Nghiên cứu nâng cao qui mô bào chế phức hợp phytosome quercetin

Hướng nghiên cứu tạo phức hợp giữa quercetin với phân tử phospholipid nhằm tăng sinh khả dụng của quercetin đang thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước.. Tron

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH VIẾT ĐẠT

NGHIÊN CỨU NÂNG QUI MÔ

BÀO CHẾ PHỨC HỢP PHYTOSOME QUERCETIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS.TS Vũ Thị Thu Giang

cô đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn ThS Nguyễn Hồng Trang về những chỉ bảo và

định hướng của cô cho đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế -

Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn

thành khóa luận này

Nhân đây tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong Ban giám hiệu, các phòng

ban và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi

trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động viên,

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, 10 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Trịnh Viết Đạt

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về quercetin 2

1.1.1 Nguồn gốc 2

1.1.2 Công thức hóa học 2

1.1.3 Tính chất lý hóa 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Dược động học 3

1.1.6 Chỉ định 4

1.1.7 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.8 Liều dùng 4

1.1.9 Một số chế phẩm chứa quercetin trên thị trường 4

1.2 Tổng quan về phytosome 5

1.2.1 Khái niệm phytosome 5

1.2.2 Thành phần cấu tạo của phytosome 5

1.2.3 Ưu nhược điểm của phytosome 7

1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome 7

1.2.5 Phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome 9

1.2.6 Phương pháp tính hiệu suất phytosome hóa 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.2 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 13

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

dung môi khác nhau 14

2.3.2 Bào chế phytosome quercetin 14

2.3.3 Phương pháp định lượng quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang 15

2.3.4 Phương pháp đánh giá sự tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome 16

2.3.5 Phương pháp tính hiệu suất tạo phức giữa quercetin và HSPC 17

2.3.6 Nghiên cứu độ ổn định của bột khô phytosome quercetin 17

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học 18

3.1.1 Phổ UV-VIS của quercetin, HSPC, phytosome quercetin trong ethanol 18

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng quercetin tự do, quercetin trong phức hợp phytosome quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang 19

3.2 Độ tan của quercetin, phytosome quercetin trong cloroform và ethylacetat 21

3.3 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức 22

3.3.1 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi cloroform 22 3.3.2 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi ethylacetat 23

3.4 Nghiên cứu bào chế phức hợp phytosome quercetin ở qui mô 500 g 27

3.4.1 Khảo sát thông số thời gian và nhiệt độ tiến hành phản ứng tạo phức giữa quercetin và HSPC 27

3.4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất tạo phức 27

3.4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất tạo phức 28

3.4.2 Bào chế phức hợp phytosome quercetin trên thiết bị cất quay ở qui mô 5 g 29

3.4.3 Bào chế phức hợp phytosome quercetin trên thiết bị cất quay qui mô 500 g 30

3.5 Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome 34

3.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 34

3.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR) 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

STT Viết tắt Từ/cụm từ viết tắt

1

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 13C ( Carbon-13

nuclear magnetic resonance)

2 ESI Kỹ thuật ion hóa phun mù electron (Electrospray

6 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine)

7 IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

8 IUPAC

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học cơ bản và Hóa học ứng dụng (International Union of Pure and Applied Chemistry)

9 MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy)

11 UV-VIS Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible)

12 TKPT Tinh khiết phân tích

13 TPCN Thực phẩm chức năng

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa quercetin có trên thị trường 4

Bảng 1.2 Các phương pháp bào chế phytosome 7

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 13

Bảng 3.1 Các pic trong phổ UV-VIS của quercetin và phytosome quercetin 18

Bảng 3.2 Kết quả độ hấp thụ quang học của dãy dung dịch chuẩn tại λ = 374 nm 20

Bảng 3.3 Độ tan bão hòa của quercetin, phức hợp trong cloroform, ethylacetat (n = 3) 21

Bảng 3.4 Kết quả tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi cloroform theo thời gian (n = 3) 22

Bảng 3.5 Kết quả tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi ethylacetat theo thời gian (n = 3) 24

Bảng 3.6 Nồng độ quercetin tự do trong ethylacetat theo thời gian siêu âm (n = 3) 25

Bảng 3.7 Nồng độ quercetin dạng tạo phức trong ethylacetat theo thời gian siêu âm (n = 3) 25

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tạo phức (n = 3) 27

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất tạo phức 29

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá bột phytosome của lô 1, lô 2, lô 3 32

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ ổn định của bột phytosome quercetin lô 1 sau 1 tháng 33

Bảng 3.12 Số sóng nhóm –OH trong phân tử quercetin, gốc N+(CH3)3, (RO)2PO2- 35

Bảng 3 13 Kết quả giải phổ MS của quercetin, HSPC và phức hợp 39

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử quercetin 2 Hình 1.2 Cấu trúc tiểu phân phytosome 5 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử HSPC 6 Hình 3.1 Phổ UV-VIS của dung dịch HSPC (a), dung dịch quercetin (b), dung dịch phytome quercetin (c) 19 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ 20 Hình 3.3 Hình ảnh dung dịch phytosome quercetin trong cloroform theo thời gian 23 Hình 3.4 Hình ảnh bột phức hợp sau bào chế 31 Hình 3.5 Phổ IR của quercetin dihydrat, HSPC, hỗn hợp vật lý quercetin và HSPC, phytosome quercetin 35 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR đoạn 9 - 13 ppm của quercetin và phytosome quercetin 36 Hình 3.7 Các pic m/z trên phổ MS của HSPC (a), quercetin (b), phức hợp phytosome quercetin (c, d, e) 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Quercetin là một flavonoid tự nhiên được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như: chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa hình thành khối u… Tuy nhiên do đặc điểm rất ít tan trong nước, phân tử có cấu trúc cồng kềnh nên phân tử quercetin được hấp thu rất kém qua niêm mạc đường tiêu hóa dẫn tới sinh khả dụng đường uống thấp

Hướng nghiên cứu tạo phức hợp giữa quercetin với phân tử phospholipid nhằm tăng sinh khả dụng của quercetin đang thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước Phân tử phytosome quercetin với cấu trúc gồm đuôi phosphatidyl thân dầu và đầu thân nước cholin gắn với dược chất Cấu trúc này của phân tử phytosome tương tự với màng tế bào, giúp phân tử phytosome dễ dàng đi qua màng tế bào nhờ đó tăng khả năng hấp thu qua niêm mạc ruột hoặc da dẫn tới tăng sinh khả dụng của quercetin Những năm gần đây, tại Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã có những nghiên cứu bào chế phức hợp phytosome quercetin Trong các nghiên cứu này, phytosome quercetin được bào chế dạng hỗn dịch và sử dụng phương pháp siêu ly tâm

để đánh giá hiệu suất tạo phức Tuy nhiên, hỗn dịch phytosome bào chế được trong các nghiên cứu này có nồng độ thấp (dưới 0,5%), qui trình bào chế gồm nhiều bước, hỗn dịch khó bảo quản vận chuyển, khó khăn trong việc đưa phytosome vào dạng bào chế thuốc rắn viên nén, viên nang Bên cạnh đó, phương pháp siêu ly tâm tách không đặc hiệu dạng tự do và dạng tạo phức

Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nâng qui mô bào chế phức hợp phytosome quercetin” với các mục tiêu chính như sau:

1 Nghiên cứu chọn được dung môi có khả năng hòa tan chọn lọc ứng dụng trong đánh giá hiệu suất tạo phức

2 Xây dựng qui trình bào chế phức hợp phytosome quercetin ở qui mô 500 g

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử quercetin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về quercetin

1.1.1 Nguồn gốc

Quercetin là flavonoid nhóm flavonol, có màu vàng nhạt đến vàng Được phát hiện

lần đầu tiên ở dạng aglycon của quercitrin có trong vỏ cây Quercus tinctoria Trong tự

nhiên, quercetin phân bố rất rộng rãi và được tìm thấy ở cả dạng tự do và glycosid, chẳng hạn dạng 3-glycosid tìm thấy trong ngô, hoa hòe… Dạng tự do có trong lá hành, trà xanh… Ngoài ra, quercetin còn được bán tổng hợp bằng cách thủy phân rutin [1]

- Bột kết tinh màu vàng xanh, hình kim

- Ở điều kiện thường tồn tại dưới dạng dihydrat, chuyển dạng khan ở 95 - 97oC

- Nhiệt độ nóng chảy 316 - 317oC [23]

- Độ tan:

+ 1 g quercetin hòa tan trong 290 ml ethanol ở nhiệt độ thường

+ Dễ tan trong dung dịch kiềm và cho màu vàng

+ Không tan trong nước [23]

 Tính chất hóa học:

- Tính oxy hóa: trong môi trường pH = 2, quercetin bị oxy hóa bởi H2O2 tạo ra quinon [28]

- Tính acid yếu: quercetin trong dung dịch ammoniac có màu vàng sáng [1]

- Phản ứng cyanidin: trong môi trường HCl, quercetin bị khử bởi magie tạo thành dẫn chất màu cyanidin clorid [5]

- Phản ứng với dung dịch FeCl3: thêm vài giọt FeCl3 5% vào dung dịch quercetin trong ethanol, lắc sẽ xuất hiện màu xanh [5]

- Phản ứng diazo hóa và azo hóa: thường sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc

kí đồ Thuốc thử là các amin thơm như acid sulfanilic, benzidin, p-nitroanilin [5]

1.1.4 Tác dụng dược lý

Quercetin có các tác dụng dược lý sau [8]:

- Chống dị ứng: quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ tế bào ưa base

- Giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch: quercetin tác động lên các gốc peroxid nên

ức chế sự hình thành của hydroperoxid, đồng thời tác động lên các gốc alkoxyl nên ngăn chặn sự oxy hóa của LDL-Cholesterol

- Chống oxy hóa mạnh: việc sản sinh ra nhiều gốc tự do là nguyên nhân gây ra sự lão hóa, đột biến, bất thường tế bào (ung thư) và các tác hại cho hoạt động sinh lý (như rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức năng gan, thận…) Quercetin là hoạt chất có khả năng chống oxy hóa thông qua việc thu dọn trực tiếp các gốc tự do; liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp để ngăn chặn phản ứng oxy hóa xảy ra và tăng cường chức năng của các chất chống oxy hóa nội sinh

- Trong điều trị ung thư: quercetin ngăn chặn quá trình sản xuất “mutant p53 protein”

và cản trở hoạt động của enzym tyrosin kinase, do đó làm chậm sự phát triển của bướu ung thư

- Điều trị bệnh gout: quercetin ức chế hoạt động của xanthin oxidase, enzym có vai trò xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric, nên làm giảm lượng acid uric trong máu

- Ngăn chặn các biến chứng của bệnh đái tháo đường: quercetin ức chế mạnh enzym aldose reductase – enzym có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol, một hợp chất liên quan chặt chẽ tới sự tiến triển các biến chứng của bệnh đái tháo đường (đục thủy tinh thể, tổn thương thần kinh, bệnh võng mạc đái tháo đường…)

1.1.5 Dược động học

Quercetin hấp thu kém qua đường tiêu hóa Trong huyết tương, 98% quercetin liên kết với protein, và được tìm thấy ở dạng liên hợp với acid glucuronic, sulfat và methyl,

hầu như không có dạng tự do Quercetin và dạng liên hợp của nó được chuyển hóa qua gan và từ gan có thể phân bố khắp các mô trong cơ thể nhờ các albumin huyết tương Thời gian bán thải của quercetin trong cơ thể là 25 giờ Chế độ ăn giàu mỡ, chất béo làm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian thải trừ của quercetin [15], [21]

1.1.6 Chỉ định

Phòng và điều trị bệnh dị ứng, một số loại ung thư (ung thư tiền liệt tuyến, ung thư

dạ dày, ruột kết…), các biến chứng của bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh gout, các bệnh về mắt (đục thủy tinh thể và thoái hóa điểm vàng…) [14]

1.1.7 Tác dụng không mong muốn

Rất ít xảy ra các tác dụng không mong muốn, thường gặp một số tác dụng phụ như: đau đầu, dị cảm (ngứa chân, tay…), khó thở, có thể gây suy thận ở liều rất cao [14]

1.1.8 Liều dùng

Lượng 15 – 40 mg quercetin mỗi ngày từ nguồn rau quả Đối với mục đích điều trị

dị ứng, chống viêm và một số bệnh khác, liều cao hơn được sử dụng Liều điều trị dao động từ 250 – 500 mg x 3 lần/ngày, tùy vào tình trạng sức khỏe của bệnh nhân Ví dụ trong tình trạng dị ứng, liều 250 - 600 mg/ngày và đối với bệnh mề đay mạn tính, liều

200 - 400 mg/ngày chia làm 3 lần/ngày được khuyến cáo [14]

1.1.9 Một số chế phẩm chứa quercetin trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa quercetin có trên thị trường

STT Tên chế phẩm

Hàm lượng quercetin

Thành phần Dạng bào

chế

Nhóm sản phẩm

1 Vital Nutrients 250 mg Quercetin Viên nang

TPCN

2 Quercetin Plus 500 mg Quercetin Viên nang

3 Quercetin Forte 500 mg Quercetin Viên nang

4 Thorne phytosome

quercetin 75 mg

Phytosome quercetin Viên nang Mặc dù, quercetin có nhiều tác dụng dược lý được biết đến: chống oxy hóa, giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngăn chặn biến chứng trong bệnh đái tháo đường… Tuy nhiên, từ bảng 1.1 có thể nhận thấy các chế phẩm chứa quercetin trên thị trường đều thuộc nhóm TPCN và chưa được sử dụng làm thuốc trong điều trị Bên cạnh nguyên nhân chưa đủ bằng chứng lâm sàng trên người, thì vấn đề quercetin hấp thu kém dẫn tới

sinh khả dụng thấp cũng là yếu tố cản trở ứng dụng quercetin với vai trò làm thuốc Hãng Thorne đã áp dụng công nghệ phytosome để sản xuất phytosome quercetin, và được thương mại dưới tên Thorne phytosome quercetin, mỗi viên nang cứng chứa 250

mg phytosome quercetin (tương đương 75 mg quercetin) So sánh với các chế phẩm chứa quercetin dạng viên nang cứng khác trên thị trường, nhận thấy liều dùng chứa quercetin dạng phytosome thấp hơn liều dùng chứa quercetin tự do 3 - 6 lần Điều này

có thể giải thích do phytosome quercetin có sinh khả dụng cao hơn quercetin tự do nhờ tăng hấp thu qua niêm mạc ruột và giảm chuyển hóa bước 1 qua gan…[15], [21] qua đó liều sử dụng giảm

1.2 Tổng quan về phytosome

1.2.1 Khái niệm phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc hoạt chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử Nó có cấu trúc tương tự màng tế bào, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [9], [26]

1.2.2 Thành phần cấu tạo của phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc hoạt chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử cho nên phytosome được coi là một phân tử mới có các

tính chất vật lý, hóa học… riêng

Cấu tạo của một phân tử phức hợp phytosome gồm hai phần: phospholipid và hoạt chất dược liệu Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro được chứng minh bằng các dữ liệu phổ H-NMR, FTIR, MS…[9], [11], [12], [20]

Hình 1.2 Cấu trúc tiểu phân phytosome

Phospholipid

Phân tử phospholipid có cấu trúc gồm một đầu phân cực (nhóm phosphat) và một

đầu không phân cực (đuôi acyl của acid béo) [16]

- Phân loại phospholipid: dựa vào alcol trong cấu trúc của phân tử phospholipid mà

phân thành hai nhóm glycerophospholipid và sphingomyelin [16]

+ Glycerophospholipid: là thành phần phospholipid chính trong tế bào eukaryote

Với khung xương sống là phân tử glycerol Dựa theo đầu phân cực gắn vào nhóm phosphat glycreophospholipid được chia thành nhiều loại như: phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), acid phosphatidic (PA)…

+ Sphingomyelin: có khung cơ bản là sphingosin Phân tử sphingomyelin đầu tiên

được làm rõ cấu trúc là N-acylsphingosin-1-phosphatidylcholin

- HSPC (Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine):

+ Về mặt cấu trúc HSPC thuộc nhóm glycerophospholipid Tuy nhiên theo nguồn gốc HSPC là một phospholipid bán tổng hợp được điều chế bằng cách hydro hóa liên kết đôi trong phân tử phosphatidylcholin

+ Ưu điểm của HSPC trong bào chế phytosome: HSPC có độ tinh khiết cao, bền vững hóa học hơn các phospholipid khác; đuôi acyl của HSPC được bão hòa giúp hạn chế quá trình peroxid hóa, giúp ổn định sản phẩm phytosome quercetin [16] Mặt khác,

về mặt thể chất HSPC có thể chất khô xốp nên bột phytosome quercetin được bào chế

có thể chất khô tơi, không bị dễ hút ẩm, bết dính như khi dùng lecithin

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử HSPC

1.2.3 Ưu nhược điểm của phytosome

Ưu điểm:

Theo các tài liệu [9], [20], [26] phytosome có các ưu điểm sau:

- Phytosome dễ tan trong cả dung môi thân dầu và thân nước Do đó, tăng khả năng hấp thu hoạt chất, tăng sinh khả dụng qua đường uống, qua da, giảm liều cần dùng và tăng hiệu quả điều trị

- Do hình thành liên kết hóa học giữa phân tử phospholipid và hoạt chất nên phytosome có độ ổn định hơn liposome

- Hiệu quả nạp thuốc cao

- Phytosome có thể làm tăng thời gian bán thải của một số hợp chất, giúp tăng thời gian lưu của chất đó trong cơ thể và qua đó tăng tác dụng sinh học

- Tác dụng hướng đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào

- Phytosome được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực mỹ phẩm do có khả năng tăng tính thấm của hoạt chất qua da, nhờ vào đặc tính thân dầu của phytosome giúp hoạt chất dễ dàng vượt qua lớp màng sinh học

Nhược điểm: hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung

môi hữu cơ độc hại như dichloromethan, methanol… để hòa tan phospholipid và hoạt chất trong quá trình phản ứng tạo phức hợp, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường

1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome

Để bào chế phytosome, các nhà khoa học thường áp dụng 3 phương pháp sau [13], [17], [20]:

- Phương pháp bốc hơi dung môi

- Phương pháp kết tủa trong dung môi

- Phương pháp siêu tới hạn

Nguyên tắc, ưu nhược điểm của mỗi phương pháp được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Các phương pháp bào chế phytosome

Phương

pháp Bốc hơi dung môi

Kết tủa trong dung

môi Siêu tới hạn

Nguyên

tắc

Phản ứng tạo phức hợp phytosome giữa dược chất hoặc cao dược liệu

Phản ứng tạo phức giữa dược chất hoặc cao dược liệu và

Tương tự phương pháp kết tủa trong dung môi Trong đó

với phospholidpid được tiến hành trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ

và thời gian thích hợp

Sau đó, dung môi được loại đi bằng phương pháp cất quay ở áp suất giảm Phytosome được nghiền, rây, đóng bao bì kín rồi bảo quản [13]

phospholipid được tiến hành trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Dung dịch sau phản ứng được cô đặc; sử dụng một đối dung môi

để làm kết tủa phytosome (thường dùng n-hexan) Lọc, thu lấy phần kết tủa

Phytosome được sấy, nghiền, rây, đóng bao

bì và bảo quản [13]

đối dung môi là một chất lỏng đặc biệt tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn (thường dùng CO2) Quá trình kết tủa phytosome được thực hiện bằng kỹ thuật SEDS (solution enhanced disperssion by supercritical fluids) hoặc GAS (gas antisolvent

precipitation) [17]

Ưu điểm

- Thiết bị, quá trình thực hiện đơn giản

- Dễ nâng cấp qui mô

- Thu hồi dung môi giúp giảm chi phí, giảm giá thành sản phẩm

- Thiết bị đơn giản, dễ thực hiện

- Dung môi kết tủa

- Qui trình nhiều bước, thủ công, khó áp dụng trong công nghiệp

- Dung môi kết tủa là n-hexan độc hại, đắt tiền

- Thiết bị và kỹ thuật hiện đại, đắt tiền

Trong ba phương pháp trên thì phương pháp bốc hơi dung môi được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome Trong giai đoạn tiến hành phản ứng hình thành phức hợp phytosome giữa phân tử phospholipid và quercetin, dung môi

thường được sử dụng trong các nghiên cứu là hỗn hợp dicloromethan và methanol Tuy nhiên, việc sử dụng hỗn hợp hai dung môi này có nhiều nhược điểm như: độc hại với con người, gây ô nhiễm môi trường, không kinh tế khi nâng cấp qui mô Vì những lý do trên, đã đặt ra yêu cầu sử dụng một dung môi khác “thân thiện” hơn Ethanol là một dung môi xanh, ít độc hại đã được nghiên cứu ứng dụng trong bào chế phytosome Năm

2015, Maryana và cộng sự đã tiến hành bào chế phytosome silymarin trong ethanol bằng phương pháp bốc hơi dung môi [18], Chen Jy và cộng sự (2015) đã nghiên bào chế phytosome (-)-epigallocatechin gallat trong ethanol và tiến hành xác định khả năng chống oxy hóa của phức hợp này; kết quả chỉ ra phức hợp phytosome (-)-

epigallocatechin gallat làm tăng khả năng chống oxy hóa của dược chất trên mô hình in

vitro [10] Trong nước, tác giả Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự (2015) tiến hành nghiên

cứu bào chế phytosome curcumin trong ethanol [3] Các nghiên cứu bào chế phytosome quercetin của tác giả Vũ Thị Thu Hà (2016) [2], Bùi Mai Hương (2017) [4], Cồ Thị Oanh (2017) [6] đều tiến hành phản ứng tạo phức trong môi trường ethanol Kết quả chỉ ra: ethanol là dung môi thích hợp cho phản ứng tạo phức giữa quercetin và phospholipid

Vì vậy, lựa chọn ethanol là dung môi thực hiện phản ứng tạo phức hợp phytosome quercetin và phương pháp bào chế: bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay trong đề tài

“Nghiên cứu nâng qui mô bào chế phức hợp phytosome quercetin”

1.2.5 Phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome

Trong các nghiên cứu về phytosome, đa phần các tác giả đều sử dụng các phương pháp như: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhận (1H-NMR, 13C-NMR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), phân tích phổ nhiễu xạ tia X để chứng minh khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid [6], [12], [24], [26]

Tuy nhiên cũng có những nghiên cứu sử dụng ba phương pháp: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhận (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng (MS) để chứng minh

sự hình thành phức hợp phytosome giữa phospholipid và các flavonoid [11] Đây cũng

là ba phổ được sử dụng phổ biến trong xác định cấu trúc của một chất mới trong tổng hợp hóa dược Vì vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tạo phức giữa quercetin

và HSPC dựa trên 3 phương pháp phổ: phổ IR, phổ 1H-NMR, phổ MS

1.2.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Nguyên lý của phương pháp: trong phân tử, nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng, nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử [7] Khi tạo thành phức hợp, đầu phân cực phân tử phospholipid (nhóm phosphat và hoặc nhóm amonium) liên kết với nhóm –OH của dược chất tạo sự tương tác liên phân tử, làm dịch chuyển bước sóng hấp thụ của các nhóm chức đó Dựa vào những thay đổi trên phổ hồng ngoại của mẫu phức hợp so với mẫu dược chất và phospholipid ta có thể dự đoán khả năng tương tác giữa dược chất và phospholipid

1.2.5.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Nguyên tắc: các hạt nhân có spin khác 0 sẽ tự quay quanh trục của nó, khi điện tích hạt nhân chuyển động trên một vòng tròn sẽ xuất hiện một từ trường Trong điều kiện bình thường, các vectơ từ sắp xếp hỗn động do đó từ trường bị triệt tiêu Khi có một từ trường mạnh Bo tác động lên hạt nhân, các vectơ từ sẽ sắp xếp song song với từ trường ngoài theo 2 chiều khác nhau: cùng chiều - ứng với mức năng lượng thấp và ngược chiều

- ứng với mức năng lượng cao Khi đặt hạt nhân vào một vùng từ trường xoay chiều B1

vuông góc với Bo và có tần số thích hợp sẽ xảy ra hiện tượng cộng hưởng từ Khi đó vectơ từ sẽ chuyển mức năng lượng để sắp xếp theo cùng một hướng Quá trình đó hấp thu năng lượng Đo năng lượng hấp thu và tần số cộng hưởng từ sẽ xây dựng được phổ cộng hưởng từ hạt nhân [7]

Mục đích: khi hình thành phức hợp giữa quercetin và HSPC sẽ làm thay đổi trường điện từ của một nhóm chức nào đó và làm độ dịch chuyển hóa học của nhóm đó thay đổi Dựa vào đó, có thể biết thông tin về những tương tác đã xảy ra [6], [12], [24]

1.2.5.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc: phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành từ pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng dalton Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thống thiết bị bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số pic có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ Nó cung

cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

Kỹ thuật ion hóa phun mù electron (ESI) là kỹ thuật ion hóa được sử dụng phổ biến trong thiết đo phổ khối lượng: ở ESI, dung dịch chứa mẫu được phun ra khỏi đầu mao quản vành vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển) Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua có điện thế cao dọc theo bề mặt của nó, và những giọt nhỏ tích điện được tách ra và đi vào buồng ion hóa Các giọt tích điện tiếp xúc với dòng khí khô (thường là nitơ), làm bay hơi các phân tử dung môi ra khỏi mẫu Điện tích của các ion sinh ra khi sử dụng ESI không nhất thiết phản ánh trạng thái điện tích của mẫu trong dung dịch Điện tích chuyển tới các phân tử mẫu (thường ở dạng proton) được tạo ra từ

sự tổ hợp nồng độ điện tích trong các giọt mẫu trong quá trình bay hơi của aerosol và các quá trình điện hóa xuất phát từ thế tĩnh điện của mao quản

Kỹ thuật ion hòa phu mù electron (ESI) có nhiều ưu điểm:

+ Áp dụng được với cả các hợp chất khó bay hơi

+ Hợp chất không bền với nhiệt

+ Nghiên cứu được các phân tử nhỏ có trọng lượng phân tử nhỏ trong khoảng

100 – 1500 và cả các phân tử sinh học lớn như protein…

Mục đích: dựa vào phổ khối lượng của hoạt chất, phospholipid và phức hợp xác định được khối lượng phân tử của hoạt chất, phospholipid, phức hợp tương ứng Trong đó khối lượng phân tử phức hợp bằng khối lượng phân tử của hoạt chất cộng khối lượng phân tử phospholipid Từ đó chứng minh có sự hình thành liên kết hóa học giữa hoạt chất và phospholipid; đồng thời cũng cho thông tin về tỉ lệ phản ứng giữa dược chất : phospholipid là 1 : 1 [11]

1.2.6 Phương pháp tính hiệu suất phytosome hóa

Đối với nghiên cứu bào chế phytosome quercetin nói riêng và bào chế phytosome nói chung, đa phần các nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu ly tâm để đánh giá hiệu suất phytosome hóa

- Về nguyên tắc: dược chất dạng tự do tồn tại ở dạng kết tinh có tỷ trọng lớn hơn dược chất dạng tạo phức hợp với phospholipid Dùng lực ly tâm để tách riêng dược chất

dạng tự do và phytome

- Để định lượng quercetin gắn với phospholipid trong phytosome ta cần phải loại bỏ quercetin ở dạng tự do bằng cách ly tâm phytosome với vận tốc 5000 vòng/phút trong

thời gian 10 phút, ở nhiệt độ 25°C Quercetin tự do sẽ bị lắng xuống đáy ống ly tâm, phần dịch phía trên chứa phytosome quercetin Định lượng quercetin trong phần dịch phía trên bằng phương pháp thích hợp Dựa trên kết quả định lượng quercetin toàn phần

và quercetin trong phức hợp tính được hiệu suất phytosome hóa

- Hiệu suất phytosome hóa được xác định bằng công thức:

H% = 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎứ𝑐 ℎợ𝑝

𝑙ượ𝑛𝑔 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 x 100%

- Tính hiệu suất tạo phức theo phương pháp này có thể mắc một số sai số do:

+ Hoạt chất dạng tự do ở kích thước nhỏ không bị loại khi ly tâm

+ Tiểu phân phytosome có kích thước lớn bị lắng xuống đáy ống ly tâm sau quá trình ly tâm

+ Có thể có một tỷ lệ dược chất dạng tự do bị nạp vào bên trong cấu trúc tiểu phân phytosome

+ Phụ thuộc vào quá trình đồng nhất kích thước tiểu phân

Vì vậy, cần thiết tìm ra một phương pháp xử lý mẫu mới, thích hợp hơn cho phép tính hiệu suất phytosome hóa

Trong vài nghiên cứu về phytosome cao bạch quả đã áp dụng phương pháp dùng một dung môi hòa tan chọn lọc phức hợp phytosome, dạng tự do không tan sẽ bị loại bỏ bằng phương pháp lọc Ví dụ, cloroform là một dung môi không phân cực hòa tan chọn lọc phytosome cao bạch quả, được ứng dụng để tính hiệu suất tạo phức hợp phytosome giữa các flavonoid có trong cao bạch quả với phospholipid [25], [27] So sánh với phương pháp siêu ly tâm, phương pháp này có một số ưu nhược điểm sau:

+ Ưu điểm: khả năng tách được phức hợp và dạng tự do tin cậy hơn, áp dụng được với dạng bột khô…

+ Nhược điểm: tính chọn lọc không hoàn toàn của dung môi nên luôn gây ra sai số

hệ thống cho phương pháp, dung môi cloroform dễ bay hơi…

Nhằm áp dụng phương pháp trên trong tính hiệu suất phytosome hóa của phản ứng tạo phức giữa quercetin và HSPC Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu, lựa chọn dung môi có khả năng hòa tan chọn lọc phức hợp hoặc dược chất dạng tự do, để xây dựng phương pháp xử lý mẫu cho phép xác định hiệu suất tạo phức

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: phytosome quercetin

2.1.2 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

Các nguyên liệu sử dụng, nguồn gốc và tiêu chuẩn nguyên liệu được trình bày ở bảng

2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Phân tích kiểm nghiệm

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA RCT basic (Đức)

- Hệ thống cất quay Rapovapor R (Buchi – Đức), bình cầu dung tích 1 lít

- Hệ thống cất quay Rovapor R - 210 (Buchi - Đức), bình cầu NS 29/32 dung tích 20 lít (Buchi - Đức), sinh hàn (Buchi – Đức)

- Máy đo quang Hitachi U-5100 (Nhật Bản)

- Thiết bị siêu âm Qsonica Model CL-334

- Bể siêu âm Wise clean (Hàn Quốc)

- Máy bể lắc điều nhiệt WiseBath (Đức)

- Tủ sấy chân không Daihan Labtech

- Tủ lạnh Daewoo (Hàn Quốc)

- Tủ vi khí hậu DEAYANGETSTH – 180S (Hàn Quốc)

- Máy quang phổ hồng ngoại FTIR Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 (Đức)

- Máy đo khối phổ LTQ Orbitrap XLTM

- Cân phân tích Satorius BP121S, tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật, các dụng cụ thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp tính hiệu suất phytosome hóa

- Bào chế phức hợp phytosome quercetin với qui mô 500 g/mẻ

- Chứng minh sự hình thành phức hợp bằng sự kết hợp các phổ IR, 1H-NMR, MS

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định độ tan của quercetin, phytosome quercetin trong các dung môi khác nhau

Dựa vào các tài liệu tham khảo [2], [19], qui trình xác định độ tan của quercetin,

phytosome quercetin trong các môi trường cloroform, ethylacetat được thực hiện như sau:

- Cân lượng dư quercetin hoặc phytosome quercetin cho vào ống nghiệm dung tích 15

ml, thêm 10 ml môi trường thử, lắc liên tục trong 24 giờ ở 25oC với tốc độ 100 vòng/phút

- Sau đó đem ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 30 phút, phần dịch phía trên được lọc qua màng 0,22 µm

- Hút chính xác một thể tích dịch lọc, bốc hơi loại dung môi cloroform hoặc ethylacetat trong tủ sấy chân không ở 40oC trong 30 phút

- Hòa tan cắn thu được bằng ethanol, pha loãng đến nồng độ thích hợp, định lượng quercetin toàn phần bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang mô tả trong mục 2.3.3

2.3.2 Bào chế phytosome quercetin

Tham khảo tài liệu [2], [4], [6] chọn tỉ lệ phản ứng quercetin:HSPC = 1:1

Cách tiến hành:

- Cân, hòa tan quercetin và phospholipid trong một lượng ethanol thích hợp Tiến hành khuấy từ hồi lưu qua đêm ở nhiệt độ thích hợp với tốc độ khuấy phù hợp 550 vòng/phút

- Sau thời gian phản ứng, cất quay chân không ở điều kiện 40oC, áp suất 100 mbar

để loại dung môi, thu lấy bột phytosome, sấy khô qua đêm trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC để loại hoàn toàn ethanol còn lại

- Nghiền và rây bột phytosome qua rây 0,25 mm

- Bột rắn thu được đóng trong lọ thủy tinh, nắp cao su Bảo quản ở nhiệt độ thường

2.3.3 Phương pháp định lượng quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang

Dựa theo tài liệu tham khảo [22] định lượng quercetin dạng tự do và dạng tạo phức với phospholipid bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang được thực hiện như sau:

- Xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ quercetin tuyến tính 1 - 8 µg/ml

- Dung môi hòa tan: ethanol

- Từ dung dịch chuẩn gốc quercetin pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 µg/ml Dung môi pha loãng: ethanol

- Đo độ hấp thu quang tại bước sóng 374 nm, bề dày 1 cm, curvet thạch anh Xây dựng đường chuẩn độ hấp thụ theo nồng độ quercetin

 Mẫu thử

- Phép định lượng quercetin toàn phần: cân chính xác khoảng 10 mg quercetin hoặc phytosome quercetin vào bình định mức 50 ml Hòa tan bằng ethanol Thêm ethanol đến vạch, lắc đều Pha loãng đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính

- Định lượng quercetin trong tính hiệu suất phytosome hóa: dung môi hòa tan ethanol, pha loãng đến nồng độ tuyến tính được dung dịch thử

Đo độ hấp thu quang của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại bước sóng 374 nm, bề dày 1 cm, curvet thạch anh Xác định hàm lượng quercetin bằng phương pháp so sánh Hàm lượng quercetin trong mẫu = 𝐴𝑡

𝐴𝑐 × Cc × k Trong đó: + At: độ hấp thụ quang của mẫu thử

+ Ac: độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn

+ Cc: nồng độ dung dịch chuẩn

+ k: hệ số pha loãng

2.3.4 Phương pháp đánh giá sự tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome

 Phức hợp lấy ra dưới dạng bột khô ở phần 2.3.2 được tinh chế loại quercetin tự do dựa trên nguyên tắc: quercetin tự do tan tốt trong ethylacetat, phức hợp phytosome quercetin tan kém trong ethylacetat

- Cân khoảng 4 g bột phức hợp vào bình nón, thêm 100 ml ethylacetat Khuấy hồi lưu trong 24 h

- Để lắng, gạn bỏ phần ethylacetat phía trên, thêm 100 ml ethylacetat Khuấy hồi lưu trong 24 h tiếp theo

- Lọc lấy phần cắn Sấy trong tủ sấy chân không ở 40oC trong 24 h để loại hoàn toàn ethylacetat

 Sử dụng phức hợp đã tinh chế loại quercetin tự do để đánh giá tương tác giữa quercetin và HSPC bằng có phổ IR, H-NMR, MS

 Phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Lấy khoảng 5 - 10 mg mẫu bột đã làm khô, trộn đều và nghiền mịn với muối kali bromid, khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên mỏng Tiến hành quét phổ với viên nén thu được Tiến hành quét phổ IR của 4 mẫu: quercetin, HSPC, phytosome, hỗn hợp vật lý của quercetin và HSPC

 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR)

Hòa tan mẫu trong DMSO đã khử khí với nồng độ 20 mg/ml Cho dung dịch vào một ống thủy tinh chuyên dụng sao cho độ cao của mực chất lỏng khoảng 4,5 đến 5 cm sau đó đậy nắp kín lại Đặt ống thủy tinh vào buồng đo, tiến hành quét phổ ở 500 MHz

Đo 3 mẫu: quercetin, HSPC và phytosome quercetin

 Phân tích phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng (MS) được đo bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa – Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, hoạt động theo nguyên tắc ion hóa phun bụi điện tử (ESI).Xác định phổ MS của 3 mẫu quercetin, HSPC, phytosome ở cùng một điều kiện: dung môi ethanol, nhiệt độ ion hóa, áp suất, điện thế…

2.3.5 Phương pháp tính hiệu suất tạo phức giữa quercetin và HSPC

Tiến hành với dung môi cloroform, ethylacetat:

- Nguyên tắc: dùng dung môi thích hợp có tính hòa tan chọn lọc quercetin hoặc phức hợp phytosome quercetin để tách quercetin tự do hoặc phức hợp ra khỏi hỗn hợp Định lượng quercetin có trong dung môi bằng phương pháp đã mô tả trong mục 2.3.3

+ Cân chính xác một lượng bột phức hợp bào chế theo mục 2.3.2 vào bình định mức

+ Hút chính xác 1 ml dịch lọc vào cốc có mỏ Đem sấy trong tủ sấy chân không ở

40oC trong 1 h để loại hết cloroform hoặc ethylacetat

+ Hòa tan cắn trong cốc có mỏ bằng ethanol, chuyển dung dịch thu được vào bình định mức, pha loãng đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính 1-8 µg/ml Định lượng querctin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang mô tả trong mục 2.3.3

2.3.6 Nghiên cứu độ ổn định của bột khô phytosome quercetin

Bột phytosome bào chế được cho vào các lọ thủy tinh đậy nắp cao su kín, theo dõi

độ ổn định trong các điều kiện khác nhau:

- Điều kiện thực trong phòng thí nghiệm: nhiệt độ 20 – 35oC, độ ẩm tương đối

55 - 85%

- Trong ngăn mát tủ lạnh: nhiệt độ 4 - 8oC, tránh ánh sáng

- Ở điều kiện lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40oC ± 2oC, độ ẩm 75% ± 5%

Sau từng khoảng thời gian nhất định (2 tuần, 1 tháng…) đánh giá bột phức hợp về các chỉ tiêu: cảm quan; hàm ẩm; hàm lượng quercetin toàn phần; và hiệu suất phytosome hóa Sau đó, so sánh với kết quả đánh giá các thông số này khi mới bào chế phức hợp

để kiểm tra mức độ ổn định của bột phức hợp phytosme quercetin

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phầm mềm Excel 2013, được biểu thị số liệu dưới dạng 𝑋̅ ± SD Trong đó:𝑋̅ là giá trị trung bình; SD là độ lệch chuẩn

3.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học

3.1.1 Phổ UV-VIS của quercetin, HSPC, phytosome quercetin trong ethanol

 Chuẩn bị dung dịch mẫu của quercetin, phytosome quercetin, HSPC trong ethanol

 Cân 0,02 g quercetin vào bình định mức 20 ml Thêm ethanol hòa tan hoàn toàn quercetin, bổ sung dung môi đến vạch định mức được dung dịch A

- Hút 5 ml dung dịch A vào bình định mức 100 ml; thêm ethanol đến vạch được dung dịch B Hút 2 ml dung dịch B vào bình định mức 20 ml; thêm ethanol đến vạch

được dung dịch C có nồng độ quercetin 5 µg/ml dùng để quét phổ UV-VIS

- Hút 5 ml dung dịch A vào bình nón, thêm 0,0117 g HSPC và 20 ml ethanol Tiến hành phản ứng tạo phức với thông số nhiệt độ 80oC, thời gian 16 h, rpm = 550 vòng/phút Hết thời gian phản ứng, toàn bộ dung dịch trong bình nón được đưa vào bình định mức

100 ml, thêm ethanol đến vạch được dung dịch D Hút 2 ml dung dịch D vào bình định

mức 20 ml; thêm ethanol đến vạch được dung dịch E chứa phytosome quercetin có

nồng độ quercetin toàn phần 5 µg/ml (bằng dung dịch C)

 Cân chính xác 10 mg HSPC vào bình định mức 50 ml; hòa tan bằng ethanol Thêm ethanol đến vạch, lắc đều thu được dung dịch F có nồng độ HSPC 200 µg/ml Pha loãng

dung dịch F 20 lần được dung dịch H có nồng độ HSPC 10 µg/ml

 Phổ UV-VIS của dung dịch C, dung dịch E, dung dịch H

Tiến hành quét phổ UV-VIS của dung dịch C, dung dịch E, dung dịch H từ bước sóng 200 nm – 600 nm Mẫu trắng: ethanol Kết quả trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Các pic trong phổ UV-VIS của quercetin và phytosome quercetin

Cực đại hấp thụ (nm) A

Cực tiểu hấp thụ (nm)

Kết luận: khi hình thành phức hợp, HSPC không làm thay đổi tính chất hấp thụ quang học của quercetin Giải thích: bản thân phân tử HSPC không có liên kết bội trong phân

tử (do được hydro hóa khi sản xuất) nên HSPC không hấp thụ tia sáng có bước sóng >

300 nm và không ảnh hưởng đến hệ điện tử của quercetin Vì vậy, có thể định lượng quercetin trong phức hợp bằng cách đo độ hấp thụ UV-VIS trong dung môi ethanol mà không cần chất chuẩn phytosome quercetin hoặc phải phân hủy phức hợp giải phóng quercetin tự do

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng quercetin tự do, quercetin trong phức hợp phytosome quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang

Hình 3.1 Phổ UV-VIS của dung dịch HSPC (a), dung dịch quercetin (b), dung dịch phytosome quercetin (c)

theo mục 2.3.3 Từ dung dịch này pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt: 1 µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, 4 µg/ml, 5 µg/ml, 6 µg/ml, 7 µg/ml, 8 µg/ml Dung môi pha loãng: ethanol

- Đo độ hấp thụ quang của 8 dung dịch chuẩn này tại bước sóng 374 nm, bề dày curvet l = 1 cm, curvet thạch anh Kết quả trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả độ hấp thụ quang học của dãy dung dịch chuẩn tại λ = 374 nm

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ

Nhận xét: dựa vào đồ thị cho thấy dung dịch quercetin có nồng độ trong khoảng 1-8 µg/ml có mối quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ quang tại bước sóng λ = 374 nm với hệ

trong phytosome và quercetin dạng tự do

3.2 Độ tan của quercetin, phytosome quercetin trong cloroform và ethylacetat

Tiến hành thử độ tan của quercetin, phức hợp phytosome quercetin trong dung môi cloroform và ethylacetat theo mục 2.3.1 Trong đó, cloroform là dung môi hòa tan chọn lọc phytosome quercetin; ethylacetat là dung môi hòa tan chọn lọc quercetin dạng tự do Kết quả được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Độ tan của quercetin, phức hợp trong cloroform, ethylacetat (n=3)

A

Độ tan (µg/ml)*

Dung môi cloroform

+ Bản thân HSPC là chất diện hoạt nên có thể làm tăng độ tan của quercetin theo

cơ chế tạo micel Tuy nhiên dịch lọc thử độ tan bão hòa của phức hợp trong cloroform

anh Kết quả không tìm thấy tiểu phân trong dung dịch đo, count rate thấp Chứng minh hiện tượng tăng độ tan của quercetin sau tạo phức không theo cơ chế micel + HSPC là một chất không phân cực, rất dễ tan trong cloroform Vì vậy khi quercetin tạo phức với HSPC tạo thành một chất mới có độ phân cực phù hợp làm tăng độ tan của quercetin trong cloroform

- Dung môi ethylacetat: quercetin tự do có độ tan bão hòa trong ethylacetat cao hơn phức hợp quercetin-HSPC 88 lần

Như vậy: sau khi tạo phức với HSPC, tính chất độ tan của quercetin trong hai dung

môi cloroform và ethylacetat thay đổi nhiều Điều này cho phép sử dụng cloroform, ethylacetat để tách riêng phức hợp hoặc quercetin trong hỗn hợp phytosome bào chế theo mục 2.3.2 để xác định được hiệu suất phản ứng bằng cách định lượng quercetin có trong dung môi

3.3 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức

3.3.1 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi cloroform

Khảo sát sự ổn định của hỗn hợp quercetin, phức hợp trong cloroform theo thời gian

- Cân chính xác 0,01 g bột phức hợp bào chế theo mục 2.3.2 vào bình định mức 10

ml Thêm dung môi cloroform đến vạch Lắc đều Tại các thời điểm 10 phút, 30 phút,

60 phút lọc lấy 1,0 ml dịch lọc Bốc hơi hoàn toàn cloroform trong tủ sấy chân không

ở 40oC trong 1 h Hòa tan cắn bằng ethanol Định lượng quercetin bằng phương pháp đã mô tả trong mục 2.3.3

- Kết quả tính hiệu suất tạo phức với dung môi cloroform theo thời gian được trình

bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi cloroform theo thời gian

(n=3)

Thời điểm (phút)

V dịch lọc

(ml) P (%)

Hệ số pha loãng (k)

Hiệu suất tạo phức (H%)

Hình 3.3 Dung dịch phytosome quercetin trong cloroformm theo thời gian

Kết luận: không sử dụng dung môi cloroform để tính hiệu suất tạo phức

3.3.2 Xây dựng phương pháp tính hiệu suất tạo phức bằng dung môi ethylacetat

3.3.2.1 Khảo sát sự ổn định của hỗn hợp quercetin, phức hợp trong ethylacetat theo thời gian

- Cân chính xác 0,40 g bột phức hợp bào chế theo mục 2.3.2 vào bình định mức 20

ml Thêm dung môi ethylacetat đến vạch Lắc đều Tại các thời điểm 10 phút, 30 phút, 60 phút lọc lấy 1,0 ml dịch lọc Bốc hơi hoàn toàn ethylacetat trong tủ sấy chân không ở 40oC trong 1 h Hòa tan cắn bằng ethanol Định lượng quercetin bằng phương pháp đã mô tả trong mục 2.3.3

- Kết quả tính hiệu suất tạo phức với dung môi ethylacetat theo thời gian được trình bày ở bảng 3.5

Hiệu suất tạo phức (H%)

10 phút giống thời điểm 60 phút

- Thời điểm 10 phút so với thời điểm 30 phút: t = 0,306 < t0,025; 4 = 2,776

- Thời điểm 10 phút so với thời điểm 60 phút: t = 2,561 < t0,025; 4 = 2,776

Kết luận: chấp nhận giả thiết H1 và giả thiết H2 ở mức α > 0,05 Như vậy, sử dụng dung môi ethylacetat cho kết quả tính hiệu suất ổn định theo thời gian, không có hiện tượng phân hủy phức hợp làm tăng nồng độ quercetin tự do trong dung dịch

Kết luận: có thể sử dụng ethylacetat làm dung môi tách dạng quercetin tự do Thông qua việc định lượng quercetin tự do hòa tan trong ethylacetat để xác định hiệu suất tạo phức

3.3.2.2 Khảo sát thời gian xử lý mẫu bột trong ethylacetat bằng siêu âm

Tiến hành:

- Cân khoảng 0,4 g quercetin cho vào mỗi bình 1, 2, 3 thể tích 20 ml

- Cân khoảng 0,4 g phức hợp đã tinh chế theo mục 2.3.4 cho vào mỗi bình 1’, 2’, 3’ thể tích 20 ml

- Thêm dung môi ethylacetat vào cả 6 bình đến vạch định mức

- Đưa cả 6 bình vào bể siêu âm: bình 1 và 1’ siêu âm 10 phút; bình 2 và 2’ siêu âm 20 phút; bình 3 và 3’ siêu âm 30 phút

- Hết thời gian siêu âm, lấy bình ra khỏi bể siêu âm, điều chỉnh nhiệt độ về 25oC, thêm ethylacetat đến vạch, lắc đều