Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens

Đây là những loài vi khuân an toàn, sỏ' hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sàn sinh chất kích thích sinh tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

C H Q G H N

BÁO CÁO TÔNG KÉT KÉT QUẢ TH ựC HIỆN ĐÊ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất

kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacìllus

amylolique/aciens

Mã số đề tài: QG.13.12

Chủ nhiệm đề tài: TS Trịnh Thành Trung

Hà Nội, 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

CKQG8.N

BÁO CÁO TỎNG KẾT KÉT QUẢ THỰC HIỆN ĐÈ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất

kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus

am ylolique/aciens

Mã số đề tài: QG.13.12

Chủ nhiệm đề tài: TS Trịnh Thành Trung

Hà Nộị, 2016

PHẢN I T H Ô N G T I N CHƯNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phươ ng p h á p tách chiết chất kháng sinh diệt

nấm gây bệnh thực vật t ừ vi k h u ẩ n B acillus am ylolique/aciens

1.2 M ã số: QG.13.12

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

"ĩ

1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

1.5 Thòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo họp đồng: 24 tháng từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 05 năm 2015

1.5.2 Gia hạn (nếu có): 12 tháng đến tháng 05 năm 2016

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quà nghiên cíni và to chức thực hiện; Nguyên nhân; Y kiến cùa Cơ quan quàrì lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 160 triệu đồng

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:

1 Đặt vấn đề

Sử dụng phân bón vô CO' và các loại thuốc hóa học phòng trừ sâu bệnh trong sàn xuất nông nghiệp đang gày ra những tác động tiêu cực đến độ mầu mỡ cùa đất, hủy hoại môi trường sống và làm ành hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh và bền vững là vấn đề tất yêu của mọi quốc gia và phân bón hữu CO' sinh học đang là giải pháp ưu thê được

nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thê giới (Bhardwaj et al.,

2014) Phân bón hữu cơ sinh học không chi cung cấp các loại chất dinh duững nhàm duy trì và ổn

định độ phi nhiêu cho đất mà còn cung cấp các loại vi sinh vật có lợi cho sự phát triển của cây

trồng Các vi sinh vật thường bồ sung vào phàn bón hữu cơ sinh học bao gồm Rhizobium (vi khuẩn

cố định nitơ sống cộng sinh), Aiospirillum (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), Bacillus (vi khuẩn phân giải phosphate khó tan và sàn sinh các chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas và

Trichoderma (vi khuân và nấm sợi sàn sinh các chất phòng trừ bệnh cây) (Fravel, 2005).

Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái Bacillus có khà năng sinh nội bào tử, một dạng nghi của tế bào để giúp vi

khuẩn có thể chổng chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi cúa môi trường như khô hạn và thiếu

dinh duởng Theo hệ thống phân loại hiện nay, chi Bacilhis có khoảng gần 300 loài và các loài phụ

1

dưới ioải (Parte, 20 i 4) Trơng số đó, Bacillus velczensìs (hay còn gọi là B amỵlolique/aciens subsp

planturum , B methylotrophicus và B oryzicolà) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis (Rooney et al., 2011; Dunlap et a l, 2015) Đây là những loài vi khuân an toàn, sỏ' hữu nhiều

đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sàn sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sàn sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm cùa các loại vi sinh vật gây bệnh

(Chovvdhury et al., 2015; Shao et a i, 2015; Li et al., 2015) Do sở hữu các đặc tính quý, nhiều chủng vi khuẩn B velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đấu tranh sinh học hoặc bổ sung vào các loại phân bón hữu cơ sinh học Một số chủng như B velezensis

FZB42 cũng đã được sàn xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng

trừ bệnh cây (Chowdhury et al., 2015) Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quà sử dụng các chửng B

vele iem is trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do

vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra (Chen et al., 2014; Huang et al., 2014; Wu et al., 2015; Kang

et a i, 2015) Sàn lưọng bông thu hoạch cũng tăng lên 30% khi bồ sung chủng B veleiensis FZB42

vào phàn bón (Yao et al., 2006)

Nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn có tiềm nãng ứng dụng trong sàn xuất chế phẩm làm phân hữu CO' sinh học, trong nghiên cứu này, chúng tôi trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho

cây trồng từ các chủng vi khuẩn B velezensis có trong bộ sưu tầm vi khuân Bacillus thu thập tại các vùng Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo Ngoài ra, chùng vi khuẩn B velezensis

SP1901 phân lập được từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng Liên cũng được sử dụng

Bacillus velezensis là một trong số tám loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sublilis (Rooney

et al., 2009) Đây là loài vi khuẩn an toàn, sỏ' hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả

năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây

chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh (Chovvdhury et al., 2015; Shao et al., 2015; Li et al., 2015) Do sờ hữu các đặc tính quv, vi khuẩn B velezensis được nhiều nhà khoa học

quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giái mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên

cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B

velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đâu tranh sinh học đê

phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng

B velezensis sán sinh ra nhiều loại chất trao đồi bậc hai có hoạt tính kháng nâm và kháng vi

khuẩn gây bệnh cây Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore

và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias et a i, 2009; Huang et al., 2014) Lipopeptide cấu tạo từ

chuỗi peptide liên kết với acid béo, được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases

(NRPS) Giải mã hệ gene của các chủng B velezensis cho thấy hơn 9% hệ genome của vi khuẩn mang các gene tham gia sinh tổng hợp lipopeptide (Chovvdhury et al., 2015) Dựa vào cấu trúc phân

tứ và đặc tính sinh học, lipopeptide sản sinh từ Bacillus và Paenibacillus được chia thành 3 nhóm

chính là lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương, lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương và lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương (Cochrance, Vederas, 2014) Surfactin, iturin và fengycin là các lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương thường được tìm thây

trong dịch nuôi cấy cùa các loài B subtilis (Stein, 2005; Ongena, Jacques, 2008) Bên cạnh đó, nhiều chùng B velezensis còn có khả năng sàn sinh đồng thời các polyketide là difficidin, bacillaene và macroìactin (Argueiles-Arias et u i, 2009; Yuan et a i, 2012).

Trong quá trình tìm kiếm các chùng vi khuẩn có khả năng ứng dụng trong đấu tranh sinh

học để phòng trừ các bệnh hại cây, chúng tôi đã phân lập được chủng B velezensis CP 1604 trong

dất nông nghiệp gần vườn Quốc gia Cúc Phương có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh

cây là Sclerotiiim hydrophilum, Rhizoctonia soỉani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum và

vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzcie (Trung et al., 2016) Trong nghiên cứu này, chúng

2

tôi tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định bàn chất của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra từ chùng CP i 604.

2 M ục tiêu

- Tuyển chọn đưọc một chủng vi khuẩn Bacillus am ylolique/aciens sinh chất kháng nấm mạnh

nhất

- Nghiên cứu điều kiện lên trên qui mô 5 lít

- Tách chiết và thu hồi chất kháng nấm

- Tinh sạch và xác định bàn chất sinh lý hóa của chất kháne nấm

- Đánh giá độ an toàn của chất kháng nấm

3 P hư ơ ng p h á p nghiên cứu

C h ủ n g vi khuẩn nghiên cứu

Từ bộ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ phân lập tại 4 vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch

Mã, Chư Yang Sin và Côn Đào, chúng tôi tiến hành so sánh tính tương đồng cao nhất cùa đoạn gen 16S rRNA so với các chúng chuẩn cúa các loài trong cơ sỏ' dữ liệu Eztaxon-e ('http://eztaxon-

methylotrophicus và B oryzicola Từ ống lưu giữ lạnh sâu ở -70°c, các chủng vi khuẩn lựa chọn

được ria hoạt hóa trên môi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) tại 30°c Sau

24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ dùng cho các thí nghiệm mô tà dưới đây

Xác định khả n ă n g sinh c h ấ t k h á n g nấm và c h ấ t k h á n g k h u ẩ n

Từ các tế bào đã hoạt hóa, các chùng vi khuẩn được cấy trải đều trên mặt thạch TSBA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) và được ủ ở 30°c Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, khoanh thạch được đục bàng ống nhựa

15 g) đã cấy sẵn các loài nấm kiêm định gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum , Scleroúum

hydrophilum , R hizoctonia solani và Phytophthora capsici hoặc đặt lên môi trường NA đã cấy vi

khuẩn kiểm định gây bệnh bạc lá lúa là X anthom onas oryzae Ngoài ra, phổ hoạt tính kháng nấm

Sacchciromyces cerevisiae Bộ giống các chùng vi sinh vật kiểm định này đang được lưu giữ tại Bào

tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Viện Vi sinh vật và Công nfihệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

Xác định khả n ă n g sinh enzym e ngoại bào

Từ các tế bào đã hoạt hóa, chủng vi khuẩn đưọc cấy vào binh tam giác 250 mi chứa 100 mỉ môi trưòng TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể Sau 48 giờ nuôi cấy lắc 160 v/p

ờ 30°c, dịch nuôi được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút nhầm loại bỏ tế bào vi khuẩn Khả năng sinh enzyme ngoại bào được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch Theo đó dịch nuôi cấy

loại cơ chất là tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein và tributyrin Sau 24 giờ ủ đĩa thạch chứa cơ chất ở 37°c, hoạt tính amylase và CMCase được xác định dựa trên vòng trong-phân giải cơ chât tinh bột tan và C M C xung quanh khoanh thạch khi nhuộm với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase

và chitinase được quan sát khi nhuộm cơ chất xylan và chitin với dung dịch đỏ công gô; hoạt tính protease và lipase được quan sát trực tiếp trên cơ chất casein và tributyrin

Xác định khả n ă n g p h â n giải p h o s p h a te khó tan

Chùng vi khuẩn đã hoạt hóa đưọc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch

M n S 0 4 H20 0,002 và F e S 0 4 7H20 0,002) Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ơ 30°c, dịch nuôi vi khuấn được ly tâm ỏ' 8.000 v/p trong 10 phút để loại bo té bào Hàm iuựrig phosphaíe vô cơ giải phóng từ

3

Ca3(P0 4 ) 2 vào mỏi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp xanh molybden dựa trên

Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trư ớ ng IAA

Chủng vi khuẩn đã hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch thể NA có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) tới nồng độ cuối là 5 mM Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30°c, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ỏ' 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào Khà năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (1AA) được xác định dựa trên phản ứng tạo mầu với thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) Hàm lượng IAA sinh ra được xác định dựa trên đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức)

Dấu vân tay re p - P C R và phân tích tính tương đồng kiểu gen

Từ các khuẩn lạc thuần khiết, ADN tổng số được tách chiết theo phưong pháp cùa Gabor et

al (2003) Mức độ tinh sạch của ADN được kiêm tra dựa trên chỉ sô bước sóng A2 6 0/A2 8 0 (xâp xi1,8) Sau đó, 50 ng ADN cùa từng chủng vi khuẩn được đưa vào ống PCR có thể tích phàn ứng cuối cùng [à 25 |il chứa sằn DreamTaq™ PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientiíìc, Mỹ) Phàn ứng

Sàn phẩm PCR được điện di trong 2 giờ tại 65 V trên gel agarose 2% có bổ sung chất nhuộm ADN RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di được chụp trên hệ thống soi gel (BioRad, Mỹ) Mô hình băng ADN (hay kiều gen) tạo ra từ mỗi chùng vi khuẩn được phân tích và được mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0 Tính tương đồng về kiểu gen được tính toán theo hệ số Dice Mối quan hệ về kiểu gen của các chùng đưọc thể hiện theo SO’ đồ cây sử dụng thuật toán UPGMA Tât cả các bước phân tích tính tương đông kiêu gen được thực hiện trên phân mêm NTSYSpc 2 1

P h â n tích trình t ự đ a gen và xây dựng cây phát sinh c hủng loại

polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha ipolC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và

được gửi lên ngân hàng gen với các số hiệu lần lượt là KU9048IỌ, KU9048I1, KU9Ọ4812 KU904813, KU904814 và K.U9048I0 Trình tự đa gcn của chủng vi khuân nghiên cứu có chiêu dài

5.547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gỵrA, đoạn 964 bp của gen rpoB, đoạn 875

bp cùa gen purH đoạn 777 bp của gen p o ic , đoạn 835 bp của gen groEL và đoạn 1,168 bp của gen

được tài về từ ngân hàng gen NCBI (http://wvv\\ ncbi.ním.nih.íiov/') Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000 lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05

Tách chiết chất k há ng nấm và kháng khuẩn

Từ dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào, chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tách chiết bàng 4 phương pháp là (i) sử dụng dung môi hữu cơ, (ii) hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, (iii) đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết bằng ethanol và (iv) tủa ở pH thấp Các phương pháp tách chiết được lặp lại 2 đến 3 lần theo quy trình như sau:

đưa vào các dung môi có độ phân cực khác nhau là benzen, l-butanol, chlorotbrm, ethyl acetate, hexan, 2-pentanoi vá tuiuene theo tỷ ỉệ ỉ : 1 Sau khi đảo trộn mẫu trong 10 phút,

dịch nuôi cấy và dung môi Phần dung môi phía trên được thu lại và cô quay ờ nhiệt độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thứ hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

4

II Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amber!ite-XAD7 được đưa vào dịch nuôi cấy theo tý lệ 1 : 5 (khối lưọng/thể tích) Hỗn hợp này được khuấy nhẹ qua đêm trên máy khuấy từ ỏ' nhiệt độ 4°c Sau đó, hạt amberlite đơọc thu lại và rửa liên tiếp 3 lần với nước cất, 1 lần với ethanol 30% Hạt amberlite được khuấy nhẹ với ethanol 75% trong 4 giờ

(He et a i, 2007) Chất kháng sinh thô thôi ra trong ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt

độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

vòng/phút trong 2 giờ nhằm chiết rút chất kháng sinh thô Phần ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cât và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định

qua đêm ờ 4°c Sau đó, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút Phân cặn tủa được thu lại và hoàn nguyên với nước cất Hoạt tính kháng sinh thô trong cặn tủa được thử với nấm và vi khuẩn kiểm định

T inh sạch chất k há ng nấm và kháng k huẩ n

Chất kháng nấm và chất kháng khuẩn đưọc tinh sạch bàng kỹ thuật HPLC sử dụng cột Zorba.\ Eclipse XDB - C18 (4,6 X 250 mm, 5 |il, Agilent Technologies, USA) Phương pháp tinh

sạch HPLC được thực hiện theo mô tả cùa He et al 2007 Theo đó, pha động sử dụng methanol và

nuớc chứa 0,05% triíluoroacetic acid Sau khi cân bàng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 |il dịch kháng sinh tách chiết theo 2 bước bàng dung môi I - butanol và hạt amberlite-XAD7 được tải lên cột Dung môi hệ động được thay đổi tuyến tính theo nồng độ methano! từ 20% lên 40% trong 10 phút, từ 40% lên 60% trong 5 phút và từ 60% lên 70% trong 10 phút Tốc độ dòng cùa cả quá trình sắc ký là 0,5 ml/phút sắc ký-đồ được ghi nhận tại bước sóng 220 nm Sau khi bị thôi ra khòi cột, các phân đoạn sẳc ký (0,5 ml/phân đoạn) được thu nhận, cô quay loại bỏ dung môi và thử hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn Sau đó, các phân đoạn có hoạt tính được trộn lại vói nhau và được tinh sạch lại một lần nữa theo chu trình sắc ký mô tà như trên Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được gửi sang Trung tâm các Phương pháp Phồ ứ n g dụng - Viện Hóa Học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ để xác định phổ khối

Xác định đặc tính sinh hóa lý của c h ấ t kháng nấm và kháng k h u a n

Khả năng bền nhiệt độ, bền pH và bền với các enzyme thủy phân của chất kháng nấm và chất kháng khuân được thử nghiệm như sau:

100°c Sau thòi gian xứ lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bàng phưong pháp khuếch tán thạch như mô tà ở trên

đệm citrate-phosphate và pH 8,0 đến 9.0 trong đệm Tris-HCI Sau 24 giờ ủ ở 4°c, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bẳng phương pháp khuếch tán thạch như mô tà

ở trên

lipase và proteinase K được pha trong đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml Sau đó dịch tách chiết chất kháng sinh được lần lượt trộn đều với các dung dịch enzyme theo tỷ lệ 1 : 1 và được ủ ở 37°c Sau 2 giờ xử lý, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn đưọc xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tà ờ trên

T h ử nghiệm tính an toàn của chất k há ng nấm và kháng khuấn

Tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn sán sinh từ chùng B amyloliquefaciem subsp plantarnm CP 1604 bước đầu được thử nghiệm trên khả náng nảy mầm của hạt thóc, hạt lạc

và hạt ngô; và thử nghiệm khá năne sinh trường của các ioại cây ìúã, cây lạc và cây ngô Qua đó

5

chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng nưóc cất và các loại hạt kể trên đưọc ngâm trong 3 giò' trong dung dịch pha loãng nàv Sau đó, hạt được đưa lên lớp bông ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ỏ- 25°c Độ ẩm của bông được kiểm tra hàng ngày

trong nước cất trước khi ù mầm

Nhằm đánh giá tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn lên sự sinh trưởng của cây non, mầm hạt cây tại các mẫu đối chứng được trồng ra đất Sau 5 - 7 ngày khi cây đã phát triên

ồn định, chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được phun đều lên bề mặt các lá Đối chửng là nưó'c cất phun đều lên bề mặt lá Màu sắc lá được quan sát hàng ngày Sau 5 ngày thử nghiệm, kích thước lá I và 2 được ghi lại và so sánh

4 T ổng kết kết quả nghiên cứu

B am ylolique/aciens subsp p lantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau

Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành thu thập 79 mẫu đất tại 4 vườn Quốc gia và các vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận là Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đào 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ đã được phân lập bàng phương pháp xử lý nhiệt [45] Dựa trên các đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuấn lạc, 252 (17,5%) chủng đã được giải trình tự gen 16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp) So sánh trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chùng có chi sô

tương đồng gen 16S rRNA cao nhất với chủng B cimylolique/ciciens subsp plantarum FZB42 là

tưong đồng cao nhất với các loài B methylotrophicuỉi và B oryzicola.

Trong số 14 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum , 3 chùng phân lập được ở Cúc

Phương, 3 chủng phân lập được ỏ- Bạch Mã, 5 chủng phân lập đ ư ọ o ở Chư Yang Sin và 3 chùng

chủng là BM 1912 và CĐH 1701 phân lập trong đất rừng Ngoài ra, B amylolique/aciens subsp

plantarum SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng Hoàng Liên cũng được nghiên cứu Thông tin chi tiết

H oạt tính kháng nấm và vi khuẩn

Cùng với chùng SP 1901, 14 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum trong nghiên cứu này đều sinh chất kháng nấm gây bệnh cây là F oxysporum , s hydrophilum R solani và p capsici

với kích thước vòng kháng nấm trung bình đối với từng loại nấm lần lượt là 4,2 mm, 10,6 mm, 7,7

mm và 7,4 mm Các chùng B amvlolique/aciens subsp plantarum thử nghiệm đều sinh hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa X oryzae với kích thước vòng kháng trung bình là 20,8 mm

Ngoài ra, hoạt tính kháng nấm cùa các chùng vi khuấn cũng thế hiện rất rõ ràng khi thử nghiệm với

2 loại nấm sợi và I loại nấm men thường gặp là A oryzae, A niger và 5 cerevisiae (Bảng 2) Điêu

đó chứng tò ràng các chung B am yitìiiqueỳaaem subsp planiarum phản lập trong môi trường tự

nhiên của Việt Nam sinh chất có phổ hoạt tính rộng kháng nấm và kháng khuẩn

Độ tu o ng đồng (%)

Số hiệu đoạn 16S rDNA tham chiếu

macrolactin) Giống như các chủng đã công bố, 15 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum

phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam đều có khả sàn sinh chất kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh cây

Trong số các loài vi khuẩn ứng dụng làm chế phẩm phòng trừ các loại bệnh hại cây trồng,

Bacillus được chú trọng nghiên cửu vì vi khuẩn có khà năng tạo nội bào tử để có thể tồn tại lâu

trong chế phẩm ở điều kiện bào quản thưòng Nhiều chùng B amylolique/aciens subsp

amylolique/aciens hoặc B amylolique/aciens đã được công bố về khà năng đối kháng với các loại

vi sinh vật gây bệnh cây trồng in vitro như chủng L-H15 đối kháng nấm F oxyspom m [22]; chùng S76-3 đối kháng nấm F graminearum [20]; chùng GR53 đối kháng nấm R solanì [32]; chùng

C N U 114001 đối kháng với 12 loại nấm gây bệnh cây là Alternaria panax, Botrytis cinerea,

Colletotrichum acutatum , c orbiculare, Curyne.spura cassicola, F oxysporiim, Penicillium digitatum, p capsici, R sôlani, Stemphliyum lycopersici, Pyricularia grisea và Sclerotinia sclerotioritm [30] Nhiều chủng B amvlolique/aciens subsp plantarum có khả năng phòng trừ và

giảm thiểu bệnh cho cây trồng khi thử nghiệm trong nhà kính như dịch nuôi cấy và dịch tế bào của

chùng NJZJSB3 đã bào vệ iá cây cải dầu chống lại hoàn toàn sự xâm nhiễm cúa nấm Sclerotinia

sclerotiorum [48]; lạc xừ lý với chủng BZ6-I đã giảm được tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do R

solanacearum từ 84,5% xuống 12,1% [47] Hon nữa, khi bổ sung vi khuẩn B amyloliqite/aciens

subsp plantarnm vào phân hữu cơ làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh của cây trồng như chùng S20 làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearnm trên cây cà tím từ 56% xuống còn 22% [7]; chủng HR62 làm giảm tỳ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum trên

cây cà chua xuống 65% [27] Chính vì vậy, nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá khá năng thúc đẩy

sự sinh trường, phát triển và tạo năng suất cho cây trồng là việc làm cần thiết nhàm tìm kiếm các

phân bón hữu cơ sinh học phù họp với các điều kiện đất canh tác nông tại Việt Nam

Báng 2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuân

Hoạt tính kháng nàin và vi khuân (D - d, mm)

Enzym e ngoại bào

Thử nghiệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy cả 15 chủng B amylolique/ciciens subsp

plantarum đều sinh các enzyme ngoại bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và

chitinase Kích thước vòng phân giải trên từng loại cơ chất là tương đương nhau và được thể hiện chi tiết trong bảng 3

Bảng 3 Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào

K há năng phân giải phosphate khó tan và sinh c h ấ t kích thích sinh trư ở n g IAA

15 chùng B amyìolique/aciens subsp plantarum đều có khà năng phân giải phosphate khó

19,64 - 74,21 |xg/ml Bên cạnh đó, một số chủng cũng có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA khá rõ ràng như chủng CDH 0101 (3,28 (ig/ml) và SP 1901 (1,98 |ig/ml): một số chung sinh hàm lượng IAA rất thấp như CP 1604 và CYS 0101 (Bàng 4)

Bảng 4 Khá năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA

ũ,(59 ± 0,09 1,41 ±0,05 1,40 ±0,04 1,18 ± 0,07 1,07 ±0,08

i ,44 i 0,04

Từ kết quả trên cho thấy, bên cạnh khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kháng vi

khuẩn gây bệnh hại cây, các B amylolique/aciens subsp pỉanlarum chùng này đều có khả nãng

phân giãi phosphate khó tan và một sô chúng như CĐH 0101 và SP 10901 có khá năng sinh chât kích thích sinh trưởng !AA khá rõ ràng trong môi trường nuôi cấy (Bàng 3.4) Các đặc tinh có lợi

cho cây trồng như này cũng đã được công bố trên một số chủng B amylolique/aciens subsp

plantarum [28, 35] Ngoài ra, tất ca các chùng B velezensis đều sinh các enzyme thủy phân ngoại

bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase Đây là những đặc tính quan trọng nhăm thúc đây quá trình phân hủy các chât hữu cơ và là cơ sở đê lựa chọn các chủng vi khuân nàyứng dụng trong sản xuất chế phẩm ủ phân compost hoặc bổ sung chủng vói phân bón hữu cơ nhàmthúc đẩy sự phát triển của cây trồng

Phân tích đa dạng kiểu g en của các ch ủng B am ylolique/aciens subsp pla n ta ru m

Phân tích dấu vân tay r e p - P C R

í§|§|f|pỊ|ỈỊ'

D íc e CCXÍĨ1C1*L1JÍ

Hình 1 Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bàng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sừ

dụng mồi ERIC cùa các chủng B amylolique/ucỉens subsp plantarum phân lập tại các vùng sinh

thái khác nhau của Việt Nam

Nhẩm phân tích tính đa dạng về mặt di truyền cùa các chung vi khuẩn B amylolique/aciens subsp

plantarum phân íặp tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam, kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR

sử dụng 2 loại mồi ERIC và GTGs đã được thực hiện Đối với mồi ERIC, phản ứng PCR đã tạo ra

11 loại băng ADN nằm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp s ố lượng băng ADN tạo ra cho

kiểu ?en với 3 nhóm chủng có cùng mô hình băng ADN là chúng CP 1604, CP 1801 và SP 1901; chủng BM 0621 và CYS 0208; và chùng BM 0824, CYS 0101, CL)H OiOi, CDH 0102 và CDH

9

1701 Năm chủng còn lại gồm CYS 0816, CYS 0901, BM 1912, CYS 091 I và CPI205 sở hữu riêng một loại kiểu gen khác nhau (Hlnh 1) Tucmg tự, đối với mồi G T G 5, phản ứng PCR đã tạo ra

15 loại băng ADN nàm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp s ố lượng băng ADN tạo ra cho

kiểu gen Trong đó, chủng CDH 0101 và CDH 0102 được xếp vào cùng 1 nhóm (Hình 2)

P hân tích trìn h tự đ a gen

- PCR, trình tự đa gen của chùng CP 1604 được phân tích và so sánh với chủng SP 1901 Trình tự

nucleotide Trên cây phát sinh chùng loại, chúng SP 1901 và CP 1604 nàm tách biệt ở 2 nhóm B

velezensis khác nhau (Hình 3) Điều đó chứng tỏ một phần là kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử

dạng di truyền trẽn loài B cimyloỉìque/aciens subsp plantarum.

0 0 0 ố-i 0 92 * ' I.

L>c? vxciBotĩr

H ình 2 Sơ đồ cây về mối tưong đồng kiều gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử

thái khác nhau cùa Việt Nam

B amylolique/aciens subsp plantarum là một trong số 8 loài vi khuẩn thuộc nhóm B

subtilis [40] Đây là loài được đề xuất đặt tên đầu tiên vào năm 2005 với tên gọi B velezensis sau

khi phát hiện về khả năng sinh các chất hoạt động bề mặt và iipopeptide kháng khuẩn [41] Nãm

2010, Madhaiyan và cộng sự đã mô tà loài B methylotrophicus phân lập từ đất vùng rễ lúa ở Hàn

Quốc Bên cạnh khả năng sử dụng methanol triethylamine và ethanol như nguồn carbon, loài vi khuẩn này còn có khá năng sinh các chất như IAA và ACC deaminase kích thích cây trồng phát triển [35] Năm 201 1, Boriss và cộng sự đã phát hiện ra một nhóm chúng vi khuẩn gần gũi với

chùng B am yloliqiie/aciem FZB42 có khá năng sống nội cộne sinh trong rề Arabidopais trong khi

đó nhóm chùng vi khuẩn gần gũi với chửng B amyloliqite/acien.s DSM 7 không có khá nãng này Dựa trên kêt quả lai DNA, B am yloiiqueỊaclem đưực tách i‘ă thành 2 loài phụ !à B

amvloliíịIIefaciens subsp plantantm và B amvlolique/acien.s subsp amylolique/aciens [4] Gân đây,

Chung và cộng sự đã mô tá một loài B oryzicola sống nội cộng sinh trong rễ lúa có khả năng kích

thích thực vật phát triển, sinh chất kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh cây và có khả năng tăng cường

hệ miễn dịch cùa thực vật N01 Do sò' hữu nhiều đặc tính có lọi quan trọng cho cây trồng, các loài

10

vi khuân kè trên đà nhận dưọc nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu; hơn 30 chủng phân iập từ cáo vùng sinh thái khác nhau đã được giải trình tự toàn bộ genome để tìm hiểu về mối tương tác giữa vi khuẩn và vật chù sống nội cộng sinh [13] Song song với đó, hệ thống phân loại cùa các loài

vi khuẩn kể trên cũng được kiểm chứng lại So sánh in silico toàn bộ hệ genome cho thấy cà bốn

loài vi khuẩn kể trên đều có hệ số tương đồng ADN - ADN lớn hơn 84% (khác với chỉ số lai ADN -

ADN thực nghiệm trước đây) Chính vì vậy, B methylotrophicus, B amylolique/aciens subsp

aniylolique/aciens và B oryzicola được chi định lại về tên loài được đặt ban đầu là B velezensis

1 0 0

100 B acillus v e le ie n sis N RR L B-23 189

B acillus v e íe ien sis N RR L B-23 190 BaciHus v e le ie n sis N R R L BD-621

B acillus vele:en sis FZB42

B a cillu s v e leie n sis Mito-5-13 Bcicillus v e le ie n sis Mito-7-4

99 B acillus ve!e:ensis T ik u se i-1 4 - 1

S P 1901

100 178 B acillus v e le ie n sìs Hitachio om iy a-8-2

B a cillu s v e le ien sis N R R L BD-557

ị - C P 1604

- B a cillu s v e le ie n sis N R R L BD-545 93ị'oo - B acillus ve!ezensis N R R L B - 4 1 5 8 0

B a cillu s v ele:en sis N R R L B-4257

0 0 BaciHus v e le :e n sis N RR L BD-569

100 B acillus veleren sis N RR L BD-568

B acillus a m ylo liq u e/a cien s N RR L BD-601

B a cillu s a m vlo lìq u e/a cien s DSM 7

B a cil/u s cim \'loliquefaciens N R R L B-14393 Bcicillus a tro p h a e u s N R R l N RS -2 13

BaciH us m ojcivensis N R R L B - 14698 BaciHus v a l/ism o rtis N R R L B - 14890 BaciHus su b lilis subsp su b lilis N R R L N RS -7 4 4

B a cillu s leq u ilen sis N R R L B-41771

I - BaciH us su b tilis subsp in a q u o so ru m NR.RL B-230 52

100 — B a cillu s s u b ú lis subsp s p i:i:e n ii N R R L B-2 30 49

Bcicillus lich en ifo rm is DSM 13

B acillus so n o ren sis N R R L B-23154

Hinh 3 Mối quan hệ giữa chúng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng loại và các loài vi

rpoB ,parH , p o ic , groEL và I S rRNA

Tổ họp kết quà cùa kỹ thuật rep - PCR sư dụng 2 loại mồi ERiC và GTG;, cho thấy có 14

loại kiều gen trong số 15 chủng tí amylolique/aciens subsp plantarum nghiên cứu Chi có duy nhất

2 chủng CĐH 0101 và CĐH 0102 phân lập từ I mẫu đất có kiểu gen tương đồng nhau Kết quả rep

- PCR được kiểm chuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự đa gen khi 2 chùng SP 1901 và CĐH 1604 phân tách rõ ràng trên cây phát sinh chùng loại Điều đó chứng tò có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền

của các chủng B velezensis phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.

Tối ưu điều kiện lên m en

LB, 1/5 LB), chùng CPỈ604 sinh trường tốt nhất trên môi trường TSB với giá trị ODéoonm sau 24

nhất (D-d lần lượt là 30 mm và 9 mm), trong khi đó với môi trường 1/5 TSB chùng vi khuẩn này sinh trưởng kém hơn rõ rệt (ODóoonm = 1,4; hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm D-d tương ứng là

20 mm và 5 mm) Tương tự, trên môi trường LB và NA, chung vi khuẩn sinh trưởng và sinh chất kháne khuẩn và kháng nấm cao hơn đáng kể so với môi trường tương ứng 1/5 LB và 1/5 NA; tuy nhiên tất cà các chi số trên đều nhỏ hơn trên môi trường TSB Do vậy chúng tôi chọn môi trường TSB cho những nghiên cứu về sau

Nhiệt độ được xem là một yếu tố quan trọng anh hưởng đến khá năng sinh trưởng cũng như kha năng sinh các chất có hoạt tính sinh học cùa vi sinh vật Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ từ 20°c đến 40°c để khảo sát ảnh hướng cùa nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cùa chủng CP1604 Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 35°c

kháng khuẩn và kháng nấm lại thể hiện tốt nhất ờ nhiệt độ 30°c, giá trị D-d tương ứng là 29 mm và

9 mm Với mục đích tối ưu điều kiện lên men thu chất kháng khuẩn và kháng nấm, nhiệt độ 30°c được lựa chọn để cho nghiên cứu tiếp theo

Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng nhất định đến sinh trưởng cũng như hoạt tính sinh học của chủng vi sinh vật Trong nghiên cứu này, chủng Ế P I6 0 4 sinh trưởng tốt nhât (OD6 0 0nm=2,8) khi được nuôi khuấy ò' tốc độ 150 vòng/phút, đây cũng là điều kiện thích hợp cho khà năng sinh chất kháng khuẩn và kháng nấm (D-d tương ứng 34 mm và 12 mm)

Tốc độ thông khí là một yếu tố ảnh hưởng then chốt đến sinh trưởng cùa vi sinh vật hiếu khí

nói chung và nhóm vi khuẩn Bacillus nói riêng Với bốn tỉ lệ thông khí 50, 75, 100 và 125% được

nghiên cứu, kết quá thí nghiệm cho thấy chủng CP1604 sinh trường tốt nhất ở ti lệ thông khí 75%

khuẩn và kháng nấm cùa chung vi khuẩn nghiên cứu (D-d tương ứng là 37 mm và 15 mm)

Trong nghiên cứu về ánh hưởng của thòi gian đến sinh trướng và khả năng sinh chất kháng khuẩn và kháng nấm tại thời điểm sau 48 giò' lên men, chúng vi khuẩn nghiên cứu đạt giá trị ODôoonm cực đại (2.9); tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn lại cao nhất sau 36 giờ nuôi (D-d=34 mm), hoạt tính kháng nấm cao nhất ở cả giờ nuôi 36 và 48 (D-d= 14 mm)

Như vậy, trong nghiên cứu này, điều kiện lên men thích họp cho chủng CPI604 là môi trường TSB, nhiệt độ 30°c, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ thông khí là 75%, thời gian lên men 36 giờ

12

1 ° 0 o

Tách chiết, tỉnh sạch và x á c định bản chất sin h học của châí kháng nâm và chât khảng k h u â n

từ chủng B amylolique/aciens subsp plantarum CP 1604

So sánh hiệu a u ả tách chiết chất kháng nấm và c h ấ t k há ng k huẩ n

Trong số các chủng B amylolique/aciens subsp pỉantarum nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn

chủng CP 1604 cho các nghiên cứu tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh Nhằm tìm hiêu điêu kiện nuôi cấy phù hợp cho chung CP 1604 sinh chất kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành thừ nghiệm các môi trường nuôi cấy TSB, 1/5 TSB NB, 1/5 NB LB, 1/5 LB ỏ' các nhiệt độ nuôi cây khác nhau

13

và thời gian nuôi cấy khác nhau Kết qua là, chung L p ỉ 604 sinh chất kháng nấm và kháng khuẩn mạnh nhất khi nuôi cấy trên môi truửng TSB ở nhiệt độ 30°c sau thòi gian 36 giờ.

Từ dịch nuôi cấy chùng CP 1601, chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được tách chiết bàng 4 phương pháp khác nhau Đối với phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ, chất

có hoạt tính được chiết rút mạnh nhất trong dung môi I - butanol và 2 - pentanol Hoạt tính khángnấm không xuất hiện khi dịch nuôi cấy được tách chiết bàng chloroform và hexan nhưng hoạt tính kháng khuẩn vẫn duy trì khá cao khi tách chiết bằng chloroform Điều đó chứng tỏ có sự khác nhau

về tính tan trong các dung môi khác nhau nên dịch nuôi cấy chủng CP 1604 có thể chứa 2 chất kháng nấm và kháng khuẩn riêng biệt nhau

Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn thu được khá cao khi tách chiết bằng phương pháp hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 và tách chiết với ethanol từ cặn đông khô Cặn tủa trong pH thấp cùa dịch nuôi cấy cũng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn nhưng hoạt tính kháng thấp hơn so với các phưong pháp còn lại (Bảng 5)

T inh sạch c h ấ t k há ng nấm và kháng khuẩn

T ừ kết quà thu đưọc ở trên, chất kháng sinh thô chuẩn bị cho tinh sạch được tách chiết liên tiếp bàng 2 phương pháp nhàm loại bỏ các tạp chất không mong muốn Đầu tiên, dịch nuôi cấy chùng CP 1604 được tách chiết với dung môi hữu cơ I - butanol Sau đó, dịch kháng sinh đưọ-c tiếp tục tách chiết bằng phương pháp hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 và được thôi ra ở nồng độ ethanol 75% Kết quả kiểm tra bằng máy HPLC cho thấy đường sắc ký đồ sau khi tách chiết 2 lần

có nhiều đình rõ ràng hon so với dịch chiết 1 lần bằng 1 - butanol Chất kháng sinh thô này sau đó được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC Kết quả thừ nghiệm hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn ỏ'

gian 5,328 phút và chất có hoạt tính kháng khuẩn được thôi ra ở thời gian 15,313 phút (Hình 4) Điều đó chứng tỏ chùng CP 1604 đã sản sinh ra 2 loại chất có hoạt -tính kháng nấm và kháng khuân khác nhau

Bảng 5 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn cùa dịch chiết thô

Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)

Fusarium oxysporitm

Xanthomoncis oryzae

1

Dungmôihữucơ

sạch từ dịch nuôi cấy chùng B amylolique/aciens subsp plantarum CP 1604.

Xác định các tính c h ấ t của chất kháng nấm và k h á n g khuẩn

Phổ khối của chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuấn được phàn tích (Hình 5) Trên

1043) Trên bản phổ ion âm, khối lượng phân tử của chất kháng khuẩn được xác định là 402 Da (M

- H+ — 4 0 1)

tính khi ở trong dung dịch đệm có pH axít trong khi đó hoạt tính khápg nấm và vi khuẩn vẫn duy trì tôt ở dung dịch đệm có pH bazơ (Bàng 7) Hoạt tính kháng nâm và kháng vi khuân cùa 2 chât cũng không bị ành hưởng bởi các enzyme thủy phân trypsin, a-chymotrypsin, amylase, lipase và

B am ylolique/aciens subsp plantarum (hay còn gọi là B velezensis, B methylotrophicus

hoặc B oryzicola) là một loài vi khuẩn sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trông, đặc biệt là khả nãng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây [13] Do đó, nhiều chùng B

a m yloliquefaciem subsp plantarum phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau đã được ứng dụng

trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh cây Nhiều chất có hoạt tính sinh học từ loài B

velezensis đã đưọc nghiên cứu nhăm làm rõ bàn chât câu trúc hóa học cũng như cơ chê tân công của

chất kháng sinh đến các vị trí đích cùa vi sinh vật gây bệnh Từ bộ sưu tầm chùng B

am yloliqite/aciens subsp plantarum phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam, chủng

CP 1604 chứng minh có khả năng sinh chất kháng nấm và kháng khuân mạnh kháng lại các ioại

nấm hại cây tà F oxysporum , s hydrophilum, R solani, p ccipsici và vi khuẩn gây bệnh bạc lá X

oryzae Chất hoạt tính này đều có thể tách chiết vói hiệu quá tương đương bằng các phương pháp

hấp phụ trong hạt amberlite-XAD7, chiết trong ethanol từ dịch đông khô, tủa ở pH thấp hoặc chiết băng các dung môi hữu CO' là 1 - butanol và 2 - pentanol Kêt quà tinh sạch băng HPLC cho thây chất kháng nấm và chất kháng khuẩn là hai chất khác nhau được thôi ra ở hai thời điêm khác nhau Phân tích khối phổ cho thấy, bên cạnh các mảnh phổ khối được quan sát thấy trên bàn phổ ion dưong, mảnh có khối lượng phân tử giống iturin A (M + H* = 1043) được tìm thấy trong phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm Tương tự mành có khối lượng phân tử giống macrolactin A (M - H T = 401) được phát hiện thấy trên bàn phổ ion ầm của phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn Điều đó chứng tỏ chủng CP 1604 sản sinh đông thòi 2 chất kháng nâm và kháng khuân trong dịch nuôi cây

và sự hiệp đồng của 2 chất này giúp cho dịch nuôi cấy của chủng CP 1604 có hoạt tính kháng nấm

và vi khuẩn phổ rộng

nhau Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) khi xử lý ở nhiệt độ 60°c trong 90 phút (1) và 120

trong 30 phút (!), 60 phút (2), 90 nhút í 3ì và n o nhút Í4Ì ĐC là đối chứng

I_ũĐũAmnỉẤậ j

Lipopeptide là các chầt kháng sinh chính sản sinh từ vi khuẩn Bacillus và các chi có quan hệ gần gũi như Paenibacillus và Brevibacillus c h ấ t kháng sinh này được cấu tạo từ 2 thành phần

chính là chuỗi peptide mạch thẳng hoặc vòng liên kết với phần mạch acid béo tại vị trí đầu N cùa peptide Trong số các lipopeptide đã công bố, iturin là được xếp vào nhỏm không mang điện tích dương, có 7 amino acid khép vòng bởi một liên kết amide giữa đầu N của phân tử p - amino acid béo và đầu c của amino acid cuối [11] Iturin thường được tách chiết từ các loài vi khuẩn thuộc

nhóm B subtilis, trong đó có B amyloliqiie/aciens subsp plantarum [37] Dựa trên sự khác nhau về

thành phần cấu tạo chuỗi amino acid và cấu trúc của phân từ acid béo, lớp iturin được chia ra làm nhiều loại với các tên gọi khác nhau là iturin, mixirin, subtulene, mycosubtilin, mojavensin và bacillomycin Kháng sinh lớp iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, iturin tấn công vào thành phần sterol trong màng tế bào nấm, làm tăng tính thấm của ion kali, phá vỡ màng tế bào, làm thoát hoặc bất hoạt các thành phần trong tế bào tế bào nấm, dẫn đến tiêu diệt tế bào nấm [11, 20] Theo các công bố trước đây, iturin A có phô hoạt tính kháng nâm

rộng, kháng lại các loại nấm như Fusarium, Rhizoctonia, Penicillium, Aspergillus và Pyricularia [19, 42] Iturin A sản sinh từ chùng CP 1604 cùng có phổ hoạt tính khang nấm mạnh kháng lại F

oxysporurn, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia soìani, Phytophthorứ capsici, Aspergillus oryzae, Aspergillus rtiger và Saccharom yces cerevisiae.

Bên cạnh lipupeptide, polyketide cũng là một trong những chất trao đổi chính thường đưọ'c

tim thấy trong dịch nuôi cấy cùa vi khuẩn Bacillus Polyketide thường có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng tế bào ung thư [43] Phân tích ADN của chủng B amylolique/ciciens subsp

plantarum FZB42 cho thấy hệ genome có 3 nhóm gene l à p k s \,p k s 2 v à p k sì quy định tổng họp các

vòng có 24 phân tử carbon liên kết với 1 hydrocarbon tại vị trí carbon số 7 Đây là chất được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1989 trong dịch nuôi cấy của một loài vi khuẩn biển và đến nay có khoảng gần 20 loại macrolãctin đã được công bố [5, 21] Trong số đó, macrolatin A có hoạt tính kháng vi khuẩn mạnh nhất, đặc biệt là khả năng đối kháng với một số loại vi khuẩn kháng thuốc

kháng sinh như Siaphylococcus aureus kháng methicillin và Enterococcus kháng vancomycin [31, 39] Macrolactin A đã đưọc phát hiện trong dịch nuôi cấy của một số chùng B amylolique/acỉens subsp planlarnm như chùng GAI [ỉ] và ESB-2 [24] Macrolactin A sàn sinh từ các chủng B

amvlolique/aciens subsp planiarum như HR62 và NJN- 6 đã được chứng minh có hoạt tính kháng

lại các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstom a solanacearnm [27, 49] Macrolactin A sàn sinh từ chùng CP 1604 cũng chửng minh có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá X oryzae Hơn nữa, dịch nuôi cấy của chủng CP 1604 cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc s aureus và E

/aecalis.

Lipopeptiđe từ vi khuẩn Bacillus là các chất trao đổi bậc 2 được sàn sinh theo con đường

sinh tổng peptide không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhò' sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NR.PS) Chất kháng sinh này chứa hồn họp các amino acid dạng D và dạng L, giúp cho chất kháng sinh bền vói các enzyme thủy phân [11]

Điều đó hoàn toàn đúng với chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra tư chùng B

amylolique/aciens subsp plantarum CP 1604 Cà hai chất đều bền với một loạt các protease như

trypsin, a-chymotrvpsin, và proteinase K Ngoài ra, hai chất này vẫn duy trì hoạt tính khi xử lý ở

pH bazơ Iturin A bền nhiệt độ hơn so với macrolactin A

Tliử nghiệm tính an toàn của chất klìáng nấm và chất kh á n g khuẩn

Bước đầu thử nghiệm tính an toàn cùa chất kháng nấm và chất kháng khuân, chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ ành hưởng của các chất này tới sự sinh trưởng và phát triển của một số loại cây trồng Qua đó chất kháng nấm và kháng khuẩn thô được tách chiết bằng 1 - butanol kết họp với hạt amberlite - XAD7 từ dịch nuôi cấy của chùng CP 1604 được pha tới nồng độ ức chế tối thiểu nấm

F oxysporum và được đưa vào thư nghiệm.

18

T h ử nghiệm nẩy m ầm hạt

Các loại hạt lúa, lạc và ngô sau khi ngâm trong dịch kháng sinh thô trong 3 giờ được ủ trong

dài trung bình của các mầm hạt khi xử lý dịch kháng sinh thô vẫn phát triển bình thường như ở mẫu đối chúng (giá trị p đều > 0,05 ở từng phép so sánh) Sau 4 ngày, độ dài mầm của các hạt lúa, lạc và

lần lượt là 2,8 cm, 5,6 cm và 11,9 cm (Bàng 3.9) Điều đó chứng tỏ chất kháng nấm và kháng khuẩn

sản sinh từ chùng B am yloliqiie/aciens subsp plantaram CP 1604 không ảnh hưởng tới sự nẩy

mầm cùa hạt

Bảng 9 Khả năng nẩy mầm của hạt khi xử lý với chất kháng sinh

Tốc độ nảy mầm cùa hạt (GTTB ± KBT, cm)

GTTB = Giá trị trung bình; K.BT = Khoáng biến thiên

T h ử nghiệm khả n ă n g sinh trư ở n g của cây

Hạt nẩy mầm được gieo vào trong đất tới khi cây phát triển ồn định (khoảng 5 - 7 ngày) Sau

đó, dịch kháng sinh thô được phun trực tiếp lên các vị trí của bề mặt lá Quan sát hàng ngày cho

Sau 5 ngày, kích thước lá được đo lại và so sánh Kết qủa cho thấy không có sự khác biệt về kíchthước giữa nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm (giá trị p đều > 0,05 ờ từng phép so sánh, Bàng

3.10) Điều đỏ chứng tỏ chất kháng nấm và kháng khuẩn sàn sinh từ chùng B amylolique/ociens subsp planiarum CP 1604 không ảnh hường tới sự sinh trưởng của các loại cây thử nghiệm.

Bảng 3.10 Khả năng sinh trưởng cùa cây non khi xử lý với chất kháng sinh

Tốc độ sinh trưcrng cùa cây non (GTTB ± KBT, cm)

GTTB = Giá trị trung bình; K.BT = Khoáng biến thiên

Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học tronơ phòng trừ sâu bệnh hại cây không những gây ỏ nhiễm mòi trường ma còn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Do đó, việc tìm kiếm các chất mới có thời gian bán hủy nhanh, tiêu diệt đặc hiệu vi sinh vật đích và có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm [ 12] Vì vậy, nghiên cứu tiếp theo đề thừ nghiệm tính

an toan và hiệu quà phòriy trừ bệnh hại cây ià việc làm cần thiết nhằm tim kiếm khá năne ứng dụng

19

của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn từ chung B amyloliquefac'lèm subsp plantarum CP 1604

trong phát triển nông nghiệp xanh và bền vừng

5 Đ á n h giá về các kết quả đã đ ạ t đưọc và kết luận

Đề tài đã thu được các kết quà như sau:

Hoạt hóa và nghiên cứu trên 15 chủng B amylolique/aciens subsp plantanim phân lập từ

các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam có sự đa dạng cao về mặt di truyền

Các chủng này đều có khà năng sinh tổng họp các chất kháng nấm và vi khuẩn gây hại cây trồna Ngoài ra, các chùng này còn có khả năng phân giài phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trường thực vật IAA và sản sinh hàng loạt các enzyme thủy phân như lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase

Chùng B am ylolique/aciens subsp plantarum CP 1604 sản sinh chất kháng nấm và chất

kháng khuẩn Dựa trên phân tích khối phổ, chất kháng nấm được xác định là iturin A có trọng lượng phàn tử là 1042 Da và chất kháng khuẩn là macrolactin A có trọng lượng phân

tử là 402 Da

Chất kháng nấm bền nhiệt nhung chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính khi bị xử lý ở 100°c

Cá hai chất nàv đều giảm hoạt tính ỏ’ pH axít nhưng duy trì hoạt tính ở pH bazơ Hoạt tính kháng nấm và kháns khuẩn không thay đổi khi xử lý với các enzyme thủy phân là trypsin, a-chvmotrypsin amylase, lipase và proteinase K

Bưó’c đầu thử nghiệm tính an toàn cho thấy chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sản sinh từ chúng CP 1604 không ảnh hircrng đến sự nẩy mầm và sinh trưởng của các loại hạt thóc, hạt lạc và hạt ngô

6 Tóm tắt kết q u ả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tiếng Vièt:

Bacillus am ylolique/aciens subsp plantarum là một loài thuộc nhổm vi khuẩn B siibtìlis Do sở

hữu nhiêu đặc tính quý có lợi cho cây trông, loài vi khuân này đang nhận được nhiêu quan tâm

nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây và tăng năng xuất cây trông 15 B

am ylolique/aciens subsp plantarum phân lập được ở các vùng Hoàng Liên, Cúc Phương, Bạch Mã,

Chư Yang Sin và Côn Đào đã được phát hiện có hoạt tính kháng các loại nấm hại cây là Fusarium

oxysporum , Sclerotium hydrophilum, Rhizoctunía solani, Phytnphthura capsici và vi khuân gây

bệnh bạc lá Xanthom onas oryzae Hơn nữa, các chùng này còn có khả năng phân giải phosphate

khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật 1AA và sản sinh nhiều enzyme thủy phân như lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase Phân tích đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng 2 mồi ERIC vá GTGs cho thấy mồi GTGs phân tách tôt hơn

mồi tạo ra 14 loại kiểu gen Kết quả đa dạng di truyền đó được kiểm chứng bàng kỹ thuật giài trình

tự đa gen của 2 chùng CP 1604 và SP 1901 vói sự phân tách rõ ràng trên cây phân loại Từ dịch

nuôi cây của chùng CP 1604, chât có hoạt tính kháng nâm Fm arium oxysporum và kháng khuân

Xanthom onas oryzae đểu có thể tách chiết được bằng phương pháp hấp phụ trong hạt amberlite-

XAD7, chiết trong ethanol từ dịch đông khô, tủa ở pH thấp hoặc chiết bàng các dung môi hữu cơ là

I - butanol và 2 - pentanol Kết quà tinh sạch bầng HPLC cho thấy chất kháng nấm được thôi ra ỏ' thòi gian 5,328 phút và chất kháng khuẩn được thôi ra ỏ' thời gian 15,313 phút Băng phương pháp phân tích khối phổ, chất kháng nấm được xác định là iturin A có trọng lưcmg phân tử là 1042 Da và chất kháng khuấn là macrolactin A có trọng lượng phân tử là 402 Da Chất kháng nấm bên nhiệt nhung chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính rõ rệt khi bị xù' lý ở 100°c trong thời gian 2 giờ Cả hai chất này đều giám hoạt tính ở pH axít nhưng duy trì hoạt tính ờ pH bazơ Hoạt tính kháng nâm vá kháng khuẩn không thay đổi khi xứ lý với các enzyme thúy phân là trypsin, a-chymotrypsin, amylase, lipase và proteinase K Vói khà năng sinh các loại enzyme thúy phân và sinh các chất có lợi cho cày trồng, các chúng CP 1604 có tiềm năng ứng dụnR đế tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ sinh học

20

Tiếng A n h:

Bacillus am yloliqueỊaciem subsp plantcirum is a species belonging to the bacterial group o f B subtilis Due to various beneílcial traits to plants, the bacterium has been received considerable

attention for application in disease control and crop productivity In this study, 15 B

amylolique/aciens subsp plantarum strains isolated from various regions o f Hoang Lien, Cuc

Phuong, Bach Ma, Chu Yang Sin and Con Dao vvere demonstrated antagonistic activity against

phythopathogenic fungi o f Fusơrium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani and

Phyíophíhora capsici and rice blight bacterium Xanthomonas oryzae Those strains were capable of

produceđ a series o f hydrolytic enzymes such as lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase and chitinase Analysis o f genetic diversity based on rep - PCR fingerprinting technique shovved that

pattỉrns o f both primers shovved 14 different genotypes in 15 5 velezensis strains Using multilocus

sequencing technique, genetic diversity was confirmed bv a clear discrimination o f strain CP 1604 and SP 1901 in tvvo different clusters on phylogenetic tree From liqưid culture o f CP 1604,

subitances vvith activity against Fusarium oxv.sporum and Xcmthomonas oryzae were extracted by

means of adsorption with amberlite-XAD7, extraction from lyophi 1 ized powder using ethanol, precipitation at low pH and extraction with organic solvents o f I - butanol and 2 - pentanol The subìtances were subsequently purified by HPLC Antiíungal substance vvas eluted at 5.328 min vvhile antibacterial substance was observed at 15.313 min Mass spectrometry analysis shovved that antifungal substance vvas iturin A with molecular weight o f 1042 Da and antibacterial substance was macrolactin A with molecular weight o f 402 Da The antifungal substance vvas stable at high

Boih substances reduced activity at low pH but the activities maintained at high pH The activities against íưngal and bacterium were not affected when treated with hydrolytic enzymes such as trypsin, a-chymotrypsin, amylase, lipase and proteinase K Due to the possession of many beretìcial traits to plants and production o f hydrolytic enzymes, the CP 1604 strains in this study ha\e potential application on preparation o f bio-fertilizer

PHÀN III SẢN P H Á M , C Ô N G BÓ VÀ K É T QUẢ ĐÀO T Ạ O CỦA ĐÈ TÀ I

21

quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

Cột sán phầm khoa học công nghệ: Liệt kê các thông tin các sàn phãm K H C N theo thứ tự

<tèn tác già, tèn công trình, tên tạp chí/nhà xuất bản, so ph á t hành, năm phát hành, trang đăng công trình, m ã công [rình đăng tạp chí/sách chuyên khảo (DOI), loại tạp chí ISI/Scopns>

Các ấn phàm khoa học (bài báo, báo cáu KH, sách chuyên khao ) chi đươc chấp nhân nếu

có ghi nhận địa c h i và cảm ơn tài trợ của Đ H Q G H N theo đúng quy định.

Ban phò tỏ loàn văn các ấn phâm này phai đưa vào phụ lục các minh chímg cùa báo cáo Rièng sách chuyên khao cần có bán phô lô bìu, irang đầu và [rang cuối có ghi thông tin mã số xuât ban.

3.3 Kết quả đào tạo

Thòi gian và kinh phí tham gia đề tài

(số tháng/so tiền)

Công trình công bô liên quan

(San phẩm KHCN, luận án, luận

vãn)

Đã bảo vệNghiên cứu sinh

PH À N IV T Ô N G H Ợ P K É T QUẢ C Á C SẢN PH Ẩ M K H & C N VÀ Đ À O T Ạ O CỦA ĐÈ TÀ I

đ ă n g ký

Số lượng dã hoàn thành

ISI/Scopus

bản

tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa

học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

hàng của đơn vị sử dụng

chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

23

PH AN V T ÌN H H Ì N H s ử DỤNG K IN H PHÍ

Kỉnh phí được duyệt

(triệu đong)

Kinh phí thực hiện

(triệu đỏng)

Ghi chú

- Cần nghiên cứu triển khai ứng dụng các chủng B am yloliquefaciem subsp plantcirum trong sàn

xuất các loại phân bón hữu CO' sinh học có khả năng phòng c h ố n g các bệnh cây.

- Cần đánh giá hiệu quả tiêu diệt bệnh cùa chất kháng nấm và chất kháng khuẩn trên cây nhiễm bệnh

PHÀN VI P H Ụ L Ụ C (minh chứng các sản phẩm nêu ờ Phần III)

V IỆ N H À N L Â M K H O A HỌC & C Ô N G N G H Ệ V IỆ T N A M T r ụ s ở T ò a s o ạ n

N guyễn P h ư ơ n g Liên, Đào T hị L ư ơ n g , D ư ơ n g Văn H ợ p

Ban biên tập T ạ p chí C ông nghệ Sinh học xin thông báo tới nhóm tác giả về bài báo nhan đề: “ T iề m n ă n g ứ ng d ụ n g tạo chế p h ẩ m làm p h â n bón híru cơ sinh học t ừ các c hủng

vi k h u ẩ n B a cillu s velezensis phâir lập từ các vùng sinh thái kh á c n h a u tại Việt N a m ” đã

xong thủ tục phàn biện và chờ xếp đăng trong thời gian tới

Xin chân thành cảm ơn và mong tiếp tục nhận được sự hợp tác!

ì T<XV( , B Ỉ Ẻ > TạP

K hoa Vi khuẩn, Viện K iểm định Q uốc gia vắ c xin và Sinh p h ẩ m Y tế2

T á c giả liên hệ: T rịnh T h à n h T rung

T Ó M T Ắ T

B acillus v e le ie n sis là m ột loài thuộc n hóm vi khuẩn B subtilis D o sở h ữ u nhiều đặc tính

quý có lợi cho cây trồng, loài vi khuẩn này đang nhận được nhiều quan tâ m nghiên c ứ u ứng dụng

trong phòng trừ b ệnh hại cây và tăng năng xuất cây trồng 15 c hủng B v elezen sis p h â n lập được

ở các vùng Hoàng Liên, C úc Phương, Bạch M ã, C h ư Y ang Sin và C ôn Đ ảo đã được phát hiện có

hoạt tính kháng các loại nấm hại cây là F usarium oxysporum , S c le ro tiu m hydrophilum ,

R hizoctonia solani, P h yto p h th o ra capsicỉ và vi khuẩn gây bệnh bạc lá X a n th o m o n a s oryzae H ơn

nữa, các chủng này còn có khả năng phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IA A v à sản sinh nhiều e nzym e thủy phân n h ứ lipase, protease, amylase,

C M C ase, xylanase và chitinase Phân típh đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật dấu vân tay rep -

loại kiểu gen Ket quả đa dạng di truyền đó được kiểm chứng bàng kỹ thuật giải trình tự đa gen cùa 2 c húng CP 1604 và SP 1901 với sự phân tách rõ ràng trên cây p h â n loại V ới k h ả năng sinh

các loại enzyme thủy p h â n và sinh các chất có lợi cho cây trồng, các c h ủ n g B velezen sis này có

tiềm năng ứng dụng để tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ sinh học

T ừ kh ó a : Bacillus velezensis, B a cillu s subtìlis, p h â n bón hữu cơ sin h học, đấu tranh sinh học, vi khuẩn kích thích câ y trồ n g p h ú t triển

M Ở ĐÀ U

Sử dụng phân b ó n vô cơ và các loại thuốc hóa học phòng trừ sâu b ệnh tro n a sản xuất nông nghiệp đang gây ra những tác động tiêu cực đến độ m ầu m ỡ của đất, hủy hoại môi trường sống v à làm ảnh hườ ng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh và bền vững là vấn đề tất yếu của m ọi quốc gia và p h â n bón hữu cơ sinh học đang là giải pháp ưu thế được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên c ứ u và ứng dụ n g rộng rãi

trên toàn thế giới (Bhardw aj et al 2014) Phân bón hữu cơ sinh học k h ô n g chỉ cung cấp các loại

chất dinh dưỡng nhằm du y trì và ổn định độ phì nhiêu cho đất m à còn c ung cấp các loại vi sinh vật có ỉọi cho sự phát triển c ủ a cây trồng Các vi sinh vật thường bổ su n g vào p hân bón hữu cơ

sinh học bao gồm R h izo b iu m (vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh), A zo sp irillu m (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), B a cilỉu s (vi k huẩ n phân giải phosphate khó tan và sản sinh các chất phòng trừ bệnh cây), P se u d o m o n a s và T richoderm a (vi khuẩn và nấm sợi sản sinh các chất phòng trừ

UA„U „AV\ ưCiiii Ỵ J 1 d VI v/ výj }.

Chi B acillu s là m ộ t n h ó m các loài vi khuẩn hiếu khí, G ram dư ơ ng, hình que, phân bô rộng rãi tro n g các hệ sinh thái B a cillu s có khả năng sinh nội bào từ, m ộ t dạng nghi c ủ a tế bào đê

giúp vi k h u ẩ n có thể c h ố n g c hịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi c ủ a m ôi trư ờ n g như khô

hạn và thiếu dinh dưỡng T h e o hệ thống phân loại hiện nay, chi B a c illu s có khoảng gần 300 loài

và các loài phụ dưới loài (Parte, 2014) T rong số đó, B acillus vele zen sis (hay c ò n gọi là B

a m ylo liq u efa cien s subsp p ỉa n ta r u m , B m eth ylo tro p h icu s và B o ry zic o la ) là m ột trong tám loài

vi khuẩn thuộc n h ó m B s u b tilis (R ooney et a i , 2011; D unlap et al., 2015) Đ ây là nh ữ n g loài vi

k huẩn an toàn, sở hữu n hiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như k h ả n ă n g sinh các chất kháng

n ấ m và k háng vi khuẩn gây b ệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trư ở ng thực vật, sản sinh các enzym e thủy p hân và có k h ả n ă n g tăng cư ờ ng tính m iễ n dịch của cây c h ố n g lại s ự xâm nhiễm

c ủa các loại vi sinh vật gây b ệ n h (Chovvdhury et al., 2015; Shao et a i , 2015; Li et a i , 2015) Do

sở hữu các đặc tính quý, n h iề u c h ủ n g vi khuẩn B velezensis đã được p h â n lập, đ á n h giá các đặc

tính có lợi và ứ ng dụng tro n g đ ấ u tranh sinh học hoặc bổ sung vào các loại p hân b ó n hữu c ơ sinh

học M ột số chủng như B v elezen sis FZB42 cũng đã được sản xuât th ư ơ n g mại sừ dụng làm chê phẩm p hân sinh học và chế phẩm phòng trừ bệnh cây (Chov/dhury et al., 2015) N h iề u báo cáo

đã công bố hiệu q uả sử d ụ n g các c hủng B velezensis trong phòng trừ v à làm giảm tỷ lệ nhiêm bệnh cũng như m ức độ n h iễ m bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây b ệ n h cây gây ra (Chen et al., 2014; H uang et a l 2014; W u e t al., 2015; K ang et a i , 2015) Sàn lư ợ n g b ô n g thu hoạch cũng tăng lên 30% khi bổ sung c h ủ n g B velezensis F Z B 42 vào phân bón (Y ao et al., 2006)

N h ằ m tìm kiếm các c hủng vi khuẩn có tiềm n ăng ứng dụng tro n g sản xuất chế phẩm làm phân hữu cơ sinh học, trong ngh iên cứu này, chúng tôi trọng tâm n g h iên cứu các đặc tính có lợi

cho cây trồng từ các c hủng vi k h u ẩ n B velezensis có trong bộ sưu tầm vi khuẩn B acillu s thu thập tại các vùng Cúc Phư ơng, B ạ c h M ã, C hư Y ang Sin và Côn Đảo N g o à i ra, c hủng vi khuẩn B

velezensis SP1901 phán lập đư ợc từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng L iê n cũng được sừ dụng.

V Ậ T LIỆ U VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P

C h ủ n g vi k h u ẩ n n g h iê n c ứ u

T ừ bộ vi khuẩn h iế u khí sinh nội bào tử phân lập tại 4 vườ n Q uốc gia Cúc Phương, Bạch

Mã, C hư Yang Sin và C ô n Đ ảo, c húng tôi tiên hành so sánh tính tươ ng đồng cao nhất của đ oạn gen 16S rR N A so với các c hủng chuẩn của các loài trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) D ự a trên số liệu so sánh, c húng tôi lựa chọn các c hủng có

trình tự gen 16S rR N A tư ơ n g đồng cao nhất với các loài B velezen sis, B a m ylo liq u e/a cien s subsp p la n ta rn m , B m e th y lo tro p h ic u s và B oryzicola T ừ ống lưu giữ lạnh sâu ở -7 0 ° c , các

chủng vi kiiuẩn lựa c họn được ria hoạt h óa trên môi trường thạch N A (Becton, D ickinson and

C om pany, Pháp) tại 3 0 ° c Sau 24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ d ù n g cho các thí nghiệm m ô

tả dưới đày

X ác đ ị n h k h ả n ă n g s in h c h ấ t k h á n g n ấ m v à c h ấ t k h á n g k h u ẩ n

T ừ các tế bào đ ã hoạt hóa, các c hủng vi khuẩn được cấy trải đ ều trên m ặt thạch T S B A (Becton, Dickinson and C o m p a n y , Pháp) và được ủ ở 30°c H oạt tính k háng n ấ m và kháng khuân được kiểm tra bãng p h ư ơ n g pháp kh u ê c h tán thạch Theo đó, k h o a n h thạch được đục băng

20 g và thạch 15 g) đã cấy sẵn các loài nấm kiểm định gây b ệ n h thực vật là F usarium

oxysporum , S cỉero tiu m h yd ro p h ilu m , R h izo cto n ia so la n i và P h y to p h th o ra ca p sici hoặc đặt lên

môi trường N A đã cấy vi k h u ẩ n k iểm định sâ v bệnh bạc lá lúa là X a n th o m o n a s oryzae N goài ra, phổ h o ạ t únh kháng n ấ m c ũ n g được kiểm tra trên các chùng n â m k iêm định là A sp e rg ilỉu s

o ryzae, A n ig er và S a c c h a ro m y ce s cerevisiae Bộ giống các c hủng vi sinh vật kiểm định này

đ a n g được lưu giữ tại B ả o tà n g G iố n g chuẩn Vi sinh vật, V iện Vi sinh vật và C ông nghệ Sinh học, Đại h ọc Q uốc gia H à N ội

X á c đ ị n h k h ả n ă n g s in h e n z y m e n g o ạ i b à o

T ừ các tế bào đã h o ạ t hóa, c h ủ n g vi khuẩn được cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 100

m l môi trư ờ ng T SB (B ecton, D ic k in s o n and C om pany, Pháp) dịch thể Sau 48 giờ nuôi cấy lắc

160 v/p ở 3 0 ° c , dịch nuôi đ ư ợ c ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút nh à m loại bỏ tế bào vi khuẩn

K h ả n ăng sinh e nzym e n g o ạ i b ào đư ợ c xác định bàng p h ư ơ n g pháp k h u ế c h tán thạch Theo đó,

m ộ t trong các loại cơ chất là tinh bột tan, C M C , xylan, chitin, casein và tributyrin Sau 24 giờ ủ đĩa thạch c h ứ a cơ chất ờ 3 7 ° c , h oạt tính a m ylase và C M C a s e được xác địn h dựa trên vòng trong

p h â n giải c ơ chất tinh bột tan v à C M C xu n g q ua nh khoanh thạch khi n h u ộ m với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase và c hitinase đ ư ợ c q u a n sát khi nhuộm c ơ chất xylan và chitin với dung dịch

đỏ công gô; hoạt tính p rotease và lipase đư ợ c quan sát trực tiếp trên c ơ chất casein và tributyrin

X á c đ ị n h k h ả n ă n g p h â n g iả i p h o s p h a t e k h ó ta n

C h ủ n g vi k huẩ n đã h o ạ t h ó a đư ợ c cấy vào bình tam giác 100 ml c h ứ a 25 ml môi trường dịch thể P V K (g/L: glucose 1 0, C a3( P 04 ) 2 5, KC1 0,2, (N H4)2S 04 0,5, N a C l 0,2, M g S 0 4 7H 2Õ

vi khuẩn được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 p h ú t để loại bỏ tế bào H à m lượng phosphate vô cơ

m o ly b d e n d ự a trên đ ư ờ n g c h u â n p h o sp h a te xây dựng từ K H2PO4 (H o lm a n et al., 1943).

X á c đ ị n h k h ả n ă n g s in h c h ấ t k íc h t h í c h s in h t r ư ở n g IA A

C h ủ n g vi khuẩn đ ã hoạt h ó a đư ợ c cấy vào bình tam giác 100 ml c h ứ a 25 ml môi trường

d ịch thể N A có bổ sung L -try p to p h a n (M erck, Đức) tới nồng độ cuối là 5 m M Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 3 0 ° c , dịch nuôi vi k h u ẩ n đ ư ợ c ly tầm ờ 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào

K hả năng sinh chất kích thích sinh trư ởng indole-3-acetic acid (IA A ) đư ợ c xác định dựa trên

p h ả n ứng tạo m ầ u với thuốc th ử Salkovvski (G lickm ann và Dessaux, 1995) H àm lượng IA A sinh

ra được xác định dựa t rê n đ ư ờ n g c h u ẩ n x ây d ự n g từ IA A (M erck, Đức)

D ấ u v â n t a y r e p - P C R v à p h â n tíc h t í n h t ư ơ n g đ ồ n g k iể u gen

T ừ các khuẩn lạc th u ầ n khiết, A D N tổng số được tách chiết theo p h ư ơ n g pháp của Gabor

et al (2003) M ức độ tinh sạch c ủ a A D N được kiêm tra dự a trên chỉ sô bư ớ c sóng A2 6 0/A2 8 0 (xâp

xỉ 1,8) Sau đó, 50 ng A D N củ a từrig c h ủ n g vi khuẩn được đư a vào ốn g P C R có thể tích phản

ứ n g cuối cùng là 25 ỊJ.1 c h ứ a sằn D r e a m T a q M P C R M aster M ix (T h e rm o Fisher Scientiíic, Mỹ)

(2008) đã m ô tả Sản p h ẩ m P C R đư ợ c điện di trong 2 giờ tại 65 V trên gel agarose 2% có bô

su n g chất n huộm A D N R e d S a fe ( iN tR O N Biotechnology, H àn Quốc) H ình ảnh điện di được

c h ụ p trên hệ thống soi gel (B io R a d , M ỹ) M ô hình băng A D N (hay kiểu gen) tạo ra từ m ỗi chủng

vi khuẩn đư ợ c p hân tích và đ ư ợ c m ã h ó a sang hệ ma trận nhị phân 1/0 T ín h tương đồng về kiểu gen được tính toán theo hệ số Dice M ối q u a n hệ về kiểu gen của các c hủng được thể hiện theo

sơ đồ cây sừ dụng thuật toán U P G M A T ất cả các bước p hân tích tính tươ ng đông kiêu gen được thự c hiện trên phần m ề m N T S Y S p c 2.1

P h à n tích t r ì n h t ự đ a g e n v à x â y đ ụ n g c â y p h á t s in h c h ủ n g loại

Phản ứ ng P C R k huếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA ), R N A poly m e rase subunit B (rp o B ), p hosphoribosylam inoim idazolecarbox-am ide form yltransferase

ip u rH ), D N A p olym erase III subunit alpha ipolC ), 60 kD a heat-shock p ro te in groE L (groE L ) và

gen đư ợ c gửi lên n g â n hàng gen với các số hiệu lần lượt là K U 9 0 4 8 1 0 , K U 9 0 4 8 1 1 , K U 904812

K Ư 904813, K U 9 0 4 8 Ị 4 và K U 904810 Trình tự đa gen của c hủng vi k h u ẩ n nghiên cứu có chiều

dài 5.547 bp đư ợ c kết nối theo th ứ tự đoạn 928 bp của gen g yrA , đ oạn 964 bp của gen rpoB ,

đ oạn 875 bp của gen p u rH , đ oạn 777 bp của gen p o i c , đoạn 835 bp củ a gen g ro E L và đoạn

1,168 bp của gen 16S rRNA T rình tự đa gen của các loài quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của

K o b o et al (2011) được tải về từ n gân hàng gen N C B I (h ttp ://w w w n c b i.n lm n ih g o v /) Cây phát

sinh c hủng loại được xây d ự n g theo phươ ng pháp N eighbor jo in in g sử d ụ n g phép toán T a m u ra -

N ei với độ lặp lại 1,000 lần trên p hần m ềm M E G A phiên bàn 5.05

K Ế T Q U Ả

B velezensis p h â n lập tại các v ù n g s in h th á i k h á c n h a u c ủ a V iệ t N a m

T ừ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên c ứ u c ủ a c húng tôi đã tiến

h ành thu thập 79 m ẫ u đất tại 4 vườ n Quốc gia và các vùng đất canh tác n ô n g nghiệp lân cận là

C úc Phương, B ạ c h M ã, C h ư Y ang Sin và Côn Đảo 1.441 chủng vi k h u ẩ n hiếu khí sinh nội bào

tử đã được p hân lập bằng p h ư ơ n g pháp xử lý nhiệt (V an e t al., 2014) D ự a trên các đặc điểm

khác biệt về m à u sắc, k ích thước, cấu trúc bề m ặt và m ép viền ngoài k h u ẩ n lạc, 252 (17,5% )

c hủng đã được giải trình tự gen 16S rR N A (xấp xỉ 1.500 bp) So sánh trong c ơ sở d ữ liệu

E ztaxon-e cho thấy, 14 c h ủ n g có chỉ số tương đồng gen I ó S t R N A cao nhất với c hủng B

cim ylolique/aciens subsp p ỉa n ta r u m FZB42 là 99,93% G en 16S r R N A c ủ a 14 chủng này đêu

tư ơ n g đồng n h a u và chỉ sai khác 1 nucleotide ở vị trí 583 (G thay b ằ n g A) so với chủng B

a m ylo liq u e/a cien s subsp p la n ta ru m FZB42 K hông có c hủng nào có trình tự gen 16S rR N A

tư ơ n g đồng cao nhất với các loài B m ethylotrophicus và B oryzicola.

Trong số 14 c hủng B velezensis, 3 chủng phân lập được ở Cúc Ph ư ơ n g , 3 chủng phân lập

đ ư ợ c ở Bạch M ã, 5 chủng p h â n lập được ở C hư Yang Sin v à 3 c hủng p h â n lập được ở C ôn Đảo

C Đ H 1701 p hân lập trong đất rừng N goài ra, B velezensis SP1901 p h â n lập từ m ẫ u đất rừng

H o à n g Liên cũng được ngh iên cứu T h ô n g tin chi tiết về 15 c hủng được trình bày trong bảng 1

H o ạ t tín h k h á n g n ấ m v à vi k h u ẩ n

Cùng với chủng ổ, vele zen sis SP 1901, 14 chủng B velezensis tro n g ngh iên cứu này đều sinh chất kháng nâ m gây b ệnh cây là F oxysporum , s h yd rophilum , R s o la n i và p capsici với

kích thước vòng kháng n ấ m trung bình đối với từng loại nấ m lần lượt là 4,2 m m , 10,6 m m , 7,7

m m và 7,4 mm Các chùng B velezensis thử nghiệm đều sinh hoạt tính k háng vi khuẩn gây bệnh bạc lá Vi&x oryzae với kích thướ c vòng kháng trung bình là 20,8 mm N g o à i ra, hoạt tính kháng

n ấ m của các c h ủ n e B v elezen sis cũng thể hiện rất rõ ràng khi thử n g h iệm với 2 loại nấm sợi và 1 loại nấm m en thườ ng gặp là A oryzae, A niger và s cerevisiae (B ả ng 2) Đ iều đó chứng tỏ ràng các chủng B veiezensis p h â n iập trong mỏi trường tự nhiên của V iệt N a m sinh hoại chất có phô

k h á n g rộng đối với nấm và vi khuẩn

B ả n g 1 Thông tin 15 c hủng B velezensis trong nghiên cứu.

T h ử n g h iệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy cả 15 c hủng B v e le zen sis đều sinh các

en z y m e ngoại bào là lipase, protease, amylase, C M C ase, xylanase v à chitinase Kích thước vòng

p h â n giải trên từ n g loại cơ chất là tư ơ n g đương n hau và được thể hiện chi tiết trong bảng 3

B ả n g 3 K hả n ăng sinh các loại en z y m e ngoại bào

M ức độ giải phóng phosphate vô c ơ vào trong môi trường nuôi cấy giao đ ộ n g từ 19,64 - 74,21

|ig/ml Bên cạnh đó, m ột số c hủng cũng có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật

ĨA A khá rõ ràng n h ư chủng C D H 0101 (3.28 u e /m l) và SP 1901 (1,98 |ig/m l); m ột số chủng sinh hàm lượng IA A rất thấp như C P 1604 và CY S 0101 (Bảng 4)

B ả n g 4 K h ả n ăng p h â n giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trư ờng IAA

, , L ư ơ n g phosp hate hòa tan L ư ơ n g IAA sinh ra

Đ a dạ ng kiểu gen của vi khuẩn

N h ằ m phân tích tính đa dạng về mặt di truyền của các c hủng vi khuẩn B

velezensis phân lập tại các vù n g sinh thái khác nhau của Việt N am , kỹ thuật dâu vân tay rep -

tạo ra 11 loại b ăng A D N nằm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp s ố lượng băng A D N

v à SP 1901; c hủng B M 0621 v à C Y S 0208; va chủng B M 0824, C Y S 0101, C D H 0101, C D H

0102 và CD H 1701 N ă m c hủng còn lại gồm C Y S 0816, C Y S 0901, B M 1912, C Y S 0911 v à

ứ n g P C R đã tạo ra 15 loại b ăng A D N n ằ m trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp Sô lượng

đ ã xác định được 13 loại kiểu gen, trong đó, c hùng CD H 0101 và C D H 0102 đư ợ c xếp vào cùng

1 nhóm (Hình 2)

vân tay rep - PC R , trình tự đa gen của chủng CP 1604 được phân tích và so sánh với chủng SP

20, 17, 12 và 1 nucleotide T rê n cây phát sinh c hủng loại, chủng SP 1901 và C P 1604 năm tách

biệt ở 2 nhóm B v elezen sis khác n h a u (H ình 3) Điều đó chứng tò, kỹ thuật dấu vân tay rep

0.75 (XH| a x 7 o.«M

Dice cocfficicnt

H ình 1 Sơ đồ cây về m ố i tươ n g đ ồ n g k iểu gen xây d ự n g bằng kỹ thuật d ấu vân tay rep - P C R sử

dụng mồi ER IC của các c hủng B v e le ze n sis p hân lập tại các vùng sinh thái khác nhau của V iệt

N am

T H Ả O L U Ậ N

B velezen sis là m ộ t trong số 8 loài vi k h u ẩ n thuộc nhóm B su b tilis (R ooney et al., 2009)

Đ ây là loài được đề xuất đặt tên v à o nă m 2005 sau phát hiện về k hả n ăng sinh các chất hoạt động

bề mặt và lipopeptide k h á n g k h u ẩ n (R uiz - G arcia et al., 2005) N ă m 2010, M a d h aiy a n et aỉ đã

m ô tả loài B m e th y lo tro p h ic u s p h â n lập từ đất vùng rễ lúa ở H àn Quốc B ên cạnh khả năng sử

dụng m ethanol, triethylam ine v à e tha nol như n g u ồ n carbon, loài vi k huẩ n này còn có khả năng

sinh các chất n h ư IA A và A C C d e a m in a s e kích thích cây trồng phát triển (M adhaiyan et al., 2010) N ă m 2011, B oriss et al đ ã phát hiện ra m ột nhóm c hủng vi khuẩn gần gùi với chủng B

am ylo liq u e/a cien s F Z B 4 2 có k h ả n ăn g sống nội cộng sinh trong rễ A ra b id o p sis trong khi đó

n h ó m chủng vi khuẩn gần gũi với c hủng B a m y lo liq u e /a c ien s D S M 7 kh ô n g có khả năng này

D ự a trên kết quả lai A D N , B a m y lo liq u e /a c ien s được tách ra thành 2 loài phụ là B

am ylo lìq u e/a cien s subsp p ia n ia r u m và B a m ylu ỉiq u e/a cien s subsp a m vỉo ỉiq u e/a cien s (Boriss et

al., 2011) G ầ n đây, C h u n g et al đã m ô tả m ột loài B o ryzicola sống nội c ộng sinh trong rễ lúa

có k h ả năng kích thích thực vật phát triển, sinh chất kháng n ấm và vi k h u ẩ n gây b ệnh cây và có

k h ả n ă n g tăng c ư ờ n g hệ m iễn dịch của thực vật (C hung et a i , 2015) D o s ở hữu nhiều đặc tính

có lợi q uan trọ n g cho cây trồng, các loài vi k huẩ n kể trên đã nhận đ ư ợ c nhiều q uan tâm của các

n h à ngh iên cứu; h o n 30 chủng phân lập từ các vùng sinh thái khác n hau đã được giải trình tự toàn bộ gen o m e để tìm hiểu về m ối tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ sống nội cộng sinh

(D u n la p et al., 2015) Song song với đó, hệ thống phân loại của các loài vi khuẩn kể trên cũng

đ ư ợ c kiểm c h ứ n g lại So sánh in silico toàn bộ hệ genom e cho thấy cả bốn loài vi khuẩn kể trên đều có hệ số tư ơ n g đ ồ n g A D N - A D N lớn hơn 84% (khác với chỉ số lai A D N - A D N thực

a m y lo liq u e /a c ien s và B o ryzicola được chỉ định lại về tên loài đư ợ c đặt ban đầu là B velezensis

(D u n la p et a i , 2015)

Dicc eociĩicicnt

H ì n h 2 Sơ đồ cây về m ối tương đồng kiểu gen xây dựng b àng kỹ thuật dấu vân tay rep - P C R sử

N a m