Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn châu chấu (aralia armata) (2018)

Trước khi được sử dụng làm dung môi chiết những dung môi này nên được chưng cất để loại bỏ tạp chất ta sẽ thu được dang sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất có thể gây ảnh hư

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

HÀ NỘI-2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS PHẠM HẢI YẾN

HÀ NỘI-2018

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới TS

Phạm Hải Yến - phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng và giúp đỡ em trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đối với ThS

Nguyễn Anh Hƣng người đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo em trong suốt

những năm học tại trường đại học và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị Viện Hóa sinh biển đã chỉ bảo

và tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu đề hoàn thiện tốt khóa luận

Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Hóa học -Trường đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập ở trường Xin cảm ơn tất cả bạn bè, người thân đã động viên, khích lệ giúp tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Khóa luận tốt nghiệp của em không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn

châu chấu (Aralia armata)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của TS Phạm Hải Yến Các kết quả, số liệu nêu trong

khóa luận này là trung thực, được làm từ thực nghiệm tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các kết quả không trùng với các kết quả đã được công bố trước đây

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Nghiên cứu tổng quan về loài đơn châu chấu 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Mô tả cây 3

1.1.3 Phân bố và sinh thái 4

1.1.4 Bộ phận dùng 4

1.1.5 Tính vị và công dụng 4

1.1.6 Thành phần hóa học 6

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 12

1.2.1 Chọn dung môi chiết 12

1.2.2 Quá trình chiết 14

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc kí 15

1.4 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 19 1.4.1 phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) 19

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy- MS) 19

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy-NMR) 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Mẫu thực vật 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu 23

2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 23 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 25

3.1 Phân lập các hợp chất 25

3.2 Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất 26

3.2.1 Hợp chất 1: Chikusetsusaponin IVa 26

3.2.2 Hợp chất 2: Chikusetsusaponin IV 26

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất 1 27

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 2 33

KẾT LUẬN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Tow-Dimensional NMR

Sắc ký cột Column Chromatography Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer Phổ khối lượng phun điện tử

Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy Phổ khối lượng ion hóa thường Field Ionization Heteronuclear Multiple Bond Connectivity Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ khối lượng phân giải cao bắn phá nguyên tử nhanh High Resolution Fast Atom Bombardment Mass

Spectroscopy Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Phổ khối lượng Mass Spectroscopy Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG

Bảng 4.1 : Số liệu phổ của hợp chất 1 (AA-W2B1) và chất tham khảo 31

Bảng 4.2 : Số liệu phổ của hợp chất 2 (AA-W2A1) và chất tham khảo 37

HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây và hoa của cây đơn châu chấu 4

Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn nước của cây đơn châu chấu 25

Hình 4.1.1 : Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 28

Hình 4.1.2 : Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 28

Hình 4.1.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 1 29

Hình 4.1.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 29

Hình 4.1.5 : Phổ DEPT của hợp chất 1 30

Hình 4.1.6 : Phổ HMBC của hợp chất 1 30

Hình 4.1.7 : Phổ HSQC của hợp chất 1 31

Hình 4.2.1 : Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 34

Hình 4.2.2 : Các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 34

Hình 4.2.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 2 35

Hình 4.2.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 35

Hình 4.2.5 : Phổ DEPT của hợp chất 2 36

Hình 4.2.6 : Phổ HMBC của hợp chất 2 36

Hình 4.2.7 : Phổ HSQC của hợp chất 2 37

MỞ ĐẦU

Khoa học ngày càng phát triển để phục vụ nhu cầu nâng cao đời sống vật chất và tinh thần của con người Nhưng bên cạnh mặt tích cực đó thì con người cũng đang phải đối đầu với nguy cơ mắc nhiều bệnh hiểm nghèo Nguyên nhân đó là do môi trường sống của con người đang bị ô nhiễm nặng nề: ô nhiễm không khí, ô nhiễm nước, ô nhiễm đất,… Từ đó đòi hỏi con người phải nghiên cứu, tìm tòi ra các loại thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên cho hiệu quả cao, ít tác dụng phụ, ít độc tính lại dễ tìm kiếm trong

tự nhiên làm nguồn nguyên liệu để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và phục vụ các mục đích khác cho con người

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hàng năm lớn, có nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu rất

đa dạng, khí hậu đặc trưng cho từng vùng.Những yếu tố trên đã tạo nên nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng dồi dào, đặc biệt là hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo ước tính Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật, trong

đó có khoảng 4000 loài cây thuốc quý mọc tự nhiên Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị về mặt kinh tế phục vụ cho việc chữa nhiều loại bệnh khác nhau Trong vài thập kỷ gần đây, xu hướng sử dụng các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên để phòng và trị bệnh

đã và đang trở lên thịnh hành trên thế giới Ngoài sự phát triển của y học hiện đại thì trong dân gian vẫn lưu truyền các bài thuốc quý về các loại thảo dược

để chữa bệnh Những bài thuốc này đóng một vai trò quan trọng là tiền đề cho

sự phát triển của ngành y học ngày nay Như vậy, việc hòa hợp hai nền y học

cổ truyền và y học hiện đại là xu thế tất yếu của thời đại nhằm giải quyết những khó khăn trong y học

Trong những bài thuốc cổ truyền hay được nhân dân sử dụng thì cây

Đơn châu chấu (Aralia armata) được biết đến với nhiều tác dụng khác nhau:

làm thuốc trị các bệnh phong thấp tê bại, phù thũng,lá và rễ dùng để trị rắn cắn Rễ sắc uống và ngâm chữa bệnh ở cổ họng, viêm amidal, thấp khớp Ngoài ra, rễ còn được dùng để trị các chứng viêm gan cấp, viêm bạch hầu, viêm sưng vú và vết thương do bị dao chém Lá giã ra để đắp chữa mụn nhọt, phần lá non có thể luộc ăn thay rau [2], [31] Do vậy, nó là một loài cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích các tác dụng chữa bệnh của cây cũng như tạo điều kiện để các nhà khoa học tìm ra các phương thuốc chữa bệnh khác cho con người

Xuất phát từ mục đích muốn góp phần hiểu biết và bổ sung thêm vào giá trị sử dụng của loài cây này mà tôi quyết định chọn đề tài khóa luận là:

“Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn châu

chấu (Aralia armata)”

Nhiệm vụ chính của đề tài là:

1 Thu mẫu cây đơn châu chấu (Aralia armata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

3 Phân lập các hợp chất trong phân đoạn nước từ cây đơn châu chấu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu tổng quan về loài đơn châu chấu

1.1.1 Thực vật học

Cây đơn châu chấu được phân loại thực vật học theo cách xác định như sau [32]:

Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida

Bộ : Cornales

Họ : Araliaceae

Chi : Aralia Loài: Aralia armata

1.1.2 Mô tả cây

- Đặc điểm thực vật học:

Cây đơn châu chấu hay còn được gọi với các tên khác như: cây cuồng, rau gai (Thái Nguyên), độc lực, cẩm giàng (Lạng Sơn), đinh lăng gai, cây

đuống, cây răng, lổ cổ, rau gai,… Nó có tên khoa học là Aralia armata (wall)

Seem, thuộc họ Ngũ gia bì -Araliaceae

- Đặc điểm sinh thái:

+ Dạng cây: cây nhỏ, cao 1-2m, có thân mảnh, mang nhiều gai cong quắp, mọc lòa xòa

+ Lá lớn, kép 2-3 lần lông chim, có 9-11 lá chét có phiến lá chét hình trứng dài 4-8 cm, rộng 2-3 cm, nhọn ở đầu, phía cuống hơi tròn, mép có răng cưa, nhẵn cả hai mặt, nhưng trên gân có những gai nhỏ, cuống lá có bẹ

+ Hoa chùm gồm nhiều tán dài, cuống hoa có gai Hoa nhỏ, màu lục, vàng nhạt

+ Quả hạch hình tròn, màu đen

- Mùa hoa quả tháng 7-9 [1], [31], [32]

Hình 1.1: Hình ảnh cây và hoa của cây Đơn châu chấu

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Loài của vùng Himalaia, lan tràn sang Ấn Độ, Mianma, Nam Trung Quốc, Lào, Việt Nam và Malaixia

Ở Việt Nam: cây đơn châu chấu mọc hoang tại nhiều nơi trong nước ta chủ yếu tại các tỉnh miền núi như Lào Cai, Hà Giang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hòa Bình, Ninh Bình, Nghệ An, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng

Cây mọc nơi có ánh sáng, ẩm, dọc theo các đường mòn ven rừng, các

bờ suối, các nơi hoang vắng, các nương rẫy cũ [2], [30]

1.1.4 Bộ phận dùng

Rễ, vỏ rễ và lá- Radix, Cortex Radicis et Folium Araliae armata

Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch, phơi khô

Lá non thường dùng tươi

Ngoài ra, vỏ rễ đơn châu chấu có nhiều tác dụng: chống viêm, đặc biệt tác dụng ức chế khá mạnh giai đoạn mạn tính của phản ứng viêm; gây thu teo tuyến ức rõ rệt, kích thích sự chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm nuôi cấy trong ống nghiệm; có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen trên động vật thí nghiệm; kháng khuẩn đối với phế bào khuẩn và liên cầu khuẩn tan máu; các saponin triterpen và genin acid oleanolic từ rễ đơn châu chấu là thành phần có hoạt tính chống viêm cấp, viêm mạn và gây thu teo tuyến ức chuột cống trắng đực non

Đồng bào vùng núi thường lấy lá non, chồi non về luộc hay xào ăn như các loại rau khác Có thể tước bỏ gai trước khi xào, nhưng ở những nõn non thì sau khi xào gai cũng trở nên mềm Để làm thuốc, thường dùng 10-30g rễ khô sắc nước uống, dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác

Đơn thuốc:

1 Viêm khớp: Rễ đơn châu chấu 10-30g sắc uống, thường phối hợp với xà cừ và mặt quỷ

2 Bạch hầu, bí đái: Dùng 8-12g rễ cây sắc nước uống

3 Rắn cắn: Vỏ rễ giã lấy nước uống, bã đắp

4 Chữa sưng vú, áp xe vú: lấy 20-30g vỏ rễ cẩm ràng, để tươi, rửa sạch, giã nhỏ với muối, trộn với ít nước vo gạo đặc, bọc trong một miếng vải sạch, hơ nóng, đắp và băng lại Có thể phối hợp với rễ cây trôm (hay cây sảng), lá mua non, lá bồ công anh, lá kim ngân với liều lượng bằng nhau Dùng 3-4 ngày [32]

Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành

phần hóa học của một số loài thuộc chi Aralia L chủ yếu thuộc nhóm chất

saponin triterpen, đây là một nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú

Nghiên cứu về các loài thuộc chi Aralia L được bắt đầu vào khoảng cuối

những năm 80 của thế kỉ XX Năm 1988, Hernandez và cộng sự đã phát hiện

tác dụng kháng viêm dạ dày từ dịch chiết rễ của loài A elata [13] Năm 1994,

từ vỏ rễ loài A elata đã được Sakai và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc

của 3 hợp chất saponin mới dưới dạng methyl hóa và được đặt tên là

tarasaponin I-III methyl ester (1-3), cùng 4 hợp chất đã biết [14]

Cũng trong năm 1994, Satoh và cộng sự đã thông báo xác định được cấu trúc của 5 hợp chất saponin mới, glycoside acid oleanolic, tarasaponin III-VII

(4-8) từ vỏ rễ loài A elata [15]

Từ loài này, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của

6 saponin mới elatoside E, G, H, I, J và K (9-14) Các hợp chất này được phát

hiện có khả năng hạ đường huyết mạnh [16]

7

Ngoài ra, bốn hợp chất mới: aralia-saponin I-IV (15-18) cũng được phân

lập và xác định cấu trúc từ loài A elata [17]

Zhang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 saponin mới

(19-22) từ loài A elata Các hợp chất này đã được phát hiện có khả năng

kháng sự phát triển của các dòng tế bào ung thư: HL-60, A-549 và DU-145 [18] Cũng liên quan đến hoạt tính diệt tế bào ung thư, Tomatsu và cộng sự đã

phát hiện ra một protein, aralin từ loài A elata có khả năng diệt tế bào ung thư

mạnh [19] Protein này có khả năng kháng sự phát triển các tế bào ung thư theo cơ chế tự chết [20] Một hợp chất triterpenoid saponin, oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl(13)-α-L-rhamnopyranosyl(12)-α-L-arabinopyranoside

từ loài A elata cũng được thông báo có tác dụng kháng viêm mạnh

Vào năm 1995, Fang và cộng sự đã phân lập được 1 hợp chất mới đặt tên

là armatosid và 10 hợp chất đã biết từ loài A armata [5] Từ rễ loài A

decaisneana, Miyase và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp

chất mới, được đặt tên là araliasaponin I-XVIII (23-39) [21], [22]

Từ loài A dasyphylla var latifolia Miq., Xiao và cộng sự đã phân lập

được 1 hợp chất mới (40) và hợp chất này thể hiện khả năng kháng sự phát triển

của các dòng tế bào ung thư mạnh [24] Zou và cộng sự đã phát hiện ra 2 hợp

chất mới có mặt ở loài A subcapitata: subcapitatoside B (41) và C (42) [25]

Từ rễ loài A spinifolia, Yu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc

của 2 hợp chất mới được đặt tên là aralosid H-J (43-44) cùng 4 hợp chất đã

biết [26]

Dịch chiết loài A mandshurica được phát hiện có tác dụng chống béo

phì Kết quả này dựa trên nghiên cứu 32 bệnh nhân ngẫu nhiên [29] Acid

continentalic từ loài A continentalis đã thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh [28] Từ loài, A elata, Nhiệm và cộng sự đã thông báo phân lập được 2 hợp

chất mới thuộc khung saponin triterpen nhóm oleanan là tarasaponin IV (45)

và elatosid L (46) cùng với 4 hợp chất đã biết Các hợp chất đều được nghiên

cứu tác dụng kháng viêm, kết quả cho thấy elatosid L và elatosid D thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 lần lượt là 4,1 µM và 9,5 µM [27]

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Tùy thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu mà người ta chọn dung môi

và hệ dung môi khác nhau Các dung môi dùng trong quá trình chiết phải được lựa chọn một cách cẩn thận

Yêu cầu với dung môi dùng trong quá trình chiết:

Nó phải hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, khó bốc cháy Trước khi được sử dụng làm dung môi chiết những dung môi này nên được chưng cất để loại bỏ tạp chất ta sẽ thu được dang sạch trước khi sử dụng nếu chúng

có lẫn các chất có thể gây ảnh hưởng tới chất lượng của quá trình chiết Có một số chất dẻo thường lẫn trong dung môi như điankyl phtalat, tri-n-butyl-axetycitrat và tributylphotphat (bị lẫn trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản dung môi do các dung môi thường được đựng trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa)

Một số dung môi thường được sử dụng:

Người ta hay sử dụng clorofom, metylen và metanol là những dung môi trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Tuy nhiên, metanol và clorofom thường chứa diotylphtalat [đi-(2-etylhexyl)phatlat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat], nó sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật Ngoài ra chất này còn thể hiện hoạt tính trong quá trình thực nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây

Những tạp chất thường lẫn trong clorofom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một số hợp chất như các ankanoit tạo muối bậc 4 Tương tự như vậy sự có mặt của HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác Do clorofom có thể gây tổn thương do gan và

thận nên khi sử dụng nó các thao tác phải cẩn thận khéo léo làm ở những nơi khô thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofom

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn clorofom Do khả năng phân cực của clorofom thấp hơn nên nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Trái lại các dung môi thuộc nhóm rượu phân cực hơn nên sẽ thấm tốt hơn qua màng tế bào Phần lớn các ancol là các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp do vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có thể được xem là dung môi có những đặc tính tốt nhất trong quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên khi dùng metanol trong quá trình chiết cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành Ví dụ như techlonolide A thu được từ Technonaetes laciniata được chuyển hóa thành trechonolode B bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy 1-hydroxyltropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol

Đietyl ete là chất rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra peroxit dễ nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Do vậy mà hiếm khi đietyl ete được sử dụng trong quá trình chiết thực vật Ngoài

ra axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazo thường được sử dụng đối với các quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazo có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn

Trong cây thường các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ có độ phân cực khác nhau Khi biết và hiểu được những đặc tính hoặc những chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó có thể lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 300C-400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vất là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh có khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi nóng hoặc lạnh Trước kia, máy chiết ngâm thường được làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh

Mẫu thực vật được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ

và sau đó chất chiết được lấy ra Lưu ý rằng sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được không còn chứa những chất giá trị nữa Có thể xác định sự kết thúc quá trình chiết bằng một số cách như: khi chiết các ankaloit

ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng

sự tạo thành kết tủa với các tác nhân đặc trưng như Dragendorff và Mayer Hay các flavoloid thường là những chất màu bởi vậy khi dịch chảy mà không

có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết Hoặc

khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi chiết thích hợp và lựa chọn phương pháp chiết hợp lý để đạt được kết quả cao trong quá trình nghiên cứu Ngoài ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có thể thu được một số hợp chất

ngay trong quá trình chiết [9] [10] [11]

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí (chromatography) là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiên nay, được sử dụng trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp thụ Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước

Sắc kí bao gồm pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính chất của chúng (tính bị hấp thụ, tính tan, ) Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp thụ và phản hấp thụ sẽ lặp đi lặp lại Kết quả là chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ sắc kí so với chất tương tác yếu hơn ở pha này Dựa vào đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí Trên thế giới hiện nay chủ yếu sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp thụ như silicagel, YMC, ODS, Al2O3 ) còn pha động được

sử dụng là các chất lỏng (sắc kí lỏng), hay chất khí (sắc kí khí) Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi kém phân cực hơn

Phân loại các phương pháp sắc kí

Tùy thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành 2 loại chính:

do đó khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm Trog một số trường hợp lực trọng trường không đủ lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) khi đó người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc

áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D) rất quan trọng, tỉ lệ này còn thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách nghĩa là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc kí tỉ

lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi

được gọi là Rf , các chất khác nhau sẽ có Rf khác nhau Dựa vào sự khác nhau

về Rf mà người ta có thể tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất Ngoài ra tỉ

lệ chất so với tỉ lệ chất hấp thụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách Chẳng hạn nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức là phụ thuộc vào sự khác nhau

Rf của các chất) hệ số này dao động trong khoảng 1/20-1/30

Việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng trong sắc kí cột tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì người ta phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó mới đưa lên cột Nếu tách tinh thì người ta thường đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng

Có hai phương pháp đưa chất hấp phụ lên cột:

1 Phương pháp nhồi cột khô:

Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột (cột đã được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, sấy khô và lót bông thủy tinh ở dưới) sau đó dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ lên thành cột đến khi chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột không nén xuống được nữa Tiếp đên dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

2 Phương pháp nhồi cột ướt

Cho chất hấp phụ vào dung môi (thường dùng là dung môi rửa cột sau này) trộn thành bột nhão sau đó đổ vào vào cột đến khi đủ lượng cần thiết Phương pháp này có ưu điểm là dễ đồng đều trên cột, không hay bị nứt cột khi chạy Lưu ý khi chuẩn bị cột phải không có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và dung môi phải khô, cột không được nứt, gãy, dò, thời gian để cột ổn định phải mất 10-

12 giờ mới dùng được

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến kết quả tách Nếu tốc độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ chảy quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian tách ảnh hưởng đến tiến độ công việc

Ngày nay để chạy nhanh, tách nhanh các chất người ta dùng phương pháp sắc kí cột nhanh có hệ thống bơm đẩy trộn dung môi tự động, lấy mẫu tự động dựa vào phổ tử ngoại Thời gian để tách rất nhanh, chính xác

Sắc kí bản mỏng (TLC)

Phương pháp dùng chất hấp phụ tráng thành lớp trên kính để phân tích hay tinh chế các chất gọi là sắc ký bản mỏng Sắc kí bản mỏng được dùng để phân tích định tính, định lượng và tinh chế các chất hay cũng có thể dùng để theo dõi quá trình chạy cột sắc kí Chất hấp phụ thường là silicagel

Việc sử dụng sắc kí bản mỏng điều chế (bản được tráng sẵn silicagel dày hơn) có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiên màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

Đối với sắc kí bản mỏng việc lựa chọn nội dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho Rf tốt rất quan trọng Nếu kiểm tra độ tinh khiết và định tính phải có Rf 0,7, vệt tròn và sắc nét Còn để khảo sát hỗn hợp hay theo dõi tiến trình phản ứng thì chọn dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt

Kết quả chạy sắc kí bản mỏng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện chạy sắc

kí Lượng dung môi cho vào bình sao cho không ngập vết chấm trên bản cho bản vào bình một cách dứt khoát và không nhắc đi nhắc lại làm lở chân bản mỏng gây ảnh hưởng đến kết quả Trong suốt quá trình chạy không nên xê dịch bình từ chỗ này sang chỗ khác Theo dõi quá trình chạy sắc kí, không để dung môi chạy hết bản [3] [9]