Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây tỏa dương (balanophora laxiflora hemsl , họ dó đất balanophoraceae) trên thực nghiệm

Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm in vivo các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng của tỏa dương.. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp của các phân đoạn và chất phân lập tiềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG

(Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ

ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN

THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG

(Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ

ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN

THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Thùy Dương

2 PGS.TS Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

tới TS Nguyễn Thùy Dương, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà

Nội, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Hà và NCS Nguyễn Thị Hồng Anh, khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu đã chỉ bảo và giúp đỡ

tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 22 tháng 3 năm 2018

Nguyễn Thị Thắm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Thành phần hóa học 2

1.1.4 Công dụng 7

1.1.5 Tác dụng dược lý 8

1.2 Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm 11

1.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vitro 11

1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo 13

1.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 20

2.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.1 Động vật nghiên cứu 19

2.1.2 Dược liệu nghiên cứu 19

2.1.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19

2.1.4 Hóa chất thuốc thử 20

2.1.5 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 20

2.2 Thiết kế nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do, chống oxy hóa 22

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và chất phân lập 23

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo 24

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do 29

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro của các phân đoạn tỏa

dương 29

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid anion (O2-•) in vitro của các phân đoạn tỏa dương 30

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và chất phân lập 31

3.2.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn……… ……31

3.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các chất phân lập……… 34

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm in vivo các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng của tỏa dương 36

3.3.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp của các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng của tỏa dương trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 36

3.3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm mạn của các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng trên mô hình gây u hạt bằng bông 38

Chương 4 BÀN LUẬN 41

4.1 Về tác dụng quét gốc tự do của các phân đoạn tỏa dương 41

4.2 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và chất phân lập 42

4.2.1 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn 42

4.2.2 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các chất phân lập 43

4.3 Về tác dụng chống viêm in vivo của các phân đoạn và chất phân lập 44

4.3.1 Về tác dụng chống viêm cấp in vivo của các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng trên mô hình gây phù bằng carrageenan 45

4.3.2 Về tác dụng chống viêm mạn in vivo của các phân đoạn và chất phân lập tiềm năng trên mô hình gây u hạt 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT Alanine aminotransferase

AST Aspartate transaminase

CTCT Công thức cấu tạo

DCGGP 1,3-di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-glucopyranose

DMSO Dimethyl sulfoxid

DPPH 1,1-Dimethyl-2-picryl hydrazyl

ED50 Effective dose 50% (liều có tác dụng 50%)

EDTA Ethylene Diamine Triacetic Acid

EtOAc Ethyl acetat

HPLC High Performance Liquid Chromatograph (sắc ký hiệu năng cao)

IC50 Inhibitory concentration 50% (nồng độ ức chế 50%)

iNOS NO synthase cảm ứng

IR InfraRed (Tia hồng ngoại)

NF- kB Nuclear factor –kappa B (Yếu tố sao chép nhân)

NMR NMR-Nuclear Magnetic Resonance:

phổ cộng hưởng từ hạt nhân NTB Nitro blue tetrazolium

ROS Reactive oxygen species (Các dạng oxy phản ứng)

SE Standard Error (sai số chuẩn)

Danh mục các bảng

1 Bảng 1.1 CTCT và tên khoa học của 19 hợp chất đã phân lập 3

2 Bảng 1.2 Tóm tắt tác dụng dược lý của các loài trong chi

3 Bảng 2.1 Hàm ẩm và hiệu suất của cao toàn phần và các phân

4 Bảng 3.1 Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các

5 Bảng 3.2 Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD của các phân

6 Bảng 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro

7 Bảng 3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro

8 Bảng 3.5

Ảnh hưởng của các chất phân lập và các phân đoạn tiềm năng đến mức độ phù của chân chuột (%) theo thời gian

38

9 Bảng 3.6

Ảnh hưởng của các chất phân lập và các phân đoạn tiềm năng đến khối lượng u hạt trên chuột cống trắng

40

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

1 Hình 2.1 Hình ảnh cây tỏa dương (Balanophora laxiflora

3 Hình 2.3 Qui trình thí nghiệm đánh gía khả năng ức chế

4 Hình 2.4

Qui trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

26

5 Hình 2.5 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống

viêm mạn bằng mô hình gây u hạt 28

6 Hình 3.1 Khả năng ức chế enzym COX- 2 in vitro của các

7 Hình 3.2 Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc 34

8 Hình 3.3

Công thức cấu tạo của các chất phân lập từ phân

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., họ Dó đất Balanophoraceae) hay

còn gọi là ngọc cẩu, củ gió đất, củ ngọt núi, hoa đất, cu chó, cây không lá, xà cô là một dược liệu quý được phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào và Việt Nam [5], [7] Trong dân gian từ lâu đã được sử dụng để điều trị các chứng nhức mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung, trĩ, yếu sinh lý nam, liệt dương, di tinh, mộng tinh và làm thuốc bổ cho người già, người mới ốm dậy, phụ

nữ sau khi sinh [5], [7], [11]

Trên thế giới đã có những nghiên cứu cho thấy một số cây trong họ Dó đất Balanophoraceae có tác dụng chống viêm [20], [54], [66] Năm 2011, tác giả Wen F.C đã chỉ ra tác dụng chống viêm của các cao chiết và các chất phân lập từ các

cao chiết loài B laxiflora [66] Ngoài tác dụng chống viêm, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy chi Balanophora có nhiều hợp chất có tác dụng chống oxy hóa

trong đó các hợp chất tannin có tác dụng rất tốt [23] Năm 2009, tác giả She G.M

và các cộng sự đã chỉ ra tác dụng dọn gốc tự do DPPH của cao chiết và các hợp

chất phân lập từ các cao chiết B laxiflora [57] Những năm sau đó, tác giả Ho S.T

đã chỉ ra tác dụng dọn gốc tự do DPPH, superoxid anion của các cao chiết hoa B laxiflora đồng thời đánh giá được tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid của hoa đực B laxiflora tốt hơn hoa cái [31] Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nghiên

cứu dược lý đánh giá tác dụng chống viêm của cây tỏa dương và các nghiên cứu hóa thực vật dựa theo định hướng tác dụng sinh học của cây tỏa dương còn hạn chế Do vậy, để cung cấp bằng chứng khoa học đối với dược liệu này Chúng tôi

thưc hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây tỏa dương

(Balanophora laxiflora Hemsl., Họ Dó đất Balanophoraceae) trên thực

nghiệm” với 2 mục tiêu như sau:

1 Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do, chống oxy hóa, chống viêm in vitro của

các phân đoạn và các chất phân lập từ cao chiết tỏa dương

2 Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của phân đoạn tiềm năng và chất

phân lập tiềm năng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu

1.1.1 Tên khoa học

Tỏa dương còn có tên khác là Nấm đất (Dó đất, Ngọc cẩu, Cu chó, Dó đất hoa

thưa) Tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl., thuộc họ Dó đất

1 vòi nhụy Hoa nở vào tháng 10 – 12 Cây mọc rải rác trong rừng cây lá rộng, nơi

ẩm, ở độ cao 600-2000 m, thường kí sinh trên rễ cây gỗ và cây bụi như đỗ quyên,

sồi, thông Tái sinh bằng đẻ nhánh [5], [7], [11] Trên thế giới, tỏa dương phân bố ở

Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào Tại Việt Nam, tỏa dương có ở các tỉnh Cao Bằng, Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Ngọc Guga, Ngọc Pan), Lào Cai [4], [5]

1.1.3 Thành phần hóa học

1.1.3.1 Những nghiên cứu nước ngoài

Năm 2009, tác giả She G.M và cộng sự đã công bố, trong cao chiết tỏa dương đã phân lập 19 hợp chất gồm: các balaxiflorin A và B, 3 hợp chất phenylpropanoid, 4 hợp chất lignan, 9 hợp chất tannin thủy phân, và acid gallic

được thể hiện dưới bảng 1.1 [57]

Bảng 1.1 CTCT và tên khoa học của 19 hợp chất đã phân lập [57] STT Tên hoạt chất Công thức hóa học

(1) (7'-S,8R,

8'-R)-9-O-

Galloyllariciresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid

R= Gal (2) 6-O-(E)-Caffeoyl

coniferin

2.R=Caf 3 R=H (3) Coniferin

(4)

Lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid

R=H (5) Pinoresinol-O-β-D-

glucopyranosid

(6) Isolariciresinol

6.R=H 7 R=Glc (7) Isolariciresinol-4-O-β-

Năm 2012, tác giả Ho S.T và cộng sự đã phân lập 4 hợp chất từ phân đoạn

EtOAc của tỏa dương gồm [30]:

1-O-(E)-Caffeoyl-β-D-glucopyranosid (20)

1-O-(E)-p-Coumaroyl-β-D-glucopyranosid (21)

1,3-di-O-Galloyl-4,6-(S)-hexanhydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranosid (22) 1-O-(E)-Caffeoyl-4,6-(S)-hexanhydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranosid (23)

1.1.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Năm 2014, tác giả Cầm Thị Ính và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất

pinoresinol (24), daucosterol (25), từ loài ngọc cẩu (B laxiflora) [9]

Năm 2015, tác giả Đỗ Thị Hà và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất

triterpenoids từ cao chiết ethanol cây tỏa dương bao gồm: lupeol (26), β- amyrin (27), β-sitosterol (28), (21β)-22-hydroxyhopan-3-one (29), daucosterol (25) và (21α)-22-hydroxyhopan-3-one (30) Trong đó hợp chất (26), (29) (30) lần đầu tiên

được công bố từ loài Balanophora laxiflora [27]

Năm 2017, tác giả Nguyễn Quyết Tiến và cộng sự đã phân lập được 6 hợp

chất bằng sắc ký cột từ các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và dichlomethan của cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) Kết hợp các phương pháp phổ hồng

ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, và so sánh dữ liệu phổ của chúng với tài liệu đã được công bố, đã xác định được cấu trúc

hóa học của chúng là 1-hexacosanoylglycerol (31), daucosterol (25), methyl gallat (32), 4-hydroxyl-3-methoxycinnamaldehyd (33), methyl-4-hydroxy cinnamat (34)

và methyl caffeat (35) [15]

Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã phân lập được một chalcon mới với 8 hợp chất khác từ cao chiết ethyl acetat của cây tỏa dương:

Balanochalcon (36), methyl caffeat (35), β-hydroxydihydrochalcon (37), methyl gallat (32), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo (38), xanthen-1,2-dicarboxylat (39)

acid p-coumaric (40), quercetin (41), scopoletin (42) và pinoresinol (43) [53]

Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất phenolic từ cặn ethyl acetat của cây tỏa dương Bốn hợp chất đã được phân lập

bao gồm epoxyconiferyl alcohol (44), salicifoliol (45), furaldehyd (46) và ethyl caffeat (47) Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên từ loài này Hợp chất (44), (45) và (46) được công bố lần đầu tiên từ

5-(hydroxymethyl)-2-chi Balanophora [1] Sau đó, trong một công trình công bố cùng năm 2017, tác giả

Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự tiếp tục phân lập được sáu hợp chất từ phân

đoạn nước của cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) bao gồm:

isolariciresinol 4-O-β-D-glucopyranosid (48),

lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid (49), secoisolariciresinol-9′-O-β-D-glucopyranosid (50),

secoisolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid (51),

1-O-E-caffeoyl-β-D-glucopyranose (52) và coniferin (53) Trong đó, các hợp chất (48), (49),

(50) và (51) lần đầu tiên được công bố phân lập từ loài B laxiflora [2]

1.1.4 Công dụng

Ở Lào, người ta dùng củ để chế một loại nhựa dính dùng bẫy chim Cây cũng được dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe, kích thích ăn ngon miệng, chữa đau bụng, chữa nhức mỏi chân tay, nhất là dùng cho phụ nữ sau khi đẻ Ở Vân Nam (Trung Quốc), toàn cây được dùng trị hư lao xuất huyết, đau lưng, trĩ, di tinh, mông tinh, yếu sinh lý nam Dạng dùng thông thường là thuốc rượu Cây hái về rửa sạch, thái mỏng sao qua, rồi ngâm rượu tỷ lệ 1:5, trong một tháng hoặc càng lâu càng tốt [5], [7], [10], [11] Một số bài thuốc sử dụng cây tỏa dương chữa bệnh trong dân gian như [5], [10]:

+ Bài thuốc giúp phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh: Tỏa dương 15 - 20 g, ích mẫu thảo khô 30 g

+ Bài thuốc chữa nam sinh lý yếu: Tỏa dương 100g, rễ đinh lăng 100g, ba kích

80g, dâm dương hoắc (sao với mỡ dê) 50g, đương quy 50g, hà thủ ô đỏ 50g, câu kỷ tử

50g, thục địa 50g, bạch truật 50g, trần bì 30g

+ Bài thuốc chữa liệt dương: Tỏa dương 12g, thục địa 15g, sơn thù 15g, sơn dược

15g, phục linh 12g, câu kỷ tử 15g, nhục thung dung 12g, dâm dương hoắc 30g, ba kích 12g, bạch nhân sâm 12g, lộc nhung 6g, táo nhân (sao) 12g, thỏ ty tử 12g, thiên môn đông 9g, cam thảo 9g

+ Bài thuốc bổ thận tráng dương: Tỏa dương 15 g, nhân sâm 12 g, hoàng kỳ

16 g, đỗ trọng 16 g, nhục thung dung 8 g, thỏ ty tử 12 g, xa sàng tử 12 g, phúc bồn tử

12 g, đương quy 12 g, bạch truật 12 g, thục địa 16 g, ba kích 12 g, dâm dương hoắc

12 g, lộc nhung 12 g, câu kỷ tử 12 g, đại táo 5 quả, long nhãn 10 g, cam thảo 6 g,

xuyên khung 8 g, hà thủ ô đỏ 12 g

1.1.5 Tác dụng dược lý

 Chống viêm in vitro

Năm 2011, tác giả Chiou W.F và cộng sự đã công bố kết quả thử tác dụng

chống viêm của cao chiết cây tỏa dương Kết quả cho thấy các phân đoạn n-hexan,

EtOAc, BuOH đều thể hiện tác dụng ức chế hình thành NO với giá trị IC50 lần lượt

là 28; 85; 2,44 và 1,56 μg/mL Từ các phân đoạn này phân lập được 18 chất tinh khiết trong đó có 2 hợp chất là isolariciresinol và ethyl caffeat trong cây tỏa dương

có tác dụng ức chế sự hình thành NO với giá trị IC50 lần lượt là 0,81 và 7,29 μM Đặc biệt isolariciresinol ức chế sự hình thành của NO và cả TNF-α với giá trị IC50

lần lượt là 17,8 và 123,8 μM Điều này có thể cho thấy isolariciresinol có thể có ứng dụng đối với các bệnh liên quan tới viêm [66]

 Tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do:

Năm 2009, tác giả She G.M và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học

và hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được từ loài B laxiflora

thông qua thí nghiệm đánh giá tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy,

19 chất phân lập được đều có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH, trong đó nhóm các hợp chất tanin có hoạt tính cao hơn hẳn các hợp chất khác Trong cùng một nhóm hợp chất acid phenolic hợp chất càng nhiều nhóm hydroxyl (OH) thì hoạt tính càng mạnh [57]

Năm 2011, Ho S.T và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các

phân đoạn EtOAc, butanol và nước loài B.laxiflora Thí nghiệm đã chứng minh

phân đoạn EtOAc ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 µg/ml của hoa đực có hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH và gốc tự do superoxid tốt hơn so với hoa cái với giá trị

IC50 của hoa đực trên 2 thử nghiệm này lần lượt tương ứng là 6,0 và 5,4 µg/ml trong khi giá trị IC50 của hoa cái trên 2 thử nghiệm này lần lượt tương ứng là 6,4 và 17,0 µg/ml [30], [31]

Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và các cộng sự đã phân lập được 8 chất

và thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đó qua thử nghiệm đánh giá

tác dụng dọn gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy, 2 hợp chất (36) và (38) có hoạt

tính chống oxy hoá [53]

 Tác dụng hạ acid uric máu và ức chế xanthin oxidase

Năm 2012, tác giả Ho.S.T và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh của cao chiết EtOAc tỏa dương và các chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn này trên mô hình gây tăng acid uric bằng kali oxonat Kết quả cho thấy phân đoạn

EtOAc và các chất phân lập gồm (22) và (23) có tác dụng giảm acid uric huyết

thanh Đánh giá khả năng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn

và các chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn tiềm năng của tỏa dương cho thấy giá trị IC50 của cao toàn phần và phân đoạn EtOAc tương ứng là 28,2 µg/ml và 14,2 µg/ml [30]

Năm 2017, tác giả Nguyễn Thùy Dương và các cộng sự đã đánh giá tác dụng

hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin oxidase của tỏa dương trên chuột nhắt trắng dựa trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat Kết quả cho thấy cao toàn phần tỏa dương với liều 300 mg/kg/ngày, uống liên tục trong 5 ngày

có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm Ngoài ra, cao toàn phần toả dương với liều này thể hiện khả năng ức chế hoạt độ xanthin oxidase ở gan chuột nhắt trắng, gợi ý cho cơ chế tác dụng hạ acid uric của tỏa dương [8] Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh và các cộng sự đã sàng

lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn và chất phân lập từ

tỏa dương Kết quả cho thấy phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng vượt trội trong số các phân đoạn thử và khi so sánh với cao toàn phần Trong số 4 hợp chất phân lập

từ phân đoạn này, BLE1 ((21α)-22-hydroxyhopan-3-on) thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase và theo cơ chế ức chế không cạnh tranh [3]

 Tác dụng tăng cường chức năng sinh dục nam

Năm 2015, tác giả Nguyễn Thanh Hương và cộng sự nghiên cứu về hoạt tính

androgen của cao lỏng tỏa dương (B laxiflora) trên chuột cống đực non thiến và

chuột cống đực trưởng thành Kết quả cho thấy cao lỏng tỏa dương thể hiện hoạt tính androgen rõ rệt thông qua việc tăng nồng độ testosteron máu và khối lượng các

cơ quan sinh dục phụ Tác dụng androgen của cao lỏng tỏa dương phụ thuộc liều, liều thấp (0,28 g/kg) làm tăng khối lượng tinh hoàn và nồng độ testosteron trên chuột cống đực trưởng thành, nhưng không làm tăng khối lượng các cơ quan sinh dục phụ trên chuột cống đực non thiến Ở liều cao (1,4 g/kg) cao lỏng tỏa dương làm tăng cả khối lượng tinh hoàn và bao quy đầu trên chuột cống đực trưởng thành

và cả cả khối lượng túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn trong chuột cống đực non thiến [12] Khi đánh giá ảnh hưởng của cao chiết nước tỏa dương lên hành vi tình dục chuột cống đực trưởng thành, cao tỏa dương ở các mức liều 0,28 g/kg; 1,4 g/kg; 2,8 g/kg làm tăng ham muốn tình dục, tăng hiệu quả giao cấu Tác dụng này phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc, khi sử dụng với liều lặp lại sau 10 ngày hiệu quả trên các hoạt động tình dục thể hiện rõ rệt hơn khi sử dụng liều đơn sau 15 phút dùng thuốc [13]

 Tác dụng gây độc tính tế bào ung thư:

Năm 2017, Đặng Ngọc Quang và các cộng sự đã chỉ ra hợp chất (35) và (38)

cho thấy có độc tính tế bào ở mức trung bình đối với bốn dòng tế bào ung thư: KB (ung thư biểu bì ở người), MCF7 (ung thư vú ở người), SK-LU-1 (ung thư phổi người) và HepG2 (ung thư biểu mô tế bào) [9], [53]

1.2 Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm

1.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

 Phương pháp gây kết tập bạch cầu đa nhân

Khi cho các tác nhân gây viêm vào cơ thể, chúng sẽ tạo ra các chất hóa ứng động thu hút và tập trung bạch cầu tới nơi có các chất hóa ứng động Sự có mặt quá nhiều bạch cầu sẽ làm khuyếch đại phản ứng viêm gây ra những tổn thương trầm trọng cho mô và cơ thể Trong mô hình này sử dụng chất hóa ứng động là bạch cầu Formyl –L- methionyl –L-leucyl- L- phenylamin (FMLP) Hỗn dịch tế bào được ủ với thuốc thử 10 phút, sau đó trộn với chất hóa ứng động để gây kết tập bạch cầu Thông số đánh giá là sự kết tập bạch cầu của nhóm thử và chứng [26], [44]

 Phương pháp gây hóa ứng động đại thực bào

Mô hình sử dụng chất gây hóa ứng động đại thực bào và qua đó đánh giá khả năng ức chế hóa ứng động đại thực bào của thuốc Các tế bào từ dịch rỉ màng bụng được tạo ra sau khi tiêm thioglycollat 4 ngày được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ 370C và 5% CO2 Các đại thực bào bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy, các tế bào không bám sẽ

bị rửa bằng nước muối sinh lý Thông số đánh giá là số lượng đại thực bào của mẫu thử và mẫu chứng [26], [44]

 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym cyclooxygenase (COX)

Acid arachidonic sẽ chuyển thành PGH2 sau phản ứng được xúc tác bởi enzym cyclooxygenase (COX), PGH2 tạo ra được khử hóa bởi SnCl2 tạo PGF2α là chủ yếu Các prostaglandin tạo thành được gắn với kháng huyết thanh và chất đánh dấu Đo độ hấp thụ quang của phức hợp kháng huyết thanh-prostaglandin-chất đánh dấu ở bước sóng 405 nm Nếu chất càng ức chế COX, prostaglandin thu được càng ít và do đó độ hấp thụ đo được thấp Thông số đánh giá là giá trị nồng độ mà tại đó thuốc thử ức chế 50% sự tạo thành PGF2α trong hỗn hợp phản ứng so mẫu chứng [37], [49]

 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym Lypoxygenase (LOX)

Khi tiếp xúc với acid béo chưa no, LOX sẽ xúc tác oxy hóa các acid này để tạo thành chất có nhiều liên kết đôi trong phân tử Do đó, độ hấp thụ của dung dịch

ở bước sóng 234 nm sẽ tăng lên Nếu chất nào có khả năng ức chế LOX sẽ làm

giảm độ hấp thụ của mẫu khi đo quang Đo độ hấp thụ quang của sản phẩm tạo ra

sẽ xác định được khả năng ức chế LOX của mẫu cần thử Thông số đánh giá là giá trị nồng độ mà tại đó thuốc thử ức chế 50% sự tạo thành sản phẩm oxy hóa của acid linoleic trong hỗn hợp phản ứng so mẫu chứng [44], [59]

 Phương pháp tạo các eicosanoid từ tế bào tiểu cầu

Eicosanoid là tên gọi chung cho các sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic, bao gồm prostagladin, leucotrien, thromboxane Prostagladin gây tăng tính thấm thành mạch, gây phù, ban đỏ, gây đau Leucotrien có tính hóa ứng dộng bạch cầu, kích thích bám dính tế bào bạch cầu vào tế bào nội mô… Thromboxan kích thích sự kết hợp tiểu cầu Do đó ức chế sự hình thành các chất này là một cơ chế chống viêm quan trọng Dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase, acid arachidonic sẽ tạo thành PGE và thromboxan A2 Một thuốc có tác dụng ức chế enzym COX sẽ ức chế tạo thành các sản phẩm chuyển hóa đó Thông số đánh giá là

sự tạo thành Thromboxan A2 và PGE2 của mẫu thử và chứng [26], [44]

 Phương pháp tạo prostaglandin ở bạch cầu đa nhân trung tính

Phương pháp sử dụng LPS để kích thích tạo PGE2 Cách tiến hành do Herrmann và cộng sự đề xuất lần đầu (1990), sau đó Weihmann và cộng sự cải tiến năm 1994 Các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính ủ với LPS và thuốc thử trong 18 giờ Thêm chất mang là ion calci và ly tâm PGE2 tạo thành nằm trong phần dịch nổi phía trên được xác định bằng kit ELISA Thông số đánh giá là nồng độ PGE2 của mẫu thử so với chứng [26], [44]

 Phương pháp gây viêm bằng LPS trong đại thực bào RAW 264.7

Các chất chống viêm làm giảm sản xuất các enzym và chất trung gian hóa học như: NO, PGE2, COX-2, IL-1 và TNF-α Do đó, mức độ biểu hiện trên của các enzym và các chất trung gian hóa học này giảm Phương pháp được tiến hành dựa theo phương pháp phân tích Western blot Thông số đánh giá là tỷ lệ biểu hiện trên gen đích của mẫu thử so với mẫu chứng được tính theo công thức của Livak [26], [29], [32], [43], [44]

 Phương pháp gây giải phóng các cytokin từ tế bào bạch cầu

Các cytokin đại diện cho một nhóm các peptid có hoạt tính sinh học cao Chúng liên quan tới rất nhiều quá trình tế bào như phản ứng viêm, miễn dịch và nhiều đáp ứng khác Việc khóa các IL-1 và TNF-α đã giúp điều trị thành công bước đầu trên các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp, viêm ruột Mô hình gây giải phóng cytokine được dùng để phát hiện các thuốc mà tác động với LPS trong quá trình

giải phóng cytokine từ tế bào bạch cầu đơn nhân Thử nghiệm được tiến hành trong đĩa 96 giếng rất nhỏ Dùng kit Elisa để xác định nồng độ cytokin Thông số đánh giá là nồng độ cytokin của lô thử và chứng [26], [44]

1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo

Một số mô hình đánh gía tác dụng chống viêm cấp in vivo được sử dụng hiện

nay như sau:

 Mô hình gây phù bàn chân chuột

Trong số nhiều mô hình được sử dụng để sàng lọc các thuốc chống viêm, một trong những mô hình được sử dụng phổ biến nhất là dựa trên khả năng ức chế phù

ở bàn chân sau của chuột Nhiều chất gây phù đã được sử dụng như men bia, formaldehyd, dextran, albumin trứng, kaolin, aerosil, polysaccharid sulfat như carrageenan hoặc naphthoylheparamin Khi tiêm các chất này vào bàn chân chuột kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học như histamine, prostaglandin, serotonin…và kết quả gây phù Thuốc có tác dụng ức chế phù được coi là có tác dụng chống viêm [14], [18], [26], [34], [44], [51] Thông số đánh giá là mức độ phù bàn chân chuột được tính theo công thức:

 Mô hình gây phù bằng chấn thương

Khi tác động cơ học mạnh lên bàn chân chuột sẽ gây tổn thương mô và tế bào chân chuột, hoạt hóa phospholipidase A2 gây giải phóng acid arachidonic từ phospholipid màng Acid arachidonic sẽ chuyển hóa thành prostaglandin nhờ

enzym COX và gây phù Tác nhân cơ học mạnh được sử dụng là quả tạ 100g từ độ cao 50 cm rơi xuống bàn chân chuột vào ngày thứ 5 sau khi uống thuốc Thông số đánh giá là mức độ phù của bàn chân chuột các lô tại thời điểm 1, 3, 5 giờ [14], [26], [44]

 Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch

Các chất gây viêm kích thích giải phóng các chất trung gian như histamin, prostaglandin, leucotrien sẽ làm giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch Kết quả là dịch và protein huyết tương bị thoát ra gây phù Các thuốc có tác dụng ức chế tính thấm của thành mạch sẽ có tác dụng giảm phù và chống viêm Các chất thường dùng để gây tăng tính thấm thành mạch như: phenethylamin, acid acetic, oxazolon Thông số đánh giá là tỉ lệ ức chế sự thoát mạch của lô thử so với

lô chứng [26], [44]

 Mô hình gây viêm màng phổi

Trên động vật thí nghiệm bệnh viêm màng phổi có thể được gây ra bởi một số chất kích thích như histamin, bradykinin, prostaglandin, degranulator, tế bào mast, dextran, enzym, kháng nguyên, vi khuẩn, và chất kích thích không đặc hiệu như dầu thông hay carrageenan Viêm màng phổi gây ra bởi carrageenan ở chuột nhắt được coi là một loại mô hình viêm cấp tính tốt trong đó sự thoát dịch, sự di chuyển của bạch cầu và các chỉ số sinh hóa khác có liên quan tới viêm được đo dễ dàng trong dịch rỉ Chuột được tiêm carrageenan 2% vào khoang màng phổi và được uống thuốc sau 1, 24, 48 giờ sau khi gây viêm Sau gây viêm 72 giờ, hút hết dịch màng phổi vào ống nghiệm và đo thể tích dịch Thông số đánh giá là thể tích trung bình của dịch hạch của các lô thử và lô chứng Một số thông số khác có thể sử dụng như: số lượng tế bào bạch cầu trong dịch rỉ, hoạt tính của enzym trong lyzoxom,

fibronectin, PGE2 [14], [26], [44]

 Mô hình gây ban đỏ

Mô hình này sử dụng tia UV và X là tác nhân gây ban đỏ Thuốc đối chứng

là aspirin 240 mg/kg đường uống Tia UV hoặc X được chiếu lên chuột 2 phút và ban đỏ được xác định tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi chiếu tia UV hoặc X Thông

số đánh giá là diện tích ban đỏ của chuột và tỷ lệ ức chế ban đỏ của lô thử so với lô chứng [26], [44]

 Mô hình tạo túi u hạt

Mô hình tạo túi u hạt do Selye phát minh năm 1953 và được Robert và Nezamis cải tiến năm 1957 Mô hình này sử dụng dầu ba đậu là chất kích thích gây viêm cấp do tăng nhiều thể tích dịch thoát mạch Dầu ba đậu 1% được tiêm vào túi không khí ở vùng da giữa lưng Sau 48 giờ rút không khí trong túi và cho chuột uống thuốc hằng ngày Hút hết dịch vào xilanh thủy tinh vào ngày thứ 5 Thông số đánh giá là trung bình dịch thu được của các lô và tỉ lệ ức chế viêm của lô thử so với chứng [14], [26]

1.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo

Hiện nay các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo được

thực hiện dựa trên các mô hình sau:

 Mô hình gây u hạt

Khi đưa vào cơ thể tác nhân gây viêm trơ như bông, amian cơ thể phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào xung quanh dị thể và tạo thành u hạt Tổ chức này bị bao phủ bởi một lớp xơ bao gồm bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu hạt

ưa base, tế bào dạng biểu mô, nguyên bào sợi nên không đủ máu tưới đến, thuốc khó thâm nhập vào nên việc điều trị thường khó khăn và lâu dài Một thuốc có khả năng ức chế u hạt đồng nghĩa thuốc có tác dụng chống viêm mạn tính Các tác nhân gây u hạt bao gồm bông, amian, tinh dầu thông, mảnh kính, bọt biển Trong đó, tác nhân gây u hạt bằng bông hiện nay được sử dụng phổ biến nhất Thông số đánh giá

là mức độ tăng khối lượng u hạt tươi và u hạt khô của lô thử so với lô chứng [14], [26], [40, [44]

 Mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Freund

Mô hình này tiến hành theo phương pháp của Newbould B(1963) [47] Chất

bổ trợ là hỗn hợp các vi khuẩn Mycobacterium M đã chết được pha trong parafin lỏng hoặc dầu thực vật Khi tiêm nội bì dưới gan bàn chân chuột cống sẽ gây hội chứng giống viêm khớp Thông số đánh giá là tỉ lệ ức chế độ dày bàn chân chuột

trước và sau 13 ngày tiêm chất bổ trợ của lô thử so với chứng được tính theo công thức:

I%= (b-x)/(a-y)x100 Trong đó b: độ dày chân phải chuột lô thử sau khi tiêm 13 ngày, x: độ dày chân phải chuột lô thử trước khi tiêm, a: độ dày chân phải chuột lô chứng sau khi tiêm 13 ngày, y: độ dày chân phải chuột lô chứng trước khi tiêm [14], [21], [47]

 Mô hình gây viêm đa khớp bằng Mycoplasma arthritis

Mô hình được tiến hành theo phương pháp của Ward và Russel (1962) [36] khi, gây viêm đa khớp thông qua tiêm phúc mạc hỗn hợp dextran 6 % và dịch rỉ chứa mycoplasma Ở những khớp bị viêm da đỏ, nóng, sưng, phần mềm tăng thể tích, đôi khi viêm tấy Các triệu chứng này bắt đầu xuất hiện từ ngày 3-4, đạt mức tối đa về cường độ và số lượng vào ngày thứ 9 và giảm dần từ ngày thứ 12-15, mất hẳn vào ngày 20 Thông số đánh giá là các biểu hiện viêm trên chân trước và chân sau của chuột lô thử và chứng và được đánh giá qua chỉ sô viêm là tổng các chỉ số viêm khớp được theo dõi hằng ngày: điểm 0: bình thường, 1: ban đỏ nhẹ, 2: ban đỏ

và sưng, 3: sưng tấy giả [14], [44]

 Mô hình gây viêm đa khớp bằng chất sáp D phân lập từ trực khuẩn lao

Chất sáp D được phân tán trong Tween80, dầu parafin và NaCl 0,9 % và được tiêm dưới da gan bàn chân phải chuột gây viêm khớp Có 2 loại tổn thương khớp là viêm khớp và viêm đa khớp Viêm khớp xuất hiện sớm tại vị trí tiêm bao gồm các triệu chứng phù và ban đỏ xuất hiện sau 24h và tăng lên khi xuất hiện viêm đa khớp, Viêm đa khớp xuất hiện sau 10-25 ngày tiêm chất bổ trợ và đạt tối đa về cường độ sau 10-15 ngày xuất hiện tại các chân và đuôi chuột Thông số đánh giá

là mức độ phù bàn chân chuột và chỉ số viêm của 4 khớp bàn chân chuột [14], [26], [44]

1.3 Mối liên quan giữa gốc tự do với phản ứng viêm và vai trò của chất chống oxy hóa

1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc của gốc tự do

Gốc tự do có thể được định nghĩa là bất kỳ tiểu phân hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập có chứa một electron chưa ghép cặp trong obitan nguyên tử Electron độc thân này quy định đặc tính chung của gốc tự do Gốc tự do không ổn định và có khả năng phản ứng cao Nó có thể cho một electron hoặc nhận một electron từ phân tử khác, do đó nó có thể xem như một chất oxy hóa hoặc một chất khử Hai nhóm chất oxy hóa sinh học chính là nhóm oxi hoạt động (ROS) như hydroxy (-OH), hydrogen peroxid (H2O2), gốc superoxid (O2-) và oxygen phân tử (O2) và nhóm nitơ hoạt động (RNS) như NO [19]

Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh như khói thuốc lá, ô nhiễm môi trường,

sự bức xạ, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, dung môi công nghiệp, ozon… và nội sinh như hoạt động của ty thể, hoạt động xanthin oxidase, hoạt động của peroxisom, quá trình viêm, quá trình thực bào, con đường arachidonat, tập thể dục quá sức, thiếu máu cục bộ hoặc chấn thương tái tưới máu

1.3.2 Mối liên quan giữa gốc tự do với phản ứng viêm và vai trò của chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một phân tử ổn định có khả năng cho hoặc nhận của gốc tự do một electron để trung hòa gốc tự do này, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó Những chất chống oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy

tế bào chủ yếu là thông qua khả năng dọn gốc tự do của chúng [19] Những chất chống oxy hóa trọng lượng phân tử thấp có thể tương tác một cách an toàn với các gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng trước khi các phân tử quan trọng bị phá hủy Các chất chống oxy hóa này được sản xuất trong quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể, ví dụ như: glutathion, ubiquinol, và acid uric

Một số loại tổn thương viêm đã được xác định là do các chất trung gian của phản ứng oxy hóa Các gốc tự do và các chất oxy hóa có thể tác động trực tiếp qua quá trình oxy hoá các thành phần tế bào thiết yếu cũng như làm tổn thương các tế

bào gián tiếp bằng cách thay đổi sự cân bằng protease hoặc antiprotease thường tồn tại trong khoang kẽ của mô Hoạt tính của các chất oxy hóa cũng có thể bắt đầu và khuếch đại viêm thông qua việc tăng cường các gen khác nhau liên quan đến đáp ứng viêm, ví dụ các cytokin gây viêm bởi sự kích hoạt một số yếu tố phiên mã, chẳng hạn như yếu tố sao chép hạt nhân kB (NF-kB) NF-kB là một yếu tố phiên

mã phổ biến và điều hòa nhiều yếu tố của nhiều gen liên quan đến đáp ứng miễn dịch và viêm Các chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin C và E có tác dụng chống oxy hóa và nhiễm khuẩn do có tác dụng dọn gốc tự do và khả năng ức chế sự kích hoạt NF-kB Vì vậy, tác dụng chống oxy hóa giúp làm giảm thiểu tổn thương tế bào và rối loạn chức năng trong một số hội chứng viêm [19]

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Động vật nghiên cứu

Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, cân nặng 140 ± 10 g, khỏe mạnh

do Học viện Quân y cung cấp Động vật được nuôi ổn định điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn đạt tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.2 Dược liệu nghiên cứu

Tỏa dương được thu hái tự nhiên ở Sa Pa vào tháng 11/2015 được PGS.TS

Trần Thế Bách và TS Nguyễn Thế Cường định danh tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl Mẫu được rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến khối lượng không đổi và

được bảo quản trong tủ mát Mẫu được lưu giữ tại Viện sinh thái tài nguyên sinh vật và Viện Dược liệu

Hình 2.1 Hình ảnh cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.)

A1 Cây đực mang cụm hoa; B1 Cây cái mang cụm hoa

2.1.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

 Chiết cao toàn phần: 3kg dược liệu khô (hàm ẩm 7,02%) được chia làm 3 mẻ,

mỗi mẻ được chiết hồi lưu 3 lần, mỗi lần với 3 lít ethanol 80 %, gộp cao chiết mỗi lần, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, sau đó cô cách thủy đến cắn thu được 895,8 g cao ethanol tỏa dương

 Chiết các phân đoạn: Hòa tan cao ethanol (806,2 g) trong 1 lít nước, sau đó siêu

âm cho phân tán hoàn toàn, rồi chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, EtOAc

theo tỉ lệ 1:1 (chiết mỗi phân đoạn 3 lần), thu cao chiết các phân đoạn, cất thu hồi

dung môi thu được các phân đoạn tương ứng n-hexan (59,6 g), EtOAc (124,1 g) và

nước (500,0 g) Kết quả chiết xuất các phân đoạn được trình bày như dưới bảng 2.1

Bảng 2.1 Hàm ẩm và hiệu suất của cao toàn phần và các phân đoạn của tỏa dương

2.1.4 Hóa chất, thuốc thử

- Chất đối chiếu: Quercein, indomethacin, prednisolon đạt tiêu chuẩn phân tích

(Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương- Bộ Y tế)

- Carrageenan (Sigma Aldrich)

- DPPH (Sigma Aldrich)

- Hóa chất pha mẫu: DMSO, methanol (Merck), Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, HCl, NaOH (Sigma Aldrich)

- Bộ hóa chất thử nghiệm khả năng ức chế COX-2:

+ Chất gây viêm: lipopolysaccharid (LPS), kháng sinh penicillin, streptomycin (100 µg/ml), NaCl, Tris, NP40 và NO (Sigma St Louis, MO)

+ Tế bào RAW264.7 (ATCC, Rockville, MD)

+ COX-2 (Sigma St.Louis, MO)

+ Quantifast SYBR Xanh RT-PCR 204.156 (Qiagen)

2.1.5 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Máy đo pH (EUTECH)

- Máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)

- Máy li tâm (HERMLE Z300)

- Máy siêu âm (Power sonic 405)

- Máy cất nước 2 lần (Halminton)

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek) và máy ủ lắc khay (Awareness)

- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3596 (Corning)

- Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co.)

- StepOnePlus qPCR cycler, Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)

- Thiết bị khuấy từ (Heidolph)

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Micropipet một đầu kênh và đa kênh với các loại thể tích: 2-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, 1000-5000 µl (Eppendorf)

- Đầu côn, microtube các loại

2.2 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 06 nội dung chính để giải quyết hai mục tiêu Thiết kế sơ đồ nghiên cứu được trình bày ở hình 2.2

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do, chống oxy hóa

2.3.1.1 Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH picrylhydrazyl) của các phân đoạn tỏa dương

(1,1-Diphenyl-2-Bố trí thí nghiệm

Mẫu thử là cao toàn phần, phân đoạn EtOAc, phân đoạn n-hexan, phân đoạn

nước được hòa tan trong DMSO sau đó được pha loãng bằng methanol để thu được dãy nồng độ Quercetin được sử dụng làm chất đối chứng

Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH được tiến hành trên đĩa 96 giếng theo phương pháp đã được mô tả trước đây [57], [70] Trên mỗi đĩa 96 giếng (Costar 3596 - Corning, Mỹ) gồm có các giếng thử và giếng chứng Lần lượt thêm vào các giếng 20 µl dung dịch thử (dung dịch đối chiếu quercetin hoặc methanol đối với mẫu trắng) và 180 µl dung dịch DPPH (100 µM trong methanol) Sau khi lắc đều, đĩa được giữ trong bóng tối 30 phút Sau đó, đo độ hấp thụ của các giếng ở bước sóng 517 nm [26]

Thông số đánh giá

 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:

Trong đó, ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng; ∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử

 Tác dụng dọn gốc DPPH của mẫu nghiên cứu được đánh giá theo trị số IC50 là giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) mà tại đó thuốc thử ức chế 50% sự có mặt của DPPH dạng gốc tự do trong hỗn hợp phản ứng so mẫu chứng

2.3.1.2 Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do superoxid anion O 2 -• của các phân đoạn tỏa dương

Bố trí thí nghiệm:

Mẫu thử là cao toàn phần, phân đoạn EtOAc, phân đoạn n-hexan, phân đoạn

nước được hòa tan trong DMSO sau đó được pha loãng bằng dung dịch đệm

carbonat (50 nM, pH=10,2) để thu được dãy nồng độ Quercetin được sử dụng làm chất đối chứng với dãy nồng độ cuối cùng mang đo là 10; 3; 2; 1; 0,5; 0,25 µg/ml Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD của mẫu thử theo quy trình được mô tả bởi Beauchamp C và cộng sự, với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm [17], [26] Phản ứng được thực hiện trên đĩa 96 giếng Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm:

+ 40 µl đệm carbonat pH 10,2 (50 mM) có chứa EDTA 0,1 mM;

+ 20 µl mẫu thử (hoặc chất đối chiếu quercetin) của các nồng độ khác nhau; + 100 µl dung dịch xanthin 200 µM (pha trong đệm carbonat);

+ 20 µl dung dịch NBT 100 µM (pha trong đệm carbonat);

+ 20 µl enzym xanthin oxidase nồng độ 0,06 U/ml

Theo dõi động học của phản ứng bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 560 nm [26]

Thông số đánh giá

 Tỷ lệ ức chế gốc tự do SOD của mẫu thử tại một nồng độ được tính theo công thức:

% ức chế SOD = (ΔODtrắng/phút – ΔODthử/phút) x 100/ ΔODtrắng/phút

 Tác dụng dọn gốc superoxid anion của mẫu thử được đánh giá theo trị số IC50 là giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) mà tại đó thuốc thử ức chế 50% sự tạo thành sản phẩm khử của NTB trong hỗn hợp phản ứng so mẫu chứng

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và chất phân lập

Bố trí thí nghiệm

Mẫu thử là cao toàn phần, phân đoạn n-hexan, EtOAc, nước và các chất phân lập

B1, B2, B3, B4 Chất gây viêm là LPS Phương pháp thử được tiến hành theo phương pháp Real time - PCR (phản ứng khuếch đại gen) được biểu diễn theo hình 2.3 như sau [20], [31], [32], [39], [48], [50]:

Hình 2.3 Qui trình thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzym COX-2 Phương pháp được thực hiện tại Cancer Infection group, College of Medicine, Lund University, Sweden.

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Bố trí thí nghiệm:

Sử dụng mô hình gây phù bằng carrageenan trên chuột cống trắng theo Winter [68] Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô: lô chứng uống nước cất, lô chứng dương uống indomethacin, lô thử uống cao toàn phần, phân