PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN

MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY

BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN

HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT

Họ và tên sinh viên : HUỲNH LÊ NGỌC DIỄM

Niên khóa : 2003 - 2008

Tháng 09/2008

PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN

MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY

BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT

Tác giả

HUỲNH LÊ NGỌC DIỄM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

Cấp bằng bác sỹ ngành

Thú y

Giáo viên hướng dẫn

ThS Nguyễn Thị Phước Ninh BSTY Đỗ Tiến Duy BSTY Lâm Thị Tú Anh

Tháng 09/2008

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng lên cha mẹ, người đã sinh thành, dạy dỗ, nuôi nấng và là điểm tựa tinh thần cho con trong cuộc sống

Xin trân trọng cảm ơn:

Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Ban chủ nhiệm Bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu của tôi

Trân trọng biết ơn quý thầy, cô:

Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu và tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình học tập

Khắc ghi công ơn:

ThS Nguyễn Thị Phước Ninh

BSTY Đỗ Tiến Duy

BSTY Lâm Thị Tú Anh

Đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Xin cảm ơn:

Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM

Ban quản lý Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM

Ban quản lý Trạm Thú Y quận Bình Thạnh

Ban quản lý Trạm Thú Y quận 5

Ban Giám Đốc Xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong

Các cô chú, anh chị đang công tác tại Bệnh Viện Thú Y, Trung Tâm Phân Tích, xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn bè tôi, lớp thú y 29 đã giúp đỡ và chia

sẽ những vui buồn trong thời gian học tập

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài “Phân lập và ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện Mycoplasma

hyopneumoniae, so sánh mức độ gây bệnh của Mycoplasma hyopneumoniae trên

heo cai sữa và heo thịt” được thực hiện trong 6 tháng từ ngày 15/2/2008 đến ngày 15/8/2008 tại Bệnh Viện Thú Y và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM

Nghiên cứu này nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán Mycoplasma

hyopneumoniae (MH) hữu hiệu trong phòng thí nghiệm đồng thời có nhận định khái

quát về mức độ gây bệnh của MH trên heo cai sữa và heo thịt để từ đó ứng dụng vào việc chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh do MH đạt hiệu quả cao

Mẫu phổi trên heo cai sữa và heo thịt có bệnh tích nghi ngờ do MH được thu thập

để đánh giá bệnh tích đại thể theo công thức của Christensen (1999) và Rice (2000), dùng môi trường Friis để phân lập và xác định MH bằng kỹ thuật PCR

 Đánh giá bệnh tích và mức độ hư hại trên 63 phổi heo cai sữa và 146 phổi heo thịt cho kết quả như sau:

- Trên heo cai sữa: tỷ lệ phổi có bệnh tích là 92,06% (58/63)

- Trên heo thịt: tỷ lệ phổi có bệnh tích là 91,78% (134/146)

 Đánh giá tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ do MH cho kết quả như sau:

- Trên heo cai sữa: tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ do MH là 79% (46/58) Bệnh tích tập trung chủ yếu ở điểm 2 tức là khoảng 25-50% bề mặt phổi

- Trên heo thịt: tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ do MH là 85,82% (115/134) Bệnh tích tập trung chủ yếu ở điểm 2 (khoảng 25-50% bề mặt phổi)

 Tỷ lệ phân lập MH trên môi trường thạch Friis từ mẫu phổi heo thịt cho kết quả dương tính 68,75% (11/16)

 Kỹ thuật PCR để xác định MH trên phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH cho kết quả như sau:

- Trên heo cai sữa: tỷ lệ dương tính là 44,44% (4/9)

- Trên heo thịt: tỷ lệ dương tính là 47,06% (8/17)

Qua kết quả như trên chúng tôi nhận thấy tỷ lệ bệnh trên đường hô hấp ở heo cai sữa và heo thịt là rất cao trong đó bệnh nghi ngờ do MH chiếm tỷ lệ lớn Đồng thời kết quả này cũng cho thấy mức độ gây bệnh của MH trên phổi heo cai sữa và heo thịt là tương đương nhau

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt khóa luận iii

Mục lục iv

Danh sách các từ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 3

2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 3

2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý 3

2.1.2 Căn bệnh học 4

2.1.2.1 Phân loại 4

2.1.2.2 Đặc điểm của M hyopneumoniae 5

2.1.3 Truyền nhiễm học 7

2.1.3.1 Loài vật mắc bệnh 7

2.1.3.2 Chất chứa căn bệnh 8

2.1.3.3 Đường truyền lây 8

2.1.3.4 Cách sinh bệnh 9

2.1.4 Triệu chứng 10

2.1.4.1 Thể cấp tính 10

2.1.4.2 Thể mãn tính 10

2.1.4.3 Thể viêm phổi phức hợp 11

2.1.5 Bệnh tích 11

2.1.5.1 Bệnh tích đại thể 11

2.1.5.2 Bệnh tích vi thể 11

2.1.6 Chẩn đoán 12

2.1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 12

2.1.6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 13

2.1.7 Điều trị 18

2.1.8 Phòng bệnh 19

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21

3.1 Thời gian và địa điểm 21

3.1.1 Thời gian 21

3.1.2 Địa điểm 21

3.2 Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm 21

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.2 Dụng cụ thu thập mẫu 21

3.2.3 Dụng cụ xử lý mẫu và phân lập MH tại phòng thí nghiệm 22

3.3 Đối tượng nghiên cứu 22

3.4 Nội dung 22

3.5 Phương pháp tiến hành 23

3.5.1 Đánh giá mức độ phân bố của bệnh tích chung và bệnh tích nghi ngờ do MH trên phổi heo cai sữa và heo thịt 23

3.5.2 Phân lập MH 24

3.5.2.1 Thu thập mẫu 24

3.5.2.2 Xử lý mẫu 25

3.5.2.3 Môi trường nuôi cấy 25

3.5.3 Kỹ thuật PCR để xác định MH 25

3.5.3.1 Xử lý mẫu 25

3.5.3.2 Ly trích DNA từ mẫu phổi 26

3.5.3.3 Ly trích DNA từ khuẩn lạc 26

3.5.3.4 Phản ứng PCR để phát hiện MH 26

3.6 Tính toán kết quả 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả đánh giá bệnh tích gây hư hại trên phổi 28

4.1.1 Đánh giá bệnh tích gây hư hại chung trên phổi 28

4.1.2 Đánh giá bệnh tích hư hại trên phổi có tính định hướng do MH 29

4.1.2.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH 29

4.1.2.2 Đánh giá mức độ hư hại trên phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 32

4.2 Kết quả phân lập MH 37

4.2.1 Phân lập MH trên môi trường thạch Friis 37

4.2.2 Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR trên mẫu phổi 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

APP : Actinobacillus pleuropneumoniae

BHI : Brain Heart Infusion broth

Bp : Base pair

CF : Complement fixation DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleic triphosphate ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FITC : Fluorescein isothicyanate IHA : Indirect hemagglutination IHC : Immunohistochemistry

kb, kDa : Kilobase pairs, kilo dalton

MH : Mycoplasma hyopneumoniae

PRRSV : Porcine reproductive and respriratory syndrome virus

PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymerase Chain Reaction PPLO : Pleuro-Pneumoniae-Like-Organism

R : Reverse

SDS : Sodium Dodecyl Sulfat SPF : Specific Pathogen Free Taq : Thermus aquaticus

TBE : Tris borate EDTA

TE : Tris EDTA TMRI : Tetramethylrhodamine isothiocyanate

UI : Unit international

UV : Utral violet

µl : Microlit

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa để xác định MH 6

Bảng 2.2 Nhiệt độ tối ưu với chuồng heo 9

Bảng 3.1 Bố trí trí nghiệm 22

Bảng 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích trong đánh giá 28

Bảng 4.2 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH trên heo cai sữa và heo thịt 29

Bảng 4.3 Các bệnh tích thường gặp trên phổi heo đánh giá 31

Bảng 4.4 Tỷ lệ hư hại trên phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH 32

Bảng 4.5 Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae ở các mức độ 34

Bảng 4.6 Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ do M hyopneumoniae trên phổi 35

Bảng 4.7 Kết quả xác định MH từ khuẩn lạc nghi ngờ bằng kỹ thuật PCR 38

Bảng 4.8 Kết quả xác định MH trên mẫu phổi bằng kỹ thuật PCR 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 4.1 Phổi heo thịt có bệnh tích nhục hóa ở thùy đỉnh, thùy giữa và thùy hoành

cách mô 36

Hình 4.2 Phổi heo cai sữa có bệnh tích nhục hóa ở thùy đỉnh và thùy giữa 37

Hình 4.3 Khuẩn lạc MH sau 7 ngày nuôi cấy 39

Hình 4.4 Kết quả chạy PCR mẫu thạch và phổi heo thịt 41

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH trên heo cai sữa và heo thịt 30

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ hư hại trung bình trên phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH 33

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm MH ở các mức độ 34

Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nuôi cấy MH trên môi trường thạch 38

Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ phổi dương tính với MH qua kiểm tra bằng kỹ thuật PCR 40

Sơ đồ 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR 17

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ thực hiện các bước thí nghiệm 23

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập Mycoplasma hyopneumoniae 25

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm do Mycoplasma hyopneumoniae là

bệnh đường hô hấp phổ biến trên heo, lây lan nhanh và thường xảy ra ở thể mãn tính Mặc dù bệnh không gây tỷ lệ chết cao nhưng gây thiệt hại kinh tế một cách đáng kể vì heo sẽ giảm tăng trọng, tăng tỷ lệ loại thải, giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, kéo dài thời gian nuôi và tăng chi phí thuốc điều trị (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006) Tỷ lệ heo mắc bệnh khá cao từ 50-100% Tuy nhiên tỷ lệ chết thường thấp khoảng 16% nếu không ghép với các bệnh truyền nhiễm khác (Trần Thanh Phong, 1996) Heo từ 50 đến

85 kg phơi nhiễm với M hyopneumoniae sẽ giảm sức tăng trưởng khoảng 12,7%

(Pointon và ctv, 1985; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006), tăng chỉ số tiêu tốn thức ăn khoảng 10% (Muirhead, 1989; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003) Heo con tiếp xúc với heo mẹ mang trùng thì giảm sức tăng trưởng khoảng 15,9% (từ lúc 8

kg đến 85 kg) và hệ số chuyển hóa thức ăn giảm 13,8% (từ lúc 10 đến 25 kg) (Ross,

1999; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

Bên cạnh đó việc phân lập Mycoplasma hyopneumoniae gặp rất nhiều khó khăn

do Mycoplasma hyopneumoniae chậm tăng trưởng, đòi hỏi môi trường giàu dưỡng

chất và rất dễ bị vấy nhiễm bởi các tác nhân khác (Quinn, 1994)

Như vậy để kiểm soát bệnh có hiệu quả và làm giảm thiệt hại do MH gây ra cần phải chẩn đoán nhanh và chính xác sự hiện diện của MH trong đàn heo Kỹ thuật PCR

tỏ ra hoàn hảo và thích hợp cho mục đích này vì kỹ thuật PCR cho kết quả nhanh, đặc hiệu, không phụ thuộc sự sống hay chết của mầm bệnh (Calsamiglia, 1998; trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004) Theo Trần Thị Dân và ctv (2003), kỹ thuật PCR phát hiện

MH có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 100% (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ Môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, dưới

sự hướng dẫn của ThS Nguyễn Thị Phước Ninh, BSTY Đỗ Tiến Duy, BSTY Lâm

Thị Tú Anh chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và ứng dụng kỹ thuật PCR để phát

hiện Mycoplasma hyopneumoniae, so sánh mức độ gây bệnh của Mycoplasma

hyopneumoniae trên heo cai sữa và heo thịt”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định Mycoplasma hyopneumoniae (MH) từ mẫu phổi có bệnh tích bằng kỹ

thuật phân lập và PCR So sánh mức độ gây bệnh của MH trên heo cai sữa và heo thịt

để từ đó ứng dụng vào việc chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh do MH đạt hiệu quả cao

- Phân lập MH trên mẫu phổi heo có bệnh tích đặc trưng

- Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán MH từ mẫu phổi và hỗ trợ xác định

MH trong phân lập

- So sánh mức độ gây bệnh của MH trên 2 hạng heo

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm

Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm còn gọi là bệnh viêm phổi dịch vùng

hay suyễn heo do Mycoplasma hyopneumoniae (MH) gây ra, thường tồn tại dưới dạng

mãn tính với đặc điểm gây viêm phế quản phổi tiến triển chậm, ho kéo dài nhiều tuần, heo chậm lớn, sức đề kháng bệnh yếu

Đây là bệnh đường hô hấp trên heo phổ biến ở nước ta và trên thế giới Bệnh được xem là nguyên nhân quan trọng gây thiệt hại kinh tế do làm giảm sức đề kháng, giảm năng suất chăn nuôi, heo còi cọc, chậm lớn, tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao, tăng chi phí thuốc điều trị (Nguyễn Đức Lưu và Nguyễn Hữu Vũ, 2004)

Thiệt hại càng nghiêm trọng hơn khi có sự tương tác phức tạp giữa nhiễm

Mycoplasma với các tác nhân cảm nhiễm khác, quản lý kém và điều kiện môi trường

không tốt Các vi khuẩn khác như Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella

bronchiseptica, Actinomyces pyogenes, Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Pasteurella mutocida, Klebsiella và Salmonella cũng tham dự làm bệnh trầm trọng

hơn (Straw và Clark, 1999; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003)

2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý

Năm 1892 hai nhà bác học Nocard và Roux phát hiện ra loài sinh vật này trên bò

bị viêm phổi (Lê Anh Phụng, 1996) Năm 1898 hai ông đã phân lập được loài sinh vật này trên phổi những bò bị bệnh viêm phổi và đặt tên là PPLO (Pleuro- Pneumoniae-

Like-Organism) Mãi đến năm 1929 hai ông mới đề nghị đặt tên là Mycoplasma (Trần

Thị Bích Liên và Tô Minh Châu, 2001)

Năm 1933, Kobe (Đức) phát hiện bệnh viêm phổi mãn tính trên heo và ông gọi dưới tên là cúm heo (trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004)

Nghiên cứu của Pullar (1948), Gulrajani và Beveridge (1951) mô tả đặc điểm của bệnh viêm phổi địa phương và phân biệt với bệnh cúm heo (Ross, 1992) Đồng thời

cũng trong năm 1951, Eunrujani phát hiện bệnh ở Anh Sau đó bệnh xảy ra ở Mỹ, Pháp, Hungari, Phần Lan, Trung Quốc, Nhật Bản (Dương Thị Thu Thủy, 2004)

Theo Mare, Switer, Goodwin và ctv (1965) đã phân lập một loài Mycoplasma trên phổi heo bị viêm và gây bệnh thực nghiệm, từ đó đề nghị đặt tên là Mycoplasma

hyopneumoniae (Ross, 1999; trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005)

Ở Việt Nam, theo Nguyễn Như Pho (2003) bệnh được phát hiện vào năm 1957 từ đàn heo ngoại nhập vào miền Bắc, sau đó lan nhanh Tuy nhiên, vào thời điểm đó chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh Hiện nay, bệnh xảy ra hầu như ở khắp các trại trong nước

2.1.2 Căn bệnh học

2.1.2.1 Phân loại

Mycoplasma hyopneumoniae thuộc lớp Mollicutes, là tế bào procaryote nhỏ nhất

có đời sống độc lập và có khả năng tự nhân đôi (Quinn, 1994)

Theo Razin và ctv (1998), Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes vì Mycoplasma

không có thành tế bào, được bao bọc bởi một màng nguyên sinh chất có 3 lớp Trong

phân loại, việc thiếu thành tế bào được dùng để phân biệt Mycoplasma với các vi

Loài Mycoplasma hyopneumoniae

Trong 6 giống của lớp Mollicutes thì giống Mycoplasma có số lượng loài phong phú nhất với hơn 80 loài đã được mô tả Theo Barbara (1999), Mycoplasma có hơn 13

loài gây bệnh trên heo, nhưng các loài phổ biến nhất thường được quan tâm là:

- M hyosynoviae: gây viêm đa khớp ở heo 12-14 tuần tuổi

- M hyorhinis: gây tình trạng viêm khớp và viêm đa thanh dịch mãn tính ở

heo 3-10 tuần tuổi

- M flocculare: đa hình thái, có cấu trúc kháng nguyên và sự sinh trưởng

tương tự như M hyopneumoniae

- M hyopneumoniae: gây dịch viêm phổi địa phương trên heo

2.1.2.2 Đặc điểm của M hyopneumoniae

Mycoplasma hyopneumoniae thuộc nhóm gram âm nhưng bắt màu kém với thuốc

nhuộm gram, bắt màu tốt khi nhuộm Giemsa và Romanowsky Chúng sống ký sinh nội bào và ngoại bào

MH sản sinh cytotoxin và bị vô hoạt ở 1000C trong vòng 15 phút Thời gian tăng

trưởng dài hơn so với các Mycoplasma khác (từ 5-7 ngày) (Trần Thanh Phong, 1996)

Cấu trúc kháng nguyên gồm nhiều loại: lactate dehydrogenase protein (36kDa),

các protein có trọng khối phân tử 40, 43, 64, 71, 79 kDa giúp phân biệt với M

flocculare, M hyorhinis (Trần Thanh Phong, 1996)

Mycoplasma có kích thước rất nhỏ khoảng 400-1200nm (bằng khoảng 1/5 vi

trùng), bộ gen 893-920 kilobase pairs (kb), nhỏ hơn rất nhiều so với vi khuẩn (1050.104 kb).Vi sinh vật này thiếu thành tế bào (Tajama và cộng sự, 1982) Quanh cơ thể chỉ là một màng nguyên sinh chất gồm protein, glycoprotein, glycolipide và phospholipid nên mềm dẻo, đa hình thái (hình cầu, hình xoắn, hình sợi hay vòng…) và

có thể dễ dàng qua được lọc 0,22m Ngoài ra MH còn có khả năng đề kháng với một

số kháng sinh tác động lên thành tế bào như penicillin, streptomycin, sunfamid, nhạy cảm với các kháng sinh phong bế tổng hợp protein hay acid nhân như tetracycline,

chloramphenicol, aminoacid ngăn cản sự nhân lên của Mycoplasma (Nguyễn Vân Tiên, 2002; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh)

MH thường hiện diện trong lòng ống của phế quản, phần lớn được tìm thấy giữa những tế bào lông rung và phần đỉnh của những tế bào vi nhung mao, trên tế bào biểu

mô phế quản và một số khác thì nằm tự do trong lòng ống (Masanori Tajima, 1982; trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005)

MH có khuẩn lạc hình tròn, lồi nhưng không có dạng hình trứng chiên như các

Mycoplasma khác, không xuyên qua bề mặt thạch, kích thước khuẩn lạc từ 200 – 400

µm (sau 5 – 10 ngày nuôi cấy) Mọc tốt nếu có 5-10 % CO2

Theo Friis (1974) thì khuẩn lạc MH có thể nhìn thấy được sau 2 ngày nuôi cấy và gia tăng kích thước từ từ sau khoảng 10 ngày ủ và đạt tối đa sau 14 ngày, tuy nhiên kích thước này còn tùy thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (Stalheim, 1990) Bên cạnh đó việc nuôi cấy trên môi trường canh thì MH có thời gian phát triển

chậm và dễ bị lấn át bởi Mycoplasma hyorhinis Thường sau 3 đến 10 lần cấy chuyển

chúng mới bắt đầu thích nghi với môi trường và có thể chuyển màu rõ rệt từ đỏ sang

vàng sau 24 đến 48 giờ trong khi đó M hyorhinis làm đổi màu môi trường nhanh hơn

chỉ sau 3 ngày ủ (Ross và Whitlestone, 1983)

 Đặc tính sinh hóa

Theo Gardella và ctv (1983), một số phản ứng sinh hóa của MH giúp phân

biệt với các loài Mycoplasma khác, đặt biệt là Mycoplasma gây bệnh trên heo (trích

dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006):

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa để xác định MH

Loài M hyopneumoniae M hyorhinis M hyosynoviae

 Sức đề kháng

Hầu hết chất sát trùng đều có hiệu quả với Mycoplasma như phenol, formol,

propiolactone, methiolate

Mycoplasma yếu ớt khi ra bên ngoài cơ thể vật chủ và sự tồn tại của nó hạn

chế trong vài ngày hay ít hơn khi ở điều kiện chuồng nuôi bình thường, nếu được bảo

vệ bởi chất tiết hay nhiệt độ môi trường lạnh thì nó sẽ sống sót lâu hơn (Nguyễn Thị

Phước Ninh, 2006) Mycoplasma rất mẫn cảm với tia tử ngoại và sự khô hạn Ở nhiệt

độ 45-550C hầu như chúng bị tiêu diệt trong vòng 15 phút, nhưng có thể tồn tại đến 17 ngày trong môi trường nước mưa ở nhiệt độ 2-70C (Tô Minh Châu, 2000) Trong phổi tồn tại 2 tháng ở -250C, 9-11 ngày ở nhiệt độ 1-60C và chỉ 3-7 ngày ở nhiệt độ 17-

250C

Đề kháng với penicillin và thallium acetate ở nồng độ thấp (1/4000) nên thường được thêm vào môi trường nuôi cấy để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram(+) và nấm

MH có khả năng phát tán trong không khí với đường kính từ 3-3,5 km do đó bệnh dễ lây lan từ trại này sang trại khác nhất là trong điều kiện thời tiết lạnh, khí hậu

ẩm

 Điều kiện và môi trường nuôi cấy

MH yêu cầu môi trường giàu dưỡng chất Môi trường thường sử dụng nhất là môi trường Friis bao gồm các thành phần: huyết thanh ngựa hay heo, môi trường dinh dưỡng cao BHI, thạch PPLO nhằm cung cấp cholesterol và acid béo để tổng hợp màng

tế bào Những yếu tố tăng trưởng khác cần cho sự phát triển như chất trích nấm men tươi, acid nucleic Penicillin, streptomicin và thallium acetate ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm mốc Ngoài ra phenol red được thêm vào như một chất chỉ thị để kiểm tra sự hiện diện của MH

Nhiệt độ thích hợp ở 37oC trong điều kiện có thêm 5-10% CO2, pH từ 7,2-7,8

Có thể nuôi cấy Mycoplasma trên phôi gà 7 ngày với đường tiêm túi lòng đỏ

2.1.3 Truyền nhiễm học

2.1.3.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên: vi khuẩn này chỉ gây bệnh trên heo Heo ở tất cả các lứa tuổi đều mắc bệnh nhưng cảm thụ mạnh nhất ở heo con và giai đoạn bắt đầu chuẩn bị đưa qua nuôi thịt, lúc lượng kháng thể giảm thấp (Trần Thị Dân và ctv, 2006) Heo con sơ sinh thường cảm nhiễm từ mẹ hoặc từ môi trường, trong điều kiện môi trường xấu có thể phát bệnh lúc một tháng tuổi hoặc sau cai sữa

Heo nái mang thai và nuôi con cũng dễ cảm nhiễm mầm bệnh

Khi heo được 20 tuần tuổi, tỷ lệ bệnh có thể lên đến 100% (Robert, 2003; trích dẫn Đặng Thị Thu Hường, 2005) Ngoài ra, giống heo ngoại nhập nội có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn giống heo lai và heo thuần giống nội (Quách Tuyết Anh, 2003)

Phòng thí nghiệm: heo con từ 10-21 ngày tuổi được chọn làm động vật thí nghiệm

2.1.3.2 Chất chứa căn bệnh

Mầm bệnh tập trung chủ yếu ở các tổ chức phổi, chất tiết đường hô hấp Ngoài ra,

trong các hạch bạch huyết dọc khí quản cũng chứa nhiều Mycoplasma

Heo khỏi bệnh vẫn mang mầm bệnh trên đường hô hấp từ vài tháng đến cả năm

2.1.3.3 Đường truyền lây

M hyopneumoniae chủ yếu lây truyền qua đường hô hấp Heo mang trùng là nguồn lây nhiễm chính trong chăn nuôi

M hyopneumoniae tồn tại trong đàn bằng cách truyền lây từ heo mẹ sang heo

con, từ heo nái sang heo thịt, từ heo lớn sang heo nhỏ

Khi heo mẹ nhiễm bệnh (thú mang trùng) thì sự tiếp xúc trực tiếp giữa heo mẹ và heo con (mũi với mũi) là điều kiện lý tưởng truyền bệnh sang heo con Một vài heo nhiễm bệnh trong đàn khi tiếp xúc với heo khỏe, sau một vài cơn ho sẽ bài xuất mầm bệnh qua các hạt chất tiết lơ lửng trong không khí, heo khỏe mạnh hít phải sẽ mắc bệnh, từ đó hình thành một đàn heo nhiễm bệnh mới Theo Goodwin (1985), mầm bệnh có thể phát tán trong không khí với đường kính >3,2km

Yếu tố môi trường, điều kiện chăn nuôi, vệ sinh chăm sóc đóng vai trò không

kém quan trọng để mở đường cho M hyopneumoniae xâm nhập và gây bệnh (Carlton,

1995; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006) như:

- Sự thông thoáng (khoảng không gian, tốc độ không khí lưu thông): tốc độ gió phải đạt ít nhất 2 m/h (Huỳnh Thị Thanh Thủy, 2006)

- Nồng độ bụi và các khí độc hại (NH3, H2S, CO2): nồng độ NH3 trên 10 ppm trong không khí chuồng nuôi có thể làm gia tăng tỷ lệ ho, 50-100 ppm làm giảm tăng trọng hằng ngày 12-30%, 61 ppm gây giảm 5% lượng thức ăn được ăn vào Nồng

độ tối đa của H2S trong chuồng là 10 ppm (Barker và ctv, 2000; trích dẫn bởi Huỳnh Thị Thanh Thủy, 2006)

- Sự biến động ẩm độ: nên giữ ẩm độ trong chuồng khoảng 50-70% (Huỳnh Thị Thanh Thủy, 2006)

- Nhiệt độ cùng với sự nhốt chung nhiều thú có nguồn gốc khác nhau

Bảng 2.2 Nhiệt độ tối ưu với chuồng heo (Phillips và Bicker, 2000; trích dẫn bởi

Huỳnh Thị Thanh Thủy, 2006)

Chuồng nuôi Nhiệt độ tối ưu (oC)

Heo 3 tuần tuổi 27 Heo 12-30 tuần tuổi 27 Heo 30-50 tuần tuổi 24 Heo 50-70 tuần tuổi 18

Heo nái chữa 16 Heo đực giống 16

2.1.3.4 Cách sinh bệnh

Mycoplasma hyopneumoniae chủ yếu khu trú và gây bệnh ở đường hô hấp

(Nguyễn Như Pho, 2003)

Mặt trong của hệ thống phế quản có rất nhiều lông rung, các lông rung này giữ

nhiệm vụ đẩy các chất cặn bẩn trong đường hô hấp ra ngoài Do Mycoplasma có đặc

tính kết dính và sản sinh độc tố trên tế bào vật chủ nên sau khi theo đường hô hấp vào trong cơ thể, MH định vị ở đỉnh của lông rung hoặc tiếp xúc trực tiếp với vi nhung mao, sản sinh độc tố, tấn công làm tê liệt hệ thống lông rung, sau đó gây thoái hóa, hoại tử các lông rung, phá hỏng hệ thống tiết dịch nhày, thậm chí làm hư hại tế bào biểu mô Từ đó để lại các tổn thương trên niêm mạc phế quản tạo nên hiện tượng viêm phế quản và vùng rìa của các thùy phổi, làm suy giảm chức năng hô hấp và làm chảy nước mũi (Baskrville, 1972; trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004)

Chính những tổn thương ở hệ thống lông rung và tế bào biểu mô tạo điều kiện

thuận lợi cho sự kế phát các vi sinh vật khác như Pasteurella, Streptococcus,

Salmonella, Actinobacillus, Haemophilus hoặc các virus gây bệnh trên đường hô hấp

như virus Aujeszky, virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV) phát triển

mạnh, làm cho diễn biến bệnh nặng hơn, gây các bệnh điển hình như viêm phổi thùy lớn, viêm màng phổi, viêm phổi hóa mũ…con vật có thể chết nhanh và nhiều hơn Theo Trần Thanh Phong (1996), nếu sức đề kháng của cơ thể gia súc tốt thì

Mycoplasma sẽ tạm thời bị cô lập Còn nếu sức đề kháng của cơ thể kém (do điều kiện

vệ sinh nuôi dưỡng kém, thời tiết thay đổi đột ngột…) trạng thái cân bằng bị phá vỡ

Mycoplasma sẽ tăng độc lực, sinh sản nhanh và tấn công vào các thùy phổi từ đó tạo

bệnh tích hoá gan đỏ rồi hoá gan xám, nhục hoá, tụy tạng hoá, xuất hiện những vùng khí thủng

- Một số biểu hiện lâm sàng thể cấp tính như sau:

+ Thân nhiệt tăng 400C có khi kéo dài trong nhiều ngày

+ Vật kém ăn hay bỏ ăn, bỏ bú, da có phần nhợt nhạt

+ Xuất hiện xáo trộn hô hấp như hắt hơi, khịt mũi, chảy nhiều nước mũi,

Thú tăng trọng chậm, tăng chỉ số biến chuyển thức ăn Thể mãn tính ít gây các triệu chứng điển hình do đó ít được các nhà chăn nuôi lưu ý Tuy nhiên, thể bệnh này gây thiệt hại kinh tế lớn do khả năng hồi phục rất chậm, heo chậm lớn và tiêu tốn thức

ăn cao

2.1.4.3 Thể viêm phổi phức hợp

Thường xảy ra trên heo con giai đoạn cai sữa bị nhiễm Mycoplasma vài tuần

trong điều kiện nuôi dưỡng không tốt, các vi khuẩn khác trong đường hô hấp phát triển gây phụ nhiễm làm trầm trọng thêm tình trạng viêm phổi với các triệu chứng: ho nhiều, thở nhanh, rất khó thở sau khi ho Nếu cảm nhiễm nặng, heo sẽ sốt cao, bỏ ăn, khó thở Các heo được chữa khỏi thường bị còi cọc, bệnh tích viêm phổi tồn tại đến lúc giết mổ (Nguyễn Như Pho, 2003; trích dẫn bởi Hoàng Văn Đức, 2007)

2.1.5 Bệnh tích

2.1.5.1 Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đặc trưng do Mycoplasma là viêm phổi có tính chất đối xứng hai bên,

tập trung ở thùy đỉnh, thùy giữa, thùy phụ và đỉnh của thùy hoành cách mô (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

Bệnh tích xuất hiện sớm nhất khoảng 3 ngày sau khi gây nhiễm thực nghiệm Phổi xuất hiện những vùng hóa gan đỏ hoặc xám và trở nên cứng nhạt màu sau 13 ngày nhiễm (nhục hóa phổi) (Trần Thanh Phong, 1996) Ba tuần sau khi nhiễm vùng nhục hóa có màu đỏ nhạt, vàng nhạt hoặc xám, rất cứng như tụy tạng (tụy tạng hóa phổi) (Taylor, 1995; trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004)

Phổi phải thường bị nặng hơn phổi trái, vùng bệnh tích khác biệt rất rõ với vùng phổi bình thường (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

Hạch lâm ba phổi sưng to gấp 2-5 lần bình thường (thuỷ thủng nhưng không xuất huyết) Trong giai đoạn đầu và giữa của bệnh, khí quản tiết dịch viêm cata, nếu có tạp nhiễm trên phổi thấy xuất hiện những ổ mủ, viêm màng phổi hay viêm phổi dính sườn Khi không có phụ nhiễm, bệnh tích thường chỉ khoảng 1/10 phổi, nhưng khi có phụ nhiễm, bệnh tích mở rộng có thể đến 1/2-2/3 phổi (Trần Thanh Phong, 1996)

2.1.5.2 Bệnh tích vi thể

Được mô tả bởi Whitleston (1972): Mô phổi có sự tập trung các bạch cầu trung tính trong lòng ống và chung quanh đường thở cũng như trong phế nang Có sự xâm

nhiễm tế bào lympho vào trong các tiểu động mạch, tiểu tĩnh mạch và quanh đường thở Sự gia tăng tế bào lympho quanh các mao quản và tiểu phế quản Khoảng 10-15 ngày có thể thấy bệnh tích rõ ràng, ngày càng tích tụ nhiều dịch chất, tế bào đơn nhân lớn, vách liên phế nang dầy hơn Bệnh tích nặng hơn vào 17-40 ngày sau khi cảm nhiễm Vùng bệnh tích đang lành có nhiều phế nang bị xẹp, khí thủng và những nốt lympho tăng sinh mạnh mẽ đặc biệt trong đường thở

Quan sát bệnh tích vi thể thấy hệ thống lông rung bị bào mòn, lòng phế quản có nhiều chỗ tổn thương làm phế quản dầy lên, bên trong chứa nhiều dịch chất và tế bào bạch cầu, đây là nguyên nhân chính gây hẹp phế quản từ đó gây hiện tượng khó thở trên heo (trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003)

2.1.6 Chẩn đoán

2.1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng

Cần dựa vào các đặc điểm:

- Dịch tễ học: bệnh xảy ra trong điều kiện vệ sinh nuôi dưỡng chăm sóc kém, chuồng nuôi có độ thông thoáng không tốt, mật độ nuôi dầy, bệnh phát triển chậm và lây lan nhanh…

- Triệu chứng lâm sàng: bao gồm ho kinh niên, thở khó, tần số hô hấp cao, chậm tăng trưởng, còi cọc, tử số thấp

- Bệnh tích: phổi có nhiều vùng bị gan hóa, nhục hóa, tụy tạng hóa mang tính chất đối xứng Bệnh tích đại thể thì khá đặc trưng nhưng không chuyên biệt vì có

trường hợp bệnh tích tương tự nhưng lại do các tác nhân khác gây ra như Pasteurella,

Salmonella, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

Phân biệt với các bệnh do:

2.1.6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Theo Satoshi Futo (1992), Mycoplasma hyopneumoniae là một trong những dòng

Mycoplasma khó phân lập nhất trong phòng thí nghiệm do có tính kén chọn và mọc

chậm trên môi trường, mất rất nhiều thời gian cộng thêm sự tạp nhiễm các vi khuẩn

khác Nhưng việc phân lập Mycoplasma hyopneumoniae vẫn được xem là “tiêu chuẩn

vàng” (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006)

Mặt khác, có thể sử dụng một số phương pháp huyết thanh học như:

 Thử nghiệm ức chế tăng trưởng và biến dưỡng

Dựa vào nguyên tắc tăng trưởng và biến dưỡng của Mycoplasma bị ức chế bởi

kháng huyết thanh đặc hiệu, người ta dùng các thử nghiệm này để xác định loài của

Mycoplasma (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang

Là kỹ thuật chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, dễ thực hiện và nhanh

chóng chỉ cần vài giờ để xác định Mycoplasma Phản ứng này phát hiện Mycoplasma

bằng cách nhuộm huỳnh quang khuẩn lạc Chất huỳnh quang thường được dùng để gắn vào kháng thể là fluorescein isothicyanate (FITC) và tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRI) (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry (IHC) assay)

Thử nghiệm này rất hữu dụng trong công tác chẩn đoán bệnh viêm phổi do

Mycoplasma nhưng nó có thể không đặc hiệu cho MH vì có thể có phản ứng chéo với

các Mycoplasma khác Mặt khác, phương pháp này phải được thực hiện trong phòng

thí nghiệm, không thể thực hiện chẩn đoán tại hiện trường được Mẫu bệnh phẩm được lấy từ các tế bào biểu mô của đường ống dẫn khí

Kỹ thuật này dựa trên sự xác định các kháng nguyên trong các lát cắt mô bằng kháng thể đặc hiệu qua phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Phản ứng kết hợp bổ thể (Complement fixation-CF)

Được dùng để xác định kháng thể đáp ứng trong giai đoạn sớm Phản ứng này

có hạn chế, không phải là phương pháp tối ưu cho việc kiểm tra bệnh viêm phổi địa phương do thỉnh thoảng xảy ra dương tính không đặc hiệu hay âm tính giả (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect hemagglutination-IHA)

Phản ứng xảy ra khi kháng thể tương ứng với kháng nguyên, kháng thể sẽ nối kháng nguyên lại mà lúc này kháng nguyên đã gắn với hồng cầu tạo nên sự ngưng kết

có thể nhìn thấy rõ ràng bằng mắt thường Tuy nhiên, theo Freeman và ctv (1984) đã cho rằng IHA thích hợp cho việc xác định kháng thể chống MH ở những heo gây bệnh thí nghiệm với liều kháng nguyên lớn nhưng không hiệu quả khi phát hiện kháng thể ở những heo nhiễm bệnh tự nhiên (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Phản ứng ELISA (enzyme- linked immunosorbent assays)

Theo Cassell và Brown (1983), phản ứng ELISA để xác định kháng thể chống

lại Mycoplasma, phản ứng này có ưu điểm vượt trội hơn các kỹ thuật xác định kháng

thể khác về tính khách quan, tính đặc hiệu và tính nhạy Phản ứng này thực hiện đơn giản, kinh tế, rất phù hợp với việc điều tra đại trà, được xem là một kỹ thuật quan

trọng trong việc kiểm soát các bệnh do Mycoplasma ở động vật

ELISA được thực hiện dựa trên hai nguyên lý: thứ nhất là phản ứng của kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu hình thành phức hợp miễn dịch bền vững và thứ hai là

sự kết hợp của enzyme với kháng-kháng thể (anti-immunoglobulin) không làm biến đổi hoạt động enzyme và miễn dịch của thành phần này (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

 Kỹ thuật PCR

 Giới thiệu kỹ thuật PCR:

Theo Armstrong và ctv (1983) để phát hiện MH bằng phương pháp nuôi cấy là điều rất khó khăn Hơn nữa, dù có sự tạo kháng thể chống lại MH nhưng các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học chỉ thành công hạn chế bởi vì có phản ứng

chéo với những loài Mycoplasma khác

Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên trong chẩn đoán MH, nhiều tác giả đề nghị sử dụng kỹ thuật PCR do Karl Mullis và ctv phát hiện vào năm

1985

Phương pháp PCR ngày nay được nhiều phòng thí nghiệm ứng dụng Phương pháp này nhanh chóng, chính xác, đặc hiệu, cực kỳ nhạy, có thể phát hiện trực tiếp kháng nguyên và có thể chẩn đoán MH trước khi có đáp ứng miễn dịch dịch thể (Mattsson, 1994)

Đây là một phương pháp khuếch đại đoạn gene đã biết lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn, mục đích nhằm tạo ra một lượng lớn các bản sao của một đoạn

mã hóa di truyền nào đó để có thể phát hiện DNA đích dễ dàng hơn Nhưng kỹ thuật này phức tạp, đòi hỏi phòng thí nghiệm phải được trang bị hiện đại, kỹ thuật viên phải thao tác tốt, đồng thời kỹ thuật phân tử dễ bị dương tính giả do bị tạp nhiễm và đòi hỏi những quy trình kiểm soát chất lượng cẩn thận (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

Trong kỹ thuật PCR dùng để phát hiện MH, đoạn gene 16S rRNA đã được

sử dụng để thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho MH (Stemke và ctv, 1985) Ngoài ra, có thể sử dụng một số đoạn gene khác như gene P97 adhensin trong DNA nhiễm sắc thể (Lin, 1999) để thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho MH (trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003)

 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Mục đích của phản ứng PCR là nhằm tạo ra một số lượng rất lớn các bản sao của một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới

từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase

sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch mới Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt để bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi Kỹ thuật PCR đòi hỏi chúng ta phải biết trình tự của các đầu tận cùng của đoạn DNA cần khuyếch đại để tạo nên các oligonucleotide bổ sung cho chúng Đoạn mồi tác động lên dây DNA 3’-5’ gọi là mồi xuôi (forward primer: F) Đoạn mồi tác động lên dây DNA 5’-3’ gọi là mồi ngược (reverse primer: R) Sự sắp xếp như vậy đảm bảo cho vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động theo 3 bước: biến tính, bắt cặp, kéo dài, tạo nên một chu kỳ và được lặp lại nhiều lần

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau và mỗi chu kỳ có 3 bước sau:

* Bước 1 (biến tính): là giai đoạn làm biến tính DNA mạch đôi thành

hai mạch đơn ở nhiệt độ cao 94-950C, chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới

* Bước 2 (Ủ bắt cặp): là bước lai phân tử tức là giai đoạn mồi bắt cặp

bổ sung với mạch khuôn ở hai đầu để chuẩn bị cho sự kéo dài Ở bước này nhiệt độ lai tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các mồi sử dụng

* Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ tăng lên đến 720C Khi ấy, với sự hiện diện

của 4 deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dCTP và dGTP) và Taq

polymerase, các oligonucleotide được kéo dài tạo nên chuỗi DNA Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

∑DNA khuếch đại = m x 2n

m: là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: là số chu kỳ

Bước 3: kéo dài

45 giây ở 95 0 C

Sơ đồ 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR