Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiệp xử lý vải bông

So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên .... Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệtrên thế giới đã sử dụ

w w.lrc t n u e d u v n

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM

ƯNG DUNG TRONG CÔNG NGHIÊP XƯ LY VAI BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN TRƯỜNG

Hà Nội - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộngtác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Lê Trọng Tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn

để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người

luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả

Lê Trọng Tài

MỤC LỤC

LƠI CAM ĐOAN .i

LƠI CAM ƠN .ii

MỤC LỤC .iii

DANH MUC TƯ VIÊT TĂT v

DANH MUC BANG .vi

DANH MUC HINH .vii

MƠ ĐÂU 1

TÔNG QUAN TAI LIÊU 3

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis 3

1.2 Hệ biểu hiện Bacillus subtilis 4

1.3 Pectin

5 1.4 Pectinase

6 1.4.1 Khái niệm pectinase

6 1.4.2 Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase

6 1.5 Pectinase của Bacillus subtilis .

10 1.6 Ứng dụng của pectinase kiềm

11 1.6.1 Cấu tạo sợi bông tự nhiên .

11 1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông

12 1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy

13 1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà 13 1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam

13 VÂT LIÊU VA PHƯƠNG PHAP 14

2.1 Vật liệu

14 2.1.1 Các chủng vi khuẩn .

14 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm .

2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp 17

2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]

2.3.7 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis 22

2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 23

2.3.9 Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis 23

2.3.10 Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử 23

2.3.11 Biến nạp plasmid vào E coli bằng phương pháp xung điện 26

2.3.12 Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B subtilis 168 26

2.3.13 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) 27

KÊT QUA VA THẢO LU NẬN 28

3.1 Sàng lọc các chủng B subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao 28

3.1.1 Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch 28

3.1.2 Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu 29

3.1.3 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi 31

3.2 Tách dòng gen pectinase trong E coli 32

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của các chủng B subtilis 32

3.2.2 Nhân gen pectinase bằng PCR 33

3.2.3 Tách dòng các gen pel vào E coli 34

3.2.4 Giải trình tự các gen pectinase 36

3.3 Tạo chủng B subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase 38

3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B subtilis 38

3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 43

3.3.3 Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng 44

3.4 So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên 47

3.4.1 So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên 47

3.4.2 So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên 48

KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

w

w w.lrc t n u e d u v n

Tài liệu tiếng Việt 50Tài liệu tiếng Anh 50

DANH MUC TƯ VIÊT TĂT

B subtilis : Bacillus subtilis

E coli : Escherichia coli

ammonium bromide

DANH MUC BANG

Bảng 1.1 Phân loại các pectinolytic enzyme 7

Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi bông 11

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng nhân gen

23 Bảng 2.2 Chương trình nhân gen bằng PCR 23

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII 24

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII 24

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter

24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel 24

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc các chủng B subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. 28

Bảng 3.2 Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ưu của các chủng nghiên cứu 30

Bảng 3.3 Hoạt tính pectinase của các enzyme thu được 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p: // w w w.lrc t n u e d u v n vi

DANH MUC HINH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin

6 Hình 1.2 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases

8 Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase

8 Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase

9 Hình 1.5 Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông Pectin được tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin 11

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein 18

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit 19

Hình 2.3 Đường chuẩn glucose 20

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase

21 Hình 3.1 Hình ảnh một số chủng B subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin

29 Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu

31 Hình 3.3 Điện di DNA tổng số của các chủng B subtilis 33

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase 34

Hình 3.5 Khuẩn lạc các thể biến nạp E coli DH5α mang pJET/pel trên môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin 34

Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII 35

Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII 35

Hình 3.8 So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B subtilis 168 37

Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B subtilis 39

Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII 40

Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel 40

Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR 41

Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR 42

Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel 42

Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp 44 Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B subtilis tái tổ hợp đa

copy trên môi trường LB+Kan 45

Hình 3.17 Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p: // w w w.lrc t n u e d u v n vii

Hình 3.18 Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B subtilis

168 trên cơ chất pectin axit

MƠ ĐÂU

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọngtrong nền kinh tế quốc Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số36/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ thì đến năm

2015 sản xuất bông trong nước là 40 ngàn tấn, đáp ứng được 10% nhu cầu và đến 2020

là 60 ngàn tấn đáp ứng được 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nước Để “chiến lượcphát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm

2015, định hướng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện

quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lượng cao, giá thành rẻ và

có thể cạnh tranh được trên thị trường quốc tế

Sợi bông tự nhiên được cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phảicellulose Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose Trong quátrình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trởthuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lượng của vải nhuộm Thông thường đểloại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bước nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng

đi, đây là công nghệ đơn giản nhưng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông

do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trường và tiêuhao rất lớn năng lượng Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệtrên thế giới đã sử dụng ng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủypectin trong sợi bông, thay vì sử dụng ng hóa chất kiềm độc hại Xử lý vải bông bằng pectinaselàm tăng khả năng thấm nước của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệuquả cao cho quá trnh t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lượng vảitốt hơn

Việc ứng dụng ng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới pháttriển khoảng 10 năm gần đây Nhưng được nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớncủa chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút ngắn

w

w w.lrc t n u e d u v n

thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác hại môi trường Hiện nay một số

dệt như Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng Novozyme), alkaline pectinase (TrungQuốc), Cottonase (Mỹ)

sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lượng cao và ảnh hưởng lớn đến môi trường.Chính vì vậy việc sử dụng ng enzyme pectinase trong xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm

sẽ giúp cho bảo vệ môi trường, làm cho vải bông có chất lượng cao và giúp cho giá thànhsản xuất giảm Từ đó nâng cao sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trường

trong công nghiệp Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase

ưa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng ng cho ngành sản xuất vải bông là điều cần thiết, giúp chongành công nghiệp dệt nước ta chủ động được nguồn enzyme phụng c vụ cho việc xử lý vảibông, nâng cao chất lượng vải bông để cạnh tranh được trên thị trường Quốc tế Đề tài

“Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ưng dung trong cô

ng nghiêp xư ly vải bông ” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase

sản lượng cao để ứng dụng ng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô

TÔNG QUAN TAI LIÊU

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (B subtilis) là vi khuẩn gram dương, thuộc họ Bac ill acea e chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhưng phổ biến nhất là trong đất Tế bào B subtilis có Hình

que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép

sinh vật chịu được những điều kiện khắc nghiệt [35], [43] Tế bào vi khuẩn B subtilis được bao

bọc bởi thành vững chắc Nó bao gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của cácloại đường và amino acid Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trường và tế bào

vi khuẩn Nó còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu được áp lực cao củamôi trường nội bào [36]

B subtilis được tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có ít hơn trong nước hay không khí B subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ trung bình Nhiệt

độ tối ưu là 25-35oC B subtilis là s i n h v ậ t h i ếu kh í s ố n g k ý s in h có bào tử có thể sống sót

ở điều kiện nhiệt độ cao, thường thấy khi nấu ăn

Hệ gen B subtilis 168 đã được giải mã thành công và công bố vào năm

1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng Tổng kích thước hệ gen là 4,2

Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein Sự giải mã thành công hệ gen B subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên cứu về proteome và metabolome

của vi khuẩn này

B subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi sinh vật

quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng ng Các ứng dụng ng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnhvực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh họcphân tử, y dược học, trong các ngành công nghiệp và trong xử lí môi trường Chính vì lẽ đó

nên ngày càng nhiều các nghiên cứu ứng dụng ng của chúng đối với đời sống con người B subtilis là vi khuẩn có khả năng tiết một số enzyme quan trọng như protease, lipase,

xylanase, pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng

w

w w.lrc t n u e d u v n

đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô

1.2 Hệ biểu hiện Bacillus subtilis

B subtilis là vi khuẩn đã được nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử (chỉ sau E coli) Chúng có nhiều đặc điểm quí như: là vi khuẩn không gây bệnh, khả năng sinh trưởng rất

subtilis được biết là một trong những hệ tiết tốt nhất để ứng dụng ng sản xuất protein tái tổ hợp Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ biểu hiện B subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp.

Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B subtilis Việc sử dụng ng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B subilis thông thường không

không bám hiệu quả vào promoter ngoại lai, ngoại trừ một vài trường hợp Tín hiệu tiết(signal peptide) cũng là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai.Wang và Doi (1989) đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của

gen ngoại lai trong B subtilis và những yếu tố cần thiết để vượt qua rào cản của sự biểu

hiện gen [49] Việc sử dụng ng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện gen ngoại laicũng cần được cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ưu điểm và nhược điểm Vector

đa copy thông thường có khả năng biểu hiện mạnh hơn vector tích hợp do có lượng bản saonhiều hơn trong một tế bào chủ nhưng lại có tính bền kém hơn Hệ biểu hiện đa copy luônluôn cần duy trì áp lực chọn lọc (như bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy) Ngượclại vector tích hợp do được tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên

có tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen

Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần lớn là vi

khuẩn thuộc họ Bacillus Lượng enzyme tái tổ hợp trong thương mại hiện nay được sản xuất

từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37] Tuy nhiên, hệ biểu hiện B subtilis cũng có những

nhược điểm như khi biểu hiện gen ngoại lai

trong chúng thì một hiện tượng hay gặp là sự tương tác bất lợi của sản phẩm biểu hiệnvới chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm chí nhiều trường hợp

chúng thì khả năng ảnh hưởng bất lợi trong khi biểu hiện là hoàn toàn được loại bỏ Hướngsản xuất protein tái tổ hợp bằng cách này là một trong những hướng sản xuất mang lại hiệuquả biểu hiện cao Hướng biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ

hợp trong B subtilis ở một số nghiên cứu trong nước [4], [5].

1.3 Pectin

Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào thực vật baogồm: pectin (polymethylgalacturonate), pectin axit (polygalacturonate) và cácoligogalacturonate Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75% các nhómcarboxyl của galactoronate bị ester hóa với methanol Oligogalacturonate là chất đa phân

tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate Oligo methylgalacturonate cũng

là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bịmethyl hóa ở vị trí C-6 [50]

Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau.Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và rhamnogalacturonan trong

đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan,galactan và arabinogalactan Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất

pectin Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose

liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thànhphần và độ dài đa dạng Chuỗi bên kéo dài thường là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [50]

w

w w.lrc t n u e d u v n

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin

Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở Hình 1.1 Các đơn vị

D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside Một số D-galacturonate

bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl- este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3

độ pH Mức độ methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38]

1.4 Pectinase

1.4.1 Khái niệm pectinase

Các enzyme xúc tác phân cắt pectin được gọi chung là pectinase Enzyme pectinaseđược tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm, nấm men, côn trùng, giun

tròn, nguyên sinh động vật và thực vật Trong đó vi khuẩn B subtilis là một trong nhóm vi

khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase

Pectinase được sử dụng ng nhiều trong một số ngành sản xuất như: sản xuất rượu vang,nước ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải Việc ứng dụng ng pectinase kiềm trongcông nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây nhưng được nhiều nhàcông nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rútngắn thời gian xử lí, tiết kiệm năng lượng và giảm thải tác hại môi trường Hiện nay một sốpectinase thương mại đã được sản xuất và bán trên thị trường để ứng dụng ng trong công nghiệpdệt

1.4.2 Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase

Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinaseđược phân chia thành các enzyme khác nhau Pectinase được phân loại thành 3 nhóm chính,được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại các pectinolytic enzyme [50]

xúc tác Esterase

3.2.1.153.2.1.82

4.2.2.24.2.2.9

4.2.2.6

4.2.2.10

PectinPectin

Protopectin Pectin axit Pectin axit Trigalacto- ronate4:5 (galacturo- nate)nPectin

Pectin axitPectin axit

Unsaturate d

digalactu- ronatePectin

Pectin axit + Methanol

Pectin Oligogalacturonates Monogalacturonate Monogalacturonate

Unsaturated monogalaturonate

và saturate (n-1)

Methyloligogalac- turonates

Unsaturated oligogalacturonates

Unsaturated digalacturonates

Unsaturated monogalacturonates

Unsaturated methyloli- gogalacturonates

Thuỷ phân

Chưa xác định

Thuỷ phânThuỷ phânThuỷ phânThuỷ phânThuỷ phân

Thuỷ phân

Chuyểnliên kết

Chuyểnliên kết

Chuyểnliên kết

Chuyểnliên kết

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân cắt chuyển

liên kết (trans –element) Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của nước, ngược lại, cơ chế

chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nước và tạo ra sản phẩm có một liên kếtđôi (Hình 1.4)

Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm methoxyl từ

nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đường thủy phân (Hình 1.2) Sản phẩm cuối

giảm độ pH của môi trường phản ứng Do vậy, có thể tiến hành đo pH của dung dịch sauphản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase.

galacturonate

Hình 1.2 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl khỏi nhóm

hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate Searle-van Leeuwen, Vincken và cộng sự (1996)

lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus niger [40] Shevchik và Cotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937

Hugouvieux-[41] Tuy nhiên, các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế

oligogalacturonates galacturonate

Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase

Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC

3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3) Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với

n

endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate) Hoạt tính của haienzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ Hình thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate

Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate ngẫu nhiên

thành oligomethylgalacturonate [6], [16] Phản ứng được xúc tác bởi sơ đồ sau:

Oligomethylgalacturonates

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể được đo bằngcách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid

Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là

pectinase Enzyme này chỉ được tìm thấy ở vi sinh vật, pH tối ưu trong khoảng

8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác Để hoạt động chúng cần sự có

giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4) Phương pháp tốt nhất để xác định hoạt tínhenzyme này là phát hiện liên kết đôi trên máy đo quang phổ ở bước sóng 232 nm [28] Ngoài

ra cũng có thể xác định hoạt tính bằng phương pháp đường khử với 3,5-dinitrosalicylate [10].Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase như sau:

unsaturated oligogalacturonates

Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một số loài vi khuẩn

như Clostridium multifermentan; Erwinia aroideae; Erwinia disolvens Cơ chất thích hợp

không phải polymethylgalacturonate mà là

polygalacturonate Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no Độ pH tối ưu củacác enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5 Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thểđược xác định giống với cách tiến hành đối với endopolygalacturonate lyase Phản ứng xúctác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau:

Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong phân tử

pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates [6], [16] Phản ứngxúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase như sau:

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp đường khử [10],[42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước sóng 232 nm [28]

1.5 Pectinase của Bacillus subtilis

Pectinase từ B subtilis đã được Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất và biểu hiện trong E coli từ những năm 90 của thế kỷ trước [31], [30] Enzyme này xúc tác phản ứng

khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid, trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu

và

Các chủng B subtilis hiện có ở Việt Nam thông thường sẽ có gen pel này, các biến

chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình tự nucleotide đã biếtcủa chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng PCR một cách dễ dàng

w

w w.lrc t n u e d u v n

1.6 Ứng dụng của pectinase kiềm

1.6.1 Cấu tạo sợi bông tự nhiên

Hình 1.5 Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của

sợi bông Pectin được tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.

Sợi bông tự nhiên được cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và

lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp Hàm lượng cellulose trong sợi bông chiếm tới

95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose) Các chất không phảicellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose (hemicellulose), protein vàchất sáp dính (waxe) [9], [39]

Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]

Thành phần sợi bông Trọng lượng khô (%)

1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông

Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme được gọi là “BioScouring” là công nghệ sửdụng ng enzyme pectinase kiềm thay thế xút trong khâu nấu kiềm đã được nghiên cứu và triểnkhai trong sản xuất và đã thu được kết quả tốt ở nhiều nơi Tháng tư năm 1999, hãngNovozymes (Đan Mạch) đã đưa chế phẩm pectinase kiềm ra thị trường có tên thươngmại BioPrep 3000L Sau đó ít lâu, hãng Bayer (Đức) có sản phẩm enzyme pectinase kiềm làBaylase EVO Từ dó công nghệ “BioScouring” sử dụng ng enzyme pectinase kiềm xử lý vải bông

ra đời Công nghệ “BioScouring” với các sản phẩm chứa pectinase kiềm đã được nhiều nhàkhoa học trên thế giới nghiên cứu cho thấy có hiệu quả tốt, có thể thay thế xút để loại pectintrong quá trình nấu tẩy [8], [12], [15], [19], [26] Pectin trong sợi bông có vai trò như chất kếtdính liên kết cellulose và chất không phải cellulose Sử dụng ng enzyme pectinase kiềm khônglàm ảnh hưởng đến cấu trúc cellulose của sợi vải, do đó tránh tổn hại sợi [22], [29], [48]

Klug-Santner và cộng sự đã chỉ ra pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã loại 80% pectin của

sợi bông [22] Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc kết hợp pectinasekiềm với một số enzyme khác như: lipase, protease, xylanase sẽ giúp hỗ trợ loại bỏ cácchất không phải cellulose (lignin, sáp, protein, hemicellulose…) hiệu quả hơn khi chỉ sử

Các chế phẩm pectinase kiềm hiện nay có trên thị trường: Bioprep 3000L, Pulpzyme

HC, Scourzyme L –Novozymes, Baylase EVO – Bayer, Unizim PEC

– Color-Center SA, Baylase EVO, Sera Zyme C – PE của Singapore, Prima Green Ecoscour củaGenencor Các chế phẩm pectinase kiềm thay thế xút đã giảm rõ rệt giá thành sản xuất nhờ

Hơn nữa, do các điều kiện xử lý “ôn hòa” của enzyme pectinase dẫn đến tăng chất lượng vải,tăng mức độ thấm, hút nước và cũng làm tăng độ tươi sáng màu sau nhuộm theo Cavaco-Paulo & Gübitz (2003) [14]

w

w w.lrc t n u e d u v n

1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy

Trong công nghệ sản xuất bột giấy hiện nay, bước tẩy trắng bằng alkaline peroxide làbước bắt buộc để tạo sản phẩm giấy trắng tinh khiết Nếu bột giấy không được loại bỏ pectinaxit trong bột giấy thì trong quá tình tẩy trắng các pectina axit này sẽ kết hợp với peroxide

kiềm để loại pectin axit trong bột giấy giúp cho quá trình tẩy trắng hiệu quả mà không ảnhhưởng đến ô nhiễm môi trường [33], [34]

1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến

cà phê và trà

Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật do đó có khả năng ứngdụng ng trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các hạt như hạt cải, dầu dừa, hạt hướngdương, hạt nho v.v Việc xử lý các hạt với pectinase kiềm giúp cho việc chiết rút dầu thựcvật hiệu quả hơn so với dùng dung môi hexane dễ gây ung thư [20] Bổ sung pectinasekiềm cùng với hemicellulase và protease trong quá trình chế biến cà phê và trà lên menlàm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [7]

1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam

Pectinase là enzyme quan trọng trong công nghiệp do đó được đã được nhiều nhàkhoa học quan tâm Nhiều tác giả đã biểu hiện thành công pectinase dạng tái tổ hợp trong

tế bào E coli [30], [21], [24], [46], trên tế bào Bacillus [27] hay tế bào nấm men Pichia

pastoris [18], [52] Tuy nhiên phần lớn các công bố trên đều biểu hiện enzyme pectinase tái

tổ hợp cho mụng c đích nghiên cứu tính chất của enzyme, các công bố về tình Hình sản xuấtenzyme trong công nghiệp cũng như năng suất sản sinh pectinase tái tổ hợp của các chủng tái

tổ hợp đều rất ít thông tin Trên thực tế có nhiều chế phẩm enzyme pectinase thương mại làenzyme tái tổ hợp nhưng có rất ít thông tin về sản xuất pectinase tái tổ hợp trong côngnghiệp được công bố Lý giải cho việc không công bố này là do các công

ty đều muốn giữ bí mật công nghệ cho nên không muốn công bố kết quả nghiên cứu củamình, đây là việc làm bình thường trong kinh doanh Gần đây Liu và cộng sự công bố kết quả

biểu hiện gen pectinase từ B subtilis trong B subtilis WB600 hiệu suất cao mụng c đích ứng

dụng ng cho sản xuất công nghiệp Các tác giả đã biểu hiện thành công và enzyme tái tổ hợp chohoạt tính riêng là 445 U/mg [27] Không có công bố hoạt tính pectinase cụ thể là bao nhiêuunit/ml dịch enzyme ngoại bào sau lên men Công bố mới đây của Zhang và cộng sự đã biểu

hiện cao pectae lyase từ B subtilis 168 trong tế bào P pastoris GS115 cho mụng c đích loại pectin trong công nghiệp xử lý sợi gai Các tác giả đã tạo được chủng P pastoris tái tổ hợp có

khả năng sản xuất pectinase trên môi trường lên men đạt

102,36 U/ml dịch lên men [52]

Ở Việt Nam hiện nay có nhiều đề tài về enzyme pectinase Các hướng nghiên cứu tập

enzyme pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus [1], [2], [3].

VÂT LIÊU VA PHƯƠNG PHAP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Các chủng vi khuẩn

subtilis nguồn gốc Việt Nam từ bộ sưu tập chủng giống của ngân hàng chủng giống

VTCC-Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh

Chủng vi khuẩn E coli chủng DH5α, DH10b (Invitrogen) được sử dụng ng cho mụng c đích

tách dòng gen

w

w w.lrc t n u e d u v n

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm

Các hóa chất trong sinh học phân tử:

Enzyme cắt giới hạn EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, ScaI, Dream Taq DNA polymerase, T4 ligase, DNA marker, protein marker được mua từ hãng Fermentas.

Kit tách DNA plasmid, kit tinh sạch DNA genome từ agarose, dung dịch

Bradford được mua từ hãng Qiagen (CHLB Đức)

Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2 được mua từ các hãng Merck (CHLBĐức), Tris-HCl, hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB), pectincitrus, pectin axit được mua của hãng Sigma

2.1.3 Các vector sử dụng

Vector cloning: pJET1.2 được mua từ hãng Fermentas

Vector biểu hiện trong B subtilis dạng đa copy pMSE3 được nhận từ viện

Công nghệ sinh vật Biển Greifswald

2.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường LB (g/l): Pepton 10, cao nâm men 5, NaCl 5

- Môi trường khoáng chất Belitsky (BMM):

+ Thành phần chính (g/l): (NH4)2SO4 4; MgSO4.7H2O 4; KCl 4; Na3- citrat 2H2O

+ T-base (g/l): (NH4)2SO4 2; K2HPO4.3H2O 18,3; KH2PO4 6; Na3-citrate 1

- Môi trường SOC (g/l): Tryptone 20; yeast extract 5; NaCl 0,58; KCl

0,186; MgCl2 0,95; MgSO4 2,4; glucose 3,6; pH = 7

w

w w.lrc t n u e d u v n

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sàng lọc các chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa

Các chủng B subtilis trong bộ sưu tập chủng giống được trẻ hóa trên môi trường LB

thạch đĩa qua đêm sau đó cấy vạch sang môi trường LB thạch đĩa bổ sung cơ chất pectin0,2%, nuôi qua đêm trong tủ ấm 37 ºC Các đĩa nuôi cấy sau đó được nhuộm với dung dịch0,5% hecxadecyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) để phát hiện vòngthủy phân pectin Các chủng sinh pectinase sẽ tạo vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc

2.3.2 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B subtilis tự nhiên

Các chủng B subtilis được trẻ hóa trên môi trường LB lỏng ở 37 ºC, 200 vòng/phút

qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trường LB lỏng có bổ sung cơ chất pectin để kíchthích sự sản sinh pectinase Sau 24 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bàođược thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong

10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào được thu nhận và

bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp

Các chủng B subtilis tái tổ hợp được trẻ hóa trên môi trường LB lỏng (bổ sung 20 µg/

ml Kan) ở 37 ºC, 200 vòng/phút qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trường lỏng(LB, BMM hay FM bổ sung 20 µg/ml Kan) Sau 26 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịchenzyme ngoại bào được thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 ºC để loại tếbào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào được thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệmtiếp theo

2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]

Nguyên lý:

Dựa vào trạng thái cân bằng bền của thuốc nhuộm Coomassie Blue G trong dungdịch, ở điều kiện axit mạnh thuốc nhuộm này tạo phức hợp màu đỏ Khi có mặt protein,thuốc nhuộm sẽ kết hợp với protein làm cho dung dịch chuyển thành màu xanh Mức độđậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch do đó có thể định lượngnồng độ protein bằng việc đo dộ hấp phụ của dịch màu trên máy quang phổ ở bước sóng 595nm

Pha loãng dịch protein cần đo ở các độ pha loãng khác nhau (1/10, 1/20,

1/100) Bổ sung 20 µl dịch protein mẫu ở các độ pha loãng vào 0,98 ml dịch

Bradford 1x Đo OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ

Chuyển đổi giá trị OD 595 sang nồng độ protein (mg/ml) theo công thức chuyển đổi

Đồ thị đường chuẩn protein có dạng như sau:

Đường chuẩn prote in

0

60

50

4

w

w w.lrc t n u e d u v n

0.30.2

y = 1.247x +0.3831R2 =0.99490

10

0 0.05 0.10.15 0.2

BSA (m g/m l)

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein Công thức chuyển đổi từ giá trị OD595 sang nồng độ protein:

(y - 0,3831) a x=

1,247Trong đó x là nồng độ protein (mg/ml), y là giá trị OD 595, a là số lần phaloãng mẫu

-2.3.5 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld

1955)[10]

Nguyên lý:

Nguyên lý của phương pháp này dựa vào phản ứng của đầu đường khử (reducing sugerend) của các oligogalacturonate được tạo ra do phản ứng cắt liên kết glycoside của cơ chấtpectin bởi pectinase với 3,5 dinitrosalicylic axit (DNSA) Trong phản ứng này, 3,5 dinitrosalicylicaxit (màu vàng) bị khử thành 3 amino, 5- nitrosalicylic axit (màu đỏ cam) (Hình 2.2) Giá trị OD

đo ở bước sóng 530 nm của dung dịch phản ứng phản ánh hoạt tính của enzyme pectinase

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino,

Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch phản ứng 0,2% pectin, ủ

400µl DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội ở nhiệt độ phòng Đo OD ở bước sóng 530 nm

Pha dung dịch DNSA: DNSA: 5 g; K-Na-tartarate: 150 g; NaOH 2M:

100 ml; nước cất: đến 500 ml

Xây dựng đường chuẩn glucose:

Đường chuẩn glucose được thiết lập để qui đổi giá trị OD 530nm của dịch phản ứng enzyme sang đơn vị unit Glucose được cân chính xác với độ sai số

0,0001 - 0,0005 mg, được pha loãng với các nồng độ từ 0,2 đến 20 mM trong nước cất 0,5

ml dung dịch glucose ở các nồng độ khác nhau được bổ sung 0,5 ml DNSA, đun sôi 5 phút,làm nguội tới nhiệt độ phòng sau đó đo OD trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm Đồthị glucose chuẩn được thiết lập trên đoạn

thẳng trên phương trình hồi qui bằng chương trình Excel có dạng sau:

3

5

y = 0.7267x 0.0654R2 =0.99812

-1

510

50-0.5

0 1 2 3

4 5

Nồng độ glucos e (m M)

Hình 2.3 Đường chuẩn glucose

OD của phản ứng so màu ở 530 nm

Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme:

Một đơn vị hoạt tính enzyme (unit) được định nghĩa là lượng enzymepectinase phân cắt cơ chất pectin tạo ra 1 µM glucose trong 1 phút

Qui đổi từ giá trị OD 530 sang Unit được tính theo công thức sau:

1000 X E

=

-tTrong đó: X là số mM đường khử được sinh ra sau phản ứng, t là thời gian phản ứng enzyme (phút), 1000 là hệ số qui đổi mM sang µM đường khử

2.3.6 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi

Nguyên lý:

Liên kết đôi

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase

Enzyme pectinase phân cắt liên kết glycosid của pectin axit bằng cơ chế chuyển liênkết tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate ở đầu không khử (Hình 2.4) Liênkết đôi này có thể phát hiện trên máy quang phổ ở bước sóng 232 nm [28]

1 giờ Bổ sung 400 µl dung dịch HCl 50 mM để kết thúc phản ứng, ly tâm

10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bước

sóng 232 nm

Đối chứng âm: thay dịch enzyme bằng 50 µl dH2O

2.3.7 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis

Nguyên lý:

Để tách chiết được DNA tổng số cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên kết củaprotein với DNA Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA

Các bước tiến hành:

Nuôi 1 khuẩn lạc B subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua đêm Hút

trên, hòa tan tế bào vào trong 100µl TE pH 8.0 Bổ sung

10 µl lysozyme nồng độ 100 µg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau

đó bổ sung thêm 10 µl SDS 1%

DNA tổng số từ hãng Bioneer theo hướng dẫn của hãng như sau: Trộn đều 100

µl mẫu đã chuẩn bị với 500 µl dung dịch 1 (dung dịch ly giải ) (để phá vỡ tế bào), ủ hỗn hợp ở 70˚C trong 5 phút, làm mẫu nguội đến nhiệt độ phòng Thêm

600 µl chloroform, trộn đều hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và ly tâm

Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA: pha loãng dung dịch 2 với nước cất tỉ lệ

1/10: hòa 80 µl dung dịch 2 với 720 µl nước cất vô trùng Dùng pipet hút nhẹ

200 µl dung dịch DNA pha trên cùng sang ống chứa 800 µl dung dịch kết tủa DNA Trộn đều

hết dịch nổi, hòa tủa trong 150 µl dung dịch 3 (dung dịch hòa tan), trộn đều trong 10 giâyđến khi hòa tan hoàn toàn tủa dưới đáy ống Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗnhợp ở -20 ˚C trong 30 phút, ly tâm

và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 100 µl dung dịch TE, bảo quản -20 ºC

2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ E coli

DNA plasmid từ E coli được tách bằng kit tách plasmid của Qiagen, các bước tách

chiết được tiến hành theo hướng dẫn của hãng

2.3.9 Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis

lắc qua đêm Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft, li tâm

dung dịch lysozyme nồng độ 20 mg/ml (pha mới trong ngày), trộn đều, ủ 37º C trong 30

M kali acetate; pH 4,2), đảo ngược ống 3-4 lần Chiết với 0,5 ml chloroform

Sau khi tủa bằng cồn, li tâm, làm khô và hòa lại plasmid trong 50 ul TE, bảo quản

2.3.10 Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử

2.3.10.1 Khuếch đại gen bằng PCR

Bảng 2.2 Chương trình nhân gen bằng PCR