Nghiên cứu phát triển KIT chẩn đoán virus viêm gan b

Việc nhập khẩu dẫn đến một số vấn đề: không chủ động nguồn sinh phẩm, giá thành cao… Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành phải chăng, phù hợp với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN NGỌC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN

VIRUS VIÊM GAN B

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn của tôi Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào

Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và

sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Nguyễn Ngọc Phương

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên công tác tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã góp những ý kiến quý báu cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu

Do điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện có giới hạn nên đề tài không thể tránh những sai sót Tôi rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô và các bạn đề

đề tài được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Ngọc Phương

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HBcAg : Hepatitis B core antigen

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc tính kháng nguyên HBV……… 9

Bảng 1.2: Tình hình nhiễm HBV ở các Châu lục……… 19

Bảng 1.3: Tỷ lệ người mang HBsAg trong cộng đồng người Việt Nam……… 20

Bảng 1.4: Tỷ lệ viêm gan B trong số bệnh nhân viêm gan B cấp ở một số bệnh viện trong nước……… 21

Bảng 1.5: Đặc tính của các vật liệu chế tạo miếng cộng hợp……… 36

Bảng 3.1: Bảng công thức đệm tạo cộng hợp………51

Bảng 3.2: Đặc tính các loại vật liệu được sử dụng làm miếng cộng hợp……… 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Virus viêm gan B dưới kính hiển vi điện tử……… 4

Hình 1.2: Cấu trúc virus viêm gan B……….5

Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen virus viêm gan B……… 7

Hình 1.4: Nguyên lý xác định kháng nguyên HBsAg……… 23

Hình 1.5: Nguyên lý xác định kháng thể HBsAb……… 24

Hình 1.6: Nguyên lý phương pháp ELISA sandwich………26

Hình 1.7: Nguyên lý phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang……… 27

Hình 1.8: Nguyên tắc kỹ thuật PCR……… 29

Hình 1.9: Nguyên tắc khuyếch đại tín hiệu bởi bDNA……… 30

Hình 1.10: Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus viêm gan B theo nguyên lý sắc ký miễn dịch……….32

Hình 3.1: Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu……… 46

Hình 3.2: Xác định giá trị pH thích hợp cho phản ứng tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng………47

Hình 3.3: Xác định lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng………49

Hình 3.4: Xác định thời gian thích hợp tạo cộng hợp………50

Hình 3.5: Xác định nhiệt độ thích hợp tạo cộng hợp ………51

Hình 3.6: Ảnh hưởng của đệm tạo cộng hợp đến tín hiệu que thử………52

Hình 3.7:Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp……… 54

Hình 3.8:Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp……… 55

Hình 3.9: Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp………56

Hình 3.10: Xác định hàm lượng kháng thể thích hợp cố định lên màng nitrocellulose 57

Hình 3.11: Kết quả thử nghiệm các loại đệm khác nhau cố định kháng thể lên màng…58

Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian sấy đến tín hiệu que thử……… 59

Hình 3.13: Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose……….60

Hình 3.14: Ảnh hưởng của miếng thấm mẫu đến tín hiệu que thử………61

Hình 3.15: Kết quả thử nghiệm các dung dịch ly giải mẫu khác nhau……… 62

Hình 3.16: Kết quả kiểm tra ngưỡng phát hiện của que thử……… 63

Hình 3.17: Thử nghiệm que thử với 5 tác nhân lây bệnh qua đường máu………64

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I………3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm virus viêm gan B 3

1.1.1 Lịch sử virus viêm gan B 3

1.1.2 Cấu trúc virus viêm gan B 4

1.1.2.1 Danh pháp và phân loại học 4

1.1.2.2 Hình dạng và cấu tạo chung 4

1.1.2.3 Cấu trúc bộ gen HBV 7

1.1.2.4 Các protein cấu trúc của virus viêm gan B 8

1.1.2.4.1 Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt ( Anti- HBs) 8

1.1.2.4.2 Kháng thể kháng kháng nguyên lõi ( anti- HBc) 9

1.1.2.4.3 Kháng thể kháng kháng nguyên e ( anti-HBe) 10

1.1.2.4.4 HBV- DNA 10

1.1.3 Đặc điểm lý hóa 10

1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus HBV 11

1.1.4.1 Mối liên quan giữa cấu trúc và sự xâm nhiễm của HBV vào tế bào gan 11

1.1.4.2 Cơ chế xâm nhiễm và tái bản của HBV 12

1.1.4.2.1 Tấn công 12

1.1.4.2.2 Thâm nhập 13

1.1.4.2.3 Quá trình phiên mã các gen của HBV 14

1.1.4.2.4 Quá trình dịch mã 15

1.1.4.2.5 Tổng hợp genome virus 15

1.1.4.2.6 Lắp ráp tạo hạt virus hoàn chỉnh 16

1.1.4.2.7 Giải phóng 16

1.1.5 Các con đường lây truyền của viêm gan B 16

1.1.6 Tình hình nhiễm virus viêm gan B trên thế giới và Việt Nam 18

1.1.6.1 Trên thế giới 18

1.1.6.2 Tại Việt Nam. 19

1.2 Các phương pháp chẩn đoán viêm gan B 22

1.2.1 Phương pháp miễn dịch 22

1.2.1.1 Phương pháp dựa trên nguyên lý sắc kí miễn dịch (que thử) 22

1.2.1.2 Phương pháp ELISA sandwich 25

1.2.1.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang ( ECLIA) 26

1.2.1.4 Phương pháp miễn dịch phóng xạ(Radio Immuno Assay-RIA) 27

1.2.1.5 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 28

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 28

1.2.2.2 Kỹ thuật PCR 28

1.2.2.3 Phương pháp lai thấm điểm 29

1.2.2.4 Khuyếch đại tín hiệu bởi bDNA 29

1.2.2.5 Phương pháp lai chéo dưới tác dụng của tia UV 30

1.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gene 30

1.3 Nguyên lý của que thử 31

1.3.1 Nguyên lý 31

1.3.2 Đặc tính các thành phần của que thử 32

1.3.2.1 Hạt nano vàng (AuNPs) 32

1.3.2.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng. 34

1.3.2.3 Miếng thấm mẫu (Sample pad) 34

1.3.2.4 Miếng cộng hợp. 35

1.3.2.5 Màng nitrocellulose (membrane). 37

1.3.2.6 Miếng thấm hút (absorbent pad). 38

CHƯƠNG II 39

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Vật liệu 39

2.1.1 Hóa chất và kháng thể 39

2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử. 39

2.1.3 Thiết bị. 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng. 40

2.2.1.2 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng .41

2.2.1.3 Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng 43

2.2.2 Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể đa dòng dê phun lên màng .43

2.2.3 Phương pháp cố định kháng thể lên màng. 44

2.2.4 Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử 44

2.2.5 Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của que thử .44

CHƯƠNG III 46

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Thiết lập điều kiện tạo que thử 46

3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 47

3.2.1 Xác định giá trị pH thích hợp tạo cộng hợp 47

3.2.2 Tối ưu nồng độ kháng thể chuột tạo cộng hợp với hạt nano vàng 48

3.2.3 Thời gian tạo cộng hợp 49

3.2.4 Nhiệt độ tạo cộng hợp 50

3.2.5 Tối ưu đệm cộng hợp 51

3.3 Nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo miếng cộng hợp chứa phức kháng thể và hạt nano vàng (conjugate pad) 53

3.3.1 Lựa chọn vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp 53

3.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp 55

3.3.3 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp 56

3.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 57

3.4.1 Xác định hàm lượng kháng thể dê thích hợp cố định lên màng nitrocellulose 57

3.4.2 Lựa chọn đệm hòa tan kháng thể cố định trên màng. 58

3.4.3 Tối ưu thời gian sấy màng nitrocellulose 60

3.4.4 Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose 60

3.5 Tối ưu vật liệu làm miếng thấm mẫu 61

3.6 Lựa chọn dung dịch ly giải mẫu (SPS) 62

3.7 Đánh giá que thử 63

3.7.1 Ngưỡng phát hiện 63

3.7.2 Phản ứng chéo. 64

3.7.3 Độ nhạy và độ đặc hiệu 65

CHƯƠNG IV 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

KẾT LUẬN 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 67

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 67

CÁC TRANG WEB 69

tỉ lệ 16,0%, Nam Mỹ, Châu Âu, Bắc Mỹ và Châu Đại Dương chiếm khoảng 3,0% Riêng Châu Á chiếm tỉ lệ rất cao từ 10,5% - 25,0% Ở vùng lưu hành dịch cao thì nguy cơ nhiễm HBV là rất lớn, ước tính tới trên 60,0% Việt Nam có tần suất nhiễm virus viêm gan B rất cao và là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao nhất trên thế giới với khoảng 10 -20 % dân số

Viêm gan virus B chủ yếu lây truyền theo đường máu, nhưng người được truyền máu hoặc sản phẩm máu sẽ bị nhiễm virus viêm gan B nếu máu và sản phẩm máu có vi-rus viêm gan B Một đường lây truyền quan trọng nữa, là đường lây truyền từ mẹ sang, ở nước ta số phụ nữ mang thai bị nhiễm virus viêm gan B có tỷ lệ từ 10-12%, như vậy hàng năm số trẻ sinh ra khoảng 1,6 triệu cháu do các bà mẹ có nhiễm virus viêm gan, số trẻ em này được phân làm 2 nhóm, nhóm 1 là những bà mẹ chưa có viêm gan(60%), 10 % số trẻ này có thể bị viêm gan virus(khoảng 6.600 trẻ); nhóm 2 số trẻ sinh ra từ các bà mẹ bị viêm gan (40%), 90% số trẻ này có thể bị viêm gan

Theo thống kê chuyên ngành ung thư của WHO thì năm 2008, tử vong do ung thư gan nước ta 21.748 người, gấp 2 lần so với chết do tai nạn giao thông năm 2012 Số bệnh

nhân bị viêm gan virus trên 8 triệu người so với số bệnh nhân nhiễm HIV-AIDS 210.000 người (năm 2012) con số tử vong liên quan đến virus viêm gan do xơ gan, ung thư gan, viêm gan virus cấp và mạn tính phối hợp với bệnh lao phổi, đái đường, tăng huyết áp, suy thận… đã gây ra cái chết cho hơn 10 vạn người mỗi năm[3]

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phát hiện sự có mặt virus HBV trong mẫu máu bệnh nhân đã được WHO khuyến cáo Tuy nhiên, đa số chi phí cho các xét nghiệm này là quá cao so với thu nhập của người dân, một xét nghiệm ELISA HBV khoảng 500.000đ, HBV-DNA khoảng 1 triệu đồng, phân loại Genotype vào khoảng 2 triệu đồng… và phải được thực hiện ở các cơ sở y tế tuyến trung ương, cần máy móc đắt tiền và nhân viên y tế có trình độ chuyên môn cao Do việc xét nghiệm đòi hỏi phải được thực hiện nhanh, đơn giản với số lượng mẫu lớn nên thực tế hiện nay các cơ sở xét nghiệm đều dùng dạng que thử nhanh Tuy nhiên, hiện nay chúng ta hoàn toàn phải nhập ngoại sinh phẩm này Việc nhập khẩu dẫn đến một số vấn đề: không chủ động nguồn sinh phẩm, giá thành cao… Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành phải chăng, phù hợp với thu nhập của người dân là việc làm cần thiết và

thực sự có ý nghĩa thực tiễn.Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu phát triển

kit chẩn đoán virus viêm gan B ” với mục tiêu:

Xác lập một số điều kiện thích hợp tạo que thử phát hiện nhanh virus viêm gan B

từ mẫu máu( huyết tương hoặc huyết thanh)

Nội dung nghiên cứu đề tài:

AuNPs; miếng cộng hợp chứa Ab – AuNPs; màng cố định kháng thể; miếng thấm mẫu; dung dịch chuẩn bị mẫu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm virus viêm gan B

1.1.1 Lịch sử virus viêm gan B

Vào những năm 1800, Lurman lần đầu tiên phát hiện một đại dịch gây ra bởi virus viêm gan B Một đợt bùng phát của bệnh đậu mùa đã xảy ra ở Bremen vào năm 1883,

1289 nhân viên nhà máy đóng tàu đã được tiêm phòng từ những người khác Sau vài tuần đến tám tháng sau đó, 191 công nhân chủng ngừa bị bênh vàng da và được chẩn đoán là viêm gan huyết thanh Với nhận xét này, người ta tin rằng bệnh viêm gan có thể lây qua đường máu

Mãi đến năm 1960, người ta chứng minh được điều này một cách cụ thể bằng test thử máu đặc biệt Trong huyết tương của một số bệnh nhân viêm gan lây qua đường máu, người ta phát hiện được một kháng nguyên đặc biệt (Antigen, viết tắt là Ag), mà sau này gọi là HBsAg

Rồi vào những năm 1970, virus viêm gan B được nhận diện dưới kính hiển vi điện

tử bởi nhà khoa học Dane Phân tử này với kích thước là 42nm, có một vỏ bên ngoài chứa kháng nguyên HBsAg và một nhân bên trong gồm DNA cả virus viêm gan B và core protein Proetein lõi này có thể phát hiện khi thử máu (HBsAg) Và khám phá này

đã đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng trong việc định bệnh viêm gan

Hình 1.1: Virus viêm gan B dưới kính hiển vi điện tử

(http://www.ungthu.org/cacbenhungthu/ut_gan/hep_b.asp) 1.1.2 Cấu trúc virus viêm gan B

1.1.2.1 Danh pháp và phân loại học

- Nhóm: Nhóm VII ( dsDNA-RT);

- Bộ (ordo): Unassigned;

- Họ (familia): Hepadnaviridae;

- Chi (genus): Orthohepadnavirus;

- Loài ( species): Hepatitis B virus

1.1.2.2 Hình dạng và cấu tạo chung

- Là một loại virus hướng gan, có cấu trúc DNA;

- Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn nhân đôi virus, người ta tìm thấy

3 kiểu cấu trúc:

 Hạt Dane hay virion hoàn chỉnh

Hình 1.2: Cấu trúc virus viêm gan B

(http://study.com/academy/lesson/hepatitis-b-virus-structure-and-function.html)

Gồm 3 phần:

 Vỏ ngoài:

- Dày khoảng 7 nm, gồm 2 lớp lipoprotein trong đó có ba loại protein, mỗi loại đều

có chung một quyết định kháng nguyên là HBsAg;

- Protein chủ yếu chiếm tỷ lệ cao nhất gồm 226 acid amin, mã hóa bởi gen S, gen này quyết định kháng nguyên HBs;

- Protein trung bình mã hóa bởi các gen tiền S2+ S, có 281 acid amin, mang các quyết định kháng nguyên HBs và tiền S2 có khả năng miễn dịch cao Protein này

chứa đựng một điểm cảm thụ với Abumin trùng hợp hóa giữ vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của virus vào tế bào gan;

- Protein lớn gồm 389- 400 acid amin tùy thuộc vào type huyết thanh, mã hóa bởi các gen tiền S1, tiền S2 và S mang các quyết định kháng nguyên HBs, tiền S1 và tiền S2 Protein này đóng vai trò quan trọng trong việc kết hợp HBV với tế bào gan qua trung gian cảm thụ đặc hiệu

 Capsit:

Dày khoảng 27- 28 nm được hình thành bởi nhiều mẫu của một protein chứa

183 acid amin được mã hóa bởi gen C mang quyết định kháng nguyên HBc Kháng nguyên e của HBV có mặt trong huyết tương hình thành do quá trình phân tách một protein lớn hơn mã hóa bởi các gen tiền C Cấu trúc đối xứng hình hộp, bao quanh lõi, thành phần chính là protein chứa hai kháng nguyên quan trọng là HBcAg và HBeAg, có các enzyme DNA polymerase, protein kinase

 Lõi:

- Genome của HBV là một phân tử DNA vòng có cấu trúc mạch kép không hoàn toàn Một sợi dài (L) gần như khép kín có 3200 nucleotit và một phần sợi ngắn (S) thay đổi từ 50-100% độ dài so với sợi dài Khối lượng phân tử gần 2.106.000 dal-ton DNA của HBV chịu trách nhiệm đối với một số phân type kháng nguyên đã được phân lập và xác định trình tự axit amin;

- Enzyme DNA polymerase có khả năng phiên mã ngược;

- Enzyme protein kinase có khả năng phosphoril hóa các protein của nuclecapsit;

- Các loại protein nhỏ khác bám vào DNA nhưng chức năng còn đàn nghiên cứu

 Cấu trúc hình cầu và hình ống Dạng hình cầu có đường kính dao động từ 17- 25 nm, dạng ống có đường kính khoảng 22 nm với chiều dài thay đổi Có chứa các kháng nguyên bề mặt nhưng có lõi không mang genome nên không có khả năng gây bệnh

- Chuỗi ngắn nằm trong, có cực tính dương (+) với chiều dài thay đổi từ 50 -100% chiều dài bộ gene

Bộ gene của HBV là một DNA có cấu trúc kép gồm 4 gene (4 khung đọc mở) S, C, P

và X Đây là các vùng mã hóa để tổng hợp protein của virus

Quá trình dịch mã được bắt đầu từ bộ ba nucleotide AUG được coi là codon khởi đầu

và chấm dứt bằng codon kết thúc là TAG

- Gene S là phần mã hóa protein chính của vỏ, bao gồm cả vùng S, pre- S1 và pre- S2 mã hóa để tổng hợp các protein bề mặt hay kháng nguyên bề mặt HBsAg Vùng

S và pre-S2 có chiều dài cố định trong khi vùng pre- S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân type khác nhau;

- Gene C mã hóa các protein capsid (HBcAg) và vùng tiền C mã hóa protein mang quyết định kháng nguyên e (HBeAg) có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng nhân đôi của virus Nếu quá trình dịch mã được bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HbeAg Một số trường hợp xảy ra đột biến ở pre-C, sự tổng hợp HBeAg khi

đó không thực hiện được mặc dù quá trình nhân đôi của virus vẫn diễn ra;

- Gene P chiếm 80% chiều dài bộ gene, mã hóa DNA polymerase cho phép HBV nhân lên Vùng này thể hiện sự đồng nhất của các trình tự ghi nhận được với các vùng mã hóa để phiên mã ngược trong Retrovirus Do đó DNA polymerase có cả hai hoạt tính: hoạt tính của DNA polymerase phụ thuộc vào DNA và hoạt tính en-zyme sao chép ngược phụ thuộc RNA;

- Gene X mã hóa protein X đóng vai trò điều hòa quá trình nhân lên của virus là HbxAg Protein X có liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào do

đó có vai trò trong cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễm

1.1.2.4 Các protein cấu trúc của virus viêm gan B

1.1.2.4.1 Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt ( Anti- HBs)

HBsAg là một protein có tính kháng nguyên, cấu tạo nên lớp vỏ và giúp cho sự bám của virus vào tế bào gan, có sự thay đổi giữa các phân type, có khối lượng phân tử thay đổi từ 23,000 đến 29,000 dalton

Xuất hiện sau một đến ba tháng kể từ khi virus viêm gan B xâm nhập vào cơ thể

Hệ thống kháng thể- kháng nguyên bề mặt viêm gan B gồm HBsAg và HBsAb Le vier và cộng sự đã xác nhận HBsAg ít nhất chứa ba thể a,d,y Kháng nguyên a là đặc hiệu nhóm vì nó có mặt ở bất cứ HBsAg nào, d và y là những kháng nguyên đối kị nhau đại diện cho các phân nhóm Những kháng nguyên nhóm và phân nhóm là những yếu tố quyết định miễn dịch của các tiểu thể hình cầu nhỏ, hình ống và lớp vỏ tiểu thể được gọi

Vou-bị viêm gan B, xuất hiện sau khi kháng nguyên không còn trong máu hoặc sau đó vài tháng, hiệu giá kháng nguyên giảm dần theo thời gian Điều quan trọng có ứng dụng bậc nhất là anti- HBs có vai trò bảo vệ cơ thể chống lại tái nhiễm HBV Một miễn dịch có hiệu lực được biểu thị bằng sự có mặt của anti- HBs

Nhóm

Thứ nhóm Thứ nhóm

1.1.2.4.2 Kháng thể kháng kháng nguyên lõi ( anti- HBc)

HBcAg về nguyên tắc thì không có mặt ở huyết thanh, kháng nguyên này chỉ có trong tế bào gan HBcAg có khối lượng phân tử 18,000 đến 19,000 dalton

HBcAg được sản xuất trong thời gian đầu của nhiễm trùng cấp tính và tiếp tục tồn tại trong nhiều năm, có thể là suốt cuộc đời Khi HBsAg đã hết, nếu HBcAg có hàm lượng cao thì chứng tỏ HBV đang phát triển, đang hoạt động và đang ở dạng viêm gan B cấp HBcAg không có giá trị bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV, cũng không có vai trò điều hòa miễn dịch cũng như miễn dịch bẩm sinh Nó có tác dụng như một chỉ điểm

chứng tỏ sự có mặt của HBcAg, là thử nghiệm đơn giản nhất để phát hiện người nhiễm HBV mà không được tiêm chủng Tiêm chủng bằng vacxin viêm gan B không tạo đáp ứng HBcAg Vì vậy, sự có mặt của HBcAg ở người được tiêm chủng có thể do họ bị nhiễm HBV hoạt động trước đó Ngược lại, HBcAb xuất hiện thứ ba sau nhiễm HBV Trong nhiễm viêm gan cấp, HBcAb được hình thành vào lúc xuất hiện các triệu chứng lâm sang khi HBsAg đạt tới đỉnh cao trong máu và kháng thể đầu tiên có đáp ứng miễn dịch với virus

1.1.2.4.3 Kháng thể kháng kháng nguyên e ( anti-HBe)

Các hệ thống kháng nguyên- kháng thể bề mặt và nhân chủ yếu nói lên đã nhiễm hoặc hiện diện của virus, phản ánh diễn biến và mức độ bệnh Trong khi hệ thống kháng nguyên kháng thể e có giá trị tiên lượng lâu dài, cho phép xác định nguy cơ mãn tính hóa, khả năng lây bệnh khi mắc viêm gan B cấp cũng như chẩn đoán phân biệt người lành mang bệnh hay người mắc viêm gan mãn tính tiến triển Anti HBe có cấu trúc thay đổi ở các phân type, có khối lượng phân tử từ 16,000 đến 19,000 dalton Theo Sheikh và cộng

sự không thấy HBeAg ở người lành mang bệnh song hiếm tồn tại ở bệnh nhân viêm gan mạn, phổ biến ở bệnh nhân viêm gan mạn hoạt động Eleftheriou thấy HBeAg liên quan đến trạng thái người lành mang bệnh hay sự ngừng phát triển của bệnh Những người âm tính với HBsAg mà dương tính với anti-HBe thì ít có khả năng lây truyền hơn những người dương tính đồng thời với cả HBsAg

1.1.2.4.4 HBV- DNA

HBV- DNA chỉ có trong huyết thanh có các tiểu thể Dane tức là HBV hoàn chỉnh Hiện nay, với kĩ thuật sinh học phân tử có thể phát hiện được HBV- DNA và DNA-polymerase trong máu người bệnh Hai dấu ấn này là những chỉ thị cho sự hoạt động và nhân lên của HBV

1.1.3 Đặc điểm lý hóa

điện di trên gel polyarilamid có thể tách ra từ 7– 9 polypeptid có khối lượng phân tử

19,000 tới 120,000 dalton Cầu nối disulfide đóng vai trò quan trọng trong tiểu thể để duy trì tính kháng nguyên

Khi chạy điện di thấy các tiểu thể HBsAg không thuần nhất Ở 61,8% số bệnh nhân xuất hiện giữa các thành phần alpha 2 và beta globulin, số còn lại trong khu vực beta globulin Ngoài protein, trong cấu trúc của HBsAg còn có thành phần lipid cũng như glu-

co protein được phân bố trên bề mặt các tiểu thế chứa maltose, glucose Nhân tiểu thể Dane chứa DNA

nguyên giảm trong vài phút

Kháng nguyên bền vững dưới tác dụng của nhiều enzyme (protease, nuclease) và nhiều dung môi hữu cơ, không bị phá hủy bởi những chất sát khuẩn mạnh Với formalin 1/ 1000 – 1/2000 nó tồn tại hàng tháng, 1/000 hai tuần, 1,5% trong bảy ngày Với phenol 2% trong 24 giờ, 3-5% mới bất hoạt Với ether và cloroforme sau 5 giờ Với cloramin 3-5% chỉ bất hoạt một phần Khi thêm vào huyết thanh một khối lượng tương đương cồn ethylic 96 độ kháng nguyên mới bất hoạt trong một số trường hợp

1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus HBV

1.1.4.1 Mối liên quan giữa cấu trúc và sự xâm nhiễm của HBV vào tế bào gan

Sau khi vượt qua hàng rào ngăn chặn sự xâm nhiễm của cơ thể, HBV di chuyển tới đích đến cuối cùng của mình là những tế bào gan Cấu trúc đặc biệt của HBV cho phép sự xâm nhập và đưa vật chất di truyền của mình vào tái bản trong tế bào gan Khả năng xâm nhập vào tế bào gan do phân tử protein bề mặt HBsAg thực hiện

HBsAg là một protein có tính kháng nguyên, tham gia cấu tạo nên lớp vỏ virus HBsAg gồm 3 loại protein là protein S (small), protein M (medium), protein L (large) Được mã hóa bởi gen S trong genome của virus Gen S bao gồm phân vùng preS1, vùng preS2 và vùng S Trong cấu trúc gene, vùng preS2 và vùng S thường có chiều dài cố định trong khi vùng preS1 có chiều dài thay đổi tùy các phân type khác nhau

 Protein S: được mã hóa bởi vùng S và chiếm đa số lượng protein có trên bề mặt hạt virus Protein S là một chuỗi gồm 226 acid amin nối lại với nhau và được tìm thấy

ở hai dạng: dạng không glycozit hóa và dạng có glycozit hóa Chính protein S quy định type của HBV;

55 acid amin được mã hóa bởi vùng preS2 và phần còn lại được mã hóa bởi vùng

S Protein Pres2 có tính ưa nước, không chứa cystein và nhạy cảm với protease Giúp cho virus bám vào màng và xâm nhập vào trong nhờ cơ chế kết hợp với các thụ thể albumin Phsa có trong huyết thanh và trên thành tế bào gan Nếu trên tế bào gan thiếu các điểm thụ thể này thì có thể làm cho các tế bào gan đó có khả năng kháng với sự nhiễm HBV;

PreS1 bao bọc chuỗi PreS2 Trình tự cuối của PreS1 là Methionin- Glycin cùng với một vài acid amin lân cận là tín hiệu cho việc thay thế Methionon bằng acid béo 18C Myristic Ngoài ra, vùng hoạt động nằm trên chuỗi Pres1 có vai trò quan trọng trong việc gắn thụ thể và xâm nhập vào tế bào gan

1.1.4.2 Cơ chế xâm nhiễm và tái bản của HBV

Những tế bào gan là tế bào đích đối với virus viêm gan B, để có thể sinh sôi và phát triển trong cơ thể vật chủ thì HBV phải xâm nhập vào tế bào gan Sự xâm nhập xảy

ra theo các bước sau: (1) Tấn công, (2) Thâm nhập, (3) Phiên mã, (4) Dịch mã, (5) Tổng hợp genome, (6) Lắp ráp, (7) Giải phóng

1.1.4.2.1 Tấn công

Trước hết, để có thể tấn công và xâm nhiễm vào tế bào gan, virus sẽ phải vượt qua hàng rào bảo vệ cũng như hệ thống miễn dịch của cơ thể Sau khi vượt qua các rào cản, HBV sẽ gặp phản ứng ngăn chặn của hệ thống miễn dịch Một trong những cách để lẩn trốn khỏi hệ miễn dịch nằm ở các dạng cấu trúc của HBV Bằng việc tạo ra các thể có lớp

vỏ và các kháng nguyên bề mặt nhưng lại không có genome đã một phần đánh lừa hệ

thống miễn dịch Trong các protein vỏ của virus có protein M và L, đấy là hai loại protein

có vai trò lớn trong việc giúp hạt virus có thể tấn công vào tế bào gan Trong thực tế, vẫn chưa thể xác định rõ được thụ thể nào trên màng tế bào gan là điểm tấn công của HBV Theo giả thiết, có thể có hai cơ chế tấn công vào tế bào gan là tấn công thông qua đoạn PreS1 và đoạn PreS2

HBV có thể tấn công bằng vùng hoạt động trên PreS1 ở protein L Vùng này tấn công trực tiếp vào điểm thụ thể phù hợp trên bề mặt tế bào gan Một cách khác để tấn công là nhờ vào khả năng gắn với pHSA của vùng PreS1 và xâm nhập thông qua các điểm vận chuyển albumin vào trong có trên bề mặt các tế bào gan

1.1.4.2.2 Thâm nhập

 Quá trình xâm nhập vào bào tương

Đối với virus gây bệnh cho người cũng như, vật có hai cơ chế để virus đưa genome của mình vào trong tế bào

Cơ chế thứ nhất, chỉ xuất hiện ở một vài virus có vỏ ngoài có các protein dung hợp Các protein này chèn một mã kị nước vào bên trong lớp màng lipid kép của tế bào đích Quá trình này gây dung hợp lớp màng của virus với màng tế bào qua đó phóng thích cấu trúc nucleocapsit vào trong bào tương

Cơ chế thứ hai, có ở hầu hết các loại virus có vỏ hoặc không có vỏ Theo cơ chế này, virus xâm nhập nội bào thông qua thụ thể trên màng tế bào Nucleocapsit được vận chuyển vào bào tương thông qua hạt nội bào (endosome) Quá trình thâm nhập thành công là khi nucleocapsit thoát được ra khỏi cấu trúc endosome và đưa genome vào trong nhân tế bào trước khi endosome chuyển thành trạng thái có tính acid phagolysosome

HBV xâm nhập vào bào tương thông qua cơ chế thứ hai Sau khi tiếp xúc với thụ thể màng tế bào gan, lõi của virus được bao bọc bởi endosome Hạt nội bào được tạo thành từ phức hợp hạt virus và màng nội bào Khi xâm nhập vào bào tương thành công, cấu trúc nucleocapsit được giải phóng vào nhân

 Sự giải phóng genome virus vào nhân tế bào

Lõi của HBV có kích thước vào khoảng 32 đến 36 nm trong khi đường kính lỗ màng nhân chỉ khoảng 26nm Như vậy, lõi của virus quá kích thước lỗ màng nhân và theo đúng logic thì lõi HBV không thể vào được vùng nhân Nhưng trong thực tế, cũng như nhiều loại virus khác, HBV sử dụng hệ thống vi ống vận chuyển của tế bào để giải phóng genome vào trong nhân Sự tương tác với bộ máy vận chuyển tế bào được thực hiện thông qua phần đầu cuối cacboxyl của protein lõi Phần đuôi cacboxyl này sẽ là phần tiếp xúc với lớp vỏ thông qua việc photphoryl hóa phần đầu tận cùng C Vùng đầu cuối C này có một miền đa chức năng Bên cạnh việc tương tác với những protein của tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho việc bám vào các hệ vi ống, nó còn bao gồm một trình tự định vị nhân (NLS) NLS là yếu tố cho việc tương tác với các importin anpha- một adaptor protein cho việc gắn importin beta Importin beta là thụ thể vận chuyển tế bào, thụ thể này gián tiếp gắn vào các sợi của lỗ màng nhân và chuỗi tín hiệu vận chuyển qua lỗ màng và vào vùng nhân

1.1.4.2.3 Quá trình phiên mã các gen của HBV

Một khi genome của virus được đưa vào trong vùng nhân nó chuyển sang một phân tử DNA dạng vòng Khi đó liên kết cộng hóa trị giữ protein P sẽ được loại bỏ khỏi đầu 5’ của chuổi DNA (-) Đoạn ARN được loại bỏ khỏi đầu 5’ của chuỗi DNA (+), trong khi DNA được tổng hợp ở đầu 3’ của chuỗi DNA (+) khiến toàn bộ phân tử DNA trở thành dạng chuỗi kép Đầu kết thúc của mỗi chuỗi được nối lại tạo thành dạng DNA đóng vòng cộng hóa trị cccDNA (covalently closed circular DNA)

Phân tử cccDNA được dùng làm khung cho quá trình phiên mã Các nghiên cứu đã xác định được có bốn promotor trong genome của HBV, những promotor này định vị ở các vùng preS1, preS2, X và pre C của genome Nhưng chỉ duy nhất promotor preS2 có trình tự TATA box Có ít nhất hai promotor có tính đặc hiệu cao đối với tế bào gan, việc này chứng tỏ thông qua một vài yếu tố phiên mã là những protein của tế bào gan Tỷ lệ phiên mã cả bốn promotor được kiểm soát bởi việc các yếu tố phiên mã bám vào hai trình

tự điều hòa tăng cường (enchancer) có sẵn trong genome của HBV Quá trình phiên mã được thực hiện nhờ vào RNA polymerase II của tế bào Sản phẩm của quá trình phiên mã

tạo ra bốn đoạn RNA có kích thước khác nhau Tất cả đều chung trình tự khởi đầu TATA box của promotor preS2 nên sẽ có đầu 3’ giống nhau

Trong quá trình phiên mã có tạo ra đoạn mRNA có kích thước 3,5 kb lớn hơn kích thước của genome 3,2 kb Để tạo ra được đoạn mRNA thì trong quá trình phiên mã, một phần DNA sẽ được phiên mã hai lần Để thực hiện được điều này RNA pol II sẽ phải bỏ qua tín hiệu TATA box trong lần đi qua đầu tiên Các nghiên cứu cho thấy việc bỏ qua này được kiểm soát bởi một trình tự DNA PET Trình tự này cho phép RNA pol II bỏ qua TATA box trong lần đi qua đầu tiên nhưng sẽ không cho qua ở lần thứ hai

1.1.4.2.4 Quá trình dịch mã

Quá trình dịch mã xảy ra ở bên ngoài nhân nhờ vào các ribosome Sau khi tổng hợp, các mRNA được đưa ra ngoài và thực hiện quá trình dịch mã tạo thành các loại pro-tein virus như: protein bề mặt HBsAg (L,M,S), protein lõi, DNA polymerase, protein X

Đoạn mRNA 2,4 kb tổng hợp nên protein L, trong khi đoạn 2,1 kb tổng hợp nên protein S và prtein M của kháng nguyên bề mặt HBsAg Đoạn 3,5 kb tổng hợp nên pro-tein lõi (protein C) và DNA pol (protein P) Đoạn mRNA nhỏ nhất kích thước 0.9 kb tổng hợp nên protein X Ngoài ra đoạn gen C và pre C còn tổng hợp nên kháng nguyên lõi HBeAg

1.1.4.2.5 Tổng hợp genome virus

Bên cạnh việc tổng hợp protein C và P, đoạn 3,5 kb còn có chức năng như là tiền genome Đoạn RNA tiền genome này được sử dụng như là khuôn để tổng hợp nên ge-nome DNA của virus

Sau khi được tổng hợp, một phân tử protein P cùng một số loại protein của tế bào

sẽ bám vào phân tử RNA 3,5 kb Protein P bám vào một đoạn trình tự có cấu trúc bậc 2, đoạn này nằm ở phía trong tín hiệu kết thúc lặp và xuất hiện cả ở hai đầu 3’ và đầu 5’ của RNA Nhưng protein P chỉ bám vào đoạn trình tự ở đầu 5’ và quá trình tổng hợp genome bắt đầu nhờ các enzyme như: Enzyme phiên mã ngược, DNA pol II Quá trình tổng hợp mạch DNA bắt đầu ở đầu 5’, một đoạn mồi gốm 4 nucleotide được tổng hợp ở đầu 5’ nhờ

thúc lặp ở đầu 3’ của RNA Sự tổng hợp được tiếp tục ở đầu 3’ của RNA, sợi DNA tiếp tục kéo dài theo chiều 5’ đến 3’ Trong khi mạch DNA được kéo dài thì sợi RNA sẽ được phân hủy từ đầu 3’ nhờ vào sự xúc tác của enzyme RNaseH Toàn bộ sợi DNA được tổng hợp hoàn tất, sợi RNA cũng được phân hủy hết trừ một đoạn trình tự ngắn ở đầu 5’ Đoạn DNA (-) đóng vòng và sợi DNA (+) được tổng hợp dựa trên mạch khung của sợi DNA

Quá trình tổng hợp nên genome của virus có sự tham gia của enzyme phiên mã ngược có vai trò chuyển đoạn RNA-pre genome thành genome Sự phiên mã ngược có tính đột biến cao, những genome tạo ra có thể sẽ không giống hoàn toàn so với genome ban đầu Chính sự đột biến này có thể làm thay đổi cấu trúc các protein bề mặt, sinh ra những kháng nguyên có cấu tạo khác với kháng kháng nguyên ban đầu Đây chính là một

cơ chế giúp HBV có thể thoát khỏi sự tiêu diệt của hệ thống miễn dịch

1.1.4.2.6 Lắp ráp tạo hạt virus hoàn chỉnh

Sau khi genome và các protein cấu trúc được tổng hợp, quá trình lắp ráp được tiến hành tạo hạt virus hoán chỉnh Protein C sẽ tạo thành lớp protein lõi bao bọc lấy genome Sau đó lõi virus sẽ được bao bọc bởi lớp vỏ nền có chứa kháng nguyên bề mặt

1.1.4.2.7 Giải phóng

Sau khi trưởng thành, hạt virus HBV được đưa đến màng tế bào và giải phóng ra ngoài theo con đường ngoại bào và không gây tổn thương đến tế bào gan Thực tế HBV không gây hại trực tiếp đến tế bào gan mà là do chính sự hoạt động của hệ thống miễn dịch trong cơ thể

Thông thường, trong khâu giải phóng ở vòng đời virus, các hạt virus mới sau khi tổng hợp sẽ thoát ra ngoài theo con đường phá vỡ thành tế bào và gây chết tế bào nhiễm virus Virus viêm gan B lại là một trường hợp cá biệt Trong quá trình thoát ra ngoài, các hạt virus thoát ra ngoài theo con đường ngoại bào nên không phá vỡ thành tế bào, không gây chết tế bào

1.1.5 Các con đường lây truyền của viêm gan B

Virus viêm gan B là một loại virus hướng gan, gây ra bệnh viêm gan Sau khi

phát hiện trong một lần đi kiểm tra sức khỏe nào đó mà thôi Nếu không được theo dõi và điều trị đúng những người bị nhiễm virus viêm gan B sẽ chuyển thành viêm gan mãn tính,

có thể dẫn tới xơ gan, ung thư gan… từ đó có thể dẫn đến tử vong cho người bệnh

 Lây truyền qua đường tình dục

Thường gặp ở các nước phát triển nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái Các nghiên cứu cho thấy, yếu tố nguy cơ lớn nhất giữa có quan hệ tình dục qua đường hậu môn và số lượng nhiều bạn tình, cũng như các hoạt động hoặc các bệnh kèm theo gây tổn thương hậu môn hoặc niêm mạc đường sinh dục

 Lây qua đường máu và các sản phẩm máu bị nhiễm virus

Máu và các sản phẩm của máu được xác nhận là nguồn chứa virus gây nhiễm Vì vậy tất cả những ai có nguy cơ tiếp xúc với máu, hoặc các sản phẩm của máu và các dịch tiết có chứa virus đều có thể nhiễm bệnh và mắc bệnh Yếu tố nguy cơ ngày càng gia tăng

ở những người hiến máu tình nguyện nhiều lần, người bị bệnh Hemophilie, chạy thận nhân tạo…

Ngoài truyền máu, nhiễm virus viêm gan B còn gặp ở các trường hợp: nội soi, phẫu thuật, thủ thuật xẻ nhọt, khâu vết thương trên da, châm cứu, xăm hình… không đảm bảo vô trùng

Những người nghiện ma túy là đối tượng được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm Ở các nước có tỉ lệ lây nhiễm cao và trung bình ở Châu Á như Việt Nam thì tần suất HBsAg dương tính trong nhóm tiêm trích ma túy cao hơn hẳn so với nhóm dân cư

 Lây truyền từ mẹ sang con

Trong giai đoạn 3 tháng đầu của thai kì thì tỷ lệ lây nhiễm từ mẹ sang con là 1% Nếu mẹ bị bệnh ở 3 tháng giữa của thai kì thì tỷ lệ lây nhiễm sang con là 10% Ở 3 tháng cuối của thai kì nguy cơ lây nhiễm tăng cao tới 60-70% Sau khi sinh thì nguy cơ truyền bệnh cho thai nhi lên đến 90% nếu không có biện pháp bảo vệ ngay sau khi sinh

Viêm gan B chủ yếu lây qua ba con đường chính trên và phần lớn thì không lây trong sinh hoạt hằng ngày Virus có thể qua các tổn thương vi thể ở da, niêm mạc để xâm

nhập vào hệ thống tuần hoàn của người lành Người mang virus đào thải ra ngoài môi trường rất lâu dài, vì thế được coi là nguồn bệnh nguy hiểm trong cộng đồng

1.1.6 Tình hình nhiễm virus viêm gan B trên thế giới và Việt Nam

1.1.6.1 Trên thế giới

Nhiễm virus viêm gan B là một vẫn đề có tính chất toàn cầu bởi HBV xuất hiện ngay cả ở các quần thể dân chúng sống cách biệt và sống trên các hòn đảo Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và cách thức lây truyền có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng khác nhau trên thế giới Trên cơ sở điều tra huyết thanh học các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan

B, đặc biệt là HBsAg, mức độ nhiễm viêm gan B được chia thành ba mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp

 Vùng dịch lưu hành cao Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn Độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc Cực như Eskimo, Maoris

Ở những khu vực này nhiễm HBV từ rất sớm, ngay từ khi mới sinh và trẻ nhỏ Phương thức lây truyền chính là từ mẹ sang con (nhiễm trong thời kì chu sinh hay còn gọi

là lây truyền dọc) hoặc lây truyền ngang trong lứa tuổi nhỏ: 60- 90% trẻ sơ sinh nhiễm HBV từ các bà mẹ có HBsAg đồng thời với HbeAg dương tính; 90% số trẻ này lớn lên trở thành người mang HBsAg mạn tính Do dịch lưu hành cao nên trên 40% số trẻ sinh ra

từ các bà mẹ không mang HBsAg ở vùng này sau 5 tuổi cũng bị nhiễm HBV [18] Vì nhiễm trùng ở trẻ nhỏ thường không có triệu chứng, do đó tỉ lệ người lành mang virus và mắc các bệnh liên quan đến nhiễm virus viêm gan B như viêm gan mãn tính, ung thư gan,

xơ gan trong cộng đồng này xảy ra rất cao

Ngoài ra, tiêm chích ma túy, quan hệ tình dục bừa bãi cũng đóng vai trò làm tăng tỉ

lệ nhiễm HBV trong cộng đồng

 Vùng lưu hành dịch trung bình

43% dân số thế giới nằm trong vùng này, gồm những vùng có tỷ lệ mang HBsAg mạn tính 2-7% và số người lớn đã bị nhiễm HBV 20-50% bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu, hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ Phương thức lây truền tại đây rất đa dạng, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn Đối tượng nhiễm virus viêm gan B trong thời kì chu sinh sẽ trở thành người mang virus mãn tính có nguy cơ lây lan cao trong cộng đồng Tình trạng lây truyền dọc chỉ chiếm 10-20%

 Vùng lưu hành thấp

Đó là những vùng mang tỷ lệ HBsAg mạn tính dưới 2%, và dưới 20% số người lớn

đã từng nhiễm HBV bao gồm các nước như Mỹ,Canada, Tây Âu, Úc, NewZealand, Bắc

Mỹ, Nam Mỹ Phương thức lây truyền chính là lây truyền ngang ở lứa tuổi trưởng thành, đối tượng có nguy cơ cao thường gặp là những người tiêm trích ma túy, đồng tính luyến

ái, nhân viên y tế, người được truyền máu hoặc lây nhiễm trong gia đình người bị nhiễm virus viêm gan B

1.1.6.2 Tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng có nguy cơ rất cao về nhiễm virus viêm gan B Tỷ lệ người nhiễm virus trong cộng đồng dân cư dao động trong khoảng 10-26% tùy theo từng

đối tượng (một trong những tỉ lệ nhiễm cao nhất thế giới) Năm 2008, theo thống kê của WHO, ở nước ta số người tử vong do ung thư gan là 21.748 người, gấp 2 lần so với người chết do tai nạn giao thông năm 2012 Số bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B trên 8 triệu người so với số bệnh nhân nhiễm HIV-AIDS là 210.000 người (năm 2012) Con số tử vong liên quan đến virus viêm gan do xơ gan, ung thư gan, viêm gan virus cấp và mãn tính đã gây ra cái chết cho 10 vạn người mỗi năm

Bảng 1.3: Tỷ lệ người mang HBsAg trong cộng đồng người Việt Nam

Bệnh viện Thống Nhất 3,25

1.029 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan tại

Viện Quân Y 108

23,12

Trên 452 bệnh nhân viêm gan virus cấp tại

Viện Y học lâm sàng các bệnh Nhiệt đới

75,6

1.2 Các phương pháp chẩn đoán viêm gan B

1.2.1 Phương pháp miễn dịch

1.2.1.1 Phương pháp dựa trên nguyên lý sắc kí miễn dịch (que thử)

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch được sử dụng để định tính được sự có mặt của kháng nguyên (kháng thể) có trong huyết thanh hoặc huyết tương Hiện nay, dạng que nhúng đã được thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng nguyên virus HBV trong mẫu máu (huyết tương) Que nhúng này có chứa 1 kháng thể kháng virus HBV được gắn cộng hợp với các hạt vàng dạng keo tụ (phức cộng hợp vàng) Kháng thể kháng virus HBV có nguồn gốc từ dê được cố định tại vị trí kiểm tra của que nhúng (vạch kiểm tra) Một kháng thể khác kháng kháng thể trong phức cộng hợp vàng cố định tại vị trí đối chứng (vạch đối chứng) Nếu trong mẫu máu có chứa kháng nguyên virus HBV thì khi đưa que nhúng vào sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể - hạt vàng Khi phức hợp này di chuyển dọc theo que nhúng tới vị trí kiểm tra hình thành một vạch màu hồng tía và thể hiện trạng thái dương tính Phần cộng hợp còn lại không gắn với kháng nguyên

di chuyển tới vị trí đối chứng cho vạch màu hồng tía chứng tỏ que nhúng hoạt động bình thường, kết quả có giá trị Như vậy khi xuất hiện cả hai vạch hồng tía ở vạch kiểm tra và vạch đối chứng, chứng tỏ mẫu dương tính với virus HBV; khi chỉ có một vạch hồng tía ở

vị trí đối chứng kết luận mẫu âm tính

a Xác định kháng nguyên HBsAg

HBsAg (Hepatitis B surface antigen) là một protein có tính kháng nguyên Sự có mặt của HBsAg trong huyết thanh hoặc huyết tương cho thấy dấu hiệu của sự bị lây nhiễm virút Viêm gan B cấp hoặc mãn tính, HBsAg bị phát hiện từ 2 đến 4 tuần trước khi men gan ALT có biến đổi khác thường và từ 3 đến 5 tuần trước khi có triệu trứng của bệnh hoặc triệu chứng vàng da Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm nhanh định tính phát hiện sự có mặt của HBsAg trong huyết thanh hoặc huyết tương Kit thử này sử dụng sự hoá hợp của các kháng thể đơn dòng và đa dòng vô tính để phát hiện một cách có chọn lọc nồng độ lên cao của HBsAg trong huyết thanh hoặc huyết tương

Theo công bố của hãng Alere Determine, Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) chỉ phát hiện sự có mặt của kháng nguyên bề mặt vi rút Viêm gan B trong mẫu phẩm, không thể phát hiện ra HBsAg khi nồng độ HBsAg trong mẫu phẩm thấp hơn 1 ng/mL, kit thử này không thể sử dụng để xét nghiệm định lượng giá trị cũng như tốc độ tăng lên của nồng độ HBsAg

Hình 1.4: Nguyên lý xác định kháng nguyên HBsAg (http://tapchi.vnha.org.vn)

viêm gan B là 10mIU/ml Tuy nhiên, có tới 5-15% người có khả năng miễn dịch tốt lại không có đủ lượng kháng thể tương ứng

Theo công bố của hãng ABON BIOPHARM, kit thử HBsAb mang tính định tính với ngưỡng phát hiện là 10 mIU/ml, không xác định được giá trị và tốc độ gia tăng của nồng độ HBsAb trong mẫu bệnh phẩm [4]

Hình 1.5: Nguyên lý xác định kháng thể HBsAb (http://tapchi.vnha.org.vn)

c, Xác định kháng nguyên HBeAg

Xét nghiệm HBeAg là một xét nghiệm đánh giá bệnh nhân bị nhiễm viêm gan B có

sự hoạt động virus không (Xét nghiệm theo dõi kháng nguyên sớm nhân lên của virus viêm gan B, có giá trị theo dõi sự đang nhân lên của virus viêm gan B) Nếu HBeAg

dương tính, mặt khác cũng đánh giá sự chuyển đổi huyết thanh sau một thời gian điều trị viêm gan B, nếu trước đó HBeAg âm tính, sau điều trị có HBeAg dương tính nói lên có

sự chuyển đổi huyết thanh

 Ưu nhược điểm của phương pháp

 Ƣu điểm:

- Chẩn đoán nhanh;

- Ít tốn kém;

- Có thể chẩn chính xác bệnh ở trong hoặc ngoài phòng thí nghiệm;

- Không cần sử dụng trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên trình độ cao

 Nhƣợc điểm:

- Độ chính xác không cao bằng các phương pháp khác;

- Không thể sử dụng để định lượng giá trị cũng như tốc độ tăng lên của nồng

độ kháng nguyên (kháng thể);

- Mỗi que thử chỉ xét nghiệm được một mẫu

1.2.1.2 Phương pháp ELISA sandwich

ELISA là phương pháp phát hiện kháng nguyên thích hợp nhất cho các nghiên cứu giám sát quy mô lớn ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật miễn dịch để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu xét nghiệm Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Đây là những phương pháp rất nhậy dùng để phát hiện tự kháng thể với nồng độ thấp Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được Phương pháp này có khả năng phát hiện HBV với nồng độ là 600 IU/ml Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml Kháng nguyên sau đó được phát hiện nhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng 1 kháng thể đặc hiệu virus HBV bậc 2 được gắn với enzyme Giới hạn phát hiện của phương pháp >

lượng lớn mẫu.Thời gian phân tích 2-3 giờ (Kelkar et al., 2004) Phương pháp định lượng

bằng ELISA có khả năng sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vì không đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng, không tốn tiền và thao tác không phức tạp, việc đánh giá kết quả đơn giản

Hình 1.6: Nguyên lý phương pháp ELISA sandwich

(http://www.epitomics.com/images/products/sandwich.jpg) 1.2.1.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang ( ECLIA)

Phương pháp dùng để định tính và định lượng kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg) trong huyết thanh và huyết tương người Sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học Vì vậy, có khả năng phát hiện chất

có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh chỉ trong vòng 18 – 20 phút Phương pháp này

được sử dụng tương tự như ELISA, nhưng thời gian nhanh hơn tuy nhiên không hợp với

cỡ mẫu lớn

Hình 1.7: Nguyên lý phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang [19]

- Thời gian tiến hành ngắn (18 phút);

- Làm được nhiều mẫu cùng lúc;

- Độ nhạy vào độ chính xác cao;

- Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo

1.2.1.4 Phương pháp miễn dịch phóng xạ(Radio Immuno Assay-RIA)

Phương pháp miễn dịch dùng đánh dấu phóng xạ, được Rosalyn Yalow và Solomon Aaron Berson phát triển vào những năm 50 Tương tự như phương pháp ELISA, bản chất của phương pháp miễn dịch phóng xạ cũng là sự kết hợp kháng nguyên- kháng thể Nhưng thay vì dùng enzyme làm thay đổi màu cơ chất như ELISA, phương pháp này dùng phóng xạ gắn vào kháng nguyên RIA là phương pháp có độ nhạy cao nhưng nhược điểm của nó là yêu cầu thiết bị hiện đại và chi phí lớn Đặc biệt, RIA có sử dụng chất phóng xạ nên yêu cầu nghiêm ngặt về an toàn trong quá trình thí nghiệm Chính vì vậy, RIA dần được thay thế bằng ELISA trong đó chất phóng xạ được thay bằng chất phát quang

1.2.1.5 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá huỷ tính chất đặc hiệu của kháng thể Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp này được phát triển dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho các gen virus HBV khác nhau Với ưu điểm: có thể xác định chính xác các đột biến điểm xảy ra; độ nhạy và độ chính xác cao Bên cạnh đó, phương pháp vẫn còn những hạn chế: nếu mẫu có nồng độ thấp khi sử dụng phương pháp sẽ cho kết quả sai lệch; phương pháp này vẫn còn gặp phải các vấn đề các probe bắt cặp không đặc hiệu gây sai lệch trong xét nghiệm; khó khăn trong việc thiết kế các probe đặc hiệu để hạn chế sự bắt cặp sai nói trên

1.2.2.2 Kỹ thuật PCR

HBV có phần lõi là DNA tức là acid nhân chứa đựng thông tin di truyền của virus Virus viêm gan B một khi nhân bản hoàn chỉnh thì sẽ tạo được một virus hoàn chỉnh.Xét nghiệm PCR- HBV DNA tức là xét nhiệm tìm xem trong máu của bệnh nhân có mang vi-

Phương pháp này có độ nhạy rất cao có thể phát hiện ở nồng độ thấp vài phân tử, tương đối nhanh và có độ tin cậy cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi các thiết bị chuyên

dụng và các nhân viên phải được đào tạo chuyên sâu, nguyên vật liệu đắt đối với Realtime PCR định lượng

Hình 1.8: Nguyên tắc kỹ thuật PCR

1.2.2.3 Phương pháp lai thấm điểm

Mẫu thử sẽ được biến tính bằng kiềm và nhiệt độ cao Mẫu biến tính được cố định lên màng lai thành các điểm và lai với mẫu dò RNA đánh dấu phóng xạ Tín hiệu lai được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Kích thước và cường độ của mẫu thử sẽ được so sánh với các mẫu HBV DNA đã biết nồng độ,từ đó chúng ta suy ra lượng HBV DNA có

trong mẫu thử

1.2.2.4 Khuyếch đại tín hiệu bởi bDNA

Là một kĩ thuật lai phân tử gữa HBV DNA với những probe bắt cặp bổ xung với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa Đây là một phương pháp phát hiện

và định lượng trực tiếp Phương pháp này cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh

có nồng độ HBV DNA từ 200000 đến 12000000 phân tử DNA/1 ml máu Các genotype của HBV cũng có ảnh hưởng đến việc định lượng HBV Giữa các genotype có độ nhạy chênh lệch nhau từ 1,5 đến 3 lần

lấy mẫu tách chiết DNA nhân DNA đặc hiệu điện di nhuộm DNA phân tích kết quả