Ứng dụng nhựa trao đổi ion để phân lập palmatin từ hoàng đằng

Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng sử dụng nhựa trao đổi ion Tulsion CXO – 9 .... DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất sử dụng

HÀ NỘI 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

ỨNG DỤNG NHỰA TRAO ĐỔI ION

ĐỂ PHÂN LẬP PALMATIN TỪ HOÀNG ĐẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

ỨNG DỤNG NHỰA TRAO ĐỔI ION

ĐỂ PHÂN LẬP PALMATIN TỪ HOÀNG ĐẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

MÃ SỐ 8720202

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Bùi Thị Thúy Luyện

2 PGS TS Nguyễn Văn Hân

LỜI CẢM ƠN !

Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn

Văn Hân, TS Bùi Thị Thúy Luyện đã luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Tôi chân thành cảm ơn Ds Trần Trọng Biên, Ds Đỗ Thị Thúy Trang đã

giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, toàn thể các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành được luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, Ban lãnh đạo khoa Dược đã tạo điều kiện cho tôi được đi học và giành cho tôi những sự hỗ trợ quý báu trong suốt thời gian tôi học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết đến gia đình, bạn bè và đồng

nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời

gian học tập và thực hiện luận văn này

Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè

Hà Nội, tháng 04 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Lan Hương

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về Hoàng đằng 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 2

1.1.4 Thành phần hóa học và công dụng 3

1.2 Tổng quan về palmatin 3

1.2.1 Công thức hóa học 3

1.2.2 Tính chất hóa lý 4

1.2.3 Vai trò palmatin 5

1.2.4 Một số nghiên cứu về chiết xuất và phân lập palmatin 6

1.3 Tổng quan về nhựa trao đổi ion 8

1.3.1.Nguyên lý trao đổi ion 8

1.3.2.Nhựa trao đổi ion 8

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 13

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 13

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Lựa chọn hạt nhựa trao đổi ion 15

2.2.2 Phân lập palmatin từ dịch chiết dược liệu bằng nhựa trao đổi ion 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1.Phương pháp định lượng 16

2.3.2.Phương pháp xử lý hạt nhựa trao đổi ion trước khi sử dụng 19

2.3.3.Phương pháp đánh giá khả năng hấp phụ 19

2.3.4.Phương pháp xác định hiệu suất giải hấp phụ 20

2.3.5.Phương pháp đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa trao đổi ion21 2.3.6.Phương pháp xây dựng quy trình phân lập Palmatin từ Hoàng đằng .21

2.3.7.Xác định cấu trúc sản phẩm 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ palmatin 22

3.2 Lựa chọn hạt nhựa trao đổi ion 23

3.2.1 Khảo sát khả năng hấp phụ của một số loại cationit 23

3.2.2 Khảo sát hiệu suất giải hấp phụ palmatin của mỗi loại cationit 25

3.3 Phân lập palmatin từ dịch chiết dược liệu bằng nhựa trao đổi ion 29

3.3.1 Xác định hàm lượng palmatin trong Hoàng đằng 29

3.3.2 Phân lập palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng 31

3.3.3 Đánh giá khả năng tái sử dụng hạt nhựa trao đổi ion 32

3.3.4 Chiết xuất và phân lập palmatin với mẻ 100g Hoàng đằng 33

3.4 Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng sử dụng nhựa trao đổi ion Tulsion CXO – 9 41

Chương 4 BÀN LUẬN 44

4.1 Dung lượng hấp phụ của các hạt cationit 44

4.2 Tác nhân giải hấp phụ 45

4.3 Khả năng ứng dụng cationit để phân lập palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(sắc ký lỏng hiệu năng cao)

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất sử dụng 14

Bảng 2.2 Các loại nhựa trao đổi ion sử dụng 15

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ

palmatin (µg/ml)

24

Bảng 3.2 Dung lượng hấp phụ palmatin (mg/g) trong môi

trường acid acetic của nhựa trao đổi ion

26

Bảng 3.3 Dung lượng hấp phụ palmatin (mg/g) trong môi

trường acid sulfuric của nhựa trao đổi ion

26

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ HCl trong ethanol 96% đến

hiệu suất phản hấp phụ palmatin ra khỏi nhựa cation acid yếu Tulsion CXO-9

31

Bảng 3.5 Hiệu quả tái sử dụng nhựa Tulsion CXO – 9 trong

phân lập palmatin từ Hoàng đằng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ

quang và nồng độ palmatin

24

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hiệu suất phản hấp phụ palmatin ra

khỏi nhựa Tulsion CXO - 9 của các tác nhân khác nhau (%)

29

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất phản hấp phụ palmatin ra

khỏi nhựa Dowex HCR – S của các tác nhân khác nhau (%)

29

Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu palmatin chuẩn 32

Hình 3.6 Sản phẩm chiết xuất palmatin từ Hoàng đằng 42

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập palmatin từ dịch chiết

Hoàng đằng bằng phương pháp truyền thống

37

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập palmatin từ dịch chiết

Hoàng đằng bằng nhựa Tulsion CXO – 9

45

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hoàng đằng là một dược liệu đã được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu đời để trị sưng viêm, nhiễm khuẩn Các nghiên cứu đã chứng minh palmatin là alcaloid chính trong cây với nhiều tác dụng dược lý quan trọng như: diệt khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [3], [22], [23],

[16], [18] Trước đây, palmatin từ Hoàng đằng được chiết xuất bằng dung môi

cồn, sau đó kết tinh bằng cách thêm muối và acid, rồi kết tinh lại trong cồn nhiều lần để thu sản phẩm Vì vậy, hiệu suất không cao và tốn thời gian Trong những năm gần đây, nhựa trao đổi ion được ứng dụng rộng rãi để phân lập các nhóm hoạt chất: alcaloid [24], carboxylic acid, phenolic anthocyamin, Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: tiến hành đơn giản, thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao, hạn chế sử dụng đến các dung môi hữu cơ độc hại, có khả năng lặp lại, độ ổn định tốt và giá thành phù hợp cho sản xuất

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về Hoàng đằng

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Fibraurea tinctoria Lour hoặc Fibraurea recisa Pierre

Tên khác: Nam hoàng liên hay Thích hoàng liên

Họ: Tiết dê (Menispermaceae)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hoàng đằng là cây dây mọc

leo, to Thân hình trụ rất cứng, cắt

ngang thấy mặt cắt hình bánh xe rất

rõ, thân già màu ngà, sù sì Lá hình

bầu dục hoặc hình mũi mác thuôn,

nhọn, dài 9- 20cm, rộng 4-10cm

Phiến lá nhẵn, cứng có 3 gân chính

Cuống lá có 2 nốt phình lên: 1 phía

trên, 1 phía dưới [3]

3

tươi, gồm 3 phần: vỏ mỏng, gỗ có nhiều tia tỏa thành hình nan hoa bánh xe, tủy hẹp Vị đắng

Phân bố

Mọc hoang khắp các vùng núi nước ta từ Lạng Sơn cho tới Nam Bộ, phân

bố phong phú hơn các vùng núi từ Nghệ An trở vào Có nhiều ở Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Bình Dương, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Nghệ An và Thanh Hóa

Thu hái và chế biến

Mùa thu hoạch gần như quanh năm Thường lấy thân và rễ cắt thành từng đoạn ngắn 15-30 cm, phơi hay sấy khô [3]

1.1.4 Thành phần hóa học và công dụng

Thành phần

Trong thân và rễ của cây Hoàng đằng có chứa hoạt chất là alcaloid có nhân isoquinolein Trong đó alcaloid chính là palmatin với tỉ lệ 1-8% (tính theo dược liệu khô) Ngoài ra còn có Jatrorhizin (khoảng 0,1%) và Columbamin (khoảng 0,01%) và một phần rất nhỏ Berberin [2], [3]

Công dụng

Làm nguyên liệu chế palmatin [2]

Có tác dụng kháng sinh: làm giảm viêm, chữa viêm ruột, viêm bàng quang, viêm gan, đau mắt, mụn nhọt, sốt nóng, tiêu chảy, lỵ (thường được sử dụng kết hợp với các dược liệu khác) [3]

các dung môi hữu cơ

 Phân tử lượng: 387.9083 g/mol

 Không có C bất đối, không có đồng phân quang học

Tính chất hóa học [3]

 Hóa tính của nitơ: N của palmatin là hydroxyd amoni bậc 4 đem

tính kiềm cho phân tử, có thể cho muối clorid với acid hydrocloric

Môi trường kiềm Môi trường acid

 Hóa tính của oxy: Palmatin có hóa chức ete có thể thuỷ phân cho

 Hóa tính của liên kết đôi: Palmatin có thể mất mạch kép tại nhân

giữa để cho các hydro alcaloid không màu Lấy palmatin màu vàng tươi đem khử với hỗn hợp Zn+H2SO4 sẽ thu được bột vô định hình trắng có nhiệt độ nóng chảy là 215oC là D,L - tetrahydropalmatin sulfat, cho tác dụng với amoniac thu được D,L - tetrahydropalmatin base, kết tinh trắng, nhiệt độ nóng chảy 140-147oC Trái lại L - tetrahydropalmatin trắng đem oxy hóa bằng iod sẽ chuyển thành palmatin màu vàng

1.2.3 Vai trò palmatin

 Tác dụng dược lý:

 Tác dụng kháng khuẩn

Palmatin ức chế sự sinh trưởng của chủng Staphyllococcus [36]

Palmatin có thể ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Helicobacter pyroli

(H.P), các nghiên cứu đã cho thấy palmatin có tác dụng điều trị các rối loạn dạ dày và ruột liên quan đến vi khuẩn H.P [23]

Nghiên cứu cho thấy palmatin có thể được sử dụng làm phương pháp điều trị bổ sung với mục đích tăng hiệu quả của kháng sinh ciprofloxacin cũng

như làm giảm sự xuất hiện của Pseudomonas aeruginosa tốt hơn berberin [34]

 Tác dụng kháng nấm

Palmatin có tác dụng kháng nấm tốt Palmatin ức chế đáng kể sự phát

triển của Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei và Candida

6

parapsilosis, thể hiện mạnh nhất trên Candida parapsilosis (MIC 16 mg/L)

Palmatin ức chế tổng hợp chitin từ cả nấm men và các giai đoạn tăng trưởng

của nấm Candida albicans một cách không cạnh tranh [24]

Hỗn hợp của palmatin clorid và berberin clorid có thể được sử dụng hiệu

quả để điều trị bệnh thối da thỏ do Microsporum canis gây ra [12]

 Tác dụng kháng tế bào ung thư

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy palmatin ức chế sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền liệt [17]

Trong nghiên cứu tìm các nguồn tự nhiên cho các tác nhân trị liệu và phòng ngừa biến chứng tiểu đường, các tác giả đã chỉ ra palmatin là một trong các alcaloid có tác dụng ức chế aldose reductase ở nồng độ ≤ 50 μg / ml [19]

 Trong tổng hợp hóa dược

Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, hiện nay palmatin chủ yếu được dùng làm nguyên liệu điều chế D,L - tetrahydropalmatin là chất có tác dụng an thần, gây ngủ [3]

Trên thị trường hiện nay palmatin chủ yếu tồn tại dưới dạng bào chế là dung dịch nhỏ mắt và viên nén Palmatin chiết xuất từ Hoàng đằng theo phương pháp truyền thống cho thấy hàm lượng palmatin chưa cao, để có thể đưa palmatin vào các dạng bào chế thì cần làm tăng thêm hàm lượng palmatin Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra palmatin có nhiều tác dụng tốt hơn berberin

và các nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu vào các tác dụng mới của palmatin như: chống ung thư Tuy nhiên, giá thành palmatin nguyên liệu hiện nay vẫn đắt hơn nhiều lần so với berberin, nếu chủ động được nguồn nguyên liệu palmatin thì sẽ góp phần làm giảm giá thành Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp mới để nâng cao hàm lượng và giảm giá thành palmatin là vô cùng cần thiết và có ý nghĩa

1.2.4 Một số nghiên cứu về chiết xuất và phân lập palmatin

Palmatin đã được chiết xuất và phân lập từ Hoàng đằng với các loại dung

7

môi khác nhau như: nước nóng, acid acetic, acid sulfuric, ethanol, Phương pháp chiết Soxhlet với dung môi chiết là methanol và aceton hay phương pháp chiết lỏng – lỏng cũng đã được nghiên cứu

Phương pháp phổ biến để chiết xuất palmatin từ Hoàng đằng là sử dụng dung môi ethanol 80% theo phương pháp ngâm ngược dòng gián đoạn với thời gian chiết là 12 giờ, chiết 4 lần Cô dịch chiết để loại tạp chất, sau đó thêm HCl

và NaCl để kết tủa palmatin clorid Kết tinh lại bằng ethanol 96% [2]

Năm 2001, Liu Youping đã đưa ra phương pháp ngâm để chiết xuất palmatin từ Hoàng đằng, dung môi chiết là H2SO4 0,2%, thời gian chiết lần 1 là

48 giờ, 3 lần còn lại mỗi lần là 24 giờ Tạo tủa thô bằng dung dịch NaCl 7% Kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối ở pH= 2 bằng dung dịch HCl 5% [27]

Liu Youping và cộng sự cũng tiến hành chiết xuất palmatin từ Hoàng đằng bằng phương pháp ngâm với dung môi H2SO4 0,2% Dùng nhựa macropopous D101 để phân lập và tinh chế Bằng cách cho dịch chiết nồng độ 0.5 mg/mL chảy qua cột có chứa hạt macropopous D101 và rửa giải bằng ethanol 40% Cô dịch rửa giải đến cắn thu được palmatin thô [27]

Li Jixian chiết xuất palmatin từ Hoàng đằng bằng phương pháp ngâm dưới áp suất giảm, với dung môi H2SO4 1% trong 12 giờ, áp suất duy trì 0,04MPa - 0,05MPa, nhiệt độ 50 – 60oC, thời gian chiết là 2 giờ, chiết 2 lần Điều chỉnh pH dịch chiết bằng dung dịch NaOH đến pH 9-10, để yên trong 12 giờ sau đó lọc để loại bỏ tạp chất Cho vào dịch lọc 7 ~ 8% NaCl, để lạnh trong

12 giờ, lọc thu được tinh thể palmatin [26]

Năm 2002, Đào Thanh Tùng so sánh 3 phương pháp chiết xuất palmatin

từ Hoàng đằng thu được kết quả như sau: phương pháp ngâm nóng với dung môi

là nước cho hiệu suất tính theo dược liệu là 1,1%, chiết xuất ngược dòng gián đoạn với dung môi là acid acetic cho hiệu suất 1,3%, trong khi đó sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96% , thời gian chiết là 16 giờ cho hiệu suất đạt 1,94 % [9]

8

Năm 2013, F S Hall và cộng sự đã tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất

và phân lập palmatin từ Tinospora cordifolia Sử dụng dung môi chiết là

methanol và aceton với tỷ lệ 70: 30 (4000 mL x 4 lần) ở 40°C trong 16 giờ trong thiết bị soxhlet Dịch chiết được cất thu hồi dung môi Sau đó dùng sắc

ký cột silica gel để phân lập và làm giàu bằng methanol Sản phẩm thu được có hàm lượng palmatin 99% [16]

Năm 2016 Lê Trường Minh và cộng sự đã khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần, phân lập bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, tinh chế trên sắc ký cột Kết quả là đã chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatin từ Hoàng đằng với độ tinh khiết 97,31% [7]

1.3 Tổng quan về nhựa trao đổi ion

1.3.1 Nguyên lý trao đổi ion

Nguyên tắc cơ bản của quá trình trao đổi ion là liên kết thuận nghịch của chất liên kết với chất đối không hòa tan trong chất nền Phân tử chất liên kết (M) liên kết với nhóm đối (G) được gắn trên chất nền resin (R) và giữ lại trên

đó đồng thời giải phóng ion đối Vì nhóm chức trên chất nền có thể mang điện dương hoặc âm, việc trao đổi ion sẽ tạo ra nhựa trao đổi ion dương hoặc âm Quá trình luôn thuận nghịch, trong quá trình hấp phụ và rửa giải với sự tái tạo lại khả năng hấp phụ của resin

Trao đổi cation: R-G- C+ + M+  R-G-M+ + C+

Trao đổi anion: R-G+ C- + M-  R-G+M- + C-

Phần lớn các phân tử hữu cơ liên kết được là do sự có mặt của các nhóm acid yếu hoặc base yếu Sự liên kết trong các phân tử có thể thay đổi nhờ điều chỉnh pH [25]

1.3.2 Nhựa trao đổi ion

1.3.2.1 Phân loại

Nhựa trao đổi ion là các polyme liên kết chéo, không tan trong nước, mang nhiều nhóm chức có khả năng ion hóa tại các vị trí xác định trên chuỗi

 Nhựa trao đổi cation (cationit)

Là nhựa có nhóm liên kết mang điện tích âm (-SO3-, -COO-) có khả năng

hấp phụ các phân tử mang điện tích dương

Các ion linh động của cationit thường là H, được gọi là nhựa trao đổi

cationit dạng H Nếu thay H bằng Na, nhựa được gọi là Na-cationit

Có 2 loại cationit:

 Cationit acid mạnh: nhóm liên kết là -SO3 H, -PO3 H,

Có khả năng phân ly thành ion linh động trong tất cả các môi trường trung tính, kiềm, acid Do đó khả năng trao đổi của chúng không bị ảnh hưởng bởi pH của dung dịch

 Cationit acid yếu: nhóm liên kết là -COOH, -OH,

Phân ly yếu trong môi trường acid, khả năng trao đổi phụ thuộc vào pH của môi trường Trong môi trường kiềm, khả năng phân ly mạnh nên khả năng trao đổi lớn Trong môi trường acid, khả năng phân ly thấp, dẫn đến khả năng trao đổi thấp [25]

 Nhựa trao đổi anion (anionit)

Là nhựa có nhóm liên kết mang điện tích dương (-N+R3, -N+R2,) có khả năng hấp phụ các phân tử mang điện tích âm Các anion linh động thường là -OH, -Cl… Có hai loại nhựa anionit:

 Anionit kiềm mạnh: nhóm liên kết là kiềm amin bậc 4: -(CH3 )3N+,-OH- Nhóm -OH liên kết vào nhựa nhờ lực tĩnh điện Anionit kiềm mạnh có mức độ phân ly ion tốt trong tất cả các môi trường nên khả năng trao đổi của chúng không phụ thuộc pH của môi trường

 Hình thái: nhựa trao đổi ion thường ở dạng tròn

 Độ nở: khi đem nhựa dạng keo ngâm vào trong nước, thể tích của nó biến đổi lớn

 Độ ẩm: là % khối lượng nước trên khối lượng nhựa ở dạng khô (độ ẩm khô), hoặc ở dạng ướt (độ ẩm ướt)

 Tính chịu nhiệt: các loại nhựa bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ đều có giới hạn nhất định, vượt quá giới hạn này nhựa bị nhiệt phân giải không sử dụng được Nhiệt độ hoạt động tốt từ 20-50oC

 Tính dẫn điện: chất trao đổi ion ẩm dẫn điện tốt, tính dẫn điện của nó phụ thuộc vào dạng ion

 Kích thước hạt: nhựa có dạng hình cầu d = 0,04 -1,00mm

 Tính chịu mài mòn: trong vận hành các chất trao đổi ion cọ sát lẫn nhau

và nở ngót, có khả năng dể vỡ vụn Đây là một chỉ tiêu ảnh hưởng đến tính năng thực dụng của nó

 Tính chịu oxy hoá: chất oxy hoá mạnh có thể làm cho nhựa bị lão hoá

 Tính năng hoá học

 Dung lượng trao đổi biểu thị mức độ nhiều ít của lượng ion có thể trao đổi trong một loại chất trao đổi ion

 Tính thuận nghịch của phản ứng trao đổi ion:

Phản ứng trao đổi ion là phản ứng thuận nghịch Dựa trên tính chất này người ta dùng dung dịch chất hoàn nguyên, thông qua chất trao đổi ion đã mất

11

hiệu lực để khôi phục lại năng lực trao đổi của nó

Ví dụ: 2HR+ + Ca2+ => CaR2+ + 2H+ (nhựa trao đổi)

CaR2+ + 2H+ => 2HR+ + Ca2+ (hoàn nguyên)

 Tính acid, kiềm: tính năng của chất Cationit RH và chất Anionit ROH giống chất điện giải acid, kiềm

 Tính trung hoà và thuỷ phân: tính năng trung hoà và thuỷ phân của chất trao đổi ion giống chất điện giải thông thường

 Tính chọn lọc: ở hàm lượng ion thấp trong dung dịch, nhiệt độ bình thường, khả năng trao đổi tăng khi hóa trị của ion trao đổi tăng [25]

Hình A Hạt nhựa trao đổi ion

Dowex HCR – S

Hình B Hạt nhựa trao đổi ion

Tulsion CXO – 9

Hình 1.3 Hạt nhựa trao đổi ion

1.3.2.3 Các ứng dụng của nhựa trao đổi ion

 Làm mềm nước: Trong ứng dụng này, nhựa trao đổi ion được sử dụng

để thay thế các ion Mg2+ và Ca2+ được tìm thấy trong nước cứng bằng Na+

 Lọc nước: Trong ứng dụng này nhựa ion dùng để loại bỏ chất độc hại (ví

dụ như đồng) và kim loại nặng (như chì hoặc cadmium) thay thế chúng bằng các ion vô hại hơn như Na+ và K+

 Sản xuất nước có độ tinh khiết cao: Nước này được sản xuất bằng cách

sử dụng các quy trình trao đổi ion hoặc sự kết hợp của màng tế bào và phương

12

pháp trao đổi ion Cation được thay thế bởi H+ bằng cách sử dụng cationit, anion được thay thế bởi OH- bằng cách sử dụng anionit Các ion H+ và OH- kết hợp tạo thành phân tử H2O Vì vậy không có các ion tồn tại trong nước sản xuất

 Xúc tác: Trong hoá học nhựa trao đổi ion có thể làm chất xúc tác cho phản ứng hữu cơ

 Sản xuất đường: Nhựa trao đổi ion được sử dụng trong sản xuất đường

từ nhiều nguồn khác nhau Chúng giúp làm sạch siro đường

 Trong phân lập các hợp chất thiên nhiên: Nhựa trao đổi ion được sử dụng trong sản xuất dược phẩm không chỉ làm chất xúc tác phản ứng nhất định mà cũng dùng để phân lập các hợp chất tự nhiên Trong phân lập một số hợp chất thuộc nhóm alcaloid như berberin được phân lập từ bột sưa bằng nhựa trao đổi cation với hiệu suất hấp phụ berberin đạt 97,03 %, hiệu suất giải hấp phụ berberin 83,17% Trong phân lập acid shikimic từ Đại hồi Đỗ Thị Loan (2015)

đã sử dụng hạt nhựa trao đổi ion dạng anionit phân lập cho thấy hiệu suất phân lập cao đạt 75,1 % và sản phẩm acid shikimic thu được có độ tinh khiết là 98,8%[25]

13

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

 Nguyên liệu: thân rễ Hoàng đằng được cung cấp bởi công ty Hóa Dược phẩm Việt Nam

 Dung môi, hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất sử dụng

1 Ethanol 96% Việt Nam Tinh khiết hóa học

hydrochloric

Trung Quốc Tinh khiết hóa học

3 Natri clorid Việt Nam Tinh khiết hóa học

4 Natri carbonat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

6 Amoniac Trung Quốc Tinh khiết hóa học

7 Nước cất Việt Nam Tinh khiết hóa học

14

 Nhựa trao đổi ion:

Bảng 2.2 Các loại nhựa trao đổi ion sử dụng

Tên

thương

mại

Khoảng nhiệt độ hoạt động

Dung lượng trao đổi

Nhóm đặc trưng

Kích thước hạt

Nguồn gốc

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)

 Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

 Máy đo quang Hitachi U1900 (Nhật Bản)

 Máy siêu âm ultrasonic LC60H (Đức)

 Hệ thống lọc hút Buchner

 Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức)

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gồm: bộ phân loại khí DGU – 14A, bơm cao áp LC – 10ADVP, buồng chứa cột CTO – 10AVP, bộ điều khiển SCL – 10AVP, detector dãy diod quang SPD – M10AVP và phần mềm Class vp 6.14

 Dụng cụ

 Bình cầu 250 mL

 Bình nón 100 mL, 250 mL

 Màng lọc cellulose acetat 0,45 μm (Satorius)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Lựa chọn hạt nhựa trao đổi ion

Để lựa chọn được loại hạt nhựa trao đổi ion tốt sử dụng trong phân lập palmatin từ dược liệu Hoàng đằng, ta tiến hành khảo sát quá trình hấp phụ palmatin từ dung dịch palmatin tinh khiết lên hạt nhựa trao đổi ion và quá trình giải hấp phụ palmatin ra khỏi hạt nhựa trao đổi ion

2.2.1.1 Khảo sát khả năng hấp phụ palmatin của mỗi loại cationit

Nội dung này đánh giá tốc độ hấp phụ palmatin được pha trong acid acetic và acid sulfuric ở các nồng độ khác nhau của mỗi loại nhựa trao đổi ion

Từ đó xác định được loại acid, nồng độ acid thích hợp và thời gian tối thiểu cần

để mỗi loại nhựa hấp phụ được tối đa palmatin Mặt khác, cũng so sánh được dung lượng hấp phụ palmatin của các hạt nhựa được sử dụng trong cùng một điều kiên

2.2.1.2 Khảo sát hiệu suất giải hấp phụ palmatin của mỗi loại cationit

Nội dung này khảo sát các dung môi có khả năng rửa giải palmatin ra khỏi hạt nhựa trao đổi ion Từ đó xác định được thời gian, nồng độ thích hợp

để giải hấp phụ palmatin từ nhựa trao đổi ion

2.2.2 Phân lập palmatin từ dịch chiết dược liệu bằng nhựa trao đổi ion

2.2.2.1 Phân lập palmatin

Từ loại nhựa trao đổi ion, loại acid, nồng độ acid và thời gian hấp phụ đã xác định được tại mục 2.2.1.1, tiến hành hấp phụ palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng lên nhựa cationit đã lựa chọn được Qua đó xác định được dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trao đổi ion đối với palmatin từ dịch chiết Hoàng đằng, đồng

16

thời cũng so sánh được dung lượng hấp phụ của palmatin từ dịch chiết và dung

lượng hấp phụ của palmatin chuẩn

Tiến hành giải hấp phụ palmatin ra khỏi nhựa cationit với các thông số về loại dung môi, thể tích và tốc độ đã xác định được tại mục 2.2.1.2 Từ đó tính được hiệu suất giải hấp phụ

2.2.2.2 Đánh giá khả năng tái sử dụng hạt nhựa trao đổi ion

Khảo sát khả năng tái sử dụng nhựa trao đổi ion trong phân lập palmatin

từ dịch chiết Hoàng đằng qua số lần lặp lại quá trình hấp phụ - giải hấp phụ - hoàn nguyên nhựa trao đổi ion

2.2.2.4 Xây dựng quy trình phân lập palmatin từ Hoàng đằng

 Chiết xuất

 Hấp phụ

 Giải hấp phụ

 Kết tinh lại

 Kiểm tra chất lượng sản phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng

a Phương pháp đo quang

Tham khảo các tài liệu [9], [26] và qua thực nghiệm, xác định dung lượng hấp phụ, giải hấp phụ palmatin từ hạt nhựa bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 340 nm

Mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 20,0 mg chất chuẩn palmatin clorid cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL nước cất nóng, lắc cho hòa tan hoàn toàn

Bổ sung nước cất đến vạch, lắc đều Hút chính xác 1mL cho vào bình định mức

100 mL, thêm nước cất vừa đủ đến vạch, lắc đều Mẫu chuẩn gốc có nồng độ khoảng 20 µg/mL

Xây dựng đường chuẩn

17

Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 20 µg/mL, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng 4-12 µg/mL và tiến hành đo quang ở bước sóng 340 nm, mẫu trắng là nước cất Xây dựng mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ palmatin

Mẫu thử là sản phẩm trung gian

Pha loãng mẫu thử đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, lọc qua màng lọc 0,45µm, sau đó đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 340 nm, mỗi mẫu

đo 3 lần lấy kết quả trung bình

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Xác định hàm lượng palmatin trong dược liệu, dịch chiết và sản phẩm bằng phương pháp HPLC

18

hydrocloric 1% trong methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng 0,45µm Dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 30 µg/mL

 Mẫu thử:

Mẫu thử là dược liệu: Cân chính xác khoảng 0,600 g bột dược liệu, gói

vào giấy lọc cho vào bình nón 100 mL, thêm 30 mL dung dịch acid hydrocloric 1% trong methanol, đậy kín nắp, siêu âm trong vòng 1 giờ trong máy siêu âm Gạn dịch chiết, bã tiếp tục tiến hành chiết lần 2, lần 3, mỗi lần chiết với 30 mL dung dịch acid hydrocloric 1% trong methanol Gộp dịch chiết, cho vào bình định mức 100 mL Thêm dung dịch acid hydrocloric 1% trong methanol vừa

đủ đến vạch, lắc đều Hút chính xác 2 mL cho vào bình định mức 10 mL, thêm dung dịch acid hydrocloric 1% trong methanol đến vạch, lắc đều

Mẫu thử (palmatin thô, sản phẩm): Cân chính xác lượng mẫu thử tương

đương 3 mg vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung dịch HCl 1% trong methanol, siêu âm 15 phút, bổ sung dung dịch HCl 1% trong methanol đủ tới vạch, lắc đều Lọc qua màng 0,45µm, phân tích bằng HPLC

Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa

vào diện tích (hay chiều cao) pic thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn

và nồng độ palmatin của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng palmatin trong mẫu thử

Công thức tính

Hàm lượng palmatin trong Hoàng đằng:

 1 100%

.S.f.Vm

.S.f.a.VmX%

C C C T

T T T



Trong đó:

X%: Hàm lượng palmatin trong Hoàng đằng

mC: Khối lượng palmatin chuẩn

mT: Khối lượng hoàng đằng đem chiết

SC: Diện tích peak mẫu chuẩn

19

i=1

ST: Diện tích peak mẫu thử

fC, fT: Hệ số pha loãng của mẫu chuẩn và mẫu thử

VC, VT: Thể tích của dung dịch chuẩn và dung dịch thử

a: Hàm lượng palmatin base trong mẫu chuẩn

2.3.2 Phương pháp xử lý hạt nhựa trao đổi ion trước khi sử dụng

Hạt nhựa trao đổi ion được rửa với ethanol loãng, rồi rửa với nước cất để loại tạp Tiếp theo ngâm hạt nhựa trao đổi ion vào dung dịch acid loãng trong 24 giờ để hạt nhựa trương nở và hoạt hóa Sau đó lọc, rửa bằng nước cất đến pH trung tính

2.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng hấp phụ

 Cân chính xác 1,000 g hạt cationit mỗi loại vào các bình nón riêng biệt

 Chuẩn bị dung dịch palmatin tinh khiết (hoặc dịch chiết Hoàng đằng) có nồng độ xác định, cho vào mỗi bình nón trên, khuấy từ 100 vòng/ phút

 Sau các khoảng thời gian 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 24h, 48h, hút dịch ngâm hạt cationit, đem pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó định lượng bằng phương pháp đo quang để xác định lượng palmatin còn lại trong dịch

 Từ lượng palmatin ban đầu trừ đi lượng palmatin còn lại sẽ tính được lượng palmatin hấp phụ tại các thời điểm khác nhau

 Khối lượng palmatin hấp phụ vào nhựa ở thời điểm t được xác định:

mhp(t) = C0 × V0 - Ct × Vt × ft -∑t−1(Ci × fi) Trong đó:

 C0,V0: Lần lượt tương ứng với nồng độ (mg/ mL), thể tích (mL) của dung dịch chuẩn ở thời điểm ban đầu

 Ct, Vt, ft: Lần lượt tương ứng với nồng độ (mg/ mL), thể tích (mL)

và hệ số pha loãng của dung dịch ở thời điểm ngâm nhựa t

 Ci, fi : Lần lượt tương ứng với nồng độ (mg/ mL) và hệ số pha loãng

20

của dịch chiết ở thời điểm ngâm nhựa i

 Dung lượng hấp phụ palmatin của nhựa trao đổi ion tại thời điểm t được xác định:

Ct (mg/g) = mhp(t) )

mnTrong đó:

 mhp(t): Khối lượng palmatin hấp phụ vào nhựa ở thời điểm t (mg)

 mn: Khối lượng nhựa trao đổi ion (g)

2.3.4 Phương pháp xác định hiệu suất giải hấp phụ

 Tiến hành thí nghiệm với loại hạt nhựa có dung lượng hấp phụ tốt đã lựa chọn được theo mô tả trong mục 2.3.3, sau đó rửa sạch hạt nhựa bằng nước cất, hút kiệt nước và ngâm hạt nhựa với dung dịch giải hấp phụ

 Sau các khoảng thời gian 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 24h, 48h, hút dịch giải hấp phụ, đem pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó định lượng bằng phương pháp đo quang để xác định lượng palmatin đã giải hấp phụ ra từ nhựa

Công thức tính:

 Khối lượng palmatin giải hấp phụ từ nhựa tại thời điểm t:

mghp(t) = Ct × ft ×Vt + Ci × fi

Trong đó:

 Ct, Vt, ft: Lần lượt tương ứng với nồng độ (mg/mL), thể tích (mL)

và hệ số pha loãng của dịch giải hấp phụ ở thời điểm t

 Ci, fi: Lần lượt tương ứng với nồng độ (mg/mL) và hệ số pha loãng của dung dịch giải hấp phụ ở thời điểm i (i= t-1)

 Hiệu suất giải hấp phụ palmatin từ nhựa cationit tại thời điểm t:

%H = mghp

mhp× mn ×100%

Trong đó:

21

 mghp(t): Khối lượng palmatin giải hấp phụ tại thời điểm t (mg)

 mhp: Khối lượng palmatin đã hấp phụ trên nhựa (mg)

 mn: Khối lượng nhựa trao đổi ion (g)

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa trao đổi ion

Hạt nhựa sau khi sử dụng được xử lý bằng phương pháp như đã trình bày

ở mục 2.3.2, được lọc hút chân không để loại bỏ nước Khả năng tái sử dụng của nhựa được đánh giá thông qua khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ tiến hành như đã mô tả trong mục 2.3.3 và 2.3.4

2.3.6 Phương pháp xây dựng quy trình phân lập Palmatin từ Hoàng đằng

 Qua khảo sát, lựa chọn loại nhựa trao đổi ion tốt nhất, sau đó hoạt hóa theo phương pháp 2.3.2

 Chuẩn bị dịch chiết

 Tiến hành hấp phụ dịch chiết vào hạt nhựa trao đổi ion theo phương pháp 2.3.3

 Tiến hành giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp theo phương pháp 2.3.4

 Phân lập thu palmatin thô từ dịch giải hấp phụ

 Tiến hành tái sử dụng cationit khi hấp phụ palmatin trong dịch chiết Hoàng đằng

 Tiến hành thực nghiệm trên mẻ lớn hơn dựa vào các thông số đã xác định được trước đó: loại nhựa cationit, dung dịch acid và nồng dộ thích hợp để chiết, tối ưu dung lượng hấp phụ palmatin trên loại nhựa đã lựa chọn và dung dịch giải hấp phụ

2.3.7 Xác định cấu trúc sản phẩm

- Đo phổ: IR, NMR để chứng minh cấu trúc hóa học của palmatin

22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang

và nồng độ palmatin

Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng 4-12 µg/mL và tiến hành

đo quang ở bước sóng 340 nm Kết quả mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ palmatin được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ palmatin (µg/ml)

Nồng độ thực tế

(µg/mL) 3,96 5,94 7,92 9,90 11,88 Mật độ quang 0,235 0,381 0,516 0,684 0,815

23

giữa nồng độ palmatin+ và mật độ quang: y = 0,0739x – 0,059 và trong khoảng nồng độ khảo sát, mật độ quang và nồng độ palmatin+ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ với R2 = 0,9988

3.2 Lựa chọn hạt nhựa trao đổi ion

3.2.1 Khảo sát khả năng hấp phụ của một số loại cationit

Mục đích của thí nghiệm là xác định tốc độ hấp phụ palmatin của các cationit khi pha palmatin clorid chuẩn trong các môi trường khác nhau Từ đó, tìm được thời gian tối thiểu để cationit hấp phụ được tối đa palmatin đồng thời cũng xác định được dung môi dùng trong chiết xuất Hoàng đằng

Tiến hành:

 Cân chính xác 1,000 g hạt cationit mỗi loại cho vào bình nón 100 mL

 Chuẩn bị dung dịch palmatin clorid: pha palmatin clorid chuẩn bằng acid acetic (2%, 3% hoặc 4%) hoặc acid sulfuric (0,2%, 0,5% hoặc 1%) để được dung dịch