Thu nhận Enzym protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

3.1.2: Lên men tạo protease Sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn Môi trường nuôi cấy: - Môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym của vi sin

Trường: Cao đẳng cộng đồng Hà Tây Lớp: công nghệ thực phẩm 11

Đề tài : Thu nhận Enzym protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

GVHD: Nguyễn Thị Phương Mai

Nhóm : 3

1: Lê Văn Hiến

2: Thái Thị Oanh

3: Bùi Thị Giang

4: Hoàng Thị Thảo

5: Giang Thanh Hải

6 :Vũ Văn Huy

7: Chu Xuân Hiếu

8: Nguyễn Văn Kiệt

9: Vũ Thị Hợp

10: Chu Văn Sơn

11: Võ Thị Phương

12: Hồ Thị Linh

MỤC LỤC Phần I: Mở đầu.

1.1: Khái niệm và phân bố của E protease

1.2: Nguồn thu thu nhận E Protease

Phần II: Sơ lược về nấm mốc A Oryzae.

2.1: Phân loại

2.2: Đặc điểm

2.3: Cấu tạo

Phần III: Phương pháp sinh tổng hợp E Protease, ứng dụng.

3.1: Quy trình thu nhận E Protease.

3.1.1: Phân lập chủng nấm A Oryzae.

3.1.2: Lên men tạo E Protease.

3.1.3: Thu nhận Enzym

3.1.4: Tinh sạch E Protease.

3.2: Ứng dụng

Kết luận.

Phần I: Mở đầu.

1.1: Khái niệm và phân bố.

Khái niệm: Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy

phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton

Phân bố: E Protease được phân bố rộng rãi từ vi sinh vật

1.2: Nguồn thu nhận E Protease.

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể

ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp

và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp

và y dược Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có

nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các

protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :

Protease serine

Protease kim loại (metallo protease)

Protease acid

Protease tiol

Phần II: Sơ lược về nấm mốc A Oryzae.

2.1: PHÂN LOẠI

Giới: Nấm

Ngành : Ascomycota

Lớp: Eurotiomysetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae

Chi: Apergillus

(Theo Kitamoto 2002)

2.2: Đặc điểm.

Vi nấm thể, nấm mọc và phát triển thành lớp mốc màu đen, vàng

Cơ thể sinh trưởng là hệ sợi, phân nhánh có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào, sợi mạnh chiều ngang sợi khoảng 5-7μm

Sinh sản bằng bào tử

Giàu Enzym thủy phân nội bào và ngoại bào: Amylase, protease Có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase

2.3: Cấu tạo :

Nấm mốc A oryzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có

nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng sáng và khi phát triển có màu

xanh lợt có ít vàng A oryzae có hình dáng đính bào tử màu thay đổi từ xanh vôi

sang xanh thẩm, dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia

Phần III: Phương pháp sinh tổng hợp E Protease, ứng dụng.

3.1: Quy trình thu nhận E Protease.

3.1.1: Phân lập chủng nấm A Oryzae.

Nguồn phân lập:

- Thức ăn

- Trung tâm cung cấp nấm giống

Phương pháp:

- Phân lập trong điều kiện tự nhiên

- Phân lập trong điều kiện sản xuất

- Phân lập từ mẫu giống đã hỏng (đất gì ?.ở đâu ?thức ăn gì ? cung cấp phân lập của trong tự nhiên ?.trong đk sx? Giống đã hỏng ?)

Cách tạo mốc giống:

Lên men tạo E.

protease

Phân lập nấm mốc

Thu nhận Enzym Tinh sạch Enzym

- Mẫu được xay nhuyễn, thêm nước cất, pha loãng ở các nồng độ thích hợp và nhân giống chọn lọc trên môi trường tổng hợp: môi trường Czapek bằng kỹ thuật cây trang

Saccharose: 30g

NaNO3: 3g

K2SO4: 1g

MgSO4: 0,5g

KCl: 0,5g

FeSO4: 0,1g

Nước cất: 1000ml

pH: 5-5,5

- Giống sau khi phân lập sẽ được cấy truyền sang bình tam giác

Môi trường nuôi nấm:

• Cám, ngô đã xay nhỏ, có thể bổ sung thêm trấu cho xốp

• Độ dày khoảng 1-2cm

• Đem hấp chín để nguội 30-35°c

• Cấy truyền giống từ ống nghiệm sang bình tam giác và nuôi 36-48 giờ nhiệt

độ 30-35°c

3.1.2: Lên men tạo protease ( Sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường

bán rắn)

Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym của vi sinh vật, thành phần môi trường phải đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho

sự phát triển bình thường của vi sinh vật và sự sinh tổng hợp enzym

- Thành phần chính của môi trường: C,H,N,O, ngoài ra còn các chất vô cơ:Mn,Ca,p,S,Fe, và các chất vi lượng khác

- Để tăng sự tổng hợp enzym người ta thường bổ sung các chất cảm ứng các chất này thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp

a Nguồn cacbon.

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp

- Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp

đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có

tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp oryzae 79có thể theo thứ tự:

fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza

- Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease (độ thông khí là gì ? giải thích sơ đồ fructoza….galactoza ? )

b Nguồn nitơ

Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ

Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao Nhiều

kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ Cho thêm vào môi trường

có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực

enzyme Protease tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung.

Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật

Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease của

chủng đột biến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24% ( A.o 9251 – 90 là gì ? 132 – 63 ?)

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng,

ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza

VSV

c Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng

- Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao

- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-30ºC Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành

E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi VSV

+ Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng) Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt

+ Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất (lắc thiết bị gì ? đơn vị tính ? bao nhiêu ?

3.1.3: Thu nhận Enzym.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+ Enzym mới bắt đầu được hình thành

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 30ºC vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt

Giai đoạn 2 Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm môi trường giảm dần

+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45°C

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi + Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn (mục đích gì ? nồng độ bao nhiêu ?)

+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30°C là tốt nhất

Giai đoạn 3 Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:

+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ Nhiệt độ nuôi duy trì ở 30°C Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzym sẽ giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường) Người

ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh

3.1.4: Tinh sạch E Protease.

Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ

Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.(nghiền gì ? nuôi trên bề mặt nào?)

Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone) (mục đích gì ?.nồng độ bao nhiêu ?)

Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt

và dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất Theo phương pháp khuếch tán bằng nước

có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 28C.(quá trình

cơ học nàycó ảnh hưởng tới hoạt tính E hay không ? tại sao ?)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :

Tỷ lệ nước trích ly:

Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau

Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc Thời gian trích ly:

Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút Nhiệt độ trích ly:

Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 30°C

Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc

Sản phẩm enzyme tinh khiết trích được nhiều lần Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được Quá trình kết tủa : Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong

đó còn chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Dung dịch enzyme thô thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này

Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa Kết tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu trong tinh sạch enzyme Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme

Nguyên tắc : Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi

Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt

Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác

có vai trò quyết định đến tính chất enzyme

Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate Nếu loại bỏ các tương tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thường gọi là tủa protein

Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch

Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách tinh sạch hơn

Quy trình trích ly:

Với tỷ lệ 1 phần enzym thô + 4-5 phần nước

Enzym protease, nước, chất hòa tan trong môi trường nuôi cấy

Dùng tác nhân kết tủa là ethanol hoặc sunfat amon Tỷ lệ 1 Phần dung dịch enzym thô + 2-2,5 ethanol nồng độ 97% Khuấy nhẹ để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh 4-7°c

Độ ẩm lớn hơn 70%, đễ bị biến tính

Nhiệt độ 40°c

Độ ẩm 40%

Chế phẩm enzym

thô

Hòa tan bằng

dung môi nước

Khuấy nhẹ, lọc

lấy dịch

Bã

Dung dịch enzym

thô

Kết tủa enzym

Thu nhận kết tủa

enzym

Sấy phun sương

Enzym protease

tinh khiết

3.2: Ứng dụng.

Protease không những được ứng dụng nhiều trong y dược, hóa học, trong nông nghiệp, mà trong công nghiệp Protease chiếm vai trò quan trọng, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lãnh vực đã dùng Protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…

Sau đây là những ứng dụng mà Protease mang lại trong công nghiệp thực phẩm: 3.2.1: Trong công nghiệp chế biến thịt

- Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt Có thể ngâm thịt vào dinh dưỡng Protease ở pH và nhiệt độ xác định-phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (E, muối, bột ngọt), tiêm dung dịch enzyme vào thịt (tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ)

3.2.2: Trong chế biến thuỷ sản

Khi sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme Protease để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm Phương pháp sử dụng Protease trong xản xuất nước mắm:

+ Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới tác động của hệ Protease nội tại trong điều kiện có muối theo cơ chế:

Trong 24 giờ đầu tiên, dưới tác động của các hệ Protease nội tại của cá một phần protein thịt cá bị thủy phân thành peptid, polypeptid hòa tan trong nước bổi Sau đó protein thịt cá, polypeptid và các peptid được tạo thành này tiếp tục bị thủy phân mạnh mẽ bởi các Protease kim loại tạo thành các aa tự do, các peptid ngắn và đã có