Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng dược lý của cao giàu saponin tam thất hoang (panax stipuleanatus h tsai et k m feng) theo định hướng chống huyết khối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRƯƠNG QUYẾT THẮNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CAO GIÀU SAPONIN TAM THẤT HOANG Panax stipuleanatus H.Tsai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG QUYẾT THẮNG

NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CAO GIÀU SAPONIN

TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) THEO ĐỊNH HƯỚNG

CHỐNG HUYẾT KHỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG QUYẾT THẮNG

NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CAO GIÀU SAPONIN

TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) THEO ĐỊNH HƯỚNG

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện được luận văn này, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc nhất tới các thầy cô, các phòng ban và bộ môn Trường Đại học dược Hà Nội, Khoa Y Dược Đại học quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp, gián tiếp dìu dắt và giảng dạy để em hoàn thành khóa học trong suốt một năm rưỡi qua

Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo PGS TS Dương Thị Ly Hương,

PGS TS Đào Thị Vui và TS Vũ Thị Thơm đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, dìu

dắt, giúp đỡ em Nhờ sự chỉ bảo hướng dẫn quý giá đó mà trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài được giao một cách tốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy Cô giáo – Các nhà khoa học

đã trực tiếp hoặc gián tiếp giảng dạy truyền đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành bổ ích cho bản thân em trong những năm tháng qua

Em xin gửi tới ban lãnh đạo Bệnh viện Bạch Mai, Khoa Y Dược Đại học quốc gia Hà Nội lời cảm tạ sâu sắc nhất vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em

có thể thực nghiệm và thu được số liệu cùng những tài liệu nghiên cứu cần thiết liên quan tới đề tài tốt nghiệp một cách dễ dàng và thuận tiện nhất

Em xin được cảm ơn và ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu nhiệt

tình của các bạn sinh viên trong nhóm nghiên cứu: Nguyễn Thị Giang, Hồ Thị Thu

Hà, Lê Thị Thanh Hoa, Lưu Thị Huyền Trang lớp Dược K2 và Nguyễn Thị Thu Giang Lớp Y6 Khoa Y Dược Đại học quốc gia Hà Nội, đã đóng góp công sức, ý

kiến và giúp đỡ cùng em triển khai, thực nghiệm, thu thập những số liệu quý báu của đề tài Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường trung cấp Y tế Vĩnh Phúc nơi em đang công tác đã quan tâm động viên khuyến khích và sự cảm thông sâu sắc của gia đình để em hoàn thành luận văn này

Em cũng xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: mã số TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội dung nghiên cứu này

KHCN-Cuối cùng, em rất mong nhận được sự đóng góp, nhận xét và phê bình của quý Thầy Cô và tất cả bạn đọc để đề tài này được hoàn thành tốt hơn

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh lý huyết khối 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh hình thành huyết khối 3

1.1.3 Các biện pháp phòng và điều trị huyết khối 12

1.2 Tổng quan về cây Tam thất hoang 15

1.2.1 Đặc điểm thực vật 15

1.2.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 16

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin rễ cây Tam thất hoang 21

2.3.2 Đánh giá tác dụng trên thời gian đông máu in vitro của cao giàu saponin Tam thất hoang 23

2.3.3 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin Tam thất hoang 25

2.3.4 Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo trên mô hình gây huyết khối đuôi chuột 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Đánh giá độc tính cấp của cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 30

3.2 Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro của cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 34

3.3 Đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin từ rễ

Tam thất hoang 35

3.4 Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo của cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang. 36

Chương 4 BÀN LUẬN 44

4.1 Đối tượng nghiên cứu 44

4.2 Kết quả nghiên cứu 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC

PHỤ LỤC 2 PHIẾU CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU

AA Acid arachidonic

ADP Adenosin diphosphat

AMP Adenosin monophosphat

APTT Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (Activated Partial

Thromboplastin Time)

ATP Adenosin triphosphat

CADP Collagen Adenosin diphosphat (Collagen +ADP

CEPI Collagen Epinephrine

COX-1 Cyclooxygenase 1

DMSO Dimethyl sulfoxide

EtOAc Ethyl acetat

EtOH Ethanol

HK Huyết khối

HP Heparin

LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lathal Dose 50%)

MPA Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation)

NTTC Ngưng tập tiểu cầu

PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma)

PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma)

PST Cao tổng cồn 70% Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Total)

PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time)

TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)

TXA2 Thromboxan A2

v/v Thể tích/Thể tích

vWF Willerbrand

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Liều cao giàu saponin cho chuột uống thực nghiệm 22 Bảng 3.1 Số chuột chết ở các lô thực nghiệm sau 72 giờ 31 Bảng 3.2 Biểu hiện chuột ở các lô thực nghiệm trong 72 giờ 32 Bảng 3.3 Tác dụng của cao chiết giàu saponin từ Tam thất hoang lên

quá trình đông máu 35 Bảng 3.4 Tác dụng ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao chiết giàu

saponin từ Tam thất hoang 35 Bảng 3.5 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ 36 Bảng 3.6 Mức độ huyết khối sau 24 giờ gây bằng k-carrageenan 37 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của đường tiêm đến sự hình thành huyết khối 39 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của sự nhúng đuôi chuột trong nước đá 40 Bảng 3.9 Tác dụng của aspirin lên sự hình thành huyết khối 41 Bảng 3.10 Kết quả sự hình thành huyết khối giữa các lô thực nghiệm 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu ADP 6 Hình 1.2 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của acid arachidonic 6 Hình 1.3 Sơ đồ quá trình đông máu 9 Hình 1.4 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu 11 Hình 1.5 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của aspirin 14 Hình 1.6 Cây Tam thất hoang 15 Hình 2.1 Quy trình chiết suất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 18 Hình 3.1 Hình ảnh nội tạng của chuột sau khi thực nghiệm bị chết được

mổ ra để quan sát 30 Hình 3.2 Một số hình ảnh huyết khối đuôi chuột 37 Hình 3.3 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột k-carrageenan ở các mức

liều khác nhau sau 24 giờ 38 Hình 3.4 Ảnh hưởng của đường tiêm thuốc đến sự hình thành huyết khối 39 Hình 3.5 Ảnh hưởng của sự nhúng đuôi chuột trong nước đá đến sự hình

thành huyết khối 40 Hình 3.6 Tác dụng của aspirin lên sự hình thành huyết khối đuôi chuột 41 Hình 3.7 Tác dụng của cao giàu saponin Tam thất hoang lên sự hình

thành huyết khối đuôi chuột 43

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao trên thế giới là do nhóm bệnh huyết khối Huyết khối cũng là nguyên nhân hàng đầu gây nên sự tắc nghẽn mạch máu gây tử vong, hoặc để lại những di chứng nặng nề cho bệnh nhân Song song với những thuốc đã được khẳng định giá trị trong phòng và điều trị huyết khối như aspirin, clopidogrel,… việc tìm kiếm các thuốc mới có tác dụng chống đông máu và chống huyết khối là vấn đề đáng quan tâm của các nhà khoa học Đặc biệt, với xu thế quay trở về với giá trị thiên nhiên, việc tìm kiếm các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược là đối tượng được lưu tâm nghiên cứu

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M.Feng) thuộc chi

Panax - họ Ngũ gia bì (Araliacea) là loài sâm mọc tự nhiên ở nước ta, chủ yếu được

tìm thấy ở khu vực dãy núi Hoàng Liên Sơn, Lào Cai, mang những đặc điểm thực vật chung của chi Nhân sâm Hiện nay đã được nhân dân các tỉnh miền núi trồng và

sử dụng thay thế cho các loại sâm như sâm ngọc linh, nhân sâm, tam thất

Theo kinh nghiệm dân gian, Tam thất hoang có tác dụng hoạt huyết, kháng viêm, giảm đau, cầm máu.Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về tác dụng dược

lý của loài cây này còn rất hạn chế

Năm 2017, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Trinh và Lê Thị Tâm

về tác dụng chống đông máu, chống kết tập tiểu cầu các phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang tại khoa y dược Đại học Quốc gia Hà Nội cho thấy, cao tổng, cao phân đoạn n-hexan, phân đoạn butanol của rễ cây Tam thất hoang làm giảm ngưng tập tiểu cầu đáng kể Phân đoạn butanol còn kéo dài thời gian đông máu APTT lên một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (ở liều 2 mg/mL và 5 mg/mL) [8], [17]

Một số nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của Tam thất hoang cho thấy trong rễ, lá của loài cây này có chứa saponin khung dammaran và hàm

lượng oleanan rất cao [24], [48], [59] Các loài khác thuộc chi Panax cũng được

tìm thấy thành phần hóa học chính là saponin [57]

Butanol là một dung môi hữu cơ, có độ hòa tan vừa phải trong nước ở nhiệt độ thường và là dung môi để chiết saponin rất tốt Tuy nhiên, butanol cũng có tính độc, nên để chiết saponin ở quy mô công nghiệp, tiến tới thương mại hóa sản phẩm, cần

1 Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin của rễ Tam thất hoang

2 Đánh giá đƣợc tác dụng chống đông, chống kết tập tiểu cầu trên in vitro cao

giàu saponin của rễ Tam thất hoang

3 Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo cao giàu saponin của rễ Tam thất

hoang trên mô hình gây huyết khối đuôi chuột

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh hình thành huyết khối

Ngay thời cổ đại nhà sinh lý học Johannes Muller (1801-1858) đã mô tả fibrin là chất liệu chính của cục máu đông Tiền chất của fibrin là fibrinogen, được đặt tên bởi Rudolf Virchow (1821-1902) và nó được phân lập hóa học bởi Prosper Sylvain Denis 1799-1863) Alexander Schmidt cho rằng sự chuyển fibrinogen thành fibrin là kết quả của một quá trình phản ứng enzyme, và gọi tên enzyme đó là

"thrombin" và tiền chất tương ứng "prothrombin".Arthus phát hiện năm 1890 rằng can xi cần cho sự đông máu Tiểu cầu được xác định năm 1865, và vai trò của chúng được mô tả bởi Giulio Bizzozero năm 1882 [7]

1.1.2.1 Co mạch

Ngay sau khi mạch máu bị tổn thương, những kích thích đau từ nơi tổn thương làm co cơ trơn của thành mạch, mạch máu co lại làm giảm lượng máu thoát ra ngoài Co mạch được thực hiện bởi hai cơ chế thần kinh và dịch thể Khi mạch máu nhỏ bị tổn thương, tiểu cầu được hoạt hóa và giải phóng ra thromboxan A2 là chất gây co mạch Co mạch tạo điều kiện hình thành nút tiểu cầu và cục máu đông [26]

1.1.2.2 Sự hình thành nút tiểu cầu

Tại nơi tổn thương, tế bào nội mạc hoặc thành mạch tổn thương để lộ sợi collagen, tiểu cầu bám dính vào những nơi này và bị hoạt hoá Khi tiểu cầu bị hoạt hoá, các protein trong tiểu cầu bị co rút mạnh và giải phóng ra các yếu tố làm hoạt hoá các tiểu cầu bên cạnh, làm cho chúng dính vào nhau tạo nên nút tiểu cầu bịt kín chỗ tổn thương (đối với các tổn thương nhỏ)

4

a Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu

Ở trạng thái sinh lý bình thường thì tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu Khi tế bào trong nội mô mạch bị tổn thương, tiểu cầu sẽ bị bám dính làm thay đổi hình dạng, tiểu cầu tham ra một loạt các phản ứng và bị ngưng tập Cuối cùng hình thành một nút tiểu cầu tại nơi bị tổn thương Tiểu cầu từ bất hoạt chuyển sang dạng hoạt hóa xảy ra theo một chiều dọc liên tục và được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập, phóng thích các chất [8], [13]

 Giai đoạn bám dính

Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động bởi oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu Tế bào nội mô còn chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kích hoạt ADP Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suy yếu để lộ lớp dưới nội mô, lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), fibronectin, lamilin…[8], [13] Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GP Ia/IIa Những tương tác này làm cho tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc các cặp thụ thể-phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [8], [13]

Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP VI gây ra sự kích hoạt GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [8], [13]

 Giai đoạn ngưng tập

Giai đoạn này là hiện tượng tiểu cầu dính với nhau tạo thành từng đám (hay gọi là nút tiểu cầu) Hiện tượng dính hoạt hoá tiểu cầu, tạo điều kiện cho hiện tượng ngưng tập xảy ra [8], [20]

Ngưng tập tiểu cầu là hiện tượng đặc trưng cho sự tích tụ tiểu cầu vào nút cầm máu Thụ thể trung tâm trong quá trình này là GP IIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng 4.000-

5

5.000 phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [8], [13]

Các chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin , trong đó ADP là quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và xúc tác cho phản ứng ngưng tập khác xảy ra Những hồng cầu tại thành mạch bị tổn thương bài tiết ADP và làm tăng nhanh nồng độ ADP tại chỗ tổn thương, làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu

Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy ADP phát huy hiệu quả đầy đủ khi

có sự tham gia của cả 3 thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2TAC, P2X1, trong đó hai thụ thể P2Y1 và P2TAC cần thiết để hiện tượng ngưng tập xảy ra tối đa Hai thụ thể này là một trong những trọng tâm của nghiên cứu về thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu trong dự phòng và điều trị huyết khối [8], [16], [20]

- Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu không ngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thoái hóa ATP thành ADP Trong trường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứng này bị ức chế dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập [11]

Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP được tóm tắt ở hình 1.1 [8]

6

Hình 1.1 Cơ chế gây ngƣng tập tiểu cầu của ADP [8], [11]

- Sự ngƣng tập tiểu cầu gây ra bởi acid arachidonic (AA): Cơ chế gây NTTC của acid arachidonic đƣợc tóm tắt ở hình 1.2 [8]

Hình 1.2 Cơ chế ngƣng tập tiểu cầu của acid arachidonic [8], [11]

7

Vai trò của phospholipid màng cụ thể là acid arachidonic (AA) tham gia vào

sự ngưng tập tiểu cầu đã được chứng minh Trong cơ chế này, ngưng tập tiểu cầu là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố kích tập với phospholipid màng và các men như cyclooxygenase và thromboxan synthetase [11]

Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A khuếch đại cùng với ADP cho phản ứng của tiểu cầu, ngoài ra serotonin có thể đóng vai trò gây đông máu, làm tăng việc lưu giữ protein đông máu như fibrinogen, thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [13]

 Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [11]

Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bị ngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích của tiểu cầu Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sự biến đổi về hình thái và sinh hóa của tiểu cầu Cụ thể như sau:

- Những thay đổi về hình thái: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại,

- Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP, serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố 3 tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid và một số men khác

- Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin

Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương

Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có

sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của tiểu cầu

b Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương

Tiểu cầu cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình đông máu thông qua một số hiện tượng sau: [20]

8

- Ngay sau khi có hiện tượng bám dính, ngưng tập để khởi động quá trình cầm máu thì đã có một quá trình hoạt hoá ngay tại màng tiểu cầu để chuyển yếu tố

XI thành XIa

- Tiểu cầu mang điện tích âm trên bề mặt tạo thuận lợi cho việc hoạt hoá yếu

tố XI nhờ kallikrein và HMWK (Hight-Molecular-Weigth-Kininogen), là bước đầu tiên trong dòng thác đông máu

- Sau khi có hiện tượng thay hình đổi dạng, tiểu cầu phóng thích các chất trong

đó có yếu tố 3 tiểu cầu, đó là yếu tố có vai trò quan trọng trong hình thành phức hợp prothrombinase gồm Xa, Va, Ca++ và phospholipid (yếu tố 3 tiểu cầu)

- Tiểu cầu gắn với yếu tố Xa làm tăng đáng kể tốc độ hoạt hoá prothrombin

Cơ chế đông máu [17]

Cơ chế đông máu diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.4)[9], [31], [41]:

- Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase

- Giai đoạn II: Hình thành thrombin

- Giai đoạn III: Hình thành fibrin

 Giai đoạn 1: Sự hình thành phức hợp prothrombinase

Prothrombinase là yếu tố khởi động cho cơ chế đông máu Cơ chế này rất phức tạp và kéo dài nhất của quá trình đông máu Quá trình được xảy ra khi thành mạch và mô bị chấn thương, hoặc chấn thương máu, hay có sự tiếp xúc của máu

là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia và kết quả sản xuất thrombin quá mức gây nên huyết khối [17], [25], [56].

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình đông máu [12]

Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo hai cơ chế ngoại sinh và nội sinh

 Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế ngoại sinh:

Mô bị tổn thương giải phóng thromboplastin (yếu tố III) và phospholipid từ màng tế bào mô Yếu tố X được hoạt hoá (Xh) nhờ yếu tố III, yếu tố VIIh (yếu tố VII được hoạt hoá nhờ yếu tố III), ion Ca2+ và phospholipid Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự tham gia của yếu tố Vh (yếu tố V được hoạt hoá

10

nhờ thrombin), ion Ca2+ và phospholipid Yếu tố Vh làm tăng hoạt tính của yếu tố

Xh Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố (Hình 1.3) [9], [31]

Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh

Khi bị chấn thương, máu tiếp xúc với collagen hoặc bề mặt vật lạ thì làm hoạt hoá yếu tố XII và phospholipid tiểu cầu được giải phóng Yếu tố XIIh chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIh (với sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald) Yếu

tố XIh hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IXh (với sự tham gia của yếu tố tiểu cầu) Yếu tố X được hoạt hoá có sự tham gia của yếu tố VIIIh (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXh, ion Ca2+ và phospholipid Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Vh (yếu tố V được hoạt hoá nhờ thrombin) và ion Ca2+ Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn (1 - 6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây) [9], [49], [54]

Giai đoạn 2: Sự hình thành thrombin

Prothrombin là α2 - globulin có trong huyết tương, do gan sản xuất, trọng lượng phân tử 68700, nồng độ trong máu bình thường là 15mg/100ml máu [36], [49] Khi phức hợp prothrombinase hình thành, nó sẽ chuyển prothrombin (yếu tố II), một zymogen không hoạt động thành thrombin (yếu tố IIh) [40], [49] Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion Ca2+ Sự hình thành thrombin từ prothrombin xảy ra trên bề mặt tiểu cầu và diễn ra rất nhanh, được tính bằng vài giây [25], [40] Thrombin là enzym trung tâm trong quá trình đông máu [40], [41] Số lượng thrombin được hình thành phải đủ lớn để đảm bảo cho quá trình đông máu nhưng lại không được gây huyết khối [17], [25], [41]

Giai đoạn 3: Sự hình thành fibrin

Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tương do gan sản xuất, trọng lượng phân tử 340000, nồng độ trong máu bình thường là 100 -700mg/100ml máu[41] Bình thường do kích thước phân tử lớn, fibrinogen rất khó vào dịch kẽ Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ [29], [32], [52] Thrombin sau khi

11

được hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi Một mạng lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yếu tố XIII (yếu tố XIII tạo liên kết cộng hóa trị giữa các sợi fibrin) [31], [40], [49] Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+ Khi mạng lưới fibrin phát triển, các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu đông Chính mạng lưới này dính vào vị trí tổn thương của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu [17], [25], [31], [40]

Hình 1.4 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu [17], [41]

1.1.2.4 Co cục máu đông và tan cục máu đông

 Sự hình thành plasmin và sự tan cục máu đông

Khi cục đông được hình thành, một lượng lớn plasminogen bị giam giữ trong cục máu đông cùng với những protein khác huyết tương Các mô tổn thương và nội mạc tổn thương giải phóng ra một chất hoạt hóa rất mạnh, gọi là chất hoạt hóa plasminogen của nó Khoảng một ngày sau khi đông máu, chất hoạt hóa này có tác dụng chuyển plasminogen thành plasmin và làm tan cục máu đông Nhiều mạch máu nhỏ bị tắc nghẽn do cục đông có thể được khai thông trở lại nhờ cơ chế này [26]

12

Plasmin tiêu fibrin và làm tiêu fibrinogen cùng một số yếu tố đông máu khác Tuy nhiên, máu chứa một yếu tố khác là α2 – antiplasmin, yếu tố này gắn với plasmin và ức chế tác dụng của plasmin [26]

1.1.3 Các biện pháp phòng và điều trị huyết khối

- Phòng huyết khối

Biện pháp đầu tiên để phòng huyết khối là làm giảm các yếu tố nguy cơ Vận động tích cực, chế độ ăn uống hợp lý, hạn chế các thuốc làm tăng huyết khối đều là các biện pháp làm giảm nguy cơ hình thành huyết khối

Ở những người có nguy cơ cao như tuổi cao, mắc bệnh tim mạch, rối loạn nhịp tim, suy tim,… cần dùng thuốc để phòng ngừa huyết khối từ khi huyết khối chưa xảy ra Các thuốc chống đông máu đường uống (như thuốc kháng Vitamin K, thuốc chống đông máu thế hệ mới), thuốc chống kết tập tiểu cầu, … đều là các thuốc dùng lâu dài để phòng ngừa huyết khối [7]

- Điều trị huyết khối

Nhờ tích nhiều điện tích âm do chứa SO42- , nên Heparin làm thay đổi hình dạng thrombin và prothrombin, giúp chúng tạo phức với antithrombin [6]

Heparin đã được sử dụng nhiều trong lâm sàng với nhiều chỉ định từ phòng ngừa huyết khối, lọc máu đến điều trị các bệnh do thuyên tắc huyết khối Khoảng 1/3 bệnh nhân nhập viện có sử dụng heparin hàng năm Heparin có tác dụng phụ như chảy máu, chảy máu các khớp, chảy máu đường tiêu hóa, dị ứng, rụng tóc… tác

13

dụng phụ nặng nhất là giảm tiểu cầu Phải ngƣng dùng heparin khi bệnh nhận có dấu hiệu giảm tiểu cầu do heparin thay thế thuốc khác [9],[38]

 Các thuốc chống đông kháng Vitamin K

Các thuốc chống đông kháng Vitamin K bao gồm dẫn chất coumarin có cơ chế là ức chế tổng hợp các yếu tố đông máu phụ thuộc Vitamin K [42]

Các thuốc chống đông nhóm này bao gồm: Dicumarol, warfarin, ethyl bicoumacetate, phenprocoumon Phenyl – indandion, fluorophenyl – indandion,

cơ chất của nhiều isomerase tạo ra ít nhất 5 prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau trong đó có Thromboxan A2 (TXA2) TXA2 đƣợc tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu để đáp ứng lại một số tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP) và nó gây ra NTTC bất hồi phục thông qua thụ thể TXA2 Aspirin ức chế COX-1 dẫn đến ức chế sự sinh tổng hợp TXA2, do đó có tác dụng ức chế NTTC gây ra bởi một số tác nhân kích thích (ADP, collagen, thrombin) Sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốt đời sống của tiểu cầu vì tiểu cầu không thể tổng hợp thêm COX-1 mới [1]

Aspirin ức chế tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 của tế bào nội mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC Tác dụng này yếu hơn tác dụng ức chế men cyclooxygenase [1]

- Ticlodipin

Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: Ticlopidin tương tác với glycoprtein IIb/IIIa receptor của fibrinogen, ức chế sự gắn fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu Ticlopidin còn làm tăng prostaglandin D2 và E2 giúp chống đông vón tiểu cầu và tăng thời gian chảy máu [9]

15

1.2 Tổng quan về cây Tam thất hoang

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Bình biên Tam

thất, Thổ Tam thất, Dã Tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng, họ ngũ gia bì (Araliaceae) [8], [15]

Đặc điểm hình thái: Cây Tam thất hoang là loại cây thân thảo, sống lâu năm, cao khoảng 0,3 – 0,7 m; đường kính thân từ 0,3 – 0,6 cm Thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất; đường kính 1,5 – 3,5 cm Phần thân mang 3 – 5 lá, mọc vòng ở đỉnh thân; Lá kép chân vịt, thường gồm 3 – 5 lá chét, mép khía răng cưa Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm Hoa mẫu 5, bầu

2 ô Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ Hạt

2, hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [8], [15]

Hình 1.6 Cây Tam thất hoang [15]

Loài Panax stipuleanatus được hai nhà khoa học người Trung Quốc

(Tao Hse Tsai và Kuo Mei Feng) công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica Sinica Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Maguan,

16

Trung Quốc (gần Việt Nam) ở độ cao 1.100-1.700m so với mặt nước biển Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông - Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [15]

Ở Việt Nam: Theo điều tra của các nhà nghiên cứu, Tam thất hoang được tìm thấy phân bố Hoàng Liên Sơn và một số vùng thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và huyện Sa Pa của tỉnh Lào Cai [15]

Đến nay phạm vi phân bố của loài này rất hạn chế, các quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ

1.2.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần hóa học của thân rễ Tam thất hoang có saponin khung olean với hàm lượng khá cao và một số saponin khung dammaran hàm lượng thấp [8]

Ở Trung Quốc vào năm 1985 các nhà nghiên cứu đã phân lập 2 saponin dẫn chất acid oleanolic là stipuleanosid R1 và R2 chiết bằng dung môi methanol từ thân

và rễ của Tam thất hoang [15][55]

Ở Đại học Toyama (Nhật Bản) vào năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS các nhà nghiên cứu đã tìm ra thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng thấp từ dịch chiết cồn của cây Tam thất hoang Trung Quốc [44]

Việt Nam và Hàn Quốc, các nhà nghiên cứu đã xác định được 15 hợp chất saponin khung oleanan vào năm 2010, có một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ của cây Tam thất hoang ở Việt Nam, 3 hợp chất polyyn, một sesquitecpen và một acid béo [34], [35]

Các hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyn 16 và polyyen 17 thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) với giá trị IC50 từ 0.13 đến 41.45 μM theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào, qua phân tích hình thái

tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis

17

Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, một số hợp chất saponin 6-11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3.1 đến 18.9 μM trên dòng tế bào HepG2 có đến khả năng kháng viêm và chống ung thư [33], [40]

Sau đây là một số hợp chất đã được phân lập từ cây Tam thất hoang:

Pseudoginsenosid RP(1) methyl ester[48], pseudoginsenosid RT(1) [48], stipuleanosid R(2) methyl ester[48], stipuleanosid R(2), [48], spinasaponin A 28-O-glucosid [48], spinasaponin A methyl ester [48], araloside A methyl ester (8) [48], 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucuronopyranosid -28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid methyl ester (9) [48], 3-O-β-D-xylopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid (10) [48], chikusetsusaponin IVa (11) [48], hemslosid Ma2 (12), [34], elatosid A (13) [34], stipuleanosid R1 methyl este (14) [34], Acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl este (15) [34], stipuleanosid R1 (16) [55], stipuleanosid R2 (17) [55], ginsenosid Rb1 (18) [44], ginsenosid Rb3 (19) [44], ginsenosid Rc (20) [44], ginsenosid Rd (21) [44]

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học

Theo y học cổ truyền (Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam), Tam thất hoang cũng được dùng làm thuốc bổ dưỡng chống mệt mỏi, xanh xao, gầy yếu cũng giống như các loài Sâm khác, có tác dụng tăng lực, kích thích tạo máu, giảm cholesterol huyết, phòng chống xơ vữa động mạch, chống lão hoá, kích thích điều hoà miễn dịch, ngăn ngừa ung thư [15], [17], [23], [27], [55].

Trong sách đỏ Việt Nam, 2007 có ghi “tất cả các bộ phận của cây Tam thất hoang đều được dùng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [17], [27]

Mới đây nhất năm 2017 đã có hai tác giả đó là: Nguyễn Thị Tuyết Trinh và

Lê Thị Tâm “Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang và sâm vũ diệp” Kết quả cho thấy các phân đoạn cao Tam thất hoang có sự giảm ngưng tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đông máu nội sinh và ngoại sinh [8], [17]

18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M

Feng) được thu hái ở Hoàng Su Phì, Hà Giang vào tháng 8-2016 (mẫu tiêu bản 020816) được giám định thực vật học bởi TS Phạm Thanh Huyền, trưởng Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu; được lưu giữ tại Khoa Tài nguyên Dược liệu

DL-Toàn bộ quy trình chiết xuất và chuẩn hóa cao giàu saponin Tam thất hoang được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang

Nghiên cứu tác dụng trên huyết khối đuôi chuột: chuột nhắt trắng chủng Swiss, khỏe mạnh từ 4 – 5 tuần tuổi, cả hai giống, cân nặng trung bình 202 g, có đuôi dài từ 6 cm trở lên, không dị tật, không mang thai hoặc đang cho bú, do học viện Quân y cung cấp

Tất cả chuột sau khi lấy từ học viện Quân y, được nuôi trong điều kiện đầy

đủ thức ăn và nước uống, duy trì chế độ sáng: tối 12:12 (7:00 – 19:00) tại phòng nuôi động vật của Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Chuột được nuôi ổn định trong 3 ngày bằng thức ăn tiêu chuẩn do viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp trước khi chính thức chia lô và tiến hành thí nghiệm

2.1.2.2 Huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh

Nghiên cứu tác dụng chống đông và chống kết tập tiểu cầu: sử dụng huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh, không mắc bệnh về máu, không đang dùng thuốc tác động trên máu

Tiêu chuẩn lựa chọn: Người có các chỉ số máu bình thường, không hút thuốc

lá, không đang dùng các thuốc tác dụng trên máu Việc lấy máu phải được thực hiện vào buổi sáng và các tình nguyện viên phải nhịn ăn 12 giờ trước khi cho máu

Tiêu chuẩn loại trừ: Không lấy máu của những người mới hiến máu dưới 30

ngày trước khi cho máu

Trước khi tham gia hiến máu thí nghiệm, các đối tượng này được giải thích

về nghiên cứu, ký chấp thuận tham gia nghiên cứu và được kiểm tra sức khỏe, được

đo các chỉ số huyết học để đảm bảo chỉ số này nằm trong giới hạn bình thường Đề cương nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội, khi đó đề tài mới được thực hiện

20

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi, hóa chất:

- Các hóa chất dùng cho xét nghiệm chống đông máu do ACL TOP700 của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ) cung cấp, bao gồm: Thromborel S, Calcium chloride Solution, Thrombin reagent, CA clean, Control Plasma N, Reaction tube

- DMSO, Sigma Aldrich

- Heparin Natri 5000UI/mL, do công ty Rox-Germany sản xuất

- Aspirin (Aspegic 100mg) - do công ty Sanofi sản xuất

- κ-carrageenan lọ 25gam, do hãng Wako japan cung cấp

- Nước cất pha tiêm 5ml, do Công ty CP dược phẩm TW1 sản xuất

- Nước muối sinh lý 500ml, do công ty dược phẩm B.Braun Hà Nội sản xuất

Dụng cụ, vật tư tiêu hao:

- Kim đầu tù cho chuột uống thuốc

- Xy lanh 1ml, do Công ty Vianhankook sản xuất

- Xy lanh 10ml, do Công ty Vianhankook sản xuất

- Ống đựng máu chứa chất chống đông và giá để ống đựng máu

- Ống falcon và giá để ống falcon

- Ống eppendorf thể tích 1,5ml và giá để ống eppendorf

- Pipet đơn thể tích 10µl – 100 µl; 20µl – 200 µl; 100µl – 1000 µl đầu

côn tương ứng và giá để pipet

- Bút dạ, giấy parafim, găng tay, khẩu trang, mũ y tế

Máy móc, thiết bị:

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Máy đo thời gian PT và APTT: Máy ACL TOP700 của ACL TOP700 của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ)

- Máy siêu âm (Power sonic 405)

- Máy đo quang phổ UV-VIS (SHIMADZU)

- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu CHRONO-LOG của Mỹ

- Máy ủ ấm điều nhiệt Water bath

21

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin rễ cây Tam thất hoang

Phương pháp thử độc tính cấp của cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang được tiến hành dựa theo hướng dẫn trong “Phương pháp xác định độc tính cấp” –

Đỗ Trung Đàm [5], hướng dẫn của Bộ Y tế [22] và hướng dẫn của OECD [53], Thực tập dược lý, Trường đại học dược Hà nội [4]

Nguyên tắc thí nghiệm:

Độc tính cấp của thuốc là độc tính xảy ra sau khi dùng cao giàu Saponin từ Tam thất hoang một lần, một số lần trong vòng 24 giờ Mục đích chính của việc xác định độc tính cấp là xác định liều chết trung bình (median lethal dose) – được định nghĩa là liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm (Viết tắt là LD50 ) Chuột được chia thành nhiều lô, dùng các mức liều khác nhau Độc tính được đánh giá theo nguyên tắc “tất hoặc không” (chết hoặc sống)

Thí nghiệm được thiết kế để xác định LD50 của cao giàu Saponin từ Tam thất hoang bằng đường uống theo mô hình cổ điển [4], [53]

Động vật, hóa chất, thiết bị:

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống cái, khoảng 4 -5 tuần tuổi, trọng lượng 20±2g Tất cả các con chuột sau khi lấy từ học viện Quân Y về, được nuôi trong điều kiện ổn định và cho đầy đủ thức ăn nước uống, chu kỳ sáng tối 12:12 (7h:00- 19h00), nhiệt độ 22◦C± 2◦C tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của Khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội Được nuôi ổn định 3 ngày trước khi làm nghiên cứu Trước khi cho chuột uống thuốc, chuột được tách thức ăn từ 17 giờ chiều hôm trước (nhịn đói qua đêm) nhưng vẫn cho uống nước đầy đủ

- Cao giàu saponin từ Tam thất hoang, DMSO, nước cất

- Cốc có mỏ, bơm tiêm 1ml, kim đầu tù để cho chuột uống thuốc

Tiến hành thí nghiệm

Sau khi thăm dò liều trên một số lượng chuột hạn chế (mỗi lô thăm dò khoảng 3 con), cho chuột uống dịch cao giàu saponin Tam thất hoang từ liều cao nhất không gây chết chuột nào đến liều thấp nhất gây chết 100% chuột

22

Khi có kết quả thăm dò liều rồi tiến hành nhưa sau: Chuột thí nghiệm được chia 9 lô, mỗi lô 8 con Đánh dấu từng con cho từng lô để tiện theo dõi Cân trọng lượng từng con chuột cho từng lô để tính thể tích dịch cao giàu saponin từ tam thất hoang cho từng con trong mỗi lô Cao giàu saponin từ tam thất hoang được pha trong trong dung môi DMSO 0,1% với liều tăng dần từ 15,0 g/kg; 17,25g/kg; 20,0g/kg; 22,5g/kg; 25,0g/kg; 27,5g/kg; 30,0 g/kg; 32,5g/kg; 35,0g/kg (các liều trên được tính theo gam cao giàu saponin) Sau khi cho chuột uống thuốc 2 giờ, cấp thức ăn và bổ sung nước uống đầy đủ trở lại

Bảng 2.1 Liều cao giàu saponin cho chuột uống thực nghiệm

Lô Liều tam thất hoang Thể tích uống /10gam thể trọng

Thông số đánh giá

- Ghi lại số chuột chết trong các khoảng thời gian nêu trên của mỗi lô

23

- Tính liều gây chết 50% số chuột được thử (LD50) dựa vào số chuột chết trong 72 giờ và các dấu hiệu ngộ độc của chuột để rút ra kết luận về độc tính cấp của Tam thất hoang

Xử lý số liệu

Ghi số liệu vào bảng kết quả:

- Tính liều LD50 cao giàu saponin Tam thất hoang, sử dụng thuật toán thống kê probit trên phần mềm SPSS để tính

2.3.2 Đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro của cao giàu saponin

Tam thất hoang

Nguyên tắc thí nghiệm

Đo thời gian đông máu trên invitro bằng nguyên lý đo quang (phương pháp

phát hiện ánh sáng tán xạ) bằng máy ACL TOP theo mô hình của Li Wang và cộng

sự, 2013 [47]

Ở huyết tương có antithrombin III (kháng thrombin III) là một globulin làm mất hiệu lực của thrombin và của yếu tố IX, X, XI, XII đã hoạt hóa Phản ứng này thường xảy ra chậm chạp Heparin tạo phức với antithrombin III Phức này thức đẩy rất mạnh phản ứng antithrombin – thrombin (và phản ứng antithrombin với các yếu

tố kể trên) Rút cuộc, những yếu tố trên mất hiệu lực, quá trình đông máu rối loạn, cuối cùng thrombin không còn khả năng chuyển fibrin thành fibrinogen nữa Chính

vì thế có thể dùng heparin làm chứng dương để chứng minh khả năng chống đông máu của cao giàu saponin của Tam thất hoang so với heparin

Nguyên lý đo thời gian prothrombin(PT): Chống đông máu bằng natri citrat

3%, máu sẽ phát động quá trình đông máu theo con đường ngoại sinh và được phục hồi với sự có mặt của thromboplastin Khảo sát thời gian đông máu khi cho thừa thromboplastin calci vào huyết tương, đánh giá ngoại sinh (PT) thông qua các yếu

tố như: II, V, VII, X [2], [3]

Nguyên lý đo thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT): Để đánh giá con

đường đông máu nội sinh, huyết tương trong citrat ủ với kaolin và cephalin sẽ làm

ảnh hưởng đến thời gian phục hồi calci của huyết tương [2], [3]

24

Mẫu huyết tương, hóa chất, thiết bị (như mục 2.2)

Tiến hành thí nghiệm

- Lấy 10 mL máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh, cho vào

ống chống đông có chứa natri citrate 3,8% (tỉ lệ 1:9)

- Ly tâm với tốc độ 3000 vòng trong 10 phút để lấy huyết tương

- Thu huyết tương vào ống falcon vô khuẩn

- Sử dụng micropipet lấy 450µl huyết tương cho vào mỗi ống nghiệm sạch, vô khuẩn

- Lần lượt thêm vào mỗi ống 50µl hóa chất gồm: DMSO 0,1%; heparin 0,2UI/mL;

dịch cao giàu saponin từ Tam thất hoang với các nồng độ 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,8mg/ml

- Ủ trong 3 phút ở 37◦C bằng máy ủ ấm

+ Ống 1: Dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm)

+ Ống 2: Dung dịch heparin 0,2UI/mL (chứng dương)

+ Ống 3: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,1mg/ml

+ Ống 4: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,2mg/ml

+ Ống 5: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,4mg/ml

+ Ống 6: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,8mg/ml

- Tiến hành đo thời gian PT, APTT trên máy ACL TOP Lặp lại thí nghiệm trên 7

lần so với mỗi loại dung dịch

Thông số đánh giá:

Ghi lại kết quả (đơn vị tính là PTs) PT tính theo giây, thời gian Quick bình thường khi sử dụng thromboplastin có hoạt tính đầy đủ là 11 đến 13 giây PT tính theo % PT Việc tính tỷ lê % dựa vào biểu đồ được lập từ nhiều độ pha loãng khác nhau của huyết tương người bình thường Giá trị bình thường nằm trong khoản 70 – 100%, giảm khi dưới 70%

25

Thời gian prothrombin(PT) được xác định bằng khoảng thời gian hóa chất

PT vào huyết tương tới khi hình thành cục máu đông và bằng máy đo đông máu ACL TOP 700 của Mỹ

Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT) được xác định bằng

khoảng thời gian từ khi cho CaCl2 vào hỗn hợp huyết tương và hóa chất APTT tới khi hình thành cục máu đông bằng máy đo đông máu ACL TOP 700 của Mỹ

Xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ và xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0 Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình lô, SE: Sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng test one-way ANOVA (đối với dữ liệu phân

bố chuẩn), dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnet T3 để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

2.3.3 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu trên invitro của cao giàu

saponin Tam thất hoang

Nguyên tắc thí nghiệm

Đo ngưng tập tiểu cầu được sử dụng phương pháp đo quang Phương pháp này được dùng thiết bị gọi là quang phổ kế Quang phổ kế phát ra một chùm tia sáng đỏ chiếu qua ống chứa huyết tương giầu tiểu cầu và ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu Dùng mẫu máu của chính huyết tương này làm điểm chuẩn cho ánh sáng truyền qua hoàn toàn (ánh sáng truyền qua là 100%) Khi các chất kích tập tiểu cầu như ADP …vào huyết tương giàu tiểu cầu sẽ làm ngưng tập tiểu cầu với nhau thành đám và độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên

Mẫu phẩm, hóa chất, dung môi và thiết bị (như mục 2.2)

Tiến hành thí nghiệm

- Lấy máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh, chống đông bằng

natri citrat 3,8% (tỷ lệ 1:9)

26

- Ly tâm máu toàn phần 500 vòng / 10 phút: Lấy phần nổi là huyết tương giàu tiểu

cầu (PRP) cho vào ống falcon vô khuẩn và giữ ở nhiệt độ phòng

- Phần còn lại ly tâm 3000 vòng/ 10 phút: Lấy phần nổi là huyết tương nghèo tiểu

cầu (PPP)

- Dùng micro pipet lấy 450 µl PRP cho vào ống cuvet thuỷ tinh có chứa khuấy từ

- Thêm lần lượt vào mỗi cuvet 50µl hóa chất gồm: DMSO 0,1%; aspirin 1mg/mL;

dung dịch cao giàu saponin từ Tam thất hoang với các nồng độ 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,4mg /ml; 0,8mg/ml; 1,16mg/ml

+ Ống 1: Dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm)

+ Ống 2: Dung dịch aspirin 1mg/mL (chứng dương)

+ Ống 3: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,1mg/ml + Ống 4: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,2mg/ml + Ống 5: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,4mg/ml + Ống 6: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 0,8mg/ml + Ống 7: Dung dịch cao giàu saponin tam thất hoang nồng độ 1,6mg/ml

- Ủ trong 3 phút ở 37◦C, sau đó thêm 5µl chất kích thích ngưng tập tiểu cầu

Xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ và xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0 So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng test one-way ANOVA (đối với dữ liệu phân bố chuẩn), dùng hậu kiểm Dunnet T3 để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với

lô chứng Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05