Nucleosil CN (250mm × 4,6mm; 5µm) Pha động: MeCN : H2O = 60:40

Flow: 0,9 ml/phút IS: flutamide Detector: UV 260nm

Chiết lỏng - lỏng bằng cloroform

[22] HPLC-UV

Cột: Aqua C18 (5µm; 75mm x 4,6mm) Pha động:

MeCN : đệm KH2PO4 (pH 3,5) = 50:50 Flow: 1ml/phút

Detector: UV 254nm

IS không có

Tủa protein bằng MeCN

[21] HPLC-UV

Cột: RP-18e (100mm x 4,6mm) Pha động: MeCN : MeOH : H2O = 45:10:45 Flow: 2 ml/phút

Detector: UV 254nm IS: acid mefenamic

Tủa tạp bằng MeCN

và NaCl

[10] HPLC-UV

Cột: C18 µ-Bondapak (250 × 3,9mm) Pha động:

Đệm KH2PO4 (pH 4,0) : MeCN = 60:40 Flow: 1,5 ml/phút

Detector: UV 260nm IS: flutamide

Chiết lỏng lỏng bằng hỗn hợp dung môi n-hexan : isoamyl alcol = 97 : 3

[17] LC–MS/MS

Cột: C18 (55mm x 2mm; 3µm) Pha động: MeOH : Đệm CH3COONH4 = 75:25

IS: celecoxib-D4 Flow: 0,2 ml/phút Detector: UV 254nm

Tủa tạp bằng dung dịch IS trong MeOH

10

[15] LC-MS/MS

Cột: Luna HILIC (50mm x 2,0 mm; 3µm) Pha động:

Đệm HCOONH4 (pH 3,0) : MeOH = 5:95 Flow: 0,2 ml/phút

IS: artorvastatin calcium

chiết lỏng lỏng bằng methyl tert-butyl ether

[14] HPLC-UV

Cột: Hypersil BDS C18 (250 x 4,6mm; 5µm) Pha động MeOH : H2O = 75:25

Flow: 1,25 ml/phút Detector: UV 250nm

IS không có

[6] HPLC-UV

Cột: Phenomenex LUNA RP-18, 250 x 4,6 mm; 5 µm

Pha động: MeOH : MeCN : H2O = 12:45:43 điều chình pH bằng CH3COOH tới 3,5

Flow: 2 ml/phút

Detector: UV 254nm IS: acid mefenamic

Chiết lỏng lỏng bằng hỗn hợp dung môi n-hexan : isopropanol

sẽ áp dụng phương pháp này để tiến hành nghiên cứu của mình

Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng cột C18 nên chúng tôi quyết định lựa chọn loại cột này để tiến hành nghiên cứu của mình

Các nghiên cứu sử dụng pha động gồm MeOH (hoặc MeCN) với H2O (hoặc đệm) Trong đó, MeCN là dung môi được ưa chuộng hơn MeOH do nền mẫu thấp (hấp thu

UV kém), cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp (ít ảnh hưởng đến độ bền cột) pKa =11,1; pH pha động sẽ ảnh hưởng đến trạng thái phân ly của celecoxib và ảnh hưởng đến thời gian lưu; vì vậy cần sử dụng đệm trong thành phần pha động để đảm

11 bảo độ lặp lại của phép phân tích Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn pha động gồm MeCN, đệm KH2PO4 (pH = 4,0) để tiến hành phân tích Celecoxib trong huyết tương

12

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu là Celecoxib trong huyết tương

2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất

Chất chuẩn:

Celecoxib (QT138031210 - Hàm lượng 99,55% - Độ ẩm 0,04%)

Nơi sản xuất: Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.Hồ Chí Minh

Felodipin (01052006 - Hàm lượng 99,30% - Độ ẩm 0,06%)

Dung môi HPLC: Acetonitril, Methanol

Hóa chất TKPT: Kali dihydrophosphat, Chloroform, Dimethylether

Huyết tương trắng: Máu NTN từ viện huyết học - truyền máu TW đã thêm chất chống đông, đem ly tâm tách lấy HT và bảo quản trong tủ lạnh sâu -40°C

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng: Cân phân tích, cân kỹ thuật, máy ly tâm lạnh, máy lắc xoáy, tủ lạnh sâu -400C, micropipet, ống ly tâm 10ml, đầu tip cho micropipet, bình định mức, pipet class A

Thiết bị phân tích: Hệ thống HPLC Shimadzu LC 20A

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng Celecoxib trong huyết tương trên thiết bị HPLC (quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký)

- Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

- Ứng dụng xác định nồng độ celecoxib trong một số mẫu huyết tương của người tính nguyện

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc CELE: Cân chính xác khoảng 50,0 mg; hòa tan trong 50 ml MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ CELE chính xác khoảng 1000 g/ml Dung dịch chuẩn làm việc: Hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng MeOH đến vừa đủ 100 ml thu được dung dịch CELE có nồng độ 10 g/ml Hút 1 ml dung dịch

13

CELE 10 g/ml đem cô đến cắn dưới dòng khí N2 rồi thêm 10,0 ml huyết tương thu được dung dịch CELE trong huyết tương có nồng độ 1 g/ml (1000ng/ml) (dung dịch chuẩn làm việc - WS)

- Dung dịch chuẩn nội gốc Felodipin (IS): Cân chính xác khoảng 25,0 mg chất chuẩn Felodipin; hòa tan trong 100 ml MeOH thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ

Bảng 2 1: Bảng nồng độ các mẫu QC

Mẫu QC Mã Khoảng nồng độ Giá trị

(ng/ml)

Vws (µl)

VHT trắng

(µl) Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC ≤ 3 x LLOQ 60 60 940 Mẫu kiểm tra nồng độ

Gần điểm giữa của đường chuẩn 400 400 600 Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC 70 – 80 % ULOQ 800 800 200

Chuẩn bị các mẫu đường chuẩn:

Các mẫu đường chuẩn gồm 1 mẫu HT trắng (blank), 1 mẫu HT trắng có pha IS (zero)

và 7 mẫu huyết tương có pha chuẩn CELE và IS

Bảng 2 2: Cách chuẩn bị đường chuẩn Nồng độ

(ng/ml) Blank Zero 20 50 100 200 500 700 1000

VWS (µl) - - 20 50 100 200 500 700 1000 Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốc độc lập

14

Chuẩn bị mẫu LLOQ

Bảng 2 3: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ

QC Nồng độ (ng/ml) VWS (µl) V HT trắng (µl)

Chuẩn bị mẫu huyết tương thử: Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau đó được xử lý theo quy trình xử lý mẫu để tiêm sắc ký

2.3.2 Khảo sát và xây dựng phương pháp

Tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn các điều kiện cố định sau:

- Cột sắc ký: Rp 18, 250 x 4 mm, 5 µm

- Cột bảo vệ: Rp 18, 4 x 3 mm, 5 µm

- Thành phần pha động: MeCN và đệm KH2PO4 (pH = 4,0)

Cách pha đệm KH2PO4 pH 4,0: cân 1,36 g KH2PO4 hòa vào 800 ml H2O Thêm 400

µl triethylamin Điều chỉnh bằng H3PO4 đến pH 4,0 Bổ sung H2O cho đủ 1000 ml

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Dựa trên kinh nghiệm xử lý mẫu huyết tương với các chế phẩm khác tại cơ sở nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp chiết lỏng – lỏng với quy trình tổng quát như sau:

Hút 1 ml dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương Thêm 0,1 ml IS, lắc xoáy 5s Thêm 0,5 ml NH4OH 0,1M Lắc xoáy 15s Thêm 6,5 ml dung môi chiết thích hợp, lắc

cơ học ngang 5 phút Ly tâm 3000 vòng/phút, trong 5 phút Hút lấy lớp dung môi đem

cô dưới dòng khí N2 Hòa cắn trong 0,5 ml pha động (lắc xoáy 1 phút) Cho vào vial, tiêm sắc ký

Tham khảo các tài liệu [11], [18] chúng tôi chọn các hỗn hợp dung môi sau để khảo sát: DET, DET : CHCl3 (các tỷ lệ 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5), CHCl3

15

2.3.3 Thẩm định phương pháp

Chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của FDA-Mỹ [11] và tham khảo SOP “Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC” [7] lưu hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW với các chỉ tiêu:

- Độ chọn lọc/đặc hiệu của phương pháp

- Độ phù hợp hệ thống

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Độ đúng, độ lặp lại

- Giới hạn định lượng dưới ( LLOQ)

- Độ ổn định của mẫu phân tích bao gồm:

o Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội

o Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông

o Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

o Độ ổn định của mẫu huyết tương dài ngày

o Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

2.3.3.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

Độ chọn lọc là khả năng của một phương pháp phân tích có thể nhận biết và định lượng được chất phân tích, phân biệt với các chất khác có trong mẫu

Tiến hành: Phân tích sắc ký các mẫu:

Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau

Huyết tương trắng có pha chuẩn nội (IS)

Huyết tương trắng có pha chuẩn CELE ở nồng độ LLOQ (20 ng/ml) và IS

Ghi lại sắc ký đồ [11], [7]

Yêu cầu: Phương pháp được coi là có tính chọn lọc khi:

Pic của CELE phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của CELE không được vượt quá 20% đáp ứng của CELE ở nồng độ LLOQ

Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của IS [7]

16

2.3.3.2 Độ phù hợp hệ thống

Tiến hành: Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu dung dịch hỗn hợp CELE (nồng độ ở khoảng giữa đường chuẩn) và IS và xử lý theo quy trình Ghi lại sắc ký đồ Đánh giá tính thích hợp của hệ thống về thời gian lưu và diện tích pic của các chất phân tích và chuẩn nội [7]

Yêu cầu:

Thời gian lưu của CELE và IS: CV% ≤ 1,0%

Đáp ứng của CELE và IS: CV% ≤ 2,0%

Tỷ lệ đáp ứng CELE/IS: CV% ≤ 2,0% [7]

2.3.3.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Mối quan hệ giữa tỷ số diện tích pic CELE/IS với nồng độ của CELE được đánh giá bằng phương pháp bình phương tối thiểu và được biểu hiện qua phương trình hồi quy tuyến tính Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Để thiết lập mối tương quan giữa nồng độ của chất chuẩn với đáp ứng của thiết bị phân tích, số lượng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm một mẫu trắng,một mẫu trắng có chuẩn nội và 6 - 8 mẫu chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát phải bao hàm được khoảng nồng độ có thể đạt được trong quá trình phân tích mẫu (từ 1/10 – 1/30 Cmax đến 2 Cmax)

Đường chuẩn nên là đường đơn giản nhất mô tả chính xác mỗi quan hệ giữa nồng độ

và đáp ứng đo được Khi phân tích dịch sinh học, khoảng nồng độ chất phân tích thường rộng và trải dài trên nhiều khoảng tuyến tính khác nhau Một đường hồi quy tuyến tính không sử dụng hệ số weighting sẽ tạo ra sai số lớn vì mô hình này giả định SD tương đương nhau trên toàn bộ phạm vi của các mẫu Trong một đường cong hiệu chuẩn điển hình, phương sai (SD2) tăng khi tăng nồng độ Giải pháp để nâng cao độ chính xác cho các dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất là sử dụng hệ số weighting Sử dụng hệ số weighting phù hợp nhất (1; 1/x; 1/x1/2 hoặc 1/x2) nếu cần để phản ánh tốt nhất tương quan giữa đáp ứng pic và nồng độ [7]

Cách xác định hệ số weighting:

- Dùng F-test để kiểm tra sự đồng nhất của tập hợp kết quả thu được

- Tại hai mức nồng độ LLOQ, ULOQ tính toán độ biến thiên các giá trị về tỷ lệ đáp ứng pic CELE/IS

17

- Tính Fthực nghiệm = Mức độ biến thiên của ULOQ/ Mức độ biến thiên của LLOQ So sánh với Fbảng tra tại bảng phân phối F (phụ lục) với α=0,01; k1 = k2 = n-1 (n là số đường chuẩn thực nghiệm)

- Nếu Fthực nghiệm > Fbảng,chứng tỏ tập hợp kết quả không đồng nhất, cần thiết phải sử dụng phương pháp weighting

- Khảo sát lựa chọn mô hình weighting phù hợp (1; 1/x; 1/x1/2; 1/x2) bằng cách tính tổng giá trị tuyệt đối các sai số dư tại các điểm chuẩn của mỗi đường chuẩn, lựa chọn

mô hình có tổng sai số dư của 5 đường chuẩn là nhỏ nhất

Yêu cầu: Đường chuẩn phải thoả mãn các yêu cầu sau:

Độ đúng lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85%-115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80%-120%

Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn

Hệ số tương quan r ≥ 0,98 [11], [7]

2.3.3.4 Độ đúng, độ lặp lại

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu

đã biết Độ lặp lại là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV (%) Độ lặp lại bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày [11]

Cách tiến hành:

Mỗi ngày chuẩn bị một đường chuẩn và 3 lô QC, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập như quy trình đã nêu Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng

độ được phân tích trong cùng một ngày Xác định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong

ít nhất 3 ngày khác nhau [7]

Yêu cầu:

Độ đúng tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115% Riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận từ 80% - 120%