Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa chất độc tế bào trên chuột cống trắng và áp dụng đánh giá tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ (carica papaya l )

Dựa trên kinh nghiệm dân gian trong điều trị các rối loạn liên quan đến giảm tiểu cầu, một số nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu của

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, ThS Phạm Đức Vịnh và DS Nguyễn Tùng Sơn

những người thầy đã luôn tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ và DS Đinh Thị Kiều Giang là

những anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực đã trực tiếp tham gia và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện đề tài, em còn nhận được sự giúp đỡ, ý kiến đóng góp

từ các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực Em xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó

Em xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược lực đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng

hộ, chia sẻ khó khăn và động viên em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên

Đinh Thị Chi

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giảm tiểu cầu 3

1.2 Các mô hình gây giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm 9

1.3 Đu đủ 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 29 3.1 Kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA trên chuột cống trắng 29

3.2 Kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan trên chuột cống trắng 34

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA 39

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 44 4.1 Về kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA trên chuột cống trắng 44 4.2 Về kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan trên chuột cống trắng 46 4.3 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu đủ 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2C9.G2 Kháng thể không liên hợp hoặc liên hợp với isothiocynate chống lại

GPIIIa (The unconjugated or fluorescein isothiocynate conjugated antibody against GPIIIa)

(FITC)-ADP Adenosine triphosphat

ALT Alanin transaminase

AST Aspart transaminase

CPA Cyclophosphamid

DIC Hội chứng đông máu nội mạch rải rác

HIT Giảm tiểu cầu do heparin

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MWReg30 The monoclonal antibody specific for glycoprotein (GP)IIb

PBS Muối đệm phosphat (phosphate-buffered saline)

PDI Protein disulfid isomerase

PF4 Yếu tố 4 tiểu cầu

RAMPS Huyết thanh thỏ kháng tiểu cầu chuột (Rabbit anti-mouse platelet

serum) TLC Sắc ký lớp mỏng

TNF Yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor)

TTP Ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Đánh giá bệnh nhân giảm tiểu cầu [35] 3

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất cao lá đu đủ 21

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA 25 Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan 26

Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA 27

Hình 3.1 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến tỷ lệ chuột chết 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến mức độ tăng khối lượng chuột theo thời gian 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng tiểu cầu tại các thời điểm khác nhau 31

Hình 3.4 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng bạch cầu tại các thời điểm khác nhau 32

Hình 3.5 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng hồng cầu tại các thời điểm khác nhau 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến thể tích trung bình tiểu cầu tại các thời điểm khác nhau 34

Hình 3.7 Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến tỷ lệ chuột chết tích lũy theo thời gian 35

Hình 3.8 Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến mức độ tăng khối lượng chuột theo thời gian 36

Hình 3.9 Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng tiểu cầu 37

Hình 3.10 Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng bạch cầu 38

Hình 3.11 Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng hồng cầu 39

Hình 3.12 Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng tiểu cầu 40

Hình 3.13 Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng bạch cầu 41

Hình 3.14 Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng hồng cầu 42

Hình 3.15 Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến thời gian đông máu và thời gian chảy máu chuột 43

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giảm tiểu cầu là một rối loạn thường gặp, đặc trưng bởi số lượng tiểu cầu giảm dưới ngưỡng 150 000 tế bào/mm3 máu Rối loạn này có thể là tiên phát (xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc thứ phát do các nguyên nhân khác nhau (như nhiễm virus, sử dụng hóa trị liệu, mang thai, …) với mức độ thay đổi từ nhẹ, không triệu chứng đến xuất huyết đe dọa tính mạng [35], [54] Trong một khoảng thời gian dài, điều trị giảm tiểu cầu chủ yếu dựa trên việc loại bỏ nguyên nhân gây bệnh và điều trị

hỗ trợ thông qua truyền máu hoặc truyền tiểu cầu khi có chỉ định Gần đây, sự ra đời

và phát triển các thuốc kích thích tiểu cầu thế hệ thứ hai đã mở ra một hướng điều trị đầy hứa hẹn trên các bệnh nhân mắc chứng giảm tiểu cầu nghiêm trọng như xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch kháng trị và thiếu máu bất sản [45] Tuy nhiên, khả năng tiếp cận của phần lớn bệnh nhân với các thuốc này khá hạn chế do giá thành của thuốc rất cao Do đó, việc nghiên cứu các thuốc điều trị giảm tiểu cầu mới nhằm bổ sung hoặc thay thế cho các thuốc kích thích tiểu cầu hiện có là một hướng tiếp cận tiềm năng và

có ý nghĩa thực tiễn lớn

Dựa trên kinh nghiệm dân gian trong điều trị các rối loạn liên quan đến giảm tiểu cầu, một số nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu của một số thuốc có nguồn gốc dược liệu và thu được những kết quả khả

quan với nhiều dược liệu khác nhau như đu đủ (Carica papaya), xuyên tâm liên (Andrographis Paniculata), ổi (Psidium guajava) [23], [60], [68] Trong đó, đu đủ là

đối tượng được quan tâm nhiều hơn cả do tác dụng tăng sinh tiểu cầu đã được ghi nhận

nhất quán trong một loạt các nghiên cứu in-vitro, in-vivo và một số thử nghiệm lâm

sàng ở Ấn Độ [17], [23], [27], [68] Đáng chú ý, mặc dù đu đủ cũng là một loài thực vật phổ biến ở Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu thực hiện đánh giá chuyên biệt tác dụng kích thích tạo tiểu cầu của dược liệu thu hái trong nước

Để bước đầu đánh giá tác dụng tăng sinh tiểu cầu của đu đủ cũng như các đối tượng nghiên cứu tiềm năng khác, trước hết cần phải xây dựng được một mô hình thực nghiệm có tính khả thi, tin cậy và mô phỏng được cơ chế sinh bệnh học của giảm tiểu cầu trên người Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu do đây là mô hình có quy trình đơn giản, dễ thực hiện và đã được sử dụng thành công để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các thuốc có

2

nguồn gốc dược liệu Tuy nhiên, trong các công bố trước đây, việc lựa chọn chế độ liều của tác nhân gây độc cũng như xác định thời điểm lấy mẫu đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến số lượng tiểu cầu còn có sự khác biệt lớn giữa các nghiên cứu [23], [37], [60], [64], [68] Ngoài ra, các chủng động vật thí nghiệm thường khác nhau về đặc tính sinh miễn dịch, dẫn đến biến thiên về mức độ giảm tiểu cầu và sự nhạy cảm

với độc tính của hóa trị liệu Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa chất độc tế bào trên chuột cống trắng” với 2 mục tiêu:

1 Triển khai được mô hình gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid và busulfan trên chuột cống trắng

2 Đánh giá được tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ trên một mô hình gây giảm tiểu cầu đã triển khai

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giảm tiểu cầu

Định nghĩa

Giảm tiểu cầu là một vấn đề lâm sàng phổ biến được định nghĩa là số lượng tiểu cầu giảm dưới ngưỡng 150 000/mm3 máu [54] Giảm tiểu cầu được chia thành ba giai đoạn: nhẹ (100 000 – 150 000 /mm3 máu), trung bình (50 000 – 100 000 /mm3 máu), nghiêm trọng (< 50 000/mm3 máu) Tuy nhiên, giảm tiểu cầu thường không được phát hiện trên lâm sàng cho đến khi số lượng tiểu cầu đã giảm xuống dưới mức 100 000/mm3 [26]

Chẩn đoán

Hình 1.1 Đánh giá bệnh nhân giảm tiểu cầu [35]

Số lượng tiểu cầu < 150 000/mm3

Hemoglobin và số lượng bạch cầu

Tiêu bản máu ngoại vi Tiểu cầu: xác định lại trong natri citrat hoặc heparin

Xém xét tủy xương

Hình thái hồng cầu

bình thường, tiểu cầu

bình thường hoặc tăng

kích thước

Xem xét:

Giảm tiểu cầu do thuốc

Giảm tiểu cầu do nhiễm trùng

Giảm tiểu cầu miễn dịch tự phát

Giảm tiểu cầu bẩm sinh

Thiếu máu tan máu vi mạch (DIC, TTP)

Tế bào hồng cầu bị phân mảnh

về máu), tình trạng nhiễm trùng [26], [35] Khi đối diện với bệnh nhân có số lượng tiểu cầu thấp nhưng không có nguyên nhân rõ ràng gây giảm tiểu cầu, cần loại trừ trường hợp giảm tiểu cầu giả Đây là hiện tượng xuất hiện do tiểu cầu kết dính với kháng thể (thường là IgG, nhưng cũng có thể là IgM và IgA) khi lượng calci giảm do thu mẫu máu trong ống chứa chất chống đông EDTA Để loại trừ trường hợp giảm tiểu cầu giả, cần tiến hành đánh giá tiêu bản máu ngoại vi kết hợp với thực hiện lại xét nghiệm tiểu cầu với mẫu máu chống đông bằng heparin hoặc citrat Quy trình đánh giá một bệnh nhân giảm tiểu cầu được trình bày trong Hình 1.1 [35]

Nguyên nhân

Ba nguyên nhân chính dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu bao gồm: (1) ức chế sản xuất tiểu cầu bởi tủy xương, (2) tăng phá hủy tiểu cầu và (3) tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách Các yếu tố này có thể xuất hiện đơn độc hoặc đồng thời trong các rối loạn sinh lý/bệnh lý khác nhau [35]

- Giảm sản xuất tiểu cầu: các bệnh làm tổn hại đến tế bào gốc hoặc ngăn chúng tăng sinh trong tủy xương thường gây giảm tiểu cầu Do chúng thường tác động đến nhiều dòng tế bào tạo máu, giảm tiểu cầu đi kèm với thiếu máu và giảm bạch cầu với những mức độ khác nhau Để chẩn đoán một khiếm khuyết trong quá trình sản sinh tiểu cầu, cần tiến hành xét nghiệm chọc hút hoặc sinh thiết tủy xương và kết quả phải cho thấy

có sự giảm số lượng tế bào nhân khổng lồ Các nguyên nhân phổ biến nhất dẫn đến giảm sản xuất tiểu cầu là bất sản tủy, xơ tủy hoặc thâm nhiễm tế bào ác tính tại tủy Tất cả những bệnh lý trên gây ra những bất thường tủy rất đặc trưng Các thuốc độc tế bào, thường được dùng trong hóa trị liệu ung thư, làm tổn hại đến sự tăng sinh và trưởng thành của các tế bào nhân khổng lồ, dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu Ngoài ra, một số bệnh tủy hiếm gặp như thiểu sản tế bào nhân khổng lồ bẩm sinh và giảm mẫu tiểu cầu kết hợp với thiếu xương quay làm giảm sản sinh tế bào nhân khổng lồ một cách chọn lọc [8], [26], [29]

5

- Tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách: 1/3 khối tiểu cầu bình thường bị giữ lại trong lách Cắt lách sẽ làm tăng số lượng tiểu cầu khoảng 30% Tăng tiểu cầu sau cắt lách là một bệnh lành tính tự khỏi không đòi hỏi liệu pháp đặc biệt Trái lại, khi lách phì đại, số lượng tiểu cầu bị giữ lại ở lách tăng lên, dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi Nguyên nhân thường gặp nhất gây phì đại lách là tăng áp lực tĩnh mạch cửa thứ phát sau bệnh gan và thâm nhiễm các tế bào u vào lách trong các bệnh loạn sản tủy, tăng sinh tế bào lympho hoặc đại thực bào trong bệnh Gaucher Lách to hiếm khi xuất hiện đơn độc mà thường đi kèm với nhiều biểu hiện lâm sàng khác của một bệnh

cơ bản Nhiều bệnh nhân bị bệnh bạch cầu, u lympho hoặc hội chứng loạn sản tủy có

cả thâm nhiễm tủy lẫn lách to và phát triển giảm tiểu cầu do phối hợp hai cơ chế giảm sản xuất tiểu cầu ở tủy xương và tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách [8], [26], [29]

- Tăng phá hủy tiểu cầu: rối loạn thành mạch, cục huyết khối fibrin và các bộ phận nhân tạo trong mạch máu, có thể rút ngắn thời gian sống của tiểu cầu và gây ra giảm tiểu cầu không do miễn dịch Hiện tượng này thường gặp trên các bệnh nhân bị viêm mạch, hội chứng tan máu do tăng ure huyết, ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối, đông máu nội mạch rải rác và bệnh nhân có van tim nhân tạo Ngoài ra, tiểu cầu có phủ kháng thể, phức hợp miễn dịch, hoặc bổ thể sẽ nhanh chóng bị các thực bào đơn nhân trong lách hoặc trong các mô khác dọn dẹp, gây giảm tiểu cầu miễn dịch Nguyên nhân phổ biến nhất của giảm tiểu cầu miễn dịch là nhiễm virus hoặc vi khuẩn, do thuốc và một bệnh tự miễn mạn tính là ban xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch [8], [26], [29]

Giảm tiểu cầu trong một số bệnh lý cụ thể

Giảm tiểu cầu là một triệu chứng phổ biến xuất hiện trong nhiều bệnh lý khác nhau như: hội chứng suy tủy, xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch, ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối, giảm tiểu cầu do heparin, nhiễm trùng (sốt xuất huyết, sốt rét, viêm gan C ),

… Dưới đây chỉ trình bày cơ chế bệnh sinh và tiếp cận điều trị của một số bệnh lý quan trọng trên lâm sàng

1.1.4.1 Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch

Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (Immune thrombocytopenia – ITP) là một rối loạn miễn dịch mắc phải, trong đó kháng thể kháng tiểu cầu làm giảm thời gian sống của tiểu cầu và ức chế sinh mẫu tiểu cầu dẫn đến giảm tiểu cầu (tiểu cầu < 100 000/mm3) [29] ITP xuất hiện ở cả người lớn và trẻ em Ở trẻ em, chủ yếu là ITP cấp, thường sau

6

nhiễm trùng, bệnh thường nhẹ và tự giới hạn, trong đó hơn 70 % sẽ tự hồi phục Ở người lớn, bệnh khởi phát âm thầm và hầu hết sẽ chuyển thành mạn tính (> 80 %) [2], [35] ITP có thể không rõ nguyên nhân (nguyên phát) hoặc do các tình trạng khác cùng tồn tại (thứ phát) hoặc do thuốc Trong ITP nguyên phát, tự kháng thể kết hợp với kháng nguyên bề mặt tiểu cầu và gây phá hủy tiểu cầu ở hệ thống liên võng nội mô, bên cạnh đó là sự ức chế sản xuất tiểu cầu thông qua trung gian miễn dịch ITP thứ phát xảy ra trong lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng kháng phospholipid, nhiễm HIV,

virus viêm gan C, Helicobacter pylori và các rối loạn tăng sinh tế bào lympho ITP do

thuốc là kết quả tương tác thuốc - tiểu cầu dẫn đến kết hợp kháng thể Thuốc liên quan đến giảm tiểu cầu bao gồm quinidin và quinin; chất ức chế tiểu cầu abciximab, eptifibatid, tirofiban và ticlopidin; kháng sinh linezolid, rifampin, sulfonamid và vancomycin; các phenytoin chống co giật, acid valproic và carbamazepin; các thuốc giảm đau acetaminophen, naproxen và diclofenac; cimetidin; và chlorothiazid [29]

Cơ chế bệnh sinh

Ban xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch là một rối loạn mắc phải trong đó có sự phá hủy tiểu cầu qua trung gian miễn dịch và ức chế sự giải phóng tiểu cầu từ tế bào nhân khổng lồ [35]

Tiểu cầu có thể bị phá hủy thông qua trung gian tự kháng thể IgG Các tự kháng thể gắn kết với một hay nhiều glycoprotein của màng tiểu cầu qua phần Fab của phân

tử kháng thể: GP IIb/IIIa, GP Ib/IX (75%), GP Ia/IIIa, GP IV, GP V (25%) Phức hợp miễn dịch sẽ gắn kết với phần thụ thể Fc của đại thực bào Tiểu cầu gắn kháng thể sẽ

bị tăng thực bào bởi đại thực bào, có thể bị ly giải qua hệ thống bổ thể Tự kháng thể cũng có thể làm giảm số lượng và ức chế sự trưởng thành của tế bào nhân khổng lồ trong tủy, ức chế yếu tố sinh tế bào nhân khổng lồ Ngoài ra, tiểu cầu cũng có thể bị ly giải thông qua trung gian lympho T Trong bệnh ITP, không có sự tăng số lượng thrombopoietin như giảm tiểu cầu trong suy tủy hay loạn sản tủy Kháng nguyên đích thường gặp trên bề mặt tiểu cầu là phức hợp glycoprotein IIb/IIIa Tiểu cầu có kháng thể trên bề mặt được bắt giữ phần lớn tại lách Cơ chế xuất hiện các tự kháng thể này vẫn chưa được xác định Có giả thuyết cho rằng các tự kháng thể này có thể xuất hiện sau khi nhiễm virus vài tuần, sau đó phản ứng chéo với kháng nguyên tiểu cầu [2]

Tiếp cận điều trị

7

Điều trị đặc hiệu: quyết định điều trị ITP nguyên phát phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của giảm tiểu cầu và nguy cơ chảy máu Lựa chọn đầu tay là glucocorticoid Trên các bệnh nhân không có đáp ứng đầy đủ, có thể điều trị bằng globulin miễn dịch đường tĩnh mạch (IVIg) hoặc anti-D immunoglobulin (bệnh nhân

Rh dương tính) [29] Biện pháp cắt lách được cân nhắc khi đã điều trị 6 tháng bằng glucocorticoid và các thuốc ức chế miễn dịch khác nhưng không hiệu quả [4] Với những bệnh nhân cắt lách thất bại, có thể lựa chọn phác đồ phối hợp glucocorticoid và thuốc ức chế miễn dịch Hiện có một số thuốc mới tác động trên thụ thể thrombopoietin, có tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu như romiplostim và eltrombopac, được sử dụng cho bệnh nhân ITP nguyên phát kháng thuốc có tăng nguy

cơ chảy máu [29]

Điều trị hỗ trợ: truyền khối tiểu cầu được chỉ định khi có xuất huyết hoặc khi không có xuất huyết nhưng số lượng tiểu cầu < 20 000/mm3 máu (ưu tiên truyền khối tiểu cầu gạn tách từ một người cho) Nếu số lượng tiểu cầu < 10 000/mm3 máu và xuất huyết nặng thì kết hợp truyền khối tiểu cầu, glucocorticoid liều cao (hoặc IVIg hoặc anti-D immunoglobulin) và acid tranexamic [4]

Điều trị ITP thứ phát có thể kết hợp giữa điều trị căn nguyên và liệu pháp điều trị

sử dụng cho ITP nguyên phát Đối với giảm tiểu cầu do thuốc nghiêm trọng, truyền tiểu cầu có thể làm giảm nguy cơ chảy máu, trong khi hiệu quả của IVIg, steroid và thay huyết tương chưa được xác định [29]

1.1.4.2 Sốt xuất huyết

Sốt xuất huyết Dengue là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Dengue gây nên Virus Dengue có 4 týp là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4 với trung gian

truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti Bệnh sốt xuất huyết Dengue có biểu hiện lâm sàng

đa dạng, tiến triển nhanh Bệnh thường khởi phát đột ngột và diễn biến qua ba giai đoạn: giai đoạn sốt, giai đoạn nguy hiểm và giai đoạn hồi phục Giảm tiểu cầu là một đặc trưng phổ biến và gắn liền với các giai đoạn của bệnh Giai đoạn đầu số lượng tiểu cầu bình thường hoặc giảm dần (nhưng còn trên 100 000/mm3), đến giai đoạn nguy hiểm (thường vào ngày thứ 3-7 của bệnh) số lượng tiểu cầu giảm dưới 100 000/mm3,

có thể có các dấu hiệu xuất huyết da, niêm mạc, tiêu hóa Giai đoạn hồi phục, số lượng tiểu cầu dần trở về bình thường [5]

8

Trong bệnh sốt xuất huyết, có sự giảm số lượng tiểu cầu kèm theo bất thường chức năng tiểu cầu

Cơ chế giảm tiểu cầu

Hai cơ chế có thể liên quan đến giảm tiểu cầu do sốt xuất huyết là ức chế tủy xương sản xuất tiểu cầu và tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi [33]

- Ức chế tủy xương sản xuất tiểu cầu: sau 2 đến 4 ngày nhiễm virus Dengue, tủy xương bị ức chế dẫn đến giảm sản xuất tiểu cầu Virus Dengue gây ức chế quá trình sản sinh tế bào nhân khổng lồ trực tiếp bằng cách gây nhiễm và ức chế tế bào tiền thân tạo máu; hoặc gián tiếp thông qua ức chế tế bào đệm, là tế bào có chức năng biến đổi tính đặc hiệu của cytokin trong tủy xương DEN-4 lan truyền trong các tế bào tủy xương và thay đổi khả năng tăng sinh của chúng Ngoài ra, virus Dengue còn có thể xâm nhập vào tế bào đệm và gây ức chế quá trình tạo máu [33]

- Tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi:

+ Cơ chế tự miễn dịch: kháng thể kháng virus Dengue tạo ra phản ứng chéo với tiểu cầu, tạo điều kiện loại tiểu cầu khỏi tuần hoàn

+ Tăng tương tác của tiểu cầu với bạch cầu và tế bào nội mô: các tế bào nội mô

bị nhiễm virus làm tăng khả năng kết dính với tiểu cầu Đồng thời, khi nhiễm virus Dengue, có sự kết tập tiểu cầu với bạch cầu, từ đó gây giảm tiểu cầu

+ Rối loạn chức năng tiểu cầu: hiện tượng giảm kết tập tiểu cầu trong sốt xuất huyết có thể liên quan đến việc nhận dạng protein disulfid isomerase (PDI) trên bề mặt tiểu cầu bằng kháng thể kháng NS1 Ngoài ra, hiện tượng này được cho là do tăng vận chuyển L-arginin và tạo nitric oxyd trong tiểu cầu

+ Virus Dengue tương tác trực tiếp với tiểu cầu: virus Dengue làm thay đổi hình thái của tiểu cầu, làm tăng biểu hiện P-selectin và fibrinogen trên bề mặt tiểu cầu ARN của virus và một số hạt virus được phát hiện trong tiểu cầu gây rối loạn chức năng tiểu cầu và giảm tiểu cầu

+ Các chất trung gian hòa tan: Các chất trung gian kích hoạt tiểu cầu và gây giảm tiểu cầu thường xuất hiện trong bệnh sốt xuất huyết Các sản phẩm phân hủy fibrin và các phức hợp thrombin/antithrombin thường tăng sau sốt xuất huyết Yếu tố von Willebrand cũng tăng lên, làm tăng hoạt hóa tiểu cầu Một loạt các cytokin, như yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và interleukin-1β (IL-1β) cũng được tạo ra trong sốt xuất

9

huyết Các cytokin này có liên quan đến khởi phát và điều hòa huyết khối, cầm máu Mức tăng TNF-α và IL-1β ở bệnh nhân sốt xuất huyết có mối tương quan với giảm tiểu cầu [33]

Tiếp cận điều trị

Chủ yếu là điều trị triệu chứng và theo dõi chặt chẽ nhằm phát hiện sớm sốc để

xử trí kịp thời [5]

Điều trị xuất huyết nặng:

- Truyền máu và các chế phẩm máu: khi người bệnh có sốc cần phải tiến hành xác định nhóm máu để truyền máu khi cần Truyền khối hồng cầu hoặc máu toàn phần sau khi đã bù đủ dịch nhưng sốc không cải thiện, hematocrit giảm xuống nhanh (mặc

dù còn trên 35%) hoặc xuất huyết nặng

- Truyền tiểu cầu: khi số lượng tiểu cầu xuống nhanh dưới 50 000/mm3 kèm theo xuất huyết nặng Nếu số lượng tiểu cầu dưới 5 000/mm3 mặc dù chưa có xuất huyết có thể truyền tiểu cầu tùy từng trường hợp cụ thể

- Truyền huyết tương tươi, đông lạnh: xem xét truyền khi người bệnh có rối loạn đông máu dẫn đến xuất huyết nặng [5]

1.2 Các mô hình gây giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm

Hiện nay, một số nhóm mô hình đã được sử dụng để mô phỏng các cơ chế bệnh sinh khác nhau của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm, bao gồm gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu, dùng kháng thể kháng tiểu cầu, gây nhiễm virus Dengue trên động vật và một số mô hình mô phỏng các rối loạn hiếm gặp như giảm tiểu cầu do heparin

Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu

Hầu hết các tác nhân hóa trị liệu có tác dụng không mong muốn là ức chế tủy xương, dẫn đến giảm các tế bào máu bao gồm tiểu cầu [60] Thách thức với việc lựa chọn các tác nhân này trong các mô hình gây giảm tiểu cầu thực nghiệm bao gồm giảm tiểu cầu nghiêm trọng, kéo dài và gây độc tính quá mức trên động vật thí nghiệm

1.2.1.1 Gây giảm tiểu cầu bằng Cyclophosphamid

Cyclophosphamid (CPA) là một tác nhân alkyl hóa kìm tế bào, có hoạt tính chống khối u và ức chế miễn dịch Bản thân cyclophosphamid không có hoạt tính nên không có tác dụng tại chỗ Để tạo ra tác dụng, CPA cần được chuyển hóa qua hệ

10

cytochrom P450 ở gan tạo thành các chất chuyển hóa có hoạt tính là aldophosphamid

và phosphoramid mustard Các chất chuyển hóa này liên kết đồng hóa trị với những gốc guanin trên phân tử ADN, tạo liên kết chéo giữa hai sợi ADN, do đó ngăn chặn sự sao chép và phiên mã ADN, đồng thời khởi phát quá trình chết tế bào CPA ức chế chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là các tế bào tủy xương dẫn đến giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu và thiếu máu [3], [32]

Trên thực nghiệm, CPA thường được sử dụng trong các mô hình gây giảm tiểu cầu trên động vật nhờ khả năng gây giảm tiểu cầu ổn định và ít gây biến đổi hình thái và cấu trúc của tiểu cầu [32], [59] Mức độ gây giảm tiểu cầu của CPA phụ thuộc vào liều Một nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu trên chuột cống trắng đã sử dụng CPA tiêm dưới da trong 3 ngày liên tiếp với các mức liều 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg,

150 mg/kg cân nặng, trong đó cả 4 mức liều CPA đều bắt đầu gây giảm tiểu cầu vào ngày thứ 7, tuy nhiên đến ngày thứ 8, tất cả động vật thí nghiệm sử dụng CPA mức liều

100 và 150 mg/kg cân nặng đều đã chết [37] Trái lại, một số nghiên cứu khác đã sử dụng các mức liều cao của CPA lên tới 50 và 100 mg/kg nhưng không ghi nhận chuột chết Trong nghiên cứu sử dụng CPA mức liều 50 mg/kg, số lượng tiểu cầu được xác định vào các ngày 1, 4, 7 và 11, kết quả số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm rõ rệt vào ngày

11 [49] Với nghiên cứu sử dụng CPA liều 100 mg/kg, thời gian giảm tiểu cầu kéo dài từ ngày 7 đến khi kết thúc nghiên cứu (ngày 15) nhưng không xác định được thời điểm số lượng tiểu cầu phục hồi [17] Một nghiên cứu khác đã sử dụng CPA với liều 25 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp và số lượng tiểu cầu được xác định vào ngày 1, 4, 7, 11, kết quả số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm từ ngày 4 kéo dài đến ngày 11 [23]

Trong các nghiên cứu trên, mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA đã được

sử dụng để nghiên cứu tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu của một số dược liệu

như lá đu đủ (Carica papaya), xuyên tâm liên (Andrographis Paniculata) và ổi (Psidium guajava)

1.2.1.2 Gây giảm tiểu cầu bằng busulfan

Busulfan là tác nhân alkyl hóa và có tác dụng ức chế chọn lọc trên tủy xương Ở liều thấp, thuốc ức chế quá trình tạo bạch cầu hạt và ức chế cả quá trình tạo tiểu cầu nhưng với một mức độ yếu hơn Với liều cao hơn, thuốc ức chế mạnh tủy xương dẫn đến giảm toàn bộ các tế bào máu Ức chế tủy xương do busulfan có thể kéo dài hoặc

11

không hồi phục được [3]

Cho đến nay, nhiều mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan đã được xây dựng trên các loài động vật khác nhau như thỏ, cừu và chuột cống [39], [40], [64] Trên chuột cống, busulfan đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu trong một số nghiên cứu đánh giá tác dụng của thuốc kích thích tiểu cầu cũng như những khía cạnh sinh bệnh học khác nhau của giảm tiểu cầu Trong những nghiên cứu này, busulfan thường được dùng theo đường tiêm màng bụng vào ngày 0, 3 hoặc tiêm dưới da vào các ngày 1, 5,

10, 15 Trong nghiên cứu được thực hiện bởi Yang C và cộng sự, busulfan được tiêm màng bụng với các mức liều 10, 15, 20 mg/kg lặp lại vào ngày 0 và 3, tương ứng với tổng liều busulfan là 20, 30 và 40 mg/kg Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các động vật thí nghiệm được tiêm busulfan với tổng liều 30 và 40 mg/kg ban đầu xuất hiện giảm tiểu cầu vào ngày thứ 7 Tuy nhiên, tất cả động vật thuộc 2 lô này đều tử vong trong khoảng thời gian từ ngày 12 đến ngày 16 của nghiên cứu Với mức liều 20 mg/kg, số lượng tiểu cầu của chuột tiêm busulfan bắt đầu giảm từ ngày 9, đạt đáy vào ngày 13 và tiếp tục duy trì khoảng 1 tuần sau đó trước khi có xu hướng hồi phục Tất

cả chuột tiêm busulfan với tổng liều 20 mg/kg đều còn sống đến cuối nghiên cứu [46], [64] Những kết quả này được tái khẳng định trong nghiên cứu của Okamura Y và cộng sự, trong đó, chỉ có busulfan với tổng liều 20 mg/kg (trong khoảng liều từ 20 - 40 mg/kg) chia làm 2 lần (ngày 0 và 3) có thể gây giảm tiểu cầu rõ rệt nhưng đồng thời không gây chết động vật thí nghiệm [43] Dựa trên 2 công bố này, các nghiên cứu sau

đó đều sử dụng mức liều 10 mg/kg busulfan tiêm màng bụng, chia làm 2 lần cách nhau

3 ngày để gây giảm tiểu cầu trên chuột cống và thu được những kết quả khá tương đồng Thời gian duy trì giảm tiểu cầu kéo dài từ ngày 10 đến ngày 20 của nghiên cứu với mức giảm thấp nhất là trên 90 % so với nhóm chứng [57], [63]

Ngoài ra, một chế độ liều khác của busulfan cũng được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá tác dụng kích tích tăng tiểu cầu của dịch chiết lá đu đủ Trong nghiên cứu này, busulfan được tiêm dưới da vào các ngày 1, 5, 10, 15 với liều 5 mg/kg Mẫu máu được lấy vào ngày trước khi tiêm busulfan và vào ngày thứ 20 sau khi tiêm busulfan Chế độ liều này gây giảm rõ rệt số lượng tiểu cầu vào ngày thứ 20, tuy nhiên không xác định được thời điểm tiểu cầu bắt đầu giảm cũng như sự biến thiên số lượng tiểu cầu theo thời gian [68]

12

1.2.1.3 Gây giảm tiểu cầu bằng carboplatin

Carboplatin là thuốc chống ung thư dẫn chất platin Carboplatin tạo liên kết chéo

ở trong cùng một sợi hoặc giữa hai sợi của phân tử ADN, làm thay đổi cấu trúc và gây

ức chế tổng hợp ADN Tác dụng không mong muốn thường gặp trên máu của carboplatin là gây suy tủy xương, trước tiên dẫn đến giảm tiểu cầu, sau đó gây giảm bạch cầu, thiếu máu và xuất huyết [3]

Carboplatin đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu ở linh trưởng, chó, chuột nhắt

và chuột cống,chủ yếu để đánh giá các tác nhân kích thích tạo máu [18], [58]

Với mục đích theo dõi tình trạng thiếu máu do hóa trị liệu trên chuột cống, Woo

S và cộng sự đã tiến hành tiêm tĩnh mạch carboplatin liều duy nhất 60 mg/kg, sau đó theo dõi các thông số huyết học trong vòng 4 tuần để đánh giá sự thay đổi của các thông số huyết học theo thời gian Kết quả cho thấy carboplatin gây giảm tiểu cầu nghiêm trọng, xảy ra vào ngày 8-11 với tỷ lệ giảm hơn 90% so với nhóm chứng Tuy nhiên, số lượng tiểu cầu hồi phục tương đối nhanh Tại thời điểm ngày thứ 13, số lượng tiểu cầu đã tăng lên mức gần tương đương so với nhóm chứng [61]

Một nghiên cứu khác đã tiến hành triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng carboplatin để đánh giá tác dụng kích thích tăng tiểu cầu của dịch chiết lá đu đủ trong các dung môi khác nhau Trong nghiên cứu này, carboplatin được tiêm màng bụng với các mức liều 50, 100 và 150 mg/kg cân nặng để gây giảm tiểu cầu trên chuột cống Dựa trên độc tính và khả năng gây giảm tiểu cầu của các mức liều carboplatin, nghiên cứu đã chọn mức liều 50 mg/kg để gây giảm tiểu cầu và áp dụng mô hình này để đánh giá tác dụng kích thích tăng tiểu cầu của lá đu đủ [52]

1.2.1.4 Gây giảm tiểu cầu bằng hydroxyure

Hydroxyure là một thuốc điều trị ung thư có độc tính cao Một trong những tác dụng phụ của thuốc là ức chế tủy và gây suy tủy, làm giảm số lượng tiểu cầu [30]

Để gây giảm tiểu cầu trên chuột thí nghiệm, hydroxyure được hòa tan trong nước

và cho động vật uống với liều 1,5 mg/kg một lần duy nhất Sau đó, mẫu máu được thu thập vào các ngày 0, 3 và 6 Kết quả cho thấy có sự giảm số lượng tiểu cầu vào ngày 3

và ngày 6, với mức giảm tối đa đạt được tại thời điểm ngày thứ 6 [38] Mặt khác, hydroxyure liều duy nhất đường uống không gây ra bất kỳ dấu hiệu độc tính nào cũng như không ảnh hưởng rõ rệt đến cân nặng và các chỉ số sinh hóa máu như AST, ALT,

13

ure và creatinin huyết thanh [28] Tuy nhiên, kết quả từ một nghiên cứu khác cho thấy liều duy nhất 1,6 mg/kg hydroxyure làm giảm tiểu cầu rõ rệt vào ngày 1 nhưng không ảnh hưởng đến số lượng tiểu cầu vào ngày 3 và 5 Trái lại, nếu dùng hydroxyure với liều 1,6 mg/kg/ngày, lặp lại trong 5 ngày, sự giảm số lượng tiểu cầu được ghi nhận vào

cả 3 thời điểm đánh giá (ngày 1, 3 và 5) [30]

Mô hình gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động

1.2.2.1 Gây giảm tiểu cầu bằng huyết thanh kháng tiểu cầu

Huyết thanh từ động vật được miễn dịch với tiểu cầu của một loài khác đã được truyền vào loài cho để gây giảm tiểu cầu Đây là mô hình đã được sử dụng phổ biến từ những năm 1950 để nghiên cứu một loạt các khía cạnh liên quan đến chức năng tiểu cầu hoặc tương tác giữa tình trạng giảm tiểu cầu và các yếu tố sinh lý, bệnh lý và dược

lý Một số loài động vật như thỏ, chuột nhắt, chuột cống, cừu, lợn, ngựa, gia súc đã được sử dụng trong các mô hình nghiên cứu giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động Những nghiên cứu này nhằm giải thích các khía cạnh khác nhau về bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch và vẫn còn ứng dụng cho đến thời điểm hiện tại Ví dụ, những nghiên cứu trên mô hình động vật gây giảm tiểu cầu miễn dịch đã được sử dụng để đánh giá tác động của thrombopoietin; tác động đến quá trình phát triển dòng tế bào sản xuất tiểu cầu; ảnh hưởng đến thời gian chảy máu và đông máu; tác dụng làm giảm mức độ giảm tiểu cầu của cortison [53]

Phương pháp này có thể ngay lập tức gây giảm mạnh số lượng tiểu cầu, tuy nhiên thời gian duy trì tác dụng của một liều huyết thanh kháng tiểu cầu thường ngắn [18] McDonald T P và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của huyết thanh kháng tiểu cầu [41] Tiểu cầu chuột được thu thập từ khoảng 200 chuột đực bằng cách ly tâm vi sai, rửa ba lần trong amoni oxalat 1% và hai lần trong nước muối, sau đó tiếp tục cho vào nước (5% huyền phù) và đông lạnh Các tiểu cầu tinh khiết đồng nhất đã được rã đông và tiêm dưới da thỏ tại nhiều vị trí hai lần mỗi tuần trong 3 tuần Bảy ngày sau lần tiêm cuối cùng, thỏ bị chảy máu từ tĩnh mạch tai và huyết thanh được thu thập Sau

đó, kháng huyết thanh thu được được xử lý và loại bỏ các kháng thể kháng tiểu cầu chuột không đặc hiệu Tiêm màng bụng 0,1 ml huyết thanh thỏ kháng tiểu cầu chuột (RAMPS) vào mỗi chuột Kết quả là tiểu cầu chuột giảm sâu trong vòng 4 giờ sau khi tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu nhưng không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu và

14

bạch cầu Trong số 1095 chuột được tiêm RAMPS, 1044 chuột có số lượng tiểu cầu giảm từ 900 000 /mm3 xuống dưới 50 000 /mm3 sau 4 giờ Nguyên nhân có thể do RAMPS gây kết tập tiểu cầu dẫn đến phản ứng giải phóng - mất ADP tiểu cầu và có thể cả mucopolysaccharides [41]

1.2.2.2 Gây giảm tiểu cầu bằng kháng thể kháng tiểu cầu

Vào đầu những năm 1980, các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu người đầu tiên được phát triển và sau đó mở rộng sang các loài động vật khác như bò, chó và chuột Một trong những kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu chuột đầu tiên là MReg30 và đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động trên chuột thực nghiệm Sau

đó, một số kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu khác cũng được sử dụng với mục đích tương tự Đối với bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) ở người, đóng góp lớn nhất của các mô hình động vật giảm tiểu cầu miễn dịch gây ra bởi kháng thể đơn dòng là làm sáng tỏ các cơ chế tác dụng của IVIg (immunoglobulin đường tĩnh mạch) Nghiên cứu đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của IVIg chỉ ra rằng IVIg người có thể làm tăng số lượng tiểu cầu ở những chuột được gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động Các nghiên cứu sau đó cho thấy hiệu quả của IVIg là do ức chế thụ thể FcγIIb, đồng thời xác định được một số cơ chế khác của IVIg trong việc làm tăng số lượng tiểu cầu, cùng với đó là phát triển các liệu pháp tế bào mới cho ITP [53]

Để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động, chuột nhắt được tiêm màng bụng kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu (2 μg MWReg30 hoặc 10 μg 2C9.G2) Sau 24 giờ, lấy máu

từ tĩnh mạch đuôi để xác định số lượng tiểu cầu Với mô hình gây giảm tiểu cầu miễn dịch này, số lượng tiểu cầu giảm thoáng qua sau 24 giờ truyền kháng thể kháng tiểu cầu,

số lượng hồng cầu không bị ảnh hưởng Nếu được tiêm 24 giờ trước khi gây giảm tiểu cầu bằng kháng thể kháng tiểu cầu, IVIg sẽ có tác dụng bảo vệ chống lại giảm tiểu cầu gây ra do kháng thể kháng tiểu cầu Nghiên cứu cũng chứng minh rằng IgG đơn dòng có tính đặc hiệu với kháng nguyên đích tuần hoàn, có thể cung cấp một liệu pháp điều trị thay thế cho IVIg trong điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch [55]

Ưu điểm của việc sử dụng kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu là loại bỏ một số yếu tố gây nhiễu tiềm tàng có liên quan đến việc sử dụng huyết thanh kháng tiểu cầu, đặc biệt là tính biến thiên giữa các lô huyết thanh miễn dịch khác nhau và thiếu các đặc tính kháng nguyên tiểu cầu đặc trưng [53]

15

Các mô hình gây giảm tiểu cầu khác

1.2.3.1 Gây giảm tiểu cầu bằng virus Dengue

Một nghiên cứu đã chứng minh rằng có thể gây nhiễm virus Dengue-2 cho chuột qua đường tiêm tĩnh mạch dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu thoáng qua sau 10 – 13 ngày Hai tháng sau đó, những động vật này được tái nhiễm với cùng một lượng virus Dengue-2, giảm tiểu cầu tiếp tục được ghi nhận sau 10 ngày tái nhiễm virus Ngoài ra, còn có sự xuất hiện của kháng thể kháng tiểu cầu sau khi nhiễm virus Dengue, bắt đầu

từ ngày thứ 4 và duy trì trong 2-3 tuần Mô hình này có thể được sử dụng để nghiên cứu cơ chế bệnh sinh, đặc biệt là quá trình hoạt hóa miễn dịch trong nhiễm virus gây sốt xuất huyết [34]

1.2.3.2 Phương pháp chiếu xạ ion hóa

Một phương pháp khác để giảm tiểu cầu ở động vật là chiếu xạ [19], [22], [62] Cường độ và thời gian chiếu xạ phải được điều chỉnh một cách thận trọng để gây giảm tiểu cầu mà không gây ra độc tính quá mức dẫn đến tử vong Số lượng tiểu cầu thấp nhất xuất hiện từ 8 đến 14 ngày sau khi chiếu xạ Giảm bạch cầu thường xảy ra vài ngày sau khi chiếu xạ và thường xuất hiện trước khi tiểu cầu bắt đầu giảm [18]

1.2.3.3 Giảm tiểu cầu do heparin

Trước khi các kỹ thuật chuyển gen được sử dụng để chuyển các gen đặc hiệu của người sang động vật, rất khó mô phỏng giảm tiểu cầu do heparin (HIT) trên động vật Hoạt hóa tiểu cầu bởi các kháng thể HIT thường xảy ra thông qua các thụ thể FcγRIIA trên tiểu cầu Tuy nhiên, nhiều loài động vật, bao gồm cả chuột, thiếu thụ thể này Hơn nữa, kháng thể HIT của người nhận có phản ứng chéo rất yếu với phức hợp yếu tố 4 tiểu cầu - heparin Mặc dù vậy vẫn có những nghiên cứu đã gây giảm tiểu cầu thành công trên chuột không biến đổi gen bằng cách tiêm kháng thể kháng PF4/heparin từ huyết thanh bệnh nhân [18]

Phát triển một mô hình động vật có chứa các yếu tố cần thiết cho HIT trở nên dễ dàng hơn với việc sử dụng chuột chuyển gen Các dòng chuột chuyển gen khác nhau biểu hiện FcγRIIA tiểu cầu hoặc PF4 của người được lai tạo để tạo ra những chuột chuyển gen kép biểu hiện cả hai kháng nguyên này Khi những động vật này được tiêm KKO, một kháng thể đơn dòng hoạt hóa tiểu cầu nhận diện phức hợp PF4/heparin của người, đã ghi nhận sự giảm số lượng tiểu cầu và các biến cố huyết khối [18]

16

1.3 Đu đủ

Đặc điểm thực vật

Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn, họ đu đủ (Caricaceae) Cây

nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4 m Thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]

Đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ song nguồn gốc xuất hiện các giống trồng trọt vẫn chưa được rõ ràng Đu đủ chủ yếu được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, một số nước trồng đu đủ nhiều như Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Mianma, Malaixia (châu Á); Tazania, Uganda (châu Phi); Braxin, Equado, Hoa Kỳ (châu Mỹ); Úc, Niuzilan (châu Đại Dương) [13]

Ở Việt Nam, đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời gian cây được nhập vào Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tuy nhiên chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Những vùng trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hà Nam, Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Lái Thiêu, Tiền Giang, các tỉnh Tây Nguyên … [13]

Các bộ phận của cây đu đủ (quả, hoa, lá, rễ, nhựa từ quả) được dùng với nhiều mục đích khác nhau

Tình hình nghiên cứu trong nước

1.3.2.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ

Cho đến nay ở nước ta đã có một số công bố về các chất có trong lá đu đủ

Alkaloid carpain: năm 1983, Nguyễn Tường Văn và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpain trong lá đu đủ [14] Năm 2014, Hồ Thị Hà xác định được alkaloid mới từ lá đu đủ là carpainon, ngoài ra hai hợp chất danielon và apocynol A lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ [6]

Carotenoid: năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC để xác định thành phần một số carotenoid (beta-caroten, lutein, lycopen) có trong lá đu đủ Kết quả cho thấy hàm lượng % beta-caroten, lutein tương ứng là 57,059% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopen trong lá đu đủ [11] Triterpen: năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết

17

n-hexan của lá đu đủ, bao gồm: β- sitosterol, daucosterol, cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol là 2 triterpen lần đầu tiên được phân lập từ lá đu đủ [7]

1.3.2.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ

Năm 1999, Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của flavonoid chiết từ lá đu đủ Các tác giả thí nghiệm với 5 chủng vi khuẩn

và 2 chủng nấm gây bệnh Nồng độ flavonoid thí nghiệm là 0,4 mg/ml Kết quả, flavonoid trong lá đu đủ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn và nấm thử

nghiệm bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella

typhi T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [9]

Năm 2001, Phạm Kim Mãn đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng, làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [10] Năm 2006, Đỗ Thị Thảo đã xác định dịch chiết methanol của lá đu đủ chỉ có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư phổi LU (IC50 = 19,2 < 20 µg/ml) và không có hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-

7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7, đồng thời dịch chiết methanol cũng không có hoạt tính với tế bào gốc tách

từ phôi chuột [12]

Tuy nhiên năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2

của lá đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml) Hai hợp chất carpain và pseudocarpain phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) Đồng thời hai hợp chất này cũng gây độc với tế bào thường của người (tế bào NIH3T3) (IC50 từ 1,40 đến 1,88 µg/ml) [6]

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.3.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ

Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công bố về thành phần hóa học của lá đu

đủ Kết quả cho thấy trong lá đu đủ có các hợp chất như: tannin, alkaloid, saponin,

+ 1 alkaloid piperidin là carpain

+ 2 acid hữu cơ: acid malic và acid quinic

+ 5 dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malat, p-coumaroyl malat và feruoyl malat, tất cả đều là acid phenolic liên kết với acid malic bằng liên kết ester

+ 4 flavonol glycosid: quercetin-3-O-(2'',6''-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranosid (manghaslin), kaempferol-3-O-(2'',6''-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranosid (clitorin), quercetin-3-O-rutinosid (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin) [15]

1.3.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ

Trong y học cổ truyền, các bộ phận khác nhau của cây đủ đủ bao gồm lá, vỏ cây, quả, mủ, hoa, rễ, hạt có nhiều ứng dụng để điều trị một số bệnh Ở Jamaica, quả chín được sử dụng trong điều trị loét dạ dày mạn tính; ở Ấn Độ, quả chín cũng được dùng điều trị bệnh dạ dày, chứng khó tiêu, làm thuốc an thần, thuốc bổ Quả xanh được những thầy lang ở Pakistan sử dụng cho mục đích tránh thai Người dân ở Lào, Campuchia và Việt Nam sử dụng mủ để điều trị bệnh chàm và bệnh vảy nến Đặc biệt,

lá đu đủ có nhiều tác dụng: ở Úc sử dụng lá đu đủ trong bệnh dạ dày và ung thư, ở Ấn

Độ dùng khi đau bụng, sốt, phá thai, hen… [43]

Hoạt tính chống ung thư của lá đu đủ

Cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu khẳng định lá đu đủ có hoạt tính chống ung thư và tác động theo những cơ chế khác nhau Một nghiên cứu chứng minh trong lá đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) RIPs có khả năng gây độc tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 mg/ml và có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [51]

Nhiều nghiên cứu khác chứng minh dịch chiết nước lá đu đủ có tác dụng ức chế, tiêu diệt một số dòng tế bào khối u rắn (như ung thư dạ dày, ung thư tuyến tụy, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư tử cung) và tế bào tạo máu Cơ chế diệt tế bào ung thư có thể thông qua việc kích hoạt quá trình tự chết của tế bào ung thư Dịch chiết lá

đu đủ làm tăng hàm lượng các cytokin, hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào

Tác dụng kích thích tạo tiểu cầu

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy dịch chiết lá đu đủ có tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu, đặc biệt tại Ấn Độ, dược liệu này cũng đã được sử dụng như một thuốc điều trị hỗ trợ cho các bệnh nhân sốt xuất huyết [16]

Tác dụng kích thích tiểu cầu của lá đu đủ đã được đánh giá trên các mô hình động vật gây giảm tiểu cầu bằng busulfan và CPA [17], [23], [49], [68] Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết lá đủ đủ cũng làm tăng số lượng tiểu cầu trên chuột không gây giảm tiểu cầu [25]

Có những báo cáo ca sử dụng dịch chiết lá đu đủ có tác dụng làm tăng số lượng tiểu cầu ở một số bệnh nhân sốt xuất huyết giai đoạn nguy hiểm mà các kháng sinh và thuốc chống sốt rét không có hiệu quả, cũng như trên bệnh nhân xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch không đáp ứng với liệu pháp điều trị bằng thuốc [16], [31]

Tại Ấn Độ, đã có một nghiên cứu lâm sàng đánh giá ảnh hưởng của viên nang chứa cao chiết lá đu đủ đến số lượng tiểu cầu trên người Nghiên cứu thực hiện trên 2 nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết có giảm tiểu cầu, một nhóm được uống viên nang lá đu

đủ 500 mg/ngày kèm điều trị hỗ trợ (hạ sốt bằng paracetamol, truyền nước muối sinh

lý 0,9%, chống nôn) so với nhóm chứng chỉ điều trị hỗ trợ Kết quả ghi nhận được nhóm bệnh nhân dùng viên nang lá đu đủ có số lượng tiểu cầu tăng nhanh và cao hơn

so với nhóm chứng, đồng thời không phát hiện thấy bất kỳ tác dụng không mong muốn nào của viên nang lá đu đủ [27] Một nghiên cứu khác xác định hiệu quả của viên nang lá đu đủ trên bệnh nhân sốt xuất huyết cũng được thực hiện tại Indonesia Kết quả cũng cho thấy nhóm điều trị bằng viên nang chứa cao chiết lá đu đủ có số lượng tiểu cầu tăng đáng kể, giảm thời gian nằm viện so với nhóm chứng [65]

20

Các hoạt tính sinh học khác

Một số nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước và ethanol của lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa [20], [56] Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu sử dụng chất chiết thô và cho giá trị IC50 khá lớn với phần lớn các test chống oxy hóa

Lá đu đủ được chiết với dung môi ethyl acetat có khả năng ức chế cả 4 chủng vi

khuẩn Bacillus stearothermophilus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp và

Escherichia coli [50] Một nghiên cứu khác cho thấy lá đu đủ được chiết bằng các

dung môi: ethanol, methanol, ethyl acetat, aceton, chlorofom, ether dầu mỏ, hexan và nước đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Trong đó, dịch chiết chlorofom có

hoạt tính kháng vi khuẩn Micrococcus luteus mạnh nhất và dịch chiết aceton có hoạt tính kháng nấm Candida albicans mạnh nhất [21]

Một số nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol của lá đu đủ có tác dụng kháng viêm, làm giảm khối lượng và lượng dịch nhày của khối viêm trên chuột cống trắng [48]

21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1.1 Nguyên liệu

Lá cây đu đủ được thu hái tại Yên Sở, Hoàng Mai, Hà Nội vào tháng 11 năm

2017 Dược liệu được bỏ cuống, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ < 60oC, sau đó nghiền thành bột và rây qua rây 1 mm Bột lá đu đủ được đựng trong túi PE có mép kín, bảo quản nơi thoáng mát Mẫu dược liệu được ThS Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực vật,

Trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa học là Carica papaya L., họ Caricaceae

2.1.1.2 Quy trình chiết xuất:

- Hiệu suất chiết: 36,37%

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất cao lá đu đủ

22

2.1.1.3 Chuẩn bị mẫu thử

Pha dung dịch thử: phân tán cao khô trong nước cất đến những nồng độ thích hợp

để sử dụng cho động vật uống Liều dùng được biểu diễn theo khối lượng cao khô tuyệt đối

Các mức liều thử: hai mức liều thử gồm 800 mg/kg cân nặng và 1600 mg/kg cân nặng

Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng giống đực, chủng Wistar, khỏe mạnh, cân nặng khoảng 150 ±

20 g do Học viện quân Y cung cấp

Động vật được nuôi 1 tuần trước khi tiến hành nghiên cứu để thích nghi với môi trường và điều kiện nuôi dưỡng ta ̣i phòng thí nghiệm Trước và trong quá trình nghiên cứu, động vật được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.2.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

Hóa chất:

- Cyclophosphamid (biệt dược Endoxan 200mg, được sản xuất bởi công ty Baxter Oncology GmbH, Đức), đạt tiêu chuẩn phân tích, số lô sản xuất: 7D158, hạn dùng: tháng 04/2020

- Busulfan (Sigma-Aldrich, Mỹ), đạt tiêu chuẩn phân tích, số lô sản xuất: BCBS3842V, PCode: 101762928

- Thiopental (biệt dược Thiopental Injection BP 1g, được sản xuất bởi công ty Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Đức), đạt tiêu chuẩn phân tích, số lô sản xuất: F40912

- PEG 400, ether, Na2EDTA đạt tiêu chuẩn phân tích

23

2.2 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế thành 3 đợt thí nghiệm Hai đợt thí nghiệm đầu được thực hiện để triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu trên chuột cống trắng bằng CPA và busulfan, đợt thí nghiệm thứ ba để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá

đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA đã triển khai Nội dung chính của từng đợt thí nghiệm như sau:

Đợt 1: Khảo sát ảnh hưởng của CPA tiêm dưới da với các mức liều thay đổi từ 12,5 đến 100 mg/kg, lặp lại 3 ngày liên tiếp, đến số lượng tiểu cầu của chuột cống trắng theo thời gian Lựa chọn chế độ liều thích hợp với mục đích đánh giá tác dụng

Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu

Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA

Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá

đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA

Đánh giá

độc tính, tỷ

lệ chuột chết

Xét nghiệm công thức máu

Xác định thời gian đông máu, chảy máu

Triển khai mô

hình gây giảm

tiểu cầu bằng

busulfan

24

của thuốc

Đợt 2: triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan trên chuột cống trắng với hai chế độ liều khác nhau

Đợt 3: Trên chuột cống trắng được gây giảm tiểu cầu bằng CPA với chế độ liều

đã chọn, đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần lá đu đủ đến số lượng tiểu cầu tại các thời điểm xác định

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA trên chuột cống trắng

2.3.1.1 Thiết kế nghiên cứu

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô (9 động vật/lô), bao gồm lô chứng

và 4 lô được gây giảm tiểu cầu bằng CPA với các mức liều khác nhau Các chế độ liều CPA được thiết kế dựa trên các công bố trước đây, bao gồm 12,5, 25, 50 và 100 mg/kg cân nặng, tiêm dưới da lặp lại 3 lần trong 3 ngày liên tiếp [23], [37], [60], [67] Động vật thuộc lô chứng được tiêm nước muối sinh lý với thể tích tương đương

2.3.1.2 Xác định các thông số nghiên cứu

- Thể trạng động vật thí nghiệm: Trong và sau khi gây giảm tiểu cầu bằng CPA, định kì theo dõi tình trạng chung của chuột (tối thiểu 2 lần/ngày), bao gồm: hoạt động

tự nhiên, tư thế, đặc điểm lông và niêm mạc, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống, số lượng

và thời điểm động vật chết (trong trường hợp có động vật chết cần tiến hành mổ, ghi lại bất thường nếu có, chú ý hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là xuất huyết bàng quang)

ở mỗi nhóm Cân nặng của động vật được ghi nhận 2 lần mỗi tuần Để giảm thiểu nguy cơ động vật tử vong do nhiễm trùng liên quan đến giảm bạch cầu, nghiên cứu sử dụng trấu đã qua chiếu xạ, kết hợp thay trấu và vệ sinh lồng thường xuyên bằng ethanol 90%, dùng nước đun sôi để nguội cho động vật uống

- Xét nghiệm công thức máu: Mẫu máu được lấy tại thời điểm ngay trước khi tiêm CPA và định kì (hai lần/tuần) sau đó cho đến khi số lượng tiểu cầu phục hồi về giới hạn bình thường Tại các thời điểm lấy mẫu, 200 µl máu được rút từ tĩnh mạch đuôi chuột vào các ống eppendorf có chứa chất chống đông EDTA Sau đó, thực hiện xét nghiệm công thức máu trên máy huyết học tự động