Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị mất vùng khứu giác và tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần từ cây chè đắng (ilex kudingcha c j tseng)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA CAO S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA CAO SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ CÂY CHÈ ĐẮNG

(ILEX KUDINGCHA C.J TSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA CAO SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ CÂY CHÈ ĐẮNG

(ILEX KUDINGCHA C.J TSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Phạm Thị Nguyệt

Hằng, trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô là người đã trực tiếp

hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học tại khoa, luôn bên cạnh động viên

cổ vũ tôi, dìu dắt tôi thực hiện tốt luận văn này

Tiếp đến, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập,

bộ môn Hóa sinh – trường Đại học Dược Hà Nội Cô đã cho tôi cơ hội được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Phí Thị Xuyến cũng như

các anh chị tại khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi về

kỹ thuật cũng như tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đáng kính trong

bộ môn Hóa sinh đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè

và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh tôi, ủng hộ và động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi tôi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong đời sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn

bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 04 tháng 04 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về sa sút trí tuệ và suy giảm trí nhớ 3

1.1.1.Khái niệm sa sút trí tuệ và suy giảm trí nhớ 3

1.1.2 Dịch tễ 5

1.1.3 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh 6

1.1.4 Thuốc điều trị 8

1.1.4.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức 8

1.1.4.2 Nhóm điều chỉnh hành vi (Tăng cường hoạt tính serotonin) 10

1.1.4.3 Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác 10

1.1.4.4 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay 10

1.1.5 Một số mô hình nghiên cứu 11

1.2 Cây chè đắng 12

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật, phân bố của cây chè đắng 12

1.2.1.1 Vị trí phân loại 12

1.2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây chè đắng 12

1.2.2 Thành phần hóa học 14

1.2.3 Một số nghiên cứu đã thực hiện về cây chè đắng 14

1.2.3.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây chè đắng làm thuốc 14

1.2.3.2 Các nghiên cứu trong nước 15

1.2.4 Nhận xét 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1.1 Nguồn gốc 19

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19

2.1.2 Tế bào, động vật thí nghiệm 21

2.1.2.1 Chuột đực ddY 21

2.1.2.2 Tế bào NG 108-15 21

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

Thiết kế nghiên cứu 22

2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể, thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 22

2.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn bằng thử nghiệm nhận diện đồ vật (Object Recognization Test - ORT) 23

2.2.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian bằng thử nghiệm mê lộ chữ Y 25

2.2.1.3 Đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ dài hạn bằng thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 26

2.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) in vitro 28

2.2.2.1 Đánh giá độc tế bào NG 108-15 của saponin toàn phần từ lá chè đắng 28

2.2.2.2 Thăm dò khả năng gây độc của protein Aβ 25-35 trên tế bào NG

108-15 29

2.2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) in vitro 29

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể, thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 31

3.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn bằng thử nghiệm nhận diện đồ

vật (Object Recognization Test - ORT) 31

3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian bằng thử nghiệm mê lộ chữ

3.2.1 Đánh giá độc tính của cao saponin toàn phần từ chè đắng đối với tế bào NG

108-15 36 3.2.2 Thăm dò khả năng gây độc của protein Aβ 25-35 trên tế bào NG 108-15 38

3.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng

trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) 39

Chương 4 BÀN LUẬN 41 4.1 Về mô hình nghiên cứu 41

4.1.1 Về lựa chọn mô hình phẫu thuật loại bỏ thùy khứu giác OBX và lựa chọn

chủng chuột ddY 41

4.1.2 Về việc lựa chọn tacrin làm thuốc chứng dương cho các thí nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của cao saponin toàn phần chè đắng trên

chuột OBX 42 4.1.3 Về lựa chọn tế bào thần kinh NG 108-15 và protein β – amyloid 25-35 43

4.2 Về kết quả nghiên cứu 44

4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể, thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 44

4.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn bằng thử nghiệm nhận

diện đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 45

4.2.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm mê lộ chữ Y (Y maze test) 46

4.2.1.3 Đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ dài hạn bằng thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 48

4.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) in vitro 49

4.2.2.1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao saponin toàn phần từ chè đắng 49

4.2.2.2 Thăm dò khả năng gây độc của protein Aβ 25-35 trên tế bào NG 108-15 49

4.2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) in vitro 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 8

Phụ lục 1 : Cấu trúc các thành phần hóa học trong chè đắng 8

Phụ lục 2: Sự hình thành cấu trúc kudinglacton trong chè đắng 13

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4D: Dioxin

Aβ: Protein β-amyloid

ACAT: Acetyl CoA cholesteryl acyl transferase

AD: Alzheimer's Disease - bệnh Alzheimer

ADAS-Cog: Alzheimer's Disease Assessment Scale-Cog

ALAT: Alanine transaminase

ApoE: Apolipoprotein E

APP: Protein tiền chất amyloid

ASAT: Aspartate transaminase

BACE1: β-site APP-cleaving 1

βAP: β-amyloid peptid

CĐ: Chè đắng

DBD: sa sút trí tuệ ở bệnh nhân Parkinson

DMSO: Dimethyl sulfoxide

EGCG: Flavonoid epigallocatechin gallat

FTD: sa sút trí tuệ thùy trán-thái dương

HA: huyết áp

LBD: sa sút trí tuệ thể Lewy

LDL: Low-density lipoprotein

MDA: Malondialdehyd

MMSE: mini–mental state examination

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NFTs: Neurofibrilary Tangles

NG 108-15: Neuroblastoma x glyoma hybrid cell, 108CC15

NICE: National Institute of China Exellence

NMDA: N-methyl D aspartate

OBX: Olfactory bulbectomized

ORT: Object Recognization Test

POL: Quá trình Peroxy hóa lipid

PPARγ: Peroxisom prolifrator activated receptor γ

ROS : Reactive oxygen species

TC: Cholesterol toàn phần

THA: 1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-amine (Tacrin)

VAD: sa sút trí tuệ thể mạch máu

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.3 Các nhóm chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 24

Bảng 2.4 Các nhóm tham gia đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG 108-15

Bảng 3.1

Thời gian các nhóm chuột khám phá vật thể O1 và O2 trong giai đoạn luyện tập, O1 và O3 trong giai đoạn kiểm tra (giây) (*p < 0,05, ** p < 0,01 khi so sánh với vật thể quen thuộc O1,

36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá chè đắng 20

Hình 2.2 Sơ đồ tiến hành thử nghiệm nhận diện đồ vật 24

Hình 2.4 Sơ đồ tiến hành thử nghiệm sợ hãi có điều kiện 27

39

lục

CĐ đã được sử dụng để thải độc tố, kháng khuẩn, giảm cơn khát và ho, mắt ngứa, mắt

đỏ, đặc biệt là để cải thiện trí nhớ Triterpenoid, acid phenolic, flavonoid, và tinh dầu

là những thành phần chính của CĐ và các thành phần này có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hòa chuyển hóa lipid, và có tác dụng chống oxy hoá, hạ đường huyết

và chống khối u [37]

Trong số các công dụng của cây CĐ, hiện nay công dụng bảo vệ thần kinh, tăng cường trí nhớ của nó đang rất được quan tâm CĐ giúp cải thiện tình sa sút trí tuệ, trong đó đáng chú ý nhất là suy giảm trí nhớ - quan trọng và xuất hiện sớm trong sa sút trí tuệ, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và cả những người chăm sóc, là gánh nặng của toàn xã hội Theo một số nghiên cứu thống kê đã được công bố, sẽ có khoảng 63 triệu người bị sa sút trí tuệ trên toàn thế giới vào năm 2030 Trong số những người sa sút trí tuệ, 60% sống ở các nước đang phát triển, con số này tăng lên 71% vào năm 2040 [59] Hội chứng sa sút trí tuệ thường có tính chất mạn tính, tiến triển dần dần và thường trở nên tồi tệ sau một vài năm Chứng sa sút trí tuệ

có ý nghĩa quan trọng về mặt kinh tế và xã hội liên quan đến gánh nặng về chi phí y tế, chi phí chăm sóc, chi phí xã hội Việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới không chỉ có hiệu quả trong việc ngăn chặn và điều trị sa sút trí tuệ mà còn có thể sử dụng trong thời gian dài nhưng không gây ra các phản ứng bất lợi là rất cần thiết

Kim và cộng sự đã báo cáo rằng CĐ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt [30] Hơn thế nữa, dược liệu này đã được báo cáo là có tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại suy giảm trí nhớ gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) ở chuột [31] và độc tính trên các tế bào thần kinh vỏ não chuột được nuôi cấy Cơ chế bảo vệ thần kinh của chè đắng chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) là do ức chế sự chết tế bào thần kinh gây bởi stress oxy hóa

và sự phosphoryl hóa protein tau Vì mất vùng khứu giác (olfactory bulbectomized - OBX) cũng gây tăng mức Aβ [31] nên có thể xem xét cơ chế ức chế sự chết tế bào của chè đắng có thể góp phần làm giảm chứng mất trí ở chuột OBX Như vậy, cây CĐ cho thấy có rất nhiều triển vọng trong việc cải thiện suy giảm trí nhớ, tăng cường chức năng hệ thần kinh Trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng bảo vệ thần kinh, tăng cường trí nhớ của cây CĐ Tuy nhiên, các tài liệu nghiên cứu về

công dụng này của cây CĐ ở Việt Nam còn ít, nhằm cung cấp thêm các bằng chứng về

công dụng này của lá cây CĐ tại Việt Nam trên in vitro và in vivo, chúng tôi thực hiện

đề tài : “Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị mất vùng khứu giác và

tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần từ cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J Tseng)” với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể, thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm sợ hãi có điều kiện

2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao saponin toàn phần từ chè

đắng trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein beta amyloid in

vitro

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về sa sút trí tuệ và suy giảm trí nhớ

1.1.1.Khái niệm sa sút trí tuệ và suy giảm trí nhớ

Theo định nghĩa của WHO: “Sa sút trí tuệ là một hội chứng cấp tính hay mạn tính do bệnh của não, gây rối loạn chức năng thần kinh cao cấp bao gồm trí nhớ, tư duy, phương hướng, sự hiểu biết, tính toán, khả năng học hỏi, ngôn ngữ và phán xét nhưng ý thức chưa bị mất hoàn toàn Hội chứng đi kèm sự suy giảm chức năng nhận thức do suy giảm trong kiểm soát cảm xúc, động cơ, hành vi xã hội Hội chứng xảy ra trong bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện khác trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến não” [53]

Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của DSM-IV: Sa sút trí tuệ bao gồm nhiều chức

năng suy giảm nhận thức trong:

- Trí nhớ

- Thiếu sót một hay nhiều nhận thức sau:

+ Mất ngôn ngữ - Aphasia + Mất động tác – Apraxia + Mất nhận thức – Agnosia Trong đó, suy giảm trí nhớ là triệu chứng quan trọng và thường xuất hiện sớm nhất trong sa sút trí tuệ Theo khái niệm tâm lý học, trí nhớ là chức phận và đặc tính của bộ não có khả năng ghi nhận, bảo tồn và cho hiện lại những kinh nghiệm và tri thức cũ dưới dạng biểu tượng, ý niệm và ý tưởng [11]

Hoạt động của trí nhớ, như vậy gồm có ba quá trình cơ bản [11]:

Quá trình ghi nhận:

Quá trình hưng phấn ở những hệ thống cấu trúc cơ động của bộ não trước những kích thích của thực tại: càng chú ý và càng thích thú với kích thích bao nhiêu thì quá trình ghi nhận càng chắc chắn, rõ ràng bấy nhiêu

Quá trình bảo tồn:

Quá trình hình thành những đường liên hệ tạm thời duy trì dấu vết của những kích thích đã tác động vào bộ não Kích thích càng mạnh, càng được lặp lại thì quá trình bảo tồn càng bền vững

Quá trình nhớ lại:

Quá trình hồi phục những đường liên hệ tạm thời đã được bảo tồn trong những

hệ thống cấu trúc cơ động của bộ não Nhớ lại tốt chứng tỏ quá trình bảo tồn tốt Thường nhớ lại xuất hiện dưới hai hình thức:

- Nhận lại: Thông qua các giác quan nhận được những đối tượng kích thích trước

kia Ví dụ: Nhận lại bạn cũ xa nhau đã nhiều năm

- Hiện tại: Kinh nghiệm và tri thức cũ, không cần thông qua tri giác đối tượng

kích thích trước kia, vẫn có thể hiện ra trong óc dưới dạng biểu tượng hay ý niệm Ví dụ: Hiện lại khuôn mặt bà mẹ đã mất

Thường chia ra trí nhớ máy móc và trí nhớ thông hiểu [11]:

- Trí nhớ máy móc: Chỉ dựa vào mối liên hệ đơn giản giữa các đối tượng để nhớ

(gần nhau, giống nhau hay trái ngược nhau) Ví dụ: Nhớ bảng cửu chương, đặt

công thức để nhớ ngữ pháp tiếng Pháp

- Trí nhớ thông hiểu: Vận dụng đến các mối liên hệ nội tại có tính chất quy luật

giữa các hệ thống để nhớ Trí nhớ thông hiểu chắc chắn hơn vì trong quá trình nhớ có sự tham gia của ý thức, sự chú ý, cảm xúc và nhất là trí tuệ, tư duy Ví

dụ: Nhớ nội dung một quyển truyện

Suy giảm trí nhớ (hypomnesia): là kém nhớ những sự việc mới xảy ra hay những sự

việc đã cũ Thường những sự việc mới xảy ra khó nhớ hơn những sự việc cũ (Định luật Ribot) Gặp trong loạn thần tuổi già, liệt toàn thể tiến triển, bệnh tâm căn suy nhược, [11] Bộ nhớ có chức năng còn nguyên vẹn là rất quan trọng để thực hiện các hoạt động trong cuộc sống hàng ngày như quản lý tài chính, nhớ uống thuốc, lái xe, nhớ sinh nhật của một đứa cháu và học cách sử dụng máy tính mới, Suy giảm trí nhớ được thấy trong lão hóa, bệnh Alzheimer nhưng cũng gặp trong một số rối loạn tâm thần và thần kinh khác: thiểu năng trí tuệ, tự kỷ, rối loạn thiếu tập trung, khuyết tật khả năng học tập, tâm thần phân liệt, trầm cảm đều có suy giảm trí nhớ, cũng như trong bệnh Parkinson, Huntington và các bệnh thoái hóa thần kinh khác Người ta tin rằng, suy giảm trí nhớ phát sinh từ các hoạt động bất thường trong mạng lưới neuron và sự suy giảm hoạt động của các synap Việc tái tạo synap là rất cần thiết cho sự hình thành của trí nhớ và được cho là điều chỉnh bởi nhiều điều kiện sinh học bao gồm: biểu hiện gen, dịch mã protein, sự suy thoái protein, động học tế bào, tương tác matrix ngoại bào, chất truyền tin thứ 2, receptor và chức năng của chất dẫn truyền thần kinh Sự thiếu hụt hoặc suy giảm chức năng của một hay nhiều yếu tố này có thể dẫn tới cản trở dẫn truyền thần kinh và gây suy giảm trí nhớ [63]

Mất nhớ hay quên (amnesia) [11]:

- Theo sự việc, chia ra:

Quên toàn bộ: Quên tất cả những sự việc cũ và mới thuộc mọi lĩnh vực, gặp trong sa

sút trí nhớ

Quên từng phần: Chỉ quên một số kỷ niệm, chỉ quên ngoại ngữ, chỉ quên thao tác nghề

nghiệp, chỉ quên danh từ riêng, Gặp trong tổn thương khu trú ở một vùng nhất định của não hay do cảm xúc mạnh

- Theo thời gian, chia ra:

Quên thuận chiều (anterograde amnesia): Quên những sự việc xảy ra ngay sau khi bị

bệnh Có thể quên trong khoảng thời gian từ vài giờ đến vài tuần Gặp sau chấn thương

sọ não, sau khi lú lẫn, hôn mê

Quên ngược chiều (retrograde amnesia): Quên những sự việc đã xảy ra trước khi bị

bệnh Thời kỳ quên có thể là vài ngày, vài tháng hay vài năm Có thể quên từng phần hay quên toàn bộ Thường gặp trong chấn thương sọ não, xơ mạch não kèm xuất huyết

Quên trong cơn (Congrade amnesia): Chỉ quên những sự việc xảy ra trong cơn, trong

một thời gian ngắn bị bệnh Gặp trong cơn động kinh, trong trạng thái hoàng hôn,

Quên vừa thuận vừa ngược chiều (anteroretrograde amnesia): Quên cả sự việc cũ lẫn

sự việc mới Gặp trong loạn thần cấp kém lú lẫn, trong sa sút trí tuệ do chấn thương sọ não,

- Theo quá trình cơ bản của trí nhớ, chia ra: Quên do ghi nhận kém và quên do nhớ lại kém

- Theo tiến triển, chia ra:

Quên cố định: không tăng, không giảm

Quên thoái triển: nhớ lại dần

Quên tiến triến: quên tăng dần, thường theo định luật Ribot: sự việc mới quên trước,

sự việc cũ quên sau

Sa sút trí tuệ cần được phân biệt với tình trạng giảm trí nhớ sinh lý của người lớn tuổi (quên lành tính của tuổi già) vốn là hệ quả của sự lão hóa trong đó các quá trình thần kinh bị chậm đi Người có chứng quên lành tính của tuổi già học các thông tin mới chậm hơn và cũng nhớ lại các thông tin mới học được chậm hơn người bình thường, tuy nhiên nếu họ được cho thêm thời gian để được thực hiện những hoạt động này thì họ vẫn đạt được các thành tích trí tuệ ở mức chuẩn của người bình thường Các hoạt động thường ngày của họ cũng không bị ảnh hưởng [17]

1.1.2 Dịch tễ

Theo báo cáo “gánh nặng bệnh tật toàn cầu” (the global burden of disease) cho thấy năm 2010, Tây Âu là khu vực có số người sa sút trí tuệ cao nhất (7,0 triệu), theo sau là Đông Á (5,5 triệu), Nam Á (4,5 triệu) và Bắc Mỹ (4,4 triệu) Cứ 20 năm, số bệnh nhân sa sút trí tuệ sẽ tăng gần gấp đôi, dự đoán lên đến con số 65,7 triệu năm

2030 Chủ yếu là do sự gia tăng về số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ ở các quốc gia thu nhập thấp và trung bình [59] Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003 bệnh suy giảm trí nhớ đóng góp 11,2% năm sống ốm yếu với khuyết tật ở những người từ

60 tuổi trở lên, cao hơn đột quỵ (9,5%), rối loại cơ xương (8,9%), bệnh tim mạch (5,0%) và tất cả các dạng ung thư (2,4%) Tỷ trọng khuyết tật do bệnh mất trí nhớ gây

ra, theo ước tính của một đồng thuận quốc tế và chuyên gia đa ngành, là cao hơn so với hầu hết các bệnh khác, ngoài chấn thương tủy sống và ung thư giai đoạn cuối Knapp và cộng sự ước tính rằng ở Anh 224000/461000 người cao tuổi bị suy giảm trí nhớ sống trong các cơ sở chăm sóc y tế với chi phí 4,6 tỷ bảng (8,2 tỷ USD) mỗi năm

(tương đương 0,6% GDP cả nước) Tại Mỹ, chi phí hàng năm của chăm sóc không chính thức là 18 tỷ đô la [24]

Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer Nghiên cứu tại bệnh viện Lão khoa Trung ương tại huyện Ba Vì, Hà Nội (2005-2006) cho thấy tỷ lệ người từ 60 tuổi trở lên sống tại cộng đồng có sa sút trí tuệ

là 4,63%), cứ sau 5 tuổi tỷ lệ mắc tăng lên 1,78 lần Tình hình sa sút trí tuệ tại Việt

Nam cũng tương tự các nước trong khu vực [12]

Bệnh nhân suy giảm trí nhớ cần được phát hiện và điều trị sớm nhằm góp phần làm chậm tiến triển của bệnh, giảm bớt đau khổ cho bệnh nhân cũng như gánh nặng cho gia đình và xã hội

1.1.3 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Có nhiều nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh dẫn tới suy giảm trí nhớ:

Nguyên nhân do bệnh lý thoái hóa:

Suy giảm trí nhớ gặp phổ biến trong bệnh Alzheimer Alzheimer là một bệnh lý thoái hóa thần kinh tiến triển, các rối loạn thần kinh không thể đảo ngược và được đặc trưng về mặt lâm sàng bởi mất trí nhớ và suy giảm nhận thức [63] Tuy nhiên, nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer chưa được biết chính xác Tuổi tác và yếu tố gen di truyền là những nguy cơ quan trọng nhất Các dấu hiệu tổn thương phổ biến trong bệnh Alzheimer là sự xuất hiện của đám rối thần kinh và cấu trúc mảng bám

ở một số vùng vỏ não, teo võ não và sự thoái hóa của hệ cholinergic

Giả thuyết beta amyloid:

β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao gồm 36-43 acid amin, βA42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ

và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào Giả thuyết chỉ ra sự tích

tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci, ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [16], [20], [23] Người ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây ra suy giảm trí nhớ

Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrilary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào vùng hải mã và

vỏ não ở người bệnh Alzheimer NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc vi ống, giúp hệ thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể, chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ bởi chúng là một dấu hiệu về sự chết đi của các tế bào thần kinh [16], [20], [23]

Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết dẫn truyền thần kinh, trong đó, các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất Sự mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh suy giảm trí nhớ Vào giai đoạn muộn của bệnh, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng cường chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [16], [20], [23]

Giả thuyết apolipoprotein E

Những nghiên cứu trước đây đã tìm thấy nhiều mối liên hệ giữa cholesterol và

sự xuất hiện của bệnh Alzheimer Apolipoprotein E là một lipoprotein có nhiệm vụ vận chuyển cholesterol trong não ApoE4 có liên quan đến tăng tính lắng đọng của βAP và được cho là đóng vai trò như một chất điều hòa thúc đẩy trong quá trình bệnh

sa sút trí tuệ mạch máu Cholesterol được vận chuyển bằng LDL vào tế bào thần kinh

và liên kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào thần kinh não có thể làm thay đổi chức năng màng tế bào, dẫn đến hình thành các βAP và các mảng bám [16], [20], [23]

Các chất trung gian gây viêm

Giả thuyết cho rằng, khi βAP tích tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia) được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP bằng cơ chế thực bào Các

tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên, việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokin như interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), nitric oxid làm tổn thương các

tế bào thần kinh và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokin và chemokin tăng lên trong não bệnh nhân Alzheimer, và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo là có liên quan với bệnh Alzheimer [16], [20], [23]

Nguyên nhân không do bệnh lý thoái hóa

Ngày càng có nhiều bằng chứng về mối quan hệ nhân - quả giữa các bệnh lý tim mạch và những yếu tố nguy cơ tim mạch với tỷ lệ mắc bệnh sa sút trí tuệ Các yếu

tố nguy cơ tim mạch cũng là những yếu tố nguy cơ sa sút trí tuệ bao gồm: tăng huyết

áp, tăng lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-cholesterol), giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL-cholesterol) và bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể làm tăng nguy cơ mất trí nhớ thông qua các yếu tố liên quan đến “hội chứng chuyển hóa” (rối loại lipid máu và tăng huyết áp) và thông qua bất thường insulin Rối loạn con đường tín hiệu insulin (insulin-signaling pathways),

cả ở ngoại vi và ở não, có sự liên quan đến bệnh sa sút trí tuệ Insulin cũng có vai trò trong việc điều chỉnh sự chuyển hóa của βAP và protein tau

Các bệnh mạch máu não làm giảm cung cấp các chất dinh dưỡng cho tế bào thần kinh và giảm độ thanh thải của βAP từ não bộ, làm tăng tốc độ lắng đọng β-amyloid và tăng độc tính của β-amyloid cho tế bào thần kinh do đó làm nặng thêm sự giảm khả năng nhận thức của bệnh sa sút trí tuệ

Những giả thuyết khác được đề xuất để giải thích cơ chế bệnh sinh của suy giảm trí nhớ bao gồm sự oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể, và những ảnh hưởng của estrogen ở phụ nữ sau mãn kinh

Cho tới nay, chưa có cơ chế bệnh sinh nào được chứng minh là cơ chế chính Nhưng tất cả các giả thuyết đều dẫn đến một hậu quả: sự thoái hóa của tế bào thần kinh trong vùng não cao hơn, hình thành NFTs và mảng bám; sự suy giảm hoạt động nghiêm trọng hệ cholinergic và sự mất nhận thức tiến triển từ từ cho tới khi bệnh nhân

tử vong [16], [20], [23]

1.1.4 Thuốc điều trị

1.1.4.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức

Thuốc kháng enzym cholinesterase

Nhóm này được sử dụng vì có tình trạng suy giảm thụ thể acetylcholin và nicotin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa sút trí tuệ do bệnh Alzheimer

và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ, nhận thức

Cho tới nay, thuốc kháng enzym cholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác, nhóm thuốc này đã được chứng minh là có hiệu quả hơn placebo trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay nặng trung bình (10-24 điểm MMSE), tuy nhiên các thuốc này không ngăn chặn được diễn tiến tự nhiên của bệnh Các thuốc thuộc nhóm này bào gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin [7], [23]

Nhóm thuốc kháng thụ thể N-methyl D aspartate (NMDA)

Nhóm này có memantin là thuốc đối kháng không cạnh tranh trên thụ thể methyl D aspartat (NMDA) của hệ thống glutamat với ái lực vừa phải, do có hiện tượng tăng hoạt hóa thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron thần kinh trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh Việc sản xuất glutamat quá mức khiến các receptor NMDA hoạt động quá mức, gây tăng nhập calci vào tế bào, dẫn đến trạng thái kích thích do nhiễm độc (excitotoxicity) có liên quan đến suy giảm trí nhớ trong AD Do phụ thuộc vào điện thế và có động lực học nhanh nên memantin giảm ức chế receptor NMDA ở lượng glutamat sinh lý và tăng ức chế receptor này ở lượng glutamat bệnh

N-lý, do đó cải thiện trí nhớ và chức năng nhận thức [27] Các bằng chứng cho thấy memantin đem lại lợi ích lâm sàng về tổng thể, chức năng nhận thức, hành vi, các hoạt động trong cuộc sống hàng ngày ở bệnh nhân Alzheimer vừa và nặng Điều trị Alzheimer vừa và nặng với memantin không cải thiện chức năng và hành vi, nhưng cải thiện ít tổng thể và tình trạng nhận thức [16], [20], [23], [27]

Chất tác dụng trên amyloid bệnh lý

Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị suy giảm trí nhớ nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [23]

- Giảm sản xuất Aβ:

+ Ức chế β-secretase: Amyloid được hoạt hóa bởi β-secretase hoặc enzym β-site

APP-cleaving 1 (BACE1) Nhóm thiazolidindion trong điều trị đái tháo đường typ 2 gồm rosiglitazon và pioglitazon được sử dụng chủ yếu đề điều chỉnh chuyển hóa glucose và lipid, cũng có thể ức chế β-secretase và tiền chất amyloid (APP) thông qua

kích thích peroxisom prolifrator activated receptor γ (PPARγ) hạt nhân [27]

+ Ức chế γ-secretase: Tác động của γ-secretase lên β-secretase trong quá trình phân

cắt protein APP là bước cuối cùng trong sản xuất Aβ Semagacestat là chất ức chế secretase duy nhất được nghiên cứu trong điều trị Alzheimer, có tác dụng giảm sản

γ-xuất Aβ ở hệ thần kinh trung ương phụ thuộc liều [27]

+ Hoạt hóa α-secretase: α-secretase là enzym cạnh tranh với β-secretase trong phân

cắt APP, hoạt hóa con đường không amyloid tạo ra các sản phẩm hòa tan có tác dụng bảo vệ thần kinh, cải thiện trí nhớ và giảm sự chết tế bào (anti-apotosis) Một số chất ảnh hưởng lên hoạt động của α-secretase thông qua các chất dẫn truyền thần kinh khác (glutamat, serotonin), hormon (estrogen, testosteron) và các statin đã được nghiên cứu Tuy nhiên, hiện tại chưa có chất tác động lên α-secretase nào được thử nghiệm pha III

[27]

- Giảm kết tập Aβ:

Gần đây, các oligome tan được (soluble oligomer) của Aβ được biết tới có mối liên hệ chặt chẽ với độc tính trên thần kinh và synap hơn so với các sợi fibrin Aβ Các chất ức chế kết tập hoặc làm mất ổn định của oligome Aβ có thể làm thay đổi triệu chứng bệnh Một số chất ức chế kết tập khác đang được nghiên cứu lâm sàng: PBT-2,

PBT-2 [27]

- Tăng thải trừ Aβ:

Loại bỏ độc tính của Aβ thông qua đáp ứng miễn dịch làm giảm bớt những tác động có hại của Alzheimer với 4 cơ chế chính: (i) liên kết kháng thể và thực bào nhờ

tế bào tiểu thần kinh đệm microglia; (ii) trực tiếp hòa tan thông qua sự gián đoạn của Aβ; (iii) chiết tách hòa tan từ hệ thần kinh trung ương bởi kháng thể trong huyết tương; (iv) liên kết kháng thể để ức chế oligome gây độc tính mà không ảnh hưởng tới amyloid Bapineuzumab và Solanezumab đang được nghiên cứu với cơ chế tạo ra

kháng thể trung gian giải phóng Aβ [27]

1.1.4.2 Nhóm điều chỉnh hành vi (Tăng cường hoạt tính serotonin)

Nhóm này có tác dụng tăng cường tái hấp thu serotonin chọn lọc SSRIs có tác dụng giúp bệnh nhân điều chỉnh hành vi, chống trầm cảm, tránh kích thích hoặc lú lẫn Nhóm này gồm có fluoxetin, citalopram, escitalopram, paroxetin [16], [20], [23]

1.1.4.3 Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác

Vitamin E: Giảm tổn thương do tế bào bị oxy hóa bởi các gốc tự do

Ginkgo Biloba: Thuốc có tác dụng tăng tuần hoàn, cải thiện suy giảm trí nhớ

Estrogen: Ảnh hưởng đến quá trình bảo vệ và dinh dưỡng thần kinh

Kháng viêm NSAID: có một nghiên cứu cho thấy nhóm này có tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer [20], [23]

1.1.4.4 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay

Sự suy giảm trí nhớ là hậu quả của sự gián đoạn dẫn truyền giữa các neuron thần kinh trong các vùng não quan trọng đối với hệ thống bộ nhớ Các phương pháp điều trị hiện tại không có hiệu quả kéo dài tuổi thọ, chữa khỏi, hoặc tạm dừng hoặc đảo ngược quá trình sinh lý bệnh Hai nhóm thuốc chính đang sử dụng là thuốc ức chế cholinesterase và thuốc tác dụng trên hệ glutamat dựa trên hai giả thuyết cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer Nhóm thuốc ức chế cholinesterase chỉ định cho trường hợp bệnh nhẹ đến trung bình, ổn định nhận thức tạm thời, hoặc làm giảm rất nhỏ sự suy giảm nhận thức, 20-30% bệnh nhân đã điều trị giảm được 7 điểm trong thang điểm đánh giá nhận thức ADAS-Cog (tương đương giảm được 1 năm suy giảm nhận thức) [23], [47] Memantin được dùng cho bệnh nhân ở giai đoạn trung bình đến nặng, ở những người không dùng được thuốc ức chế cholinesterase [44] Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả của memantin khi đánh giá bằng thang ADAS-Cog so với giả dược ở thời điểm 12 - 24 tuần điều trị, nhưng không cho thấy lợi ích từ 24-48 tuần [43] Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị Alzheimer nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [27]

Những nhóm thuốc điều trị triệu chứng không thuộc nhận thức: các thuốc chống loạn thần, thuốc chống trầm cảm, chống co giật được sử dụng khi những triệu chứng về tâm-thần kinh ở mức độ nghiêm trọng Việc điều trị phải dựa trên sự cân bằng giữa lợi ích và nguy cơ [51] Ngoài ra, thuốc hướng thần còn có tác dụng kháng cholinergic, vì vậy, chúng có thể làm bệnh trầm trọng hơn hoặc tác động đến việc sử dụng thuốc ức chế cholinesterase [22] Các thuốc điều trị suy giảm trí nhớ hiện nay cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn do tác dụng kích thích cholinergic quá mức và gây ra nhiều tương tác thuốc

1.1.5 Một số mô hình nghiên cứu

Dựa trên cơ chế bệnh sinh, các mô hình hiện đại nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm trí nhớ lần lượt ra đời

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản, dễ làm và ít tốn kém

Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE) thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng ACh sẽ bị enzym AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị cholin oxidase oxy hóa chuyển thành betain

và H2O2 Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với thuốc thử 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ thuận với nồng độ ACh và AChE Từ đó có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt tính của AChE [15] Hoặc có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của enzym AChE

ex vivo theo nguyên tắc của Ellman và cộng sự [26]: cơ chất acetylthiocholin iodid

(ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác

giả Ellman và cộng sự [26] Có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của AChE in

vitro với nguyên tắc tiến hành theo phương pháp của Ellman và cộng sự [26] nhưng sử

dụng AChE có sẵn [5], [36], [15], [56]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat,

sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng tế bào sống sót [34], [31], [32], [62] Thuốc điều trị Alzheimer sẽ được sử dụng để ngăn chặn hoặc làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh

NG 108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người là cần thiết để hiểu rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng Bệnh Alzheimer đã được gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh Alzheimer có tính chất gia đình, hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS) Các chủng

chuột chuyển gen này thể hiện bệnh lý Alzheimer nhưng mô hình biểu hiện quá mức

có thể dẫn tới các kiểu hình bổ sung không liên quan đến Alzheimer Mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng Những chuột này cho thấy sự tích tụ β-amyloid không có kiểu hình liên quan đến biểu hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện Alzheimer trên lâm sàng của người [28], [33].

Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [25], [50], [55], [60]

Bên cạnh đó, các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Mô hình gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục

bộ (ischemia induced learning and memory deficit) bằng cách thắt 2 động mạch cảnh đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột đã được giáo sư Kinzo Matsumoto sử dụng để nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ năm 2000 [62] Trong

mô hình này, chuột sẽ được gây mê, sau đó bộc lộ 2 động mạch cảnh một cách cẩn thận, thắt 2 động mạch cảnh này bằng chỉ kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời lấy máu đuôi chuột trong quá trình gây thiếu máu cục bộ Đây cũng là mô hình đã triển khai thành công tại Viện Dược liệu

Một mô hình mới cũng được sử dụng hiện nay là mô hình gây suy giảm học và nhớ trên chuột mất vùng khứu giác (learning and memory deficit in olfactory bulbectomized mice) của giáo sư Kinzo Matsumoto áp dụng từ năm 2011 [62] Chuột được gây mê và cố định trên hệ thống định vị chuột Sau đó, rạch da bộc lộ phần hộp

sọ bao phủ vùng khứu giác (OBX) rồi khoan thủng 1 lỗ đường kính 1 mm, phá hủy vùng khứu giác của chuột, lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelatin Chuột sau khi

bị loại bỏ vùng khứu giác sẽ bị suy giảm khả năng học tập và trí nhớ

1.2 Cây chè đắng

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật, phân bố của cây chè đắng

1.2.1.1 Vị trí phân loại

Ở Việt Nam, tên khoa học của cây CĐ mọc ở vùng núi đá vôi thuộc tỉnh Cao

Bằng và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C J Tseng (với tên đồng nghĩa là

Ilex kaushue S Y Hu) Tên Việt Nam là chè đắng, ché khôm (tên địa phương gọi theo

tiếng dân tộc Tày), khổ đinh trà [4] Chi Ilex thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên khác là Ilicaceae), bộ Celetrales phân lớp Rosidae (phân lớp

Hoa hồng), ngành Ngọc Lan

1.2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây chè đắng

Cây thân gỗ, cao 6-20m, đường kính thân từ 20-60cm, cành thô, màu nâu xám, không có lông, cành non hình trụ có nhiều gờ nhỏ Lá đơn mọc cách, mép lá có răng cưa nhỏ và tù Phiến lá hình bầu dục đến thuôn hoặc hình mác ngược Ở cây trưởng thành lá thường dài 12-17cm, rộng 5-6cm Mặt trên của lá màu lục sẫm và láng bóng, mặt dưới màu lục nhạt, cả hai mặt đều không có lông Lá vò trong tay có mùi thơm mát, hơi hắc của tinh dầu Hoa màu trắng ngà, đơn tính khác gốc

Cây CĐ là loại cây mọc tự nhiên, phân bố tản mạn ở một số địa phương miền núi phía bắc nước ta như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình, trong đó, Cao Bằng là địa phương được xác định có 6/12 huyện có mật độ phát triển của cây CĐ cao, chiếm 32% diện tích toàn tỉnh

Hình 1.1: Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C J Tseng) (Nguồn: Sở Khoa học công nghệ và môi trường tỉnh Cao Bằng (2002), “Cây chè đắng giá trị kinh tế

và kỹ thuật trồng”, Tài liệu phổ khoa học kỹ thuật Số 1 - 2002)

1.2.2 Thành phần hóa học

Theo 1 nghiên cứu về cây chè đắng ở Trung Quốc [39], thành phần hóa học chủ yếu của chè đắng gồm các triterpenoid, các acid phenolic, các flavonoid và các tinh dầu Một số saponin triterpenoid trong chè đắng: Các ursan triterpenoid với vòng

lacton ở vị trí C20 và C28 được gọi là α-kudinlacton (48-57, 113), β-kudinlacton

(58-69), và γ-kudinlacton (74-78) (Phụ lục 1), được xem là thành phần hóa học chính

trong các loài chè đắng Sự hình thành các cấu trúc kudinglacton trong chè đắng được

thể hiện trong Phụ lục 2

Ở Việt Nam, đã phát hiện trong lá CĐ thu hái tại Cao Bằng cũng có saponin triterpenoid tương tự như lá CĐ ở Trung Quốc Ngoài ra, còn có flavonoid, β-caroten, polysaccharid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin [8], [6], [9]

1.2.3 Một số nghiên cứu đã thực hiện về cây chè đắng

1.2.3.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây chè đắng làm thuốc

Cây CĐ ở Trung Quốc (Ilex kudingcha C.J Tseng) đã được sử dụng làm thuốc

và nước uống từ cách đây 2000 năm Nước hãm của lá chè đắng được dùng rộng rãi như một loại nước uống truyền thống ở các tỉnh phía nam Trung Quốc Theo kinh nghiệm, lá CĐ được sử dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ; thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, kéo dài tuổi thọ Ngoài ra, lá CĐ còn được sử dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản,

Uống chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trò tích cực trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt, mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực do các bệnh tim mạch [64] CĐ có hoạt tính sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh và [38]

Saponin trong lá cây Ilex kudingcha cũng như các loài chè đắng nói chung có vị đắng và chiếm hàm lượng khá cao trong nhiều loài của chi Ilex, được cho là một tác

nhân góp phần tạo nên mùi vị khác biệt cho chè đắng Không chỉ đóng góp tạo mùi vị, saponin còn được chứng minh là có nhiều tác dụng quan trọng như ức chế xơ gan, chống oxy hóa, chống viêm cấp, hạ cholesterol, tác dụng giải độc Cơ chế giảm cholesterol huyết là do các saponin trong chè đắng ức chế sự khuếch tán của acid colic

và tạo thành các mixen nên ngăn cản sự hòa tan lipid do vậy lipid dễ bị thải trừ hơn [37]

1.2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính, tác dụng trên thần kinh

Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Diệu Anh (2009) [1] đã phân lập và xác định được cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid Đây là những hợp chất saponin và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ lá CĐ thu hái tại Cao Bằng Saponin CĐ và cao nước CĐ có độc tính cấp thấp và được xếp vào loại chế phẩm không xác định được LD50 Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm saponin và cao nước CĐ đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của thỏ, tế bào gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường Saponin CĐ không ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống trắng đực Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin CĐ có tác dụng rút ngắn 8,57% số ngày học tập phản xạ có điều kiện và kéo dài 69,14% thời gian duy trì phản xạ đã học được so với lô chuột đối chứng

Tác dụng chống oxy hóa, ức chế xơ gan, chống viêm cấp và mạn tính của chế phẩm saponin toàn phần

Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm saponin toàn phần chiết xuất từ là CĐ có các tác dụng sau: Saponin chè đắng có tác dụng ức chế xơ gan trên mô hình gây tổn thương gan và xơ gan bằng CCl4, tác dụng chống oxy hóa, lợi mật, chống viêm cấp và mạn [2]

Nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Mai Huy (2003) [8] cho thấy flavonoid trong lá chè đắng có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan và não chuột do ức chế quá trình POL rất rõ Hoạt tính này tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid Flavonoid toàn phần trong lá chè đắng cũng có hoạt tính thu dọn gốc tự do anion superoxide trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase, khả năng thu dọn gốc tự do cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng

độ flavonoid toàn phần

Tác dụng chống độc

Các tác giả trường Đại học Y Thái Nguyên đã thử tác dụng của dịch chiết lá CĐ trên chuột bị gây độc bằng dioxin (2,4D) Kết quả cho thấy dịch chiết CĐ có tác dụng giảm 20-40% sự tác động của 2,4D tới dòng bạch cầu, đồng thời giảm 36% tác hại của 2,4D tới enzym ASAT; ngăn chặn ảnh hưởng của 2,4D tới NST ở mô tủy xương và

mô tinh hoàn và dịch chiết lá CĐ không gây rối loạn NST chuột Saponin CĐ có thể dùng phòng độc hại cho người làm việc trong môi trường độc hại kéo dài do nghề nghiệp hoặc môi trường [13]

Một số nghiên cứu trên lâm sàng

Tác dụng giải độc và bảo vệ gan của CĐ cũng đã được khẳng định khi thử nghiệm trên một số chỉ số sinh học của dân cư sống quanh vùng khai thác thiếc Sơn

Dương của Đại học Y Thái Nguyên Đã xác nhận rằng những người sống trong vùng

có nguy cơ nhiễm độc kim loại, chất độc, thuốc trừ sâu, có biểu hiện mất ngủ, đau đầu, chóng mặt, tê đầu chi, nhức khớp, da tái nhợt, xét nghiệm thấy rối loạn công thức máu, tăng enzym gan, Sau một thời gian uống nước sắc lá CĐ đã làm giảm ASAT, ALAT trong huyết thanh, làm ổn định về số lượng và tỷ lệ thành phần bạch cầu Nếu sử dụng thường xuyên có khả năng làm giảm một số triệu chứng cơ năng ở những người có biểu hiện nhiễm độc mạn tính, nâng cao sức đề kháng [3]

Trong thí nghiệm trên bệnh nhân tăng huyết áp vô căn điều dưỡng tại bệnh viện điều dưỡng và phục hồi chức năng tỉnh Thái Nguyên, Nông Thị Nga và cộng sự đã chứng minh lá CĐ có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường giấc ngủ sâu và dài, cải thiện một số chỉ tiêu chủ quan như: đau đầu, chóng mặt, choáng váng, tê mỏi chân tay, đau tức ngực trái Lá CĐ cũng giảm hàm lượng cholesterol máu [10]

1.2.3.3 Các nghiên cứu trên thế giới

Tác dụng trên lipid và lipoprotein huyết tương

Những kết quả nghiên cứu trên chó thực nghiệm cho thấy dịch chiết lá cây CĐ có tác dụng hạ huyết áp (HA) rõ rệt Mức độ hạ HA từ từ, thời gian và mức độ hạ HA phụ thuộc vào liều lượng, liều càng cao tác dụng càng mạnh Dịch chiết lá CĐ có tác dụng làm hạ cholesterol máu, mức độ hạ cholesterol phụ thuộc vào liều lượng thuốc [46], [45]

Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

Kim và cộng sự đã báo cáo rằng CĐ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt CĐ làm giảm đáng kể MCAO/tái tưới máu gây ra do phù nề, thiếu máu thần kinh và chết tế bào não Sự suy giảm glutathion và quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi MCAO/tái tưới máu đã được

ức chế khi dùng CĐ CĐ làm ức chế đáng kể sự tăng phosphoryl hóa MAPKs, COX-2

và protein gây chết tế bào theo chương trình ở chuột Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột của CĐ có thể do tác dụng ngăn chặn sự chết tế bào, là kết quả của tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm của nó [30]

Hơn thế nữa, dược liệu chè đắng I.latifolia đã được báo cáo là có tác dụng bảo vệ

thần kinh chống lại suy giảm trí nhớ gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) ở chuột Tác dụng bảo vệ thần kinh của dịch chiết ethanol của CĐ chống lại sự suy giảm trí nhớ gây bởi Aβ ở chuột và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não chuột Sự suy giảm trí nhớ

ở chuột được gây ra bởi tiêm trong não thất 15 nmol Aβ (25-35) và đánh giá bằng thử nghiệm né tránh thụ động và thử nghiệm mê lộ nước Morris Dùng CĐ trong thời gian dài (25/100 mg/kg, p.o) giúp ngăn chặn đáng kể tác hại gây suy giảm trí nhớ gây ra bởi

Aβ (25-35) CĐ cũng ngăn chặn sự suy giảm nồng độ glutathion, sự tăng peroxy hóa lipid, sự biểu hiện của phosphoryl hóa tau (p-tau) và sự thay đổi trong quá trình chết tế bào theo chương trình liên quan đến protein trong suy giảm trí nhớ ở não chuột Ủ các

tế bào thần kinh vỏ não nuôi cấy với 10 μM Aβ (25-35) trong 36 giờ gây chết tế bào thần kinh Tác động gây chết các tế bào thần kinh, làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, tạo

ra các phản ứng oxy hóa và biểu hiện của các protein gây chết tế bào theo chương trình gây ra bởi Aβ (25-35) trên các tế bào thần kinh bị ức chế bởi CĐ ở nồng độ 1-50 μg/ml) Những kết quả này cho thấy CĐ có thể có vai trò trong cải thiện suy giảm nhận thức liên quan đến bệnh Alzheimer Cơ chế có thể do ức chế sự chết tế bào liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa và ức chế sự phosphoryl hóa protein tau [31]

Cơ chế bảo vệ thần kinh của chè đắng chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) là do ức chế sự chết tế bào thần kinh gây bởi stress oxy hóa và sự phosphoryl hóa protein tau Vì mất vùng khứu giác (olfactory bulbectomized - OBX) cũng gây tăng mức Aβ [31] nên có thể xem xét cơ chế ức chế sự chết tế bào của chè đắng có thể góp phần làm giảm chứng mất trí ở chuột OBX CĐ có thể ngăn ngừa ảnh hưởng của glutamat gây tổn thương tế bào thần kinh bằng cách ức chế sự gia tăng nồng độ Ca2+, các ROS và con đường gây chết tế bào theo chương trình Ngoài ra, tác dụng ngăn chặn tổn thương não gây ra do thiếu máu cục bộ có thể liên quan đến các hoạt động chống kích thích và chống oxy hóa của các hoạt chất CQA trong CĐ (3,4-Dicaffeoylquinic acid (diCQA), 3,5-diCQA, và 3,5-diCQA methyl ester)

1.2.4 Nhận xét

Chè đắng là loại dược liệu đã được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền với nhiều công dụng, đáng chú ý là làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ Tác dụng kích thích thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ là một trong những tác dụng dược lý của nhóm hoạt chất saponin trong một số dược liệu quý như nhân sâm, đinh lăng, Do đó, việc dự đoán saponin trong lá CĐ là nhóm hoạt chất quan trọng đối với tác dụng trên thần kinh trung ương là có cơ sở Lá CĐ thu hái tại Cao Bằng, Việt Nam có hàm lượng saponin tương đối cao Đã có một số công trình khoa học nghiên cứu thành phần saponin trong lá CĐ Tác dụng trên thần kinh trung ương của CĐ được mô tả khá đặc biệt: Khi sử dụng sẽ giúp cho người dùng cảm thấy tỉnh táo, sảng khoái, tăng khả năng làm việc trí óc, nhưng không gây mất ngủ Có một

số công trình nghiên cứu về tác dụng của saponin CĐ trên thần kinh trung ương tuy

nhiên chưa đầy đủ; các nghiên cứu về công dụng của loài CĐ Ilex kudingcha về khả

năng cải thiện nhận thức, tăng cường trí nhớ, bảo vệ thần kinh còn ít Vì vậy, đề tài

tiến hành nghiên cứu tác dụng của saponin trong lá CĐ Ilex kudingcha thu hái tại tỉnh

Cao Bằng, Việt Nam trên thần kinh trung ương theo hướng tăng khả năng nhận thức

và ghi nhớ để cung cấp thêm bằng chứng về khả năng bảo vệ thần kinh, tăng cường trí nhớ của cao saponin toàn phần từ lá CĐ

Các kết quả nghiên cứu sẽ có ý nghĩa thực tiễn lớn Một mặt, có thể góp phần

khẳng định cao saponin toàn phần chiết xuất từ lá CĐ Ilex kudingcha có tác dụng cải

thiện suy giảm trí nhớ, bảo vệ tế bào thần kinh, có triển vọng sử dụng làm thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc với tác dụng tăng cường trí nhớ, làm tăng khả năng lao động trí óc và phòng bệnh lú lẫn ở người cao tuổi

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao saponin toàn phần từ lá cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)

2.1.1.1 Nguồn gốc

Lá CĐ dùng trong nghiên cứu này được thu thập tại tỉnh Cao Bằng, Việt Nam Dược liệu đã được tiến sĩ Phạm Thị Thanh Huyền (Khoa tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu) giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện Dược liệu

Lựa chọn lá xanh tốt, không sâu bệnh, sấy khô ở 45-50°C trong tủ sấy có thông gió, sau đó xay thành bột thô để chiết xuất thu được cao saponin toàn phần đưa vào nghiên cứu

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Chiết saponin toàn phần từ lá CĐ: lá CĐ được sấy khô, xay thô và bảo quản

trong túi kín cho tới khi đưa vào nghiên cứu chiết xuất Bột dược liệu được ngâm với cồn 80% theo tỷ lệ dươc liệu/dung môi là 1/10 (w/v) trong 48h Lọc rút lấy dịch chiết trong Bã dược liệu được ngâm tiếp với cồn thêm 2 lần, mỗi lần 24h Dịch chiết của 3 lần được gộp lại, cô dưới áp suất giảm ở 50°C đến cắn Hòa tan cắn vào nước rồi lắc với hỗn hợp n-hexan và CH2Cl2 Lấy lớp nước đem lắc với n-butanol, chiết và cô chân không ở nhiệt độ 60°C đến khô thu được sản phẩm là cao khô saponin toàn phần từ lá

CĐ Tính được hiệu suất chiết đối với dược liệu khô là 10,72% Quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá chè đắng như sau:

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá chè đắng

Cao saponin toàn phần chè đắng đã được nghiên cứu chiết xuất phân lập ra 2 hợp chất saponin tinh khiết là Kudinosid D và Kudinosid E bằng sắc ký cột lặp lại nhiều lần với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo với các hệ dung môi thích hợp

Cô dưới áp suất giảm ở 50°C

Hòa vào nước, lắc với hỗn hợp

chân không ở 60°C

2.1.3 Hóa chất, thiết bị

Hóa chất

Bảng 2.1: Nguồn gốc hóa chất

1 Tacrin Sigma St.louis, MO, USA

2 Sodium Scopolamin HBr Sigma, St Louis, MO, USA

3 Phenobarbital sodium Wako, Nhật Bản

4 Protein beta-amyloid Aβ 25-35 Sigma St.louis, MO, USA

5 Thuốc thử MTT Sigma St.louis, MO, USA

4 Bộ thiết bị tiến hành thử nghiệm sợ

hãi có điều kiện

Muromachi, Kikai, Tokyo, Nhật Bản

5 Phần mềm phân tích kết quả ANY MAZE, Stoeling, Mỹ

6 Tủ lạnh âm sâu Sanyo Nhật Bản

7 Máy đọc ELISA Thermo Labsystem Thermo, Đức

8 Và các trang thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể, thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm sợ hãi có điều kiện

Nơi thực hiện: Khoa Dược lý – Trường Đại học Toyama – Nhật Bản

Chuẩn bị động vật thí nghiệm

Chuột ddY được tập luyện nuôi ổn định trong phòng chăn nuôi ít nhất 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Chuột được cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ Nhiệt độ phòng luôn duy trì ở khoảng 24 ± 1°C, độ ẩm 65%, chu kỳ sáng/tối là 12h (sáng từ 7h00-19h00) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng, từ 9:00 đến 18:00

Tiến hành phẫu thuật chuột OBX

Chuột được phẫu thuật cắt bỏ vùng khứu giác theo phương pháp của Le XT và cộng sự (2013) [36], Yamada và cộng sự (2011) [61], có sự điều chỉnh nhỏ Tiến hành gây mê cho chuột bằng phenobarbital sodium (60mg.kg i.p) và cố định trên hệ thống

Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị mất vùng khứu giác và tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn

phần từ cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J Tseng)

Đánh giá tác dụng bảo vệ

tế bào thần kinh của saponin toàn phần từ chè đắng trên mô hình gây độc

từ chè đắng đối với tế bào NG 108-15

Thăm dò khả năng gây độc của protein Aβ 25-35 trên

tế bào NG 108-15

lộ chữ Y

Đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ dài hạn bằng thử nghiệm sợ hãi có điều kiện

Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của saponin toàn phần từ chè đắng khi gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein Aβ

25-35

định vị chuột (do công ty Narishige, Tokyo, Nhật Bản cung cấp) Rạch da bộc lộ phần hộp sọ bao phủ vị trí OBX, sau đó khoan thủng hộp sọ 1 lỗ có đường kính 1mm, phá hủy vùng khứu giác của chuột, sau đó lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelatin Sau khi kết thúc tất cả các thí nghiệm, chuột được phẫu thuật não, kiểm tra trực quan tất cả các chuột xem vùng khứu giác đã được lấy hết hay chưa, loại bỏ kết quả hành vi của những chuột không lấy được trên 70% vùng khứu giác hoặc những chuột có vùng

vỏ não không còn nguyên vẹn

Chuột chứng cũng được thực hiện tương tự nhưng không loại bỏ vùng OBX Khi kết thúc tất cả thí nghiệm, phẫu thuật kiểm tra vùng OBX của chuột chứng phải được xác định là còn nguyên vẹn

Thử thuốc

Chuột thí nghiệm được chia làm 4 nhóm như trong Bảng 2.3:

Bảng 2.3: Các nhóm chuột tiến hành thử tác dụng dược lý

Chứng sinh lý 9-12 Uống nước cất (0,2ml/20g thể

trọng)

- Trong vòng 1 tuần trước khi phẫu thuật

- Bắt đầu lại từ ngày thứ

3 sau phẫu thuật

- 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hành

vi Riêng nhóm OBX + Tacrin tiêm trước khi tiến hành thí nghiệm hành vi 30 phút

Chứng bệnh lý 9-12 Uống nước cất (0,2ml/20g thể

trọng) OBX + CĐ 9-12 Uống cao saponin toàn phần chè

đắng 540mg/kg x 1 lần/ngày (pha trong dung môi là nước cất) OBX + Tacrin 9-12 Tacrin pha loãng trong nước muối

sinh lý 0,9% rồi tiêm phúc mạc liều 2,5mg/kg x 1 lần/ngày

Tacrine (THA; 9-amino-1,2,3,4-tetrahydro-acridine HCl) do công ty Sigma, St Louis cung cấp

2.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn bằng thử nghiệm nhận diện

đồ vật (Object Recognization Test - ORT)

Nguyên tắc

Các nhóm chuột sau khi xử lý với mẫu thử sẽ được đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ tạm thời (short-term memory) (trí nhớ ngắn hạn không liên quan đến vị trí không gian tương ứng với trí nhớ phân đoạn của con người) bằng mô hình thử nghiệm nhận diện đồ vật vào ngày thứ 17 sau khi tiến hành phẫu thuật Mô hình này được thực hiện theo phương pháp của các tác giả Le XT và cộng sự (2013) [36], Yamada và cộng

sự (2011) [61] Dựa trên xu hướng để chuột nhận biết đối tượng quen thuộc trước sự

có mặt của một đối tượng mới

Phương pháp tiến hành:

Hệ thống dụng cụ gồm 1 hộp hình trụ kích thước 35 x 35 x 50 cm Các vật thể bao gồm O1, O2 giống hệt nhau và O3 có hình dạng và kích thước khác O1 và O2 Một ngày trước khi tiến hành thử nghiệm ORT, chuột được đặt vào hộp hình trụ cho phép chuột tự do khám phá không gian mới trong thời gian 10 phút Ngày tiếp theo, thử nghiệm ORT được tiến hành Thử nghiệm ORT gồm có 2 giai đoạn: giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra Giai đoạn luyện tập, mỗi chuột được đặt vào hộp hình trụ ngày hôm trước, có bổ sung thêm 2 đồ vật giống nhau O1 và O2 Chuột được phép

tự do khám phá 2 đồ vật này trong 5 phút Giai đoạn kiểm tra được tiến hành sau khi thực hiện giai đoạn luyện tập 30 phút Ở giai đoạn này, một trong 2 đồ vật trong hộp hình trụ được thay thế bởi 1 đồ vật khác có hình dáng và kích thước khác với 2 đồ vật

ở giai đoạn luyện tập, đặt tên là O3 Chuột cũng được phép tự do khám phá những đồ vật này trong 5 phút giống ở giai đoạn luyện tập Sau mỗi lần, các đồ vật được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi

Thời gian chuột khám phá các đồ vật sẽ được ghi lại bằng camera và tính toán

sử dụng phần mềm ANY MAZE, Stoeling, Mỹ

Hình 2.2: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm nhận diện đồ vật

Chỉ tiêu đánh giá:

Thời gian chuột khám phá vật thể được định nghĩa là khoảng thời gian tính từ lúc chuột bắt đầu hướng mũi về phía vật thể cách vật thể 2cm, khám phá vật thể cho tới lúc chuột rời đi

Chuột có tính tò mò, luôn có xu hướng khám phá vật thể mới để thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó, bảo đảm sự an toàn cho bản thân động vật Sự nhận diện thành công vật thể trước đây được phản ánh qua việc khám phá vật thể mới Sự khác biệt của vật thể mới được đánh giá thông qua việc so sánh sự khác nhau về thời gian khám phá của vật thể mới và vật thể quen thuộc Do đó, chuột có trí nhớ tốt hơn

sẽ có thời gian khám phá vật thể mới O3 dài hơn

2.2.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian bằng thử nghiệm mê lộ chữ Y

+ Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian

Các nhóm chuột sau khi xử lý với mẫu thử sẽ được đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ không gian làm việc bằng thử nghiệm mê lộ chữ Y vào ngày thứ 24 và 31 sau khi làm phẫu thuật Mô hình này được thực hiện theo phương pháp của tác giả Le XT

và cộng sự (2013) [36], Yamada và cộng sự (2011) [61] Mục đích của thí nghiệm này

là kiểm tra tác dụng của cao saponin toàn phần từ chè đắng trên trí nhớ được hình thành trong quá trình làm việc (working memory) trên chuột OBX

Phương pháp tiến hành

Thiết bị được sử dụng là một mê lộ hình chữ Y, có 3 cánh tay (Y1, Y2, Y3) màu đen, làm từ polypropylene, mỗi cánh tay dài 40 cm, rộng 12 cm ở phía trên và rộng 3 cm ở phía đáy, chiều cao 18 cm Thí nghiệm này bao gồm 2 giai đoạn, giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra, cách nhau 30 phút Ở mỗi giai đoạn chuột được khám phá mê lộ trong 5 phút Ở giai đoạn luyện tập, chuột chỉ được phép khám phá 2 cánh tay của mê lộ chữ Y, còn một cánh tay sẽ bị đóng lại Đến giai đoạn kiểm tra, chuột được khám phá 3 cánh tay của mê lộ chữ Y Cánh tay đóng trước đây đã được

mở trong các thử nghiệm giai đoạn kiểm tra được gọi là cánh tay mới Sau mỗi lần thử nghiệm, sàn và tường của mê lộ được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi

Phần trăm thời gian và số lần chuột đến cánh tay mới sẽ được ghi lại bằng camera và tính toán bằng phần mềm ANY MAZE, Stoeling, Mỹ

+ Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ không gian của cao saponin toàn phần chè đắng

Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y ở ngày thứ 31, scopolamin HBr do công ty Sigma (St Louis, MO, Hoa Kỳ) cung cấp, được pha loãng trong nước muối sinh lý 0,9% rồi tiêm cho chuột OBX uống CĐ và chuột tiêm tacrin, 1 mg/kg (i.p) một liều duy nhất trước khi tiến hành thử nghiệm 1 giờ

Chỉ tiêu đánh giá

Thời gian chuột khám phá các nhánh Y1, Y2, Y3 được tính từ lúc bắt đầu nằm

hoàn toàn 4 chi trong các nhánh đó

Chuột có tính tò mò, luôn có xu hướng khám phá vật thể mới để thu thập thông

tin mới của môi trường, qua đó, bảo đảm sự an toàn cho bản thân động vật Do đó,

chuột có trí nhớ tốt hơn sẽ có tỷ lệ phần trăm thời gian khám phá nhánh mới Y3 lớn

hơn

Hình 2.3: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y

2.2.1.3 Đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ dài hạn bằng thử nghiệm sợ hãi có

điều kiện

Thử nghiệm sợ hãi có điều kiện được tiến hành để đánh giá khả năng cải thiện

trí nhớ dài hạn trên chuột OBX 3 tuần sau khi thực hiện thử nghiệm mê lộ chữ Y (ngày

52) Thử nghiệm này được tiến hành theo phương pháp của Yamada và cộng sự (2011)

[61], có sự điều chỉnh nhỏ Lồng để tiến hành thử nghiệm sợ hãi gồm một lồng acrylic

trong suốt (30 x 30 x 30 cm) và sàn lưới thép không gỉ được trang bị 1 máy kích thích

điện SGS-002R, CS Controller CSS-001R và máy hẹn giờ theo chu kỳ do công ty

Muromachi Kikai, Tokyo, Nhật Bản cung cấp Một máy phát ra âm thanh có tần số 2,9

kHz, cường độ 80dB (SonalertR, Mallory Sonalert Products Inc., Indianapolis, IN,

- Ilex kudingcha (CĐ) 540 mg/kg/ngày p.o

- Tacrin 2,5 mg/kg/ngày, i.p

Xử lý với mẫu thử

60 phút 5 phút 30 phút 5 phút

Pha luyện tập

Pha kiểm tra

Thử nghiệm với

mê lộ chữ Y

- Uống nước cất

- Ilex kudingcha (CĐ) 540 mg/kg/ngày p.o

+ scopolamin 1 mg/kg, i.p liều duy nhất

- Tacrin 2,5 mg/kg/ngày, i.p + scopolamin

1 mg/kg, i.p liều duy nhất

Xử lý với mẫu thử

60 phút 5 phút 30 phút 5 phút

Pha luyện tập

Pha kiểm tra

Cánh tay

bị đóng

Cánh tay mới

Cánh tay

bị đóng

Cánh tay mới

USA) cho động vật nghe, được đặt trong một hộp theo dõi cách âm (MC-050/CM) do công ty Muromachi Kikai, Tokyo, Nhật Bản cung cấp Trong giai đoạn luyện tập, chuột được đặt riêng từng con vào lồng thử nghiệm sợ hãi có điều kiện và được tự do khám phá trong 4 phút Sau đó, chúng sẽ nhận được kích thích âm thanh có tần số 2,9 kHz, cường độ 80 dB trong thời gian 20 giây kết hợp với gây kích thích điện chân chuột với cường độ dòng là 0,8 mA trong thời gian 2 giây cuối Gây kích thích âm thanh và gây kích thích điện lặp lại liên tục 5 lần với khoảng cách giữa các lần là 1 phút 1 phút sau lần gây kích thích điện chân chuột cuối cùng, chuột được thả trở lại lồng của chúng Giai đoạn kiểm tra được tiến hành sau giai đoạn luyện tập 5 ngày để đánh giá đáp ứng sợ hãi với kích thích bối cảnh và kích thích âm thanh Chuột được đặt vào trong cùng một lồng với giai đoạn luyện tập để gây kích thích bối cảnh và được phép tự do di chuyển trong 6 phút Các hành vi đáp ứng được ghi lại trong 3 phút

kể từ thời điểm 1 phút sau khi chuột được đưa vào buồng để phân tích nhằm đánh giá hành vi bất động như là 1 chỉ số về trí nhớ bối cảnh Sau đó, chuột được nghe âm thanh trong thời gian 2 phút, và hành vi bất động trong suốt khoảng thời gian này cũng được ghi lại như ký ức sợ hãi phụ thuộc thính giác Sau mỗi thử nghiệm, sàn và tường được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi Các hành vi của động vật được quay phim, ghi âm và phân tích tự động bằng hệ thống Smart® Hành vi bất động được định nghĩa là không có bất kỳ cử động nào ngoại trừ cử động liên quan đến quá trình hô hấp

Hình 2.4: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm sợ hãi có điều kiện

2.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng

trên mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β - amyloid (Aβ 25-35) in vitro

Nơi thực hiện: Khoa dược lý – Sinh hóa, Viện dược liệu

Nghiên cứu này sử dụng tế bào thần kinh NG 108-15 là tế bào u nguyên bào thần kinh nuôi cấy nguyên phát, gây độc tế bào bằng protein β-amyloid, qua đó đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao saponin toàn phần chè đắng khỏi độc tính gây ra bởi protein β-amyloid 25-35 theo phương pháp của tác giả Lee, B.Y và cộng sự (2005) [35]

2.2.2.1 Đánh giá độc tế bào NG 108-15 của saponin toàn phần từ lá chè đắng

Cao saponin toàn phần chè đắng được pha thành nồng độ 40 mg/ml trong DMSO Sau đó được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy thành các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ cuối cùng trong mỗi giếng tế bào là 200; 150; 100; 75; 50; 25μg/ml

Tế bào NG 108-15 được rã đông từ tủ -80°C sau đó được nuôi cấy ổn định trong môi trường DMEM có bổ sung thêm 4% FBS, Hypoxanthin 100 μM, Thymidin

16 μM, Aminopterin 1 μM, Minomycin 1 μg/ml; điều kiện nuôi cấy trong tủ ủ 37°C 5% CO2, 95% không khí

Khi tế bào phát triển khoảng 70% bề mặt đĩa nuôi thì được sử dụng để thứ mẫu Tách tế bào ra khỏi đĩa petri bằng trypsin 0,1%, ủ ấm 05 phút Tế bào thu được sẽ trải vào đĩa 96 giếng với mật độ 2 x 104 tế bào/giếng/90 ml môi trường đầy đủ Tế bào được ủ 24 giờ để phát triển ổn định Chia các giếng tế bào thành 6 nhóm, tra 10 µL cao saponin toàn phần chè đắng ở với các nồng độ đã pha ở trên vào mỗi giếng Tiếp tục nuôi cấy ở 37°C, 95% độ ẩm, 5% CO2 Sau 24 giờ đánh giá khả năng sống sót của tế bào bằng thử nghiệm MTT (Mosmann, 1983) [42]

Thử nghiệm MTT

Nguyên tắc phương pháp: MTT là một tetrazolium hòa tan trong nước có màu

vàng nhạt Trong tế bào sống, enzym hydrogenase ở ty thể sẽ phân giải vòng tetratropium của MTT thành tinh thể formazal màu tím Hòa tan tinh thể bằng dung môi thích hợp Định lượng lượng chất phản ứng bằng đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm Độ hấp thụ của dung dịch là một hàm chuyển đổi tỷ lệ thuận với lượng

tế bào sống

Thử nghiệm MTT để đánh giá khả năng gây độc tế bào: Bổ sung 10 μl MTT (nồng độ 5 mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 5% CO2 Sau 3 giờ, hút loại

bỏ môi trường, thêm vào 50 μl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể formazal Đo

độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm bằng máy ELISA