Tổng quan về thuốc sinh học tương tự và ứng dụng trong y dược

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Acid ribonucleic CHO cell ChineseHamster Ovary cell Tế bào buồng trứng của chuột h

HÀ NỘI - 2018

Người hướng dẫn:

PGS.TS Nguyễn Thị Lập

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được rất nhiều sự chỉ bảo, những lời khuyên cũng như sự động viên từ thầy cô, gia đình

và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Thị

Lập, giảng viên Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội Cô đã nhận

tôi vào bộ môn cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất để giúp tôi tiến hành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình, chị

Đinh Thị Hoa, em Lê Thị Ngọc Diễm, các chị em nhà 64 và bạn bè đặc biệt là

bạn Dương Thị Hồng Nhung, Phạm Đăng Lượng đã luôn bên tôi, ủng hộ và

động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi tôi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn

có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Đinh Thị Thảo

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TÌM HIỂU CÁC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG VIỆC CHẾ TẠO THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ 2

1 Các định nghĩa 2

1.1 Các định nghĩa của thuốc sinh học tương tự 2

1.2 Các định nghĩa liên quan 4

2 Một số đặc điểm của thuốc sinh học tương tự 9

2.1 Tổng quan về thay đổi trong và sau dịch mã……….10

2.2 Đặc tính lý hóa……… 12

3 Công nghệ sinh học trong chế tạo thuốc sinh học tương tự………….14

3.1 Công nghệ tái tổ hợp ADN ……….15

3.1.1 Nguyên tắc……… 15

3.1.2 Ứng dụng công nghệ tái tổ hợp trong chế tạo một số thuốc sinh học tương tự……… 17

3.1.2.1 Chế tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp………17

3.1.2.2 Chế tạo protein dung hợp Fc (Fc-fusion protein)………….21

3.2 Các hệ thống biểu hiện gen –tế bào chủ……….25

3.2.1 Hệ thống biểu hiện gen là tế bào vi khuẩn, nấm men……… 28

3.2.1.1 Một số dòng tế bào vi khuẩn, nấm men (gồm cả tế bào côn trùng) sử dụng hiện nay.……… 28

3.2.1.2 Ưu, nhược điểm……… 29

3.2.2 Hệ thống biểu hiện gen là tế bào động vật……… 30

3.2.2.1 Một số dòng tế bào động vật sử dụng hiện nay…….30

3.2.2.2 Ưu, nhược điểm……… 31

3.2.3 Hệ thống biểu hiện gen là tế bào thực vật……… 32

3.2.3.1 Một số dòng tế bào thực vật sử dụng hiện nay…… 32

3.2.3.2 Ưu, nhược điểm……… 33

CHƯƠNG II: QUÁ TRÌNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ……… 35

1 Vấn đề chất lượng, an toàn và hiệu quả………35

2 Quy trình đánh giá……… 35

2.1 Hướng dẫn của các cơ quan quản lý……… 35

2.2 Các kỹ thuật và phương pháp phân tích đặc tính……… 38

CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA CÁC THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ TRONG Y – DƯỢC……… 41

1 Sự phát triển của thuốc sinh học tương tự trong điều trị………41

2 Vấn đề ngoại suy chỉ định và vấn đề khả năng hoán đổi với sản phẩm của nhà phát minh trong điều trị……… 44

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN……… 47

1 Về định nghĩa và các công nghệ chế tạo………47

2 Về quy trình đánh giá chất lượng……… 49

3 Về ứng dụng của thuốc sinh học tương tự………49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

ARN Ribonucleic acid Acid ribonucleic

CHO (cell) ChineseHamster Ovary (cell) Tế bào buồng trứng của chuột

hamster Trung Quốc

CM Chemical modification thay đổi hóa học

CMC chemistry, manufacturing, and

control

Hóa học, sản xuất và kiểm soát E.coli Escherichia coli vi khuẩn Escherichia coli

EMA European Medicines Agency Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu

Fc Fragment crystallizable Mảnh có thể kết tinh được

FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm và

dược phẩm G-CSF Granulocyte-colony

stimulating factor

Yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt

HEK Human Embryonic Kidney

Cells

Tế bào thận người chưa phát triển

IgG Immunoglobulin G Kháng thể immunoglobulin G mAb

(mAbs)

Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng

P/GP Protein / Glycoprotein Protein / Glycoprotein

PTM/CTM Post-translational

modification/ Co-translational modification

Biến đổi sau dịch mã/ biến đổi trong dịch mã

TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 So sánh thuốc sinh học và thuốc hóa dược 5

1.3 So sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 27 1.4 Một số thuốc sinh học tương tự được EMA phê duyệt sử

dụng hệ biểu hiện là vi khuẩn E.coli

28

1.5 Một số thuốc sinh học tương tự sử dụng CHO làm hệ biểu

hiện

30

2.1 Các vấn đề được đưa ra trong hướng đẫn đánh giá về chất

lượng được ban hành bởi EMA và FDA

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.2 Đa dạng chức năng của protein dung hợp chứa Fc 22

1.4 Biểu đồ hệ thống biểu hiện gen được sử dụng trong sản

xuất các thuốc đã được phê duyệt (2006)

25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các thuốc sinh học đang được phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây, được sản xuất từ những tế bào sống bằng các công nghệ sinh học hiện đại, ứng dụng từ công nghệ tái tổ hợp ADN Ngày nay, các thuốc sinh học đang đóng vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị các bệnh nguy hiểm đe dọa tính mạng

và hiếm gặp như ung thư, đái tháo đường, thiếu máu, viêm khớp dạng thấp, đa xơ cứng bì,… kể từ lần đầu được phê duyệt bời FDA năm 1980, số lượng các thuốc sinh học phát minh ngày càng tăng và hàng chục thuốc đã và đang đối mặt với sự hết hạn độc quyền Theo đó, các thuốc sinh học tương tự cũng được mở đường

để đưa vào thị trường đầy tiềm năng này EU đã đi tiên phong trong việc thiết lập hàng rào tiêu chuẩn pháp lí cho các thuốc sinh học tương tự vào thị trường đánh dấu bởi sự phê duyệt biệt dược Omnitrope (chứa hoạt chất chính là Somatropin) vào 12/04/2006 Không thể phủ nhận rằng sự phát triển của ngành công nghiệp sản xuất thuốc sinh học tương tự đang có sức hút mạnh mẽ đối với các nhà nghiên cứu phát triển và nhà sản xuất dược phẩm trên thế giới Gắn liền với sự phát triển của các thuốc sinh học tương tự là việc ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại từ các giai đoạn sản xuất đến các bước đánh giá sự tương tự so với sản phẩm phát minh

Để có cái nhìn tổng quan và cập nhật về con đường phát triển của các

thuốc sinh học tương tự, đề tài “Tổng quan về các sản phẩm tương tự sinh học

và ứng dụng trong Y-Dược” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Giới thiệu được công nghệ chế tạo thuốc sinh học tương tự

2 Giới thiệu được quy trình đánh giá chất lượng các thuốc sinh học tương tự

3 Giới thiệu được ứng dụng của thuốc sinh học tương tự trong Y-Dược

CHƯƠNG I: ĐỊNH NGHĨA VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG VIỆC CHẾ TẠO THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ

1 Các định nghĩa

1.1 Các định nghĩa của thuốc sinh học tương tự

Từ năm 2001, các cuộc thảo luận về khuôn khổ pháp lý đối với thuốc sinh học tương tự nổi lên, sự ra đời của các thuốc sinh học tương tự là tất yếu theo nhu cầu của thị trường khi các thuốc sinh học phát minh đang trên đà hết hạn bảo

hộ bản quyền Thuốc sinh học tương tự ra đời mang lại lợi ích lớn nhất cho bệnh nhân là làm giảm đáng kể chi phí điều trị mà vẫn đảm bảo đạt được sự an toàn và hiệu quả điều trị

Thuốc sinh học tương tự xuất hiện trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau: tại Châu Âu nó xuất hiện với tên gọi là sản phẩm thuốc sinh học tương tự (similar biological medicinal product); tại Mỹ nó được gọi là thuốc sinh học theo sau (follow-on biologics) và Thuốc sinh học tương tự (biosimilars); WHO gọi các sản phẩm này là thuốc sinh học tương tự (2 tên gọi là similar biotherapeutic product-SBP hay Biosimilar); tại Brazil nó được gọi là thuốc sinh học (Biologic product); tại Ấn Độ là thuốc sinh học tương tự (similar biologic); tại Mexico là sản phẩm sánh ngang bằng thuốc sinh học (biocomparable); tại Canada là thuốc sinh học hạng mục nhập sau (subsequent-entry biological); tại Australia là Biosimilars; tại Việt Nam là sinh phẩm tương tự hay thuốc sinh học tương tự [30]

Trong định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi FDA trên website chính thức, một thuốc sinh học tương tự là một thuốc sinh học có độ giống cao

và không có những khác biệt có ý nghĩa trên lâm sàng với một thuốc tham chiếu đang lưu hành và đã được cấp phép bởi FDA FDA cũng giải thích hai tiêu chí, thứ nhất là “độ giống nhau cao” được chỉ ra bởi kết quả so sánh về các đặc tính như độ tinh khiết, xác định về hóa học và hoạt tính sinh học bằng các công nghệ hiện đại giữa thuốc sinh học tương tự và thuốc tham chiếu, những sự khác biệt

nhỏ về thành phần không có hoạt tính trên lâm sàng như chất ổn định, hệ đệm là

có thể chấp nhận và sẽ được định lượng cẩn thận bởi FDA Những khác biệt nhỏ xảy ra trong quá trình sản xuất như các biến thể có thể chấp nhận của hoạt chất cũng được chấp nhận và kiểm soát, điều chỉnh qua từng lô mẻ với cả thuốc sinh học tương tự và thuốc tham chiếu Thứ hai là cụm từ “không có những khác biệt

có ý nghĩa trên lâm sàng” được cụ thể là về an toàn, độ tinh khiết và hiệu quả (an toàn và hiệu lực) và được chỉ ra qua các nghiên cứu dược động học, dược lực học, đánh giá về tính sinh miễn dịch trên lâm sàng và cả nghiên cứu lâm sàng nếu cần

thiết [21]

Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi EMA một thuốc sinh học

có độ giống cao so với một thuốc sinh học khác đã được phê duyệt ở EU (thuốc sinh học tham chiếu) EMA cũng giải thích rằng: “độ giống cao” nghĩa của thuốc sinh học tương tự với thuốc tham chiếu về đặc tính lý, hóa, sinh học, và có thể có những khác biệt nhỏ so với thuốc tham chiếu nhưng chúng không có ý nghĩa trên lâm sàng về độ an toàn và hiệu quả [12]

Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi WHO năm 2009: thuốc sinh học tương tự là một thuốc sinh học tương tự về chất lượng, tính an toàn và hiệu quả so với một thuốc sinh học tham chiếu đã được cấp phép [42]

Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi Việt Nam: Sinh phẩm tương tự (còn gọi là thuốc sinh học tương tự) là thuốc sinh học có sự tương tự về chất lượng, an toàn, hiệu quả so với một thuốc sinh học tham chiếu [3]

Trong đó: Sinh phẩm tham chiếu (còn gọi là thuốc sinh học tham chiếu) là sinh phẩm được cấp phép lưu hành tại Việt Nam trên cơ sở có đầy đủ dữ liệu về chất lượng, an toàn, hiệu quả; Sinh phẩm (còn gọi là thuốc sinh học) là thuốc được sản xuất bằng công nghệ hoặc quá trình sinh học từ chất hoặc hỗn hợp các chất cao phân tử có nguồn gốc sinh học bao gồm cả dẫn xuất của máu và huyết tương người Sinh phẩm không bao gồm kháng sinh, chất có nguồn gốc sinh học

có phân tử lượng thấp có thể phân lập thành những chất tinh khiết và sinh phẩm

chẩn đoán in vitro [3]

Như vậy, qua các định nghĩa trên có thể rút ra rằng một sản phẩm được coi

là thuốc sinh học tương tự khi nó thỏa mãn 3 điều kiện sau:

(1): là một thuốc sinh học,

(2): có độ giống cao và không có những khác biệt có ý nghĩa về lâm sàng với thuốc tham chiếu,

(3): thuốc tham chiếu là một thuốc sinh học đã được cấp phép lưu hành

Độ giống cao là kết quả đánh giá dựa trên việc phân tích đặc tính chất lượng như cấu trúc, đặc tính lý hóa, hoạt tính sinh học, những khác biệt nhỏ sẽ được chấp nhận nhưng phải được chỉ ra và chứng minh là không có ý nghĩa trên lâm sàng

1.2 Các định nghĩa liên quan

Thuốc sinh học tương tự và thuốc generic đều là các phiên bản của thuốc phát minh được tung ra thị trường sau khi các thuốc phát minh hết hạn bảo hộ độc quyền và có thể là một lựa chọn khác tốt hơn cho bệnh nhân Thuốc sinh học tương tự và generic được phê duyệt thông qua các con đường quản lý khác nhau nhưng đều là con đường rút gọn không yêu cầu thử nghiệm lâm sàng đầy đủ tốn kém như với một thuốc mới [21] Nhưng thuốc sinh học tương tự không phải là sản phẩm generic và để tránh nhầm lẫn người ta không dùng thuật ngữ bio-generic Đó là do, thuốc sinh học tương tự có kích thước lớn, cấu trúc phức tạp

và không phải là bản sao nguyên của thuốc sinh học phát minh Thuốc sinh học

có bản chất là protein được sản xuất trong tế bào sống, qui trình sản xuất các thuốc sinh học rất phức tạp yêu cầu hàng trăm bước phân lập và tinh chế Với sản xuất một thuốc sinh học thì “quy trình sản xuất chính là sản phẩm” Trong thực

tế sản xuất không thể có một bản sao y nguyên của một thuốc sinh học, vì chỉ cần thay đổi quy trình một chút cũng có thể làm thay đổi sản phẩm cuối cùng Và một protein có thể bị biến đổi trong quá trình sản xuất (ví dụ: thêm chuỗi đường,

thay đổi cấu trúc protein dẫn đến mất cấu trúc xoắn…), quy trình khác nhau sẽ cho ra sản phẩm cuối cùng khác nhau làm ảnh hưởng đến tính hiệu quả và an toàn, và có thể ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của bệnh nhân Trong một vài trường hợp, ngay cả nhà phát minh ra sản phẩm đó cũng gặp phải những tình huống tương tự như thế [7]

Bảng 1.1: So sánh thuốc sinh học và thuốc hóa dược [5, 6]

Nội dung so

sánh

Thuốc hóa dược

Thuốc generic

Thuốc sinh học

Thuốc sinh học tương tự

Tổng hợp Tổng hợp

hóa học

Bản sao chép của công thức hóa học của nhà phát minh

Sản xuất dựa vào ứng dụng của công nghệ sinh học trong

tế bào chủ

Phát triển dựa trên phân tử thuốc sinh học của nhà phát minh

Đơn giản, đã được xác định các đặc tính lý hóa

Nhạy cảm với nhiệt và dễ biến đổi trong

quá trình vận chuyển

quá trình vận chuyển

Hoạt chất Không phải

là kháng nguyên, tồn tại độc lập,

độ tinh khiết về hóa học cao, tiêu chuẩn tinh khiết được thiết lập rõ ràng

Không phải

là kháng nguyên, tồn tại độc lập,

độ tinh khiết

về hóa học cao, tiêu chuẩn tinh khiết được thiết lập rõ ràng

Thường là hỗn hợp có tính kháng nguyên, nhiều đặc tính

và có thể thay đổi trong suốt quá trình phát triển, khó định chuẩn

Thường là hỗn hợp có tính kháng nguyên, nhiều đặc tính

và có thể thay đổi trong suốt quá trình phát triển, khó định chuẩn

Có nhiều kỹ thuật để xác định sự giống nhau giữa thuốc generic

và thuốc phát minh

Không yêu cầu Không có kỹ

thuật nhận dạng sự tương đồng về cấu trúc nên thử nghiệm lâm sàng là cần thiết

Ngoài ra, các nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự không được tiếp xúc với nguồn nguyên liệu sản xuất của nhà sản xuất thuốc phát minh cũng như quy trình sản xuất của họ Do đó nó được sản xuất hoàn toàn độc lập với thuốc phát minh, nguồn nguyên liệu, tế bào chủ hay quy trình đều có thể khác nên thuốc sinh học được sản xuất ra chỉ có thể có độ giống cao so với thuốc phát minh chứ không phải là bản sao y của thuốc phát minh Bảng 1 sẽ làm rõ hơn sự khác nhau này

Cũng cần phải phân biệt định nghĩa thuốc sinh học tương tự (biosimilars) với các loại thuốc sinh học khác (bảng 2)

Trước hết, thuốc sinh học tương tự không phải là thuốc sinh học thế hệ hai (second-generation biopharmaceuticals), những thuốc sinh học thế hệ hai có cấu trúc khác với thuốc phát minh, là phiên bản cải tiến nhưng vẫn giữ được cơ chế tác dụng

Thuốc sinh học tương tự cũng không phải là Biomimics (ví dụ: Reditux- một biomimics của Rituximab) - phiên bản sao chép có chủ đích - Biomimics là những sản phẩm sao chép không được phát triển, đánh giá hay phê duyệt bởi hướng dẫn qui định cho thuốc sinh học tương tự, sự giống nhau cũng không được nêu ra bởi các đánh giá so sánh toàn diện hay thang đánh giá; có thể có sự khác nhau về cấu trúc bậc 1 khi so sánh với thuốc sinh học tham chiếu và có thể khác với thuốc sinh học tham chiếu về công thức, liều, tính hiệu quả, độ an toàn và sự sinh miễn dịch của cơ thể

Thuốc sinh học tương tự cũng không phải là thuốc sinh học phiên bản tốt hơn (Biobetter) Biobetter là sản phẩm được thiết kế để cải thiện hiệu quả, tính

an toàn, dược động học hoặc khả năng sản xuất, vận chuyển Biobetter được coi

là thuốc mới và phải có đầy đủ hồ sơ bằng chứng nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng

Bảng 1.2: Phân biệt một số kiểu thuốc sinh học [55]

Giá cả hợp lý, chất lượng cao

Độ an toàn, hiệu quả không được so sánh nghiêm ngặt với thuốc phát minh Mục

tiêu

Thuốc mới có

mục tiêu mới

Mục tiêu giống với sinh phẩm gốc nhưng có cải thiện về hiệu quả/ an toàn…

Tương đương lâm sàng và sánh ngang được với sản phẩm phát minh

Mục đích là sao chép lại phiên bản của nhà phát minh Tập trung vào

sự tiếp cận của bệnh nhân và thị trường

thuốc sinh học tương tự

thuốc sinh học không phải thuốc phát minh khác

Sản phẩm có thể hoán đổi được (Interchangeable product) là thuốc sinh học tương tự thỏa mãn các yêu cầu bổ sung đề ra bởi Đạo luật Cạnh tranh về giá của các thuốc sinh học và Đổi mới (Biologics Price Competition and Innovation Act) Để hoàn thành các yêu cầu bổ sung này sản phẩm cần phải được chứng minh là sẽ mang lại kết quả trên lâm sàng giống như thuốc tham chiếu trên bất kỳ bệnh nhân nào Ngoài ra đối với sản phẩm không phải liều duy nhất thì phải được đánh giá nguy cơ về an toàn và hiệu quả khi chuyển đổi qua lại giữa sản phẩm đó và thuốc tham chiếu.Một sản phẩm có thể hoán đổi được có thể thay thế thuốc tham chiếu mà không cần hỏi ý kiến của người kê đơn [21]

2 Một số đặc điểm của thuốc sinh học tương tự

Để sản xuất được các protein và glycoprotein (P/GP) tái tổ hợp việc đầu tiên cần thực hiện đó là mô tả đặc điểm của cấu trúc và tác dụng của các phân tử nội sinh Đây là việc rất có ý nghĩa, trong khi trình tự gen sẽ xác định trình tự cơ bản của các acid amin nó sẽ giúp xác định được chính xác cấu trúc của phân tử hoạt chất Các thông số cần xác định đó là: cấu trúc của polypeptid (cấu trúc bậc hai, bậc ba, bậc 4), các đặc tính hóa học (điện tích, thân nước, kỵ nước), thay đổi sau dịch mã và thay đổi hóa học, và vi môi trường mà nó có thể hiện hoạt tính của mình Do đó, khi cố gắng tạo ra một phân tử nội sinh ngoài cơ thể có thể tạo

ra rất nhiều phân tử không đồng nhất trong suốt quá trình phân lập, tinh khiết và định tính

Trong thực tế, tương đồng về cấu trúc là mục đích của các nhà phát triển Chúng ta hi vọng rằng P/GP tái tổ hợp sẽ mang đặc tính sau dịch mã giống như phân tử nội sinh vì khi có sự thay đổi sau dịch mã không tự nhiên cơ thể sẽ nhận diện phân tử P/GP như một kháng nguyên và sinh ra kháng thể chống lại P/GP điều trị chúng ta đưa vào Nhưng không thể tránh khỏi sự khác nhau giữa phân tử tái tổ hợp và phân tử tự nhiên vì các phân tử protein tái tổ hợp được tổng hợp bởi các mô, tế bào không phải của con người ( ví dụ: tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc - CHO, tế bào u tủy chuột -NS0, tế bào ung thư tủy

Sp2/0,…), tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, sản phẩm của các tế bào nguyên vẹn

và bị suy yếu, trải qua giai đoạn sau lên men gồm các quá trình tinh chế, hoàn thiện công thức và điều kiện bảo quản Trong hệ thống biểu hiện là sinh vật nhân

sơ ví dụ như E.coli khi sản xuất quá nhiều protein trong một thời gian ngắn

chúng sẽ hình thành thể vùi là thể đậm đặc của protein cuộn gấp sai và không thể hoạt động chức năng nên chúng cần phải được hòa tan và tái cuộn xoắn trong ống nghiệm do đó sản phẩm có thể thiếu quá trình thay đổi sau dịch mã tự nhiên hoặc phải trải qua quá trình sửa sau dịch mã không tự nhiên

Thêm vào đó, để chỉ ra hiệu quả lâm sàng phục vụ cho quá trình phê duyệt công ty sản xuất của sản phẩm phát minh phải chỉ ra được đặc tính của sản phẩm

về cấu trúc và chức năng Nếu được phê duyệt các thông số được thành lập để định nghĩa sản phẩm cần được đảm bảo duy trì trong suốt tuổi thọ của thuốc, các thay đổi trong quy trình sản xuất sẽ được phê duyệt nếu có bằng chứng chỉ ra rằng không có ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và lợi ích của bệnh nhân

Bản sao chép của thuốc sinh học không thể xác định được cấu trúc, tuy nhiên, nó cần phải được chứng minh là có thể sánh được với thuốc phát minh So sánh về cấu trúc phải nhận biết được điểm khác nhau về cấu trúc giữa thuốc sinh học tương tự và biologics và phải chỉ ra rằng điểm khác nhau đó không ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị cũng như lợi ích của bệnh nhân [17]

2.1 Tổng quan về thay đổi trong và sau dịch mã

Các biến đổi về cấu trúc của protein được dự đoán bởi việc đọc khung trình tự gen thường được gọi chung là biến đổi sau dịch mã Tuy nhiên, các biến thể có thể xuất hiện từ giai đoạn sớm ví dụ bởi bắt cặp nhầm trong quá trình phiên mã, dịch mã của ADN, ARN, cấp độ acid amin Thông thường các biến đổi trong quá trình dịch mã hay sau dịch mã hay biến đổi hóa học bao gồm quá trình glycosyl hóa, phosphoryl hóa, sulfat hóa, glycan hóa, sự khử amid, sự khử amin Hơn nữa, hồ sơ cấu trúc có thể đa dạng về tuổi, giới tính, sức khỏe và tình trạng bệnh tật Bộ gen của con người gồm khoảng 21000 gen mã hóa protein, nhưng

thực tế có khoảng 1-2 triệu protein, do các thông số được đề cập phía trên cộng thêm sự biến đổi do hóa học và enzym trong cơ thể Theo lý thuyết, mỗi cá thể người nên thích ứng về miễn dịch với tất cả các phân tử trong hệ gen của chúng

ta, bao gồm cả những biến đổi sau dịch mã và biến đổi về hóa học Tuy nhiên, những hệ thống ngày nay có độ nhạy cao cho phép nhận ra kháng thể có ái lực thấp đến rất nhiều tự kháng nguyên trong mỗi cá thể Nghịch lý rằng, mặc dù mỗi

cá thể khỏe mạnh có các kháng thể tự nhận dạng miễn dịch của kháng nguyên giống hoặc gần giống, nhưng các kháng thể đặc hiệu có thể sẽ được khuếch đại khi bị bệnh và được coi là một dấu hiệu cho các thể bệnh riêng

Việc liệt kê các biến đổi trong và sau dịch mã (PTM/CTM) và biến đổi hóa học (CM) tạo ra các P/GP không đồng nhất được thực hiện bằng sự phát triển mang tính cách mạng trong khối phổ khối lượng và định lượng, định nghĩa của hơn 300 cấu trúc biến đổi sau dịch mã và biến đổi hóa học, phân tích của 530,264 trình tự trong cơ sở dữ liệu Swiss-Prot đã giúp xác định 87.308 PTM đã được xác định bằng thực nghiệm và 234.938 phân tử được cho là PTM Tiềm năng của sự phức tạp về cấu trúc và chức năng có thể được đánh giá cao từ thực

tế là bộ gen của con người mã hóa cho 518 protein kinase và 200 phosphatase CTM/PTM phổ biến thứ hai là sự glycosyl hóa Oligosaccharid có thể được gắn vào vị trí asparagin để tạo ra các glycoprotein liên kết N hoặc gắn vào các nhóm hydroxyl của serin, threonin hay tyrosin để tạo các dạng glycol- liên kết O Đầu liên kết N gồm hơn 500 cấu trúc oligosaccharid khác nhau, do đó có thể được gắn ở các vị trí glycosyl hóa khác nhau để tạo nên hơn 1000 dạng glycan khác nhau; kết quả của hoạt động của hơn 250 enzym vận chuyển gốc glycosyl

Ví dụ về sự đa dạng và phức tạp là kháng thể đơn dòng Một trình tự đầy

đủ của một phân tử IgG gồm khoảng 40 vị trí asparagin/glutamin; do vậy, sự khử amid ngẫu nhiên của một trong các vị trí đó sẽ làm xuất hiện 40 biến thể cấu trúc (các isoform); sự khử amid của 2 vị trí sẽ làm xuất hiện 40*40=1560 biến thể;…

Và cứ như thế với độ dài của cả một phân tử IgG khi được sửa sau dịch mã sẽ có

thể làm xuất hiện 108 isoform Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp có một thách thức duy nhất là chúng phải được đánh giá trên cơ sở từng trường hợp, mỗi thành phần được cấu tạo bởi hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ, có chuỗi hằng định duy nhất May mắn rằng công nghệ ngày nay cho phép sàng lọc và chọn sớm các dòng không có các vị trí acid amin dễ bị biến đổi sau dịch mã trong vùng xác định bổ sung của chúng, các tiêu chí khác có thể được lựa chọn và tối ưu độ tan,

độ ổn định,… Trình tự vùng cố định có thể cũng được lựa chọn (có thể là lớp Ig

và phân lớp) để xác định hợp chất/sản phẩm thuốc cuối cùng được phát triển Một thuốc muốn được công nhận là thuốc sinh học tương tự cần phải đưa ra được bằng chứng về sự so sánh ngang bằng về cấu trúc và chức năng [17]

2.2 Đặc tính lý hóa

Nhiều ý kiến cho rằng để so sánh thuốc sinh học tương tự và thuốc phát minh thì xây dựng dựa trên đặc tính lý hóa sẽ đem lại kết quả tin cậy hơn là các thử nghiệm lâm sàng hạn chế Thừa nhận rằng các thử nghiệm lâm sàng bao quát

và đắt đỏ mà nhà phát minh cần thực hiện để được phê duyệt sản phẩm không cần thiết phải áp dụng đối với phát triển thuốc sinh học tương tự Một thử nghiệm lâm sàng hạn chế có thể mang lại kết quả không đáng tin cậy do các bệnh đồng thời, sự khác biệt liên quan hay không liên quan giữa các bệnh nhân… Bước đầu tiên để phát triển một thuốc sinh học tương tự là tìm hiểu được các đặc tính của thuốc phát minh, sử dụng nhiều mẫu thu được từ các hiệu thuốc, từ đó

sơ bộ lựa chọn ra các dòng và cuối cùng là xác nhận khả năng so sánh của sản phẩm Bất lợi với các nhà phát triển là các kỹ thuật sử dụng và kết quả nghiên cứu đặc tính lý hóa của nhà phát minh không được công bố Nhà sản xuất và bệnh nhân có được nhiều lợi ích hơn nếu có sự giúp đỡ thành lập các kỹ thuật và quy trình đã được ứng dụng Sự sẵn có của nguyên liệu đối chiếu tiêu chuẩn đã phân tích đặc tính bằng phương pháp hiện đại, và sự sẵn sàng của các phòng thí nghiệm học thuật hay thương mại điều khiển từ bên ngoài đối với các quy trình nội bộ sẽ là một bước tiến lớn để đạt được mục đích trên [17]

Thử thách trong việc sản xuất thuốc sinh học tương tự so với Generic là xác định đặc tính lý hóa Ngay cả đối với nhà phát minh thuốc sinh học việc sản xuất nhất quán qua từng lô mẻ đã là điều rất khó nên đối với nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự để sản xuất được một sản phẩm tương tự là một thử thách rất lớn Đó là do các chi tiết bổ sung về sự không đồng nhất về cấu trúc hóa lý của một thuốc sinh học vượt ra ngoài những yếu tố chính đã được biết đến về thuốc phát minh: trình tự các acid amin trong chuỗi polypeptid của nó Thông tin về sự

đa dạng, không đồng nhất của phân tử thuốc sinh học trong một mẻ hay qua từng

lô mẻ chỉ được biết bởi nhà phát minh và cơ quan quản lý càng làm quy trình sản xuất thuốc sinh học tương tự khó khăn hơn việc sản xuất generic Thực tế là, đối với sản xuất generic một khi đã xác định được cấu trúc hóa học của sản phẩm hóa dược phát minh họ dễ dàng thiết kế lại được con đường tổng hợp để sản xuất

ra phân tử đó Nhưng đối với thuốc sinh học cấu trúc hóa học của trình tự acid amin của thuốc sinh học phát minh không phải là cấu trúc cuối cùng hoàn thiện của nó Từ góc nhìn hóa lý, một cấu trúc sinh học bao gồm một nhóm các biến đổi hóa học trong chuỗi polypeptid (bao gồm cấu trúc bậc 1 và các liên kết cộng hóa trị) và những thay đổi về cấu trúc vật lý đến cấp độ cuộn xoắn của nó (là kết quả của các sửa đổi hóa học và/ hoặc các thay đổi vật lý thay thế các liên kết bậc hai không hóa trị chịu trách nhiệm cuộn xoắn không gian ba chiều và sự ổn định của sản phẩm) Những thay đổi hóa lý bổ sung theo suốt chiều dài của các acid amin tạo nên một cấu trúc tổng thể cuối cùng của thuốc sinh học Tuy nhiên, sự xuất hiện của những thay đổi hóa lý bổ sung này không nhất thiết xuất hiện ở mỗi phân tử thuốc sinh học Sự thật là mỗi thay đổi về cấu trúc được phân bố đặc trưng độc lập giữa các phân tử, như vậy tỷ lệ các phân tử thuốc sinh học với mỗi thay đổi bổ sung là rất đa dạng, từ mỗi phân tử thuốc sinh học có tất cả các thay đổi quan sát được trong một mẫu đến một số phân tử chỉ có duy nhất một phần trong tổng số biến đổi quan sát được và những phân tử không chứa biến đổi nào trong các biến đổi quan sát được

Ngoài ra, một số biến đổi cấu trúc hóa học quan sát được có thể xảy ra ở nhiều vị trí trên một phân tử thuốc sinh học đưa ra một con đường khác về sự phân bố các thay đổi cấu trúc này Kết hợp tất cả những thay đổi này ở một mức

độ nhất định về sự đa dạng trong phân bổ các thay đổi về cấu trúc trong các phân

tử thuốc sinh học qua từng lô mẻ, và với vô số kiểu thay đổi khác nhau có thể xuất hiện, tạo ra nhiều quần thể các phân tử khác nhau hay các biến thể của thuốc sinh học Kết quả cuối cùng là một thuốc sinh học có thể được xem như một hỗn hợp không đồng nhất của các phân tử protein (hay còn gọi là proteform) khi so sánh với thuốc hóa dược sử dụng công nghệ tách hiện đại gọi là điện di mao quản (capillary electrophoresis -CE) Trong nhiều trường hợp, sự không đồng nhất này thường đươc gọi là sự không đồng nhất nhỏ (microheterogeneity) do kích thước tương đối nhỏ của các thay đổi hóa học bổ sung hay vùng mà sản phẩm chịu sự thay đổi hóa lý, đặc biệt là so với toàn bộ kích thước của phân tử sinh học Sự không đồng nhất này hay tập hợp rộng lớn các dạng biến thể của thuốc sinh học có thể được chia làm hai loại chính là các hợp chất gần với thuốc sinh học (drug-product-related substances) (có thể so sánh với dạng chính của thuốc sinh học về hiệu lực và an toàn) và các tạp chất liên quan (không có khả năng so sánh với dạng thuốc chính về hiệu lực và độ an toàn) Do vậy, nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự phải tìm ra sự phức tạp về cấu trúc chi tiết bổ sung này và sự đa dạng của nó quan từng lô mẻ (yếu tố làm tăng tính không đồng nhất cấu trúc của một thuốc sinh học phát minh) và sau đó nhân bản và kiểm soát thì mới thành công trong việc phát triển một sản phẩm thuốc sinh học tương tự [17]

3 Công nghệ sinh học trong chế tạo thuốc sinh học tương tự

Trong phạm vi các thuốc sinh học tương tự, các sản phẩm được thiết kế bởi công nghệ gen chủ yếu là các protein tái tổ hợp, bởi vì chúng được biểu hiện

và sản xuất bởi các hệ thống sinh học (ví dụ: vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật) đã được chèn trình tự gen cụ thể mã hóa cho protein mong muốn Hiện nay các hormone như insulin, hormon tăng trưởng, erythropoietin, yếu tố kích thích

tạo dòng bạch cầu hạt, kháng thể đơn dòng, protein dung hợp Fc được phát triển bởi các nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự nhờ công nghệ tái tổ hợp ADN

3.1 Công nghệ tái tổ hợp ADN

3.1.1.Nguyên tắc

Công nghệ tái tổ hợp ADN đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ bộ gen của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định [2]

7 giai đoạn chính của công nghệ tái tổ hợp ADN

Giai đoạn 1: phân lập vật liệu gen (ADN)

Acid nucleic là vật liệu gen có ở trong mọi cơ thể sống Trong hầu hết các

cơ thể sống chúng tồn tại ở dạng acid deoxyribonucleic hay còn gọi tắt là ADN ADN cần phải được tinh khiết khỏi các thành phần khác của tế bào như protein, RNA, enzym,… để có thể cắt lấy đoạn ADN mong muốn nhờ enzym cắt giới hạn

Để phân lập được ADN cần phải trải qua 3 bước:

Bước 1: Vì ADN được bao bọc bên trong màng nên để giải phóng ADN

cùng với các phân tử lớn khác như protein, polysaccharide và lipid, tế bào vi khuẩn, thực vật hay mô động vật cần được trộn với enzym lysozyme nếu là tế bào vi khuẩn, cellulose nếu là tế bào thực vật và chitinase nếu là nấm

Bước 2: loại bỏ RNA bằng enzym ribonuclease, loại bỏ protein bằng

enzym protease

Bước 3: loại bỏ các phân tử tạp khác ở các bước tinh chế ADN cuối cùng

khi thêm ethanol lạnh Thu lấy sợi ADN vẩn trong dung dịch

Giai đoạn 2: cắt đoạn ADN ở một vị trí xác định

Enzym giới hạn được ủ với ADN Tùy vào loại enzym mà tối ưu hóa điều kiện ủ

Giai đoạn 3: phân lập đoạn ADN mong muốn

Sử dụng điện di trên gel agarose, có thể kiểm tra hoạt động của enzym cắt giới hạn nhờ phương pháp này Vì ADN mang điện tích âm nó sẽ di chuyển về cực dương hay còn gọi là anod và ADN sẽ tách nhau ra trong quá trình nó di chuyển Sau quá trình điện di này đoạn ADN mong muốn sẽ được tách ra

Giai đoạn 4: Khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp hay PCR là kỹ thuật sao chép nhân bản ADN trong ống nghiệm Kỹ thuật này được phát triển bởi Kary Mullis năm 1985 và nhận giải Nobel hóa học năm 1993 PCR được sử dụng để khuếch đại gen mong muốn sử dụng 2 đoạn mồi primer

Giai đoạn 5: gắn mảnh ADN vào vector

Quy trình này yêu cầu một ADN vector và một ADN nguồn cho gen quan tâm Để hai ADN gắn được với nhau thì chúng nên được cắt bởi cùng một enzym cắt bên trong phân tử acid nucleic (gọi là endonuclease) Sau đó cả hai được ghép với nhau bằng cách trộn ADN vector, gen quan tâm và enzym ligase để tạo thành ADN tái tổ hợp hay ADN lai

Có ba nhóm vector chính được sử dụng trong tạo dòng ADN và nhân bản chúng trong tế bào vật chủ gồm: (1) nhóm plasmid; (2) nhóm phage/phagemid; (3) nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC và YAC) Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào vật chủ và mang được các gen cần chuyển Các vector chuyển gen phải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu sau:

- Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập

- Có các vị trí nhận biết đơn (SRS) nơi mà các enzym hạn chế nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép để tránh bị cắt nhầm

- Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gen ngoại lai

- Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể tế bào vật chủ

- Có các gen chỉ thị để dễ dàng phát hiện ra thể tái tổ hợp

Giai đoạn 6: chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ

Có rất nhiều phương pháp để chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhưng cần phải chắc rằng tế bào chủ có khả năng tiếp nhận ADN tái tổ hợp Nếu một ADN tái tổ hợp chứa gen kháng kháng sinh ví dụ như ampicillin được chuyển

vào tế bào E.coli thì tế bào chủ này sẽ biến thành tế bào kháng ampicillin Gen

kháng ampicillin trong trường hợp này được gọi là một marker có thể lựa chọn Sau khi các tế bào biến đổi chúng được nuôi cấy trong thạch agar chứa ampicillin, chỉ những tế bào đã biến đổi thành công sẽ tiếp tục phát triển, những tế bào khác

sẽ bị chết

Giai đoạn 7: Lấy hoặc nuôi trồng sản phẩm gen ngoại lai

Khi chèn một mảnh ADN ngoại lai vào một vector tạo dòng và chuyển nó vào tế bào vi khuẩn, ADN lạ sẽ được nhân lên Mục đích cuối cùng là để sản xuất một hệ biểu hiện protein mong muốn Sự biểu hiện của gen ngoại lai hoặc các gen của tế bào chủ liên quan đến việc hiểu rất nhiều chi tiết kỹ thuật Nếu protein được mã hóa bằng gen đích được biểu hiện trong tế bào chủ khác loài, nó được gọi là protein tái tổ hợp Các tế bào chứa gen mong muốn được nuôi ở quy

mô nhỏ trong phòng thí nghiệm sua đó sẽ được chiết lấy protein mong muốn bằng cách sử dụng các kỹ thuật tách chiết [2, 37]

3.1.2 Ứng dụng công nghệ tái tổ hợp trong chế tạo một số thuốc sinh học tương tự

3.1.2.1 Chế tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

Cấu trúc kháng thể (hình 1) gồm 2 phần là phần hằng định (C) và phần biến đổi (V), cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptid: 2 chuỗi nặng (H), 2 chuỗi nhẹ (cùng

là lamda hoặc cùng là kappa), các chuối liên kết với nhau nhờ cầu nối disulfit Vùng hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, được đặc trưng bởi chuỗi acid amin giống nhau giữa các kháng thể Vùng biến đổi khác nhau giữa các kháng thể.Vị trí nhận diện kháng nguyên được gọi là paratope gồm Vh+Vl

Hình 1.1: cấu trúc chung của kháng thể (nguồn VOER- Thư viện Học

liệu Mở Việt Nam)

Công nghệ chế tạo kháng thể đơn dòng được phát triển từ năm 1975 bởi Kohler và Milstein, sử dụng tế bào lai giữa tế bào lách sản xuất kháng thể mong muốn từ một con chuột đã được tiêm kháng nguyên quan tâm với tế bào ung thư bất tử Tế bào lai này được nuôi trong khoang màng bụng của một con chuột khác để tạo dịch cổ chướng chứa kháng nguyên mong muốn hoặc được nuôi cấy

in vitro với môi trường nuôi cấy đặc biệt Phương pháp này rẻ, dễ thực hiện tuy

nhiên lại phải giết rất nhiều động vật và gây đau đơn cho chúng [34]

Nhưng từ năm 1990, John McCafferty và cộng sự đã chỉ ra rằng các mảnh kháng thể có thể được biểu hiện bởi vi rút của vi khuẩn, được gọi là bacteriophage hay phage bằng cách đưa đoạn gen mã hóa kháng thể vào bộ gen của phage thông qua vector Quá trình tái tổ hợp kháng thể có thể chia làm 5 bước chính sau: (1) thành lập thư viện gen của kháng thể; (2) biểu hiện thư viện gen phage coats hoặc bề mặt tế bào; (3) phân lập kháng thể chống lại kháng nguyên mục tiêu; (4) sửa chữa kháng thể đã được phân lập và (5) mở rộng quy

mô sản xuất kháng thể được lựa chọn trong hệ thống biểu hiện môi trường nuôi cấy tế bào

Bước 1: Tạo thư viện gen kháng thể: Kháng thể là phân tử hình chữ Y được tạo thành từ một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ (hình 1), mỗi chuỗi có vùng biến đổi và vùng hằng định Vùng biến đổi của cả chuỗi nhẹ và chuỗi nặng nhận diện và lien kết với kháng nguyên Vùng hằng định của chuỗi nặng xác định loại, hoặc isotype của kháng thể Có 5 loại isotype kháng thể khác nhau ở động vật (IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE) Kháng thể của những isotype giống nhau có vùng hằng định giống nhau

Một thư viện gen kháng thể là bộ sưu tập vi sinh vật, được biến đổi gen của vùng biến đổi của kháng thể khác nhau Vùng gen biến đổi có thể được tổng

hợp in vitro hoặc khuếch đại từ ADN của tế bào B sản xuất kháng thể của người

Gen vùng biến đổi được sử dụng thay vì gen của cả phân tử kháng thể bởi vì các mảnh kháng thể dễ bắt chước trong vi sinh vật hơn so với toàn bộ phân tử kháng thể và vùng biến đổi của kháng thể là phần quan trọng nhất quyết định chức năng

Mỗi gen vùng biến đổi được nối vào một vector (phương tiện chuyển nguyên liệu gen bên ngoài vào tế bào), và vector được tích hợp vào vi sinh vật

Bước 2: Biểu hiện thư viện: các vector của thư viện kháng thể bao gồm các chỉ thị di truyền (genetic instructions) để sản xuất protein được tìm thấy trên

bề mặt của phân tử virus hoặc màng tế bào Gen vùng biến đổi được nối với những cấu trúc này để dung nạp protein, được tạo thành khi vector tích hợp vào

Trong hệ biểu hiện phage (phage display platforms), gen vùng biến đổi của kháng thể thường được dung hợp với gen vỏ của phage pIII Các vector của thư viện kháng thể được tích hợp vào vi khuẩn và vi khuẩn được gây nhiễm với phage đã sửa chữa Vector và phage làm việc cùng nhau để phá vỡ hoạt động bình thường của vi khuẩn vì thế tế bào vi khuẩn bắt đầu sản xuất ra các phage con mới có chứ a gen kháng thể và mảnh kháng thể chức năng biểu hiện trên bề mặt của chúng Các mảnh kháng thể được liên kết với protein vỏ phage pIII

Bước 3: Phân lập kháng thể: một khi các kháng thể tái tổ hợp được biểu hiện, có thể sử dụng ELISA để phân lập kháng thể mong muốn sau đó loại bỏ kháng nguyên và sàng lọc các đặc tính mong muốn

Bước 4: Sửa đổi: Các kháng thể được phát triển với số lượng lớn hơn và được trải qua quy trình tuyển chọn một lần nữa để làm giàu kháng thể mong muốn và có hiệu suất cao nhất Nếu ái lực của các kháng thể mong muốn không

đủ mạnh các kháng thể có thể được “thuần thục” (“maturation”) thông qua các phương pháp đột biến hợp lí hoặc ngẫu nhiên Sự trưởng thành của một kháng thể là một quá trình tự nhiên diễn ra trong cơ thể Các nhà nghiên cứu sử dụng

quá trình in vitro tương tự để tạo ra các kháng thể tái tổ hợp Các kỹ thuật sinh

học phân tử như PCR, xáo trộn ADN, các hướng đột biến vi khuẩn có thể được

sử dụng để biến đổi vùng được chọn của một mảnh kháng thể tạo ra một thư viện mới hoàn toàn có thể kiểm tra chức năng đã được tăng cường

Bước 5: Hệ biểu hiện kháng thể: một khi kháng thể mong muốn được lựa chọn, các gen của kháng thể nhờ vector biểu hiện sẽ được chuyển sang hệ biểu hiện (vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật phù hợp việc biểu hiện gen mong muốn) Lựa chọn của vector và hệ biểu hiện phụ thuộc vào loại kháng thể được sản xuất

Kháng thể từ các thư viện kháng thể thường là các mảnh đơn chỉ chứa một

vị trí gắn kết kháng nguyên và không có vùng hằng định Các kháng thể tự nhiên

có một bản sao của vị trí liên kết kháng nguyên trên mỗi “cánh tay” của “Y” (2 vị

trí) và một vùng hằng định - phần đáy của “Y” Các vector biểu hiện có thể liên kết hai hay nhiều mảnh tạo kháng thể đa trị Vector biểu hiện có thể gắn thêm một vùng hằng định với các mảnh để xây dựng cấu trúc kháng thể có chiều dài

đầy đủ [19]

3.1.2.2 Chế tạo protein dung hợp Fc (Fc-fusion protein)

Giới thiệu về protein dung hợp Fc

Protein dung hợp Fc bao gồm một chuỗi Fc của kháng thể globulin- Ig được liên kết trực tiếp với một peptide khác Phần dung hợp với nó có thể là một phân tử chứa protein mong muốn khác, ví dụ một phối tử (ligand) hoạt hóa dựa trên tác động với một receptor trên bề mặt tế bào, một kháng nguyên bản chất peptide chống lại một nguồn bệnh hoặc một protein nhiễu để xác nhận phần gắn còn lại được lắp ráp trong một Protein microarray (là phương pháp sử dụng để theo dõi các tương tác và hoạt động của protein) Thông thường, các phần dung hợp sẽ có tiềm năng điều trị quan trọng và chúng được gắn với một chuỗi Fc để mang lại cho protein lai các đặc tính dược lý và có thêm các đặc tính sinh học thuận lợi Sự đa dạng chức năng của protein dung hợp chứa Fc được chỉ ra trong hình 2 Có lẽ quan trọng nhất là sự có mặt của phần Fc làm tăng đáng kể thời gian bán bán thải (t1/2) để kéo dài hoạt động điều trị, do sự tương tác của nó với việc bảo vệ thụ thể Fc mới sinh, cũng như làm chậm quá trình thanh thải ở thận

do phân tử có kích thước lớn Chuỗi Fc được gắn vào cũng cho phép các phân tử này phản ứng với Fc receptor được tìm thấy trong tế bào miễn dịch, đây là đặc tính quan trọng ứng dụng trong các liệu pháp điều trị ung thư và vaccine Từ quan điểm sinh lý, vùng Fc cuộn gấp độc lập và có thể cải thiện độ hòa tan và độ

ổn định của phân tử gắn cùng cả trong in vitro và in vivo, trong khi từ quan điểm

công nghệ thì vùng Fc cho phép tinh chế với chi phí thấp bằng sử dụng sắc ký ái lực protein trong quá trình sản xuất Ngoài ra, hầu hết các Fc-fusion được biểu hiện ở dạng nhị phân tử (homodimer) bây giờ có thể được sửa đổi để có thể hợp nhất 12 thành phần Do đó, sự tăng ái lực kèm với hiệu quả từ một thành phần

đã dung hợp được phân tách là một lợi thế đáng chú ý của protein dung hợp với

Fc [8]

Hình 1.2: Đa dạng chức năng của protein dung hợp chứa Fc;Vùng gắn

ligand có thể được bắt nguồn từ một receptor vùng ngoại bào, cytokine, enzym hay peptide.Vùng Fc của IgG1 có khả năng gắn FcγR và C1q, có khả năng kích hoạt protein dung hợp để khởi tạo ADCC (kháng độc tế bào, trung gian tế bào), CDC(độc tính phụ thuộc bổ sung), FcRn liên kết với vùng Fc chịu trách nhiệm

làm kéo dài thời gian bán thải huyết thanh của phân tử protein dung hợp [8]

Thiết kế phân tử protein dung hợp Fc

Các protein dung hợp Fc là các dẫn xuất của kháng thể đơn dòng Tất

cả các kháng thể đơn dòng chứa miền Fc có khả năng kéo dài thời gian bán thải

t1/2 in vivo, nhưng dựa trên nhiều khía cạnh của việc thiết kế công thức phân tử

phân biệt lớp protein dung hợp Fc Bởi vì các protein như vậy có nguồn gốc từ các thụ thể của con người và các chuỗi immunoglobulin Chúng có thiết kế linh hoạt: thường là các nhị trùng hai hóa trị, chúng cũng có thể đơn hay đa hóa trị Ái lực gắn của chúng có thể rất cao, đặc biệt trong trường hợp bẫy cytokine, phân tử nhị trùng với các miền đa liên kết bắt nguồn từ các chuỗi receptor khác nhau Các vùng liên kết ligand kết hợp chức năng để tạo thành một điểm gắn có ái lực cao nhất, do vậy một ligand sẽ bị bẫy giữa hai chuỗi [40]

Để thiết kế một protein dung hợp với Fc, việc cắt vùng receptor thường được mong muốn là sẽ làm giảm kích thước và sự phức tạp về cấu trúc của cấu trúc fusion tạo thành- đặc biệt là đối với các glycoprotein màng có cấu trúc nhiều chuỗi lớn Đối với protein vận chuyển màng như CD4 hay receptor của TNF, phối tử gắn được đặt trong ECD (vùng ngoại bào- extracellular domain) Tất cả các phần của vùng này được dùng để xây dựng cấu trúc protein dung hợp, điều này đảm bảo rằng việc gắn kết đặc hiệu và/ hoặc ái lực được giữ vững Cấu trúc của phân tử dung hợp được biểu hiện ở cấp ADN, chế tạo một cADN mã hóa cho chuỗi polypeptid dung hợp [40]

Đầu tận Cacbon của protein mong muốn được hợp nhất với đầu tận Nito của phần Fc của IgG người, đó có thể là liên kết trực tiếp hay thông qua một peptide trung gian để tạo thành một mối nối Sự dung hợp của vùng Fc-Ig có thể

là đầu N hoặc đầu C của một protein gắn, tùy thuộc vào cấu trúc kết thúc nào có thể được kết nối mà không cản trở việc cuộn gấp chính xác hay hoạt động của

nó Vùng hoạt động sinh học của protein mong muốn sẽ thay thế vùng Fab của Ig- vùng được tạo bởi chuỗi nhẹ biến đổi (VL), chuỗi nặng biến đổi (VH) và chuỗi nặng hằng định 1(CH1)- và được dung hợp với bản lề nơi liên kết với vùng Fc- vùng được tạo bởi chuỗi CH2 và CH3 của IgG1 của người Bản lề bao gồm các cầu nối disulfit để các chuỗi nặng liên kết cộng hóa trị với nhau và nó khác với IgG subtype ở chiều dài và số lượng cầu nối disulfit Chú ý rằng bởi vì protein dung hợp được thiết kế để nối hai chuỗi protein không liên quan trong tự

nhiên với nhau, nên tác động qua lại giữa 2 chuỗi có thể ảnh hưởng đến độ ổn định vật lí Tất cả các protein dung hợp với Fc để điều trị đã được phê duyệt đến nay đều có nguồn gốc từ IgG1, và tất cả đều có khả năng gắn với receptor của

Fc

Trong thiết kế protein dung hợp chứa Fc của Fc - CD4, vị trí hợp nhất được đặt ở Asp216 của IgG chuỗi nặng, ở ngay hạ lưu của phần còn lại cysteine vùng tạo thành liên kết disulfit liên kết giữa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của IgG Bản lề

là khoảng linh động giữa hai phần của protein dung hợp cho phép mỗi phần của phân tử thực hiện chức năng độc lập Chiến lược hợp nhất này bao gồm cấu trúc nguyên vẹn của bản lề trong phân tử IgG, cũng như với kháng thể đơn dòng, protein dung hợp chứa Fc có thể dễ bị phân cắt enzym bởi papain

Nếu sử dụng một linker peptide thì trình tự và độ dài phải được tối ưu hóa

vì nó có thể ảnh hưởng đáng kể đến độ ổn định của protein dung hợp Zhang và cộng sự liệt kê các yếu tố cần quan tâm khi thiết kế một linker, bao gồm các phương pháp thiết kế và tối ưu hóa cấu trúc của protein dung hợp Thay vào đó, một vị trí phân tách enzym có thể được thiết kế ở mối nối của protein dung hợp Mặc dù nó thường được sử dụng để nghiên cứu trong protein dung hợp nhưng không có protein nào như vậy được thiết kế để làm thuốc bao gồm một vị trí phân cắt đã được tạo Để đảm bảo sự tiết protein dung hợp một cách hiệu quả từ các tế bào trong suốt quá trình sản xuất người ta sử dụng một trình tự tín hiệu bài tiết có đầu tận N ở động vật có vú trong tự nhiên [40]

Ví dụ thực tế: Etanercept

Etanercept là một hoạt chất bản chất là Fc-fusion protein được phát minh bởi hai công ty Amgen và Pfizer với tên biệt dược là Enbrel Etanercept là một protein dung hợp hai thành phần: 2 chuỗi p75 của yếu tố hoại tử khối u được gắn với nhau bằng vùng Fc bất biến của IgG1 được thể hiện trong hình 3 Nó được sản xuất từ ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sử dụng vật chủ là tế bào CHO [25]