Xây dựng phương pháp định lượng 6 gingerol trong gừng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các nghiên cứu trong khoa học hiện đại đã xác định được thành phần làm nên tác dụng sinh học đó của gừng là các thành phần thuộc nhóm chất cay, bao gồm nhóm gingerol, nhóm shogaol, zinge

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG [6]-GINGEROL TRONG GỪNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HƯƠNG

Mã sinh viên: 1301206

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG [6]-GINGEROL TRONG GỪNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Tuấn Hiệp

2 ThS Nguyễn Thị Thùy Linh

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Khoa Công nghệ chiết xuất – Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung quanh Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS Nguyễn Tuấn Hiệp,

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo em trong suốt quá

trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn cô ThS Nguyễn Thị Thùy Linh, người

đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện Dược

Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp đỡ em Chân

thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại viện

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động viên, khích

lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018

Sinh viên Trần Thị Hương

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Zingiber 3

1.1.1 Đa dạng loài và mô tả thực vật chung 3

1.1.2 Đặc điểm một số loài trong chi Zingiber tại Việt Nam 3

1.1.3 Tác dụng dược lý của gừng 5

1.1.4 Thành phần hóa học trong loài Zingiber officinale 7

1.2 Tổng quan về chất cay trong loài Zingiber officinale 8

1.2.1 Thành phần và cấu trúc hóa học 8

1.2.2 Vai trò của chất cay trong một số lĩnh vực 11

1.3 Các phương pháp phân tích [6]-gingerol 12

1.3.1 Định tính thành phần [6]-gingerol trong Zingiber officinale 12

1.3.2 Các phương pháp định lượng [6]-gingerol 12

1.4 Tổng quan về phương pháp định lượng bằng HPLC 14

1.4.1 Khái niệm 14

1.4.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất 16

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 17

2.2.2 Xử lí số liệu 17

2.3 Thẩm định phương pháp 17

2.3.1 Tính thích hợp của hệ thống 17

2.3.2 Tính chọn lọc 17

2.3.3 Đường chuẩn 18

2.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) 18

2.3.5 Độ lặp lại 18

2.3.6 Độ đúng 19

2.4 Ứng dụng phương pháp HPLC định lượng [6]-gingerol trong các mẫu thực 19 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng [6]-gingerol 20

3.1.1 Lựa chọn điều kiện định tính [6]-gingerol bằng TLC 20

3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký định lượng [6]-gingerol trong gừng 20

3.1.3 Quy trình chiết xuất [6]-gingerol trong gừng (Zingiber officinale) 23

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 25

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 25

3.2.2 Tính chọn lọc 26

3.2.3 Đường chuẩn 27

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 28

3.2.5 Độ lặp lại 28

3.2.6 Độ đúng 29

3.3 Ứng dụng phương pháp định lượng [6]-gingerol trong một số mẫu gừng 30

3.4 Bàn luận 32

3.4.1 Quy trình chiết xuất [6]-gingerol trong gừng 32

3.4.2 Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp 33

3.4.3 Hàm lượng [6]-gingerol ở một số mẫu thực 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official analytical

chemists) EtOH Ethanol

f Tốc độ dòng

GC - MS Sắc ký khí kèm khối phổ (Gas chromatography – mass spectrometry)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance liquid

choromatography – Mass spectrometry) kl/kl Khối lượng/ khối lượng

MeOH Methanol

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

USP35 Dược điển Mỹ 35 (The United State of Pharmacopoei 35th

)

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

V Thể tích tiêm mẫu

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Đặc điểm cơ bản của 3 loài gừng phổ biến ở Việt Nam 3 1.2 Cấu trúc hóa học của nhóm chất cay trong gừng 9 1.3 Hệ dung môi pha động HPLC theo USP35 12

1.4 Các phương pháp định lượng [6]-gingerol trong các tài liệu tham

3.1 Chương trình gradient dung môi của ACN và H2O 22 3.2 Kết quả hàm lượng [6]-gingerol (% kl/kl) theo dung môi 23 3.3 Kết quả hàm lượng [6]-gingerol (% kl/kl) theo phương pháp chiết 24 3.4 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống 26 3.5 Sự phụ thuộc vào diện tích pic theo nồng độ [6]-gingerol 27

3.8 Hàm lượng [6]-gingerol trong một số dược liệu gừng 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 14 3.1 Sắc ký đồ định tính [6]-gingerol bằng TLC 20

3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn [6]-gingerol theo ACN : H2O (55 : 45) 21 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử với hệ ACN : H2O (55: 45) 22 3.5 Sắc ký đồ (1) mẫu chuẩn [6]-gingerol và (2) mẫu thử 22 3.6 Quy trình chiết [6]-gingerol trong gừng Zingiber officinale 25

3.7 Kết quả sắc ký đồ (a) mẫu trắng, (b) mẫu thử, (c) mẫu [6]-gingerol

3.8 Sắc ký đồ của dãy dung dịch chuẩn nồng độ 5 – 300 µg/ml 27 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ [6]-gingerol 28 3.10 Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 28

3.12 Hình ảnh chồng sắc ký đồ: (1) mẫu thử G02 và (2) chuẩn

[6]-gingerol

32

được phát hiện đầu tiên vào năm 1692 bởi vanRheede và được sử dụng rộng rãi làm

thức ăn, làm thuốc và cũng được cho là loài “gừng” thực sự [49] Bên cạnh Z

officinale thì hai loài Z cassumunar (hay còn được biết đến dưới tên Z motanum) và

Z zerumbet cũng được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền địa phương

Ngày nay, gừng vẫn được sử dụng rộng rãi làm gia vị trong thực phẩm, cũng như

sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam với công dụng phát tán phong hàn (với sinh khương), hồi dương cứu nghịch (với can khương), chống nôn, buồn nôn và tác dụng chống viêm [5], [63] Các nghiên cứu trong khoa học hiện đại đã xác định được thành phần làm nên tác dụng sinh học đó của gừng là các thành phần thuộc nhóm chất cay, bao gồm nhóm gingerol, nhóm shogaol, zingerone, gingerdion…[21] Trong các thành phần đó [6]-gingerol được xác định là thành phần có hàm lượng cao nhất thuộc nhóm chất cay trong gừng (chiếm khoảng 75%) [28] Hơn nữa, hàm lượng [6]-gingerol có mối liên hệ chặt chẽ với tác dụng dược lý của gừng [8] và nó đã được chứng minh trên các thử nghiệm lâm sàng trên tác dụng kháng viêm và dị ứng [67], tác dụng chống oxy hóa và ung thư [39] bên cạnh tác dụng hạ sốt cũng như ức chế tổng hợp prostaglandin,

và ức chế hoạt động của tiểu cầu [38], [55] Tuy nhiên theo thời gian bảo quản cũng như qua chế biến, [6]-gingerol bị biến đổi thành những hợp chất khác làm thay đổi hoạt tính và có thể có độc tính Chính vì thế, việc xác định được hàm lượng [6]-gingerol là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của gừng

Trong Dược điển Việt Nam IV tuy đã có chuyên luận rất rõ ràng về dược liệu sinh khương và can khương nhưng lại chưa có một quy trình quy chuẩn hóa hướng dẫn phương pháp định tính và định lượng hàm lượng [6]-gingerol Vì thế việc xây dựng một quy trình chuẩn để đánh giá hàm lượng [6]-gingerol trong gừng là rất cần thiết

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Zingiber

1.1.1 Đa dạng loài và mô tả thực vật chung

a Đa dạng loài

Chi Zingiber là một chi thuộc họ Gừng Zingiberaceae gồm có 150 loài khác nhau

trong đó có 34 loài được báo cáo từ Trung Quốc và 24 loài từ Ấn Độ [49] Tại Việt

nam, chi Gừng có khoảng 14 - 17 loài [9] Theo phân loại thực vật học, chi Zingiber

được sắp xếp theo trình tự [4]:

- Giới (regnum): Thực vật (Plantae)

- Bộ (oro): Zingiberales

- Họ (familia): Zingiberaceae

b Mô tả thực vật chung của chi Zingiber

Cây thân thảo yếu cao đến 2-3 m Lá thuôn dài, hình mũi mác, mọc cao vừa phải, mỏng, không có cuống hoặc cuống rất ngắn Cụm hoa hình nón, phát sinh từ thân rễ trên một trục nhẵn có vẩy, không có lá Lá bắc xếp đè lên nhau chặt chẽ, khá lớn, thường có màu sắc rực rỡ, màu đỏ hoặc màu vàng Hoa mọc ở mỗi trục của các lá bắc, đài hoa mỏng, hình ống Tràng có 3 thùy thuôn dài Cánh môi hình trứng hay hình thuôn Noãn có 3 ngăn Quả nang hay nạc, không mở Hạt màu đen hoặc nâu đen, được bao phủ bởi một lớp áo hạt mỏng, màu trắng [7], [49], [59], [66] Toàn cây

thường có mùi hắc [1]

1.1.2 Đặc điểm một số loài trong chi Zingiber tại Việt Nam

Trong sản xuất và trong tự nhiên ở nước ta phổ biến 3 loài gừng khác nhau: Zingiber

cassumuar Roxb, Zingiber zerumbet, Zingiber officinale

Bảng 1.1 Đặc điểm cơ bản của 3 loài gừng phổ biến tại Việt Nam

Phát hoa bầu dục, lá hoa tròn màu lục, bìa trong rồi đỏ, đài trắng, cao 12mm, vành trắng, ống dài 3 cm, môi vàng tái có 3 thùy

Nang bầu dục, hạt đen [9]

Cây thảo cao từ 0,5 - 1m

Lá mọc cách, không cuống, phiến lá hình mác to, mặt lá nhẵn bóng, có gân giữa hơi trắng nhạt và khi vò có mùi thơm Hoa mọc thành bông

từ gốc, có cuống dài, màu vàng xanh Cán hoa dài cỡ

20 cm Hoa có tràng hoa màu vàng xanh, có thùy gần bằng nhau Quả mọng

Hoa màu đỏ tươi [30]

Lưỡi bẹ chưa tới

vị thuốc, tăng tính ấm cho vị thuốc (thục địa chế); giảm tác dụng gây nê trệ của một số

vị thuốc sinh tân dịch như huyền sâm, mạch môn; tăng tác dụng phát tán của thuốc, giảm tính kích ứng của một số vị thuốc (bán hạ) [5]

Sinh khương là thân rễ tươi của cây gừng, có vị cay, tính ấm Sinh khương thuộc nhóm thuốc giải biểu cay ấm (tân ôn giải biểu, phát tán phong hàn) dùng trong cảm mạo do phòng hàn gây ra; làm ấm vị (ấm dạ dày) hết nôn dùng khi bị lạnh… Dùng làm gia vị trong một số món ăn hoặc chế biến thành mứt gừng, trà gừng và gừng được dùng để giải cảm, trị cảm hàn, phế lạnh có đàm, lạnh bụng, ăn không tiêu [5]

Can khương là thân rễ phơi khô của cây gừng, có vị cay, tính ấm Quy kinh tỳ, vị, tâm và phế Can khương thuộc nhóm thuốc khử hàn (thuốc ôn lý trừ hàn, hồi dương cứu nghịch) có công năng ôn trung ở liều thấp, hồi dương ở liều cao dùng khi tỳ vị hư nhược; hàn gây tiết tà bụng sôi, phân nát lỏng; hàn tà phạm vị gây nôn ra nước dãi; hàn ẩm phạm phế gây ho, khí, suyễn [5]

6

b Theo y học hiện đại

Các nghiên cứu của y học hiện đại đã có những kết luận về tác dụng dược lý của gừng gây tác dụng co mạch, hưng phấn thần kinh trung ương và thần kinh giao cảm, tăng tuần hoàn, tăng huyết áp, ức chế trung tâm nôn, sung huyết ở dạ dày, cầm máu nhẹ Trong đó:

+ Các tác dụng của gừng đã được chứng minh bằng lâm sàng là việc dự phòng buồn nôn và nôn có liên quan đến say rượu [26], [29], [36], [58], buồn nôn sau mổ [19], nôn mửa có hại trong thai kỳ [64] và say sóng [32], [48] Gừng cũng được sử dụng trong điều trị chứng khó tiêu, đầy hơi, đau bụng, ói mửa, tiêu chảy, co thắt và các vấn đề về dạ dày khác Không những thế, bột gừng còn được sử dụng trong điều trị cảm lạnh và cúm, kích thích sự thèm ăn, có tác dụng như một chất đối kháng với ma túy và như một chất chống viêm trong điều trị đau nửa đầu, thấp khớp và loạn dưỡng

cơ Những tác dụng này được lưu trữ trong các tài liệu dược điển cũng như các y văn của y học cổ truyền [63]

+ Tác dụng giảm đau bụng kinh nguyên phát: nghiên cứu phân tích meta và tổng quan hệ thống đã chứng minh hiệu quả của 750 – 2000mg bột gừng trong 3 – 4 ngày đầu tiên của chu kì kinh nguyệt cho chứng đau bụng kinh nguyên phát [25]

+ Tác dụng trên cải thiện các chỉ số glycemic của bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2: Nghiên cứu mù đôi, thử nghiêm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng của Shidfa F và cộng sự đã chỉ ra việc cung cấp 3g bột gừng trong 3 tháng đã cải thiện chỉ số glycemic indices, TAC (dung lượng chống oxy hóa toàn phần trong huyết tương), và PON-1 (chỉ số paraoxonase) trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 [52]

+ Tác dụng chống nôn: Nghiên cứu pha 2 ngẫu nhiên mù đôi có đối chứng với placebo của Konmun J và cộng sự đã chỉ ra tác dụng chống nôn của bệnh nhân có khối

u rắn được điều trị hóa chất [39] và tác dụng được chỉ ra tương tự trong nghiên cứu trên bệnh nhân ung thư vú nữ [40] Ngoài ra rất nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra tác dụng vượt trội của gừng so với placebo trên tác dụng chống buồn nôn và chống nôn [48], [65]

+ Tác dụng kháng khuẩn: gừng có tác dụng ức chế một số khuẩn Escherichia coli

gây tiêu chảy ở chuột [22]

7

+ Tác dụng chống viêm: Nghiên cứu đến từ Trung Quốc đã báo cáo kết quả 113 bệnh nhân với bệnh thấp khớp và đau thắt lưng đã tiêm dịch chiết gừng 5 – 10% vào điểm đau Kết quả là những bệnh nhân giảm đau một phần hoặc toàn bộ, giảm các khớp sung và cải thiện hoặc phục hồi chức năng khớp [63] Một nghiên cứu khác sử dụng bột gừng đường uống cho bệnh nhân thấp khớp và rối loạn cơ xương (MSDs) cũng báo cáo kết quả tương tự trên mức độ giảm đau khác nhau cũng như giảm sưng [54]

+ Tác dụng chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của gừng được chứng minh

cả trên các nghiên cứu in vitro và in vivo Tác dụng chống oxy hóa của gừng được chỉ

ra trên tác dụng ức chế quá trình peroxyd hóa lipid, tăng glutathione cũng như loại bỏ các gốc tự do trên mô hình động vật [14], [35], [68]

1.1.4 Thành phần hóa học trong loài Zingiber officinale

Thành phần trong loài Zingiber officinale chứa 1 - 4% tinh dầu và dạng oleoresin

(một dạng hỗn hợp giữa nhựa và tinh dầu) [63] Tùy vào điều kiện trồng, điều kiện chế

biến, xuất xứ loài Zingiber officinale mà thành phần trong tinh dầu gừng và trong

oleoresin cũng như tỉ lệ hàm lượng của chúng có trong gừng là có sự khác nhau [49]

a Tinh dầu gừng

Thành phần và hàm lượng tinh dầu gừng thay đổi theo nguồn gốc, vị trí địa lý, và điều kiện trồng gừng, tuy nhiên, cấu trúc chính trong thành phần là sesquiterpene hydrocarbon (là chất chịu trách nhiệm chính trong việc cho hương thơm) thì không

thay đổi Các hợp chất sesquiterpen hydrocarbon này bao gồm zingiberene, curcumene, (-)-β-sesquiphellandrene, và β-bisabolene, bên cạnh đó, các hợp chất

(+)-ar-monoterpene aldehyde, hợp chất alcol cũng xuất hiện trong tinh dầu gừng [63] Thân

rễ loài gừng Việt Nam có hàm lượng khoảng 2,7% so với khối lượng khô tuyệt đối được định lượng bằng phương pháp cất kéo hơi nước (bởi Van Beek, 1987) so với 1,7% hàm lượng tinh dầu của gừng Đài Loan (bởi Chen 1988) và từ 1% - 2% gừng Tứ Xuyên (Trung Quốc) Đồng thời, thành phần các hoạt chất trong tinh dầu gừng Việt Nam đã được định danh bằng các phương pháp GC, GC/MS và C-NMR [49]

b Chất dinh dưỡng

Ngoài thành phần tinh dầu, trong loài Zingiber officinale còn chứa:

8

+ Protein: khoảng 12,25% với gừng Trung Quốc, 6,67% với gừng Thái Lan, 2,3% với gừng Ấn Độ

+ Chất xơ, chất béo: khoảng 9,0% với gừng Thái lan, 7,78% với gừng Trung

Quốc, và 1% với gừng Ấn Độ [10] Cùng với đó, trong loài gừng Zingiber officinale

còn chứa các vitamin (thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxine, vitamin C, vitamin A, vitamin E); các chất khoáng (P, Mg, Ca) [49]

c Chất cay

Bên cạnh các hoạt chất trong tinh dầu cùng với các thành phần dinh dưỡng đã được định tính, các nhóm hợp chất tạo nên vị cay trong gừng gồm nhóm gingerol, gingerdiol, zingerone và shogaol, những thành phần này chiếm khoảng 8% của dầu nhựa gừng [15-17, 24, 46]

Trong đó, nhóm gingerol là một nhóm tương đồng về mặt hóa học như phenyl alkanones, bao gồm các hoạt chất [6]-, [8]-, [10]-gingerol, khác nhau về độ dài mạch carbon Trong các hoạt chất thuộc nhóm gingerol, thì [6]-gingerol là thành phần chất cay nhiều nhất (chiếm khoảng 75%), theo sau đó là [10]-, [8]-gingerol [45], [56] Bên cạnh đó, các thành phần trong nhóm gingerol cũng có sự thay đổi dựa trên loại giống,

vị trí địa lý, và cách bảo quản Cũng dựa trên các nghiên cứu trước đây, gingerol được xác định là thành phần chủ yếu trong gừng tươi, và cũng được tìm thấy trong gừng khô Mặc dù vậy, trong gừng khô thì hoạt chất thuộc nhóm shogaol lại là chủ yếu [13] Dựa trên điều này mà nhóm gingerol hoặc [6]-gingerol sẽ được sử dụng để ước tính độ tươi của gừng [49]

1.2 Tổng quan về chất cay trong loài Zingiber officinale

1.2.1 Thành phần và cấu trúc hóa học

Các chất cay được báo cáo tồn tại trong thân rễ của Gừng bao gồm zingerone, nhóm gingerol, gingerdiol, zingeron, nhóm shogaol có cấu trúc hóa học chung được trình bày trong bảng 1.2 [31], [27]

a Zingerone

Zingeron hay 4-(4-hydroxy-3-metoxypheny)-2-butanon, không tan trong nước, tan trong cồn, và tan một phần trong cồn 50 Zingeron hay còn được biết đến với tên vanillylacetone [63], là một thành phần quan trọng trong chất cay của gừng có cấu trúc

dụng trong điều trị tiêu chảy do enterotoxin gây ra bởi E coli được nghiên cứu trên đối tượng chuột [22] Ngoài ra, Zingerone cũng được nghiên cứu in vitro chứng minh tác

dụng giảm gốc tự do và các loại chất oxy hóa trong cơ thể, ức chế các enzym tham gia tạo các gốc tự do này và kích thích sự phóng thích của catecholamine [47]

b Nhóm Gingerol

Gingerol được xác định là nhóm chất có hàm lượng cao nhất trong nhóm hợp chất tạo nên vị cay của gừng Thành phần có hàm lượng lớn nhất trong nhóm gingerol

10

có mặt trong gừng tươi là [6]-gingerol (chiếm khoảng 75%) Các chất khác thuộc

nhóm gingerol có cấu trúc và tính chất gần tương tự như [6]-gingerol (bảng 1.2)

 [6] -gingerol

[6]-gingerol hay (S)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-3-decanon, tan trong cồn, methanol, acetonitrile, benzen, chloroform, tan ít trong ether [42], và nóng chảy ở 30 – 32oC (86 – 90oF, 303 đến 305o

K)

HO OCH3

O OH

[6] - gingerol

Khi gừng được chế biến, gingerol biến đổi thành zingerone ít cay và thơm hơn theo cơ chế phản ứng aldol ngược Và khi gừng được sấy khô hoặc lưu trữ thì trải qua phản ứng khử nước tạo thành [6]-shogaol, có độ cay gấp đôi so với gừng tươi [21] Dựa trên tính chất đó mà việc đánh giá hàm lượng [6]-gingerol trong gừng sẽ đánh giá được chất lượng của gừng

Độ ổn định của [6] – gingerol [18], [56]

Nghiên cứu đến từ trường Đại học Sydney, Australia năm 2006 đã đánh giá tốc

độ chuyển gingerol sang shogaol trong môi trường dịch nước dựa theo khoảng nhiệt

độ từ 37 tới 1000

C ở pH là 1, 4 và 7 Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tốc độ chuyển

từ gingerol sang shogaol rất nhanh và đạt cân bằng trong vòng 2h tại 1000C và pH = 1

Và ngược lại, tốc độ biến đổi rất chậm và ổn định lớn nhất là tại pH = 4 và nhiệt độ tại

370C Đồng thời, nghiên cứu này cũng đánh giá độ ổn định của gingerol và shogaol trong môi trường dịch giả dạ dày và ruột Trong đó, [6]-gingerol bị biến đổi không đáng kể (< 2%) trong vòng 1 giờ đầu khi ngâm trong môi trường pH=1 và tăng dần tới cân bằng nếu ngâm lâu trong môi trường này và không có sự ảnh hưởng của enzyme Ngược lại, [6]-shogaol cũng ổn định trong vòng 1 giờ đầu nhưng bị biến đổi hoàn toàn thành [6]-paradol trong vòng 48h tiếp theo

[6]-c Nhóm Shogaol

Nhóm shogaol là nhóm hợp chất bị biến đổi bởi [6]-gingerol theo cơ chế loại nước Trong nhóm shogaol thường hay biết đến ở dạng [6]-shogaol (n = 3), ngoài [6]-shogaol thì [4]-shogaol, [8]-shogaol, [10]-shogaol và [12]-shogaol cũng được tìm thấy trong gừng có cấu trúc và tính chất gần tương tự với [6]-shogaol

11

[6]-shogaol hay (E)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)dec-4-en-3-on tan được

trong methanol và ethanol, tan ít trong chloroform và ethyl acetat Mặc dù [6]-shogaol

là sản phẩm được chuyển thể từ [6]-gingerol do quá trình bảo quản hoặc gia nhiệt nhưng điều thú vị là [6]- shogaol có độ cay lớn hơn [6]-gingerol (độ cay của shogaol là 160.000 SHU trong khi của gingerol là 60.000 SHU) và một số tác dụng sinh học mạnh hơn [6]-gingerol [21], [34] Vì thế tỉ lệ shogaol và gingerol thay đổi theo thời gian và có thể coi là dấu hiệu để đánh giá chất lượng của gừng Trong môi trường acid hoặc môi trường dịch giả dạ dày ruột: [6]- shogaol bị biến đổi thành [6]-paradol 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) decan-3-one [18], [21]

1.2.2 Vai trò của chất cay trong một số lĩnh vực

+ Tác dụng chống viêm và chống dị ứng: nghiên cứu chứng minh [6]-gingerol thể hiện tác dụng chống viêm và dị ứng ở mức liều 50µM [36], [67] so với mức liều 32 µM, 17,5 µM, 7,5 µM của [10]–gingerol, [8]–shogaol và [10]–shogaol tinh khiết qua cơ chế ức chế chọn lọc enzym COX-2 [61]

+ Tác dụng chống viêm do TPA gây ra: [6]-gingerol ở liều 1µmol có khả năng giảm

phù nề trên tai gây ra bởi TPA trên chuột, đồng thời giảm đáng kể hàm lượng của các cytokin

+ Tác dụng chống ung thư: gingerol và shogaol được chứng minh là các hợp chất có

tính chất gây độc với tế bào ung thư [51] liên quan tới chu trình apoptosis, ức chế sự hình thành mạch và là hướng nghiên cứu mới trong phát triển thuốc ung thư mới [33], [62], [43]

Trên thực tế, một số nghiên cứu đã so sánh hoạt tính sinh học của [6]-gingerol và [6]-shogaol, là hai thành phần đại diện cho hai nhóm quan trọng nhất trong chất cay là nhóm gingerol và shogaol, tác dụng của [6]-shogaol được chứng minh là mạnh hơn nhiều so với [6]-gingerol Bằng chứng là trên các tác dụng chống viêm, dị ứng, hoặc hoạt tính chống các gốc oxy hóa, [6]-shogaol đều cho tác dụng ở mức liều thấp hơn [6]-gingerol [27] Tuy nhiên, vì hoạt tính mạnh ở liều thấp này, [6]-shogaol sẽ gây tác dụng quá mức nếu có hàm lượng quá cao trong gừng Chính vì điều này mà trong dược điển Mỹ USP35 quy định giới hạn trên cho [6]-shogaol không được quá 0,18% tính theo hàm lượng dược liệu khô [60]

12

1.3 Các phương pháp phân tích [6]-gingerol

1.3.1 Định tính thành phần [6]-gingerol trong Zingiber officinale

a Phương pháp sử dụng sắc ký lớp mỏng

Sử dụng bản mỏng silicagel GF254; dung môi khai triển: ether và n - hexane (7: 3) [60] hoặc n-Hexan - aceton - acid acetic băng (7,5 : 2,5 : 4 giọt) [3] và thuốc thử hiện màu là dung dịch 10% sulfuric acid trong cồn

+ Dung dịch mẫu: 0,2 g gừng, thêm 5ml MeOH, lắc trong 30 phút, để lạnh

+ Dung dịch chuẩn: 0,2 g gừng chuẩn làm song song như phần dung dịch mẫu

b Phương pháp HPLC

Sử dụng cột C18, pha động gồm dung dịch A: ACN, H3PO4 (1/1000), MeOH (55:

44: 1) và dung dịch B: ACN theo chương trình gradient (bảng 1.3), UV 282 nm, f =

1,0 ml/phút, V = 25µl Dung dịch chuẩn: 0,1 mg/ml của Capsaicin trong MeOH Thời

gian lưu tương đối của 6 – gingerol so với capsaicin 0.8 [60]

Bảng 1.3 Hệ dung môi pha động HPLC theo USP35 Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

1.3.2 Các phương pháp định lượng [6]-gingerol

Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu tiến hành định lượng các hàm lượng chất cay trong gừng từ nhiều nguyên liệu khác nhau: gừng tươi [11], [28], bột gừng, trà gừng, các viên nang mềm, nang cứng chứa gừng [50], gel giảm đau chứa gừng [57]… Trong các nghiên cứu đó, phương pháp hay sử dụng nhiều nhất là HPLC và HPLC-MS được trình bày chi tiết trong bảng 1.4 với nguyên liệu đầu vào là bột gừng

Bảng 1.4 Các phương pháp định lượng [6]-gingerol bằng HPLC

[42]

Cân chính xác khoảng 1g bột gừng, đặt trong ống

ly tâm, thêm 30ml hỗn hợp MeOH và nước (3: 1),

lắc trong 20 phút, sau đó ly tâm và tách riêng phần

chất lỏng bên trên, lặp lại việc chiết xuất thêm 2

Cột C18, 40oC, pha động:

H2O : ACN : H3PO4

(3800:2200:1); UV 205nm; V = 10µL

13

lần nữa Gộp dịch chiết định mức vừa đủ 100ml tR = 19 phút

[44]

Cân chính xác 0,25g bột cho vào bình nút mài,

thêm 20ml của MeOH 75% và cân Dùng sóng

siêu âm (100 W, tần số 40 kHz) 40 phút, để

nguội cân lại, bù lại thể tích dung môi đã mất

Cột C18, pha động: ACN : MeOH : H2O (40: 5: 55);

UV 280nm; V = 10µL

[41]

Cân chính xác 2.0g gừng tươi/ bột gừng thêm

60ml MeOH, chiết hồi lưu trong 2 giờ và lọc,

lặp lại quá trình hồi lưu với 30ml MeOH, gộp

Cân chính xác 150mg bột gừng, chiết xuất bằng

10ml ethylacetat Đuổi dung môi và thêm 2.0ml

dung môi pha động, lắc trộn khoảng 25 giây và

Gừng được chiết xuất bằng methanol Dịch chiết

methanol được lọc vào chuyển vào bình cô quay

100ml, quay chân không ở 40oC

Cột Inertsil ODS-3 Pha động: MeOH : H2O;

UV 282 nm; f = 1,0 ml/ phút, tR =3,8-16,2 phút

[21]

Gừng rửa sạch, thái lát, và làm sấy lạnh, rây qua

rây 200 Cân 10g bột gừng đặt trong bình thủy

tinh Soxhlet chiết bằng CO2 áp suất cao Nhiệt độ

dùng bình cách thủy 45 ± 2oC, p = 600 – 700 psi,

t = 24 giờ Sau đó, được làm lạnh -70oC (dùng

cồn) để giảm áp suất bên trong Chiết bằng aceton

dưới áp suất giảm thu được nhựa dầu gừng

Cột Varian Micro Pak SP-

C18, pha động: Gradient từ MeOH : H2O (65 : 35) tới MeOH : Nước (100 : 0);

UV 282 nm; f = 1,0 ml/ phút

tR = 6,2 phút

- Phương pháp HPLC-MS [57]: cân chính xác 50mg oleoresin hòa tan trong 10ml MeOH thu được dịch tiêm mẫu Sử dụng cột C18, 48oC, pha động là ACN : H2O theo chương trình gradient dung môi, f = 0,2 ml/phút

14

1.4 Tổng quan về phương pháp định lượng bằng HPLC

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)

là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích được hòa tan trong pha động và di chuyển qua cột chứ các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực tương đối của chất phân tích với pha tĩnh với pha động mà các chất sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến thứ tự rửa giải của các chất cũng khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2]

1.4.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hệ thống HPLC gồm có các bộ phận cơ bản: hệ thống cấp pha động, bơm sắc ký

lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột, detector, bộ phận thu nhận và xử lý số liệu (hình 1.5)

Hình 1.1 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [37]

a Hệ thống cấp pha động

Pha động trong sắc ký lỏng thường là dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Trước khi sử dụng, cần lọc dung môi pha động qua màng 0,45 µm và đuổi khí hòa tan trong pha động Có thể loại khí bằng siêu âm, sục khí trơ như heli… Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh

Có hai cách dùng pha động rửa giải:

- Đẳng dòng (isocratie): Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 – 4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định

b Hệ thống bơm

Hệ bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký Bơm HPLC phải tạo được áp suất cao 250 – 500 atm và lưu

15

lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/phút, không bị ăn mòn bởi các thành phần pha động,

có tốc độ bơm không đổi

c Bộ phận tiêm mẫu

Bộ phận tiêm mẫu tự do: mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ở ngay đầu cột mà không cần dùng dòng Khi dùng van tiêm sẽ dễ dàng tự động hóa Phần mềm máy tính dễ dàng điều khiển và kiểm soát hệ bơm mẫu tự động, sai số tiêm mẫu khoảng 0.5%

Dùng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột: Sử dụng một bơm tiêm mẫu chuyên dụng

để bơm mẫu lỏng hoặc dung dịch vào pha động Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao (dưới 1500 psi), cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn nhiều so với dùng van tiêm

d Cột sắc ký

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ thường có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong từ 2 – 5 nm, thường có cột nhồi và cột bảo vệ Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 – 10 Chất nhồi cột thường là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một chất hữu cơ) Bên cạnh silicagel, người ta còn dùng các hạt khác: nhôm oxyd, polyme xốp, chất trao đổi ion Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loài các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột

e Detector

Detector là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu khi có chất ra khỏi cột và các tín hiệu này được ghi dưới dạng pic trên sắc đồ Hiện nay có nhiều detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc hai nhóm quang hóa và điện hóa: detector hấp thụ UV – VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn

f Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính có khả năng ghi nhận, xử lý, và lưu trữ thông tin

16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu gừng thuộc các loài khác nhau được thu hái từ các vùng khác nhau của Việt Nam bao gồm: Lào Cai, Hà Nội… và được giám định tên khoa học bởi các chuyên gia của Viện Dược Liệu lưu giữ tại khoa Công nghệ Chiết xuất, Viện Dược liệu

Bảng 2.1 Các mẫu gừng dùng trong nghiên cứu

STT Kí hiệu

Ngày nhận

- Máy HPLC UFLC Shimadzu, Nhật bản

- Máy siêu âm Daihan, Hàn Quốc

- Các thiết bị phụ trợ khác: cân hàm ẩm OHAUS (Swithzerland), tủ sấy Memmert

(Đức), cân phân tích 4 số AND (Nhật Bản), máy chiết Soxhlet 148 Velp (Italy)