Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LIÊN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LIÊN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Nguyên Hà

PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị

kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi

Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần

Nguyên Hà và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS Trần Cao Sơn đã

cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Cao Công Khánh cùng các anh chị, các

bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ

gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực

phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện

luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy

và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi những ngày qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018

Học viên

Lê Thị Liên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng 4

1.1.3 Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L 4

1.1.4 Tác dụng sinh học 5

1.2 Tổng quan về crinamidin 5

1.3 Một số nghiên cứu xác định crinamidin 7

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2.1 Chất chuẩn 15

2.2.2 Hóa chất, dung môi 16

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK 17

2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS 19

2.4 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK 21

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 21

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 22

3.1.1 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS 22

3.1.2 Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng

crinamidin bằng GC-MS/MS 29

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 39

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 39

3.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 40

3.2.3 Khoảng tuyến tính 44

3.2.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 45

3.2.5 Độ lặp lại 46

3.2.6 Độ thu hồi 48

3.3 So sánh phương pháp xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV 52

3.3.2 So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai phương pháp 54

3.3.3 So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai phương pháp 55

3.4 Kết quả xác định hàm lượng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK 57

PHẦN 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về phương pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC 61

4.2 Về xác định hàm lượng crinamidin bằng GC-MS/MS 61

4.3 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng crinamidin trên mẫu thực 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

Kết luận 64

Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh)

(Association of Official Analytical Communities)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin 6

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét 7

Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá 23

Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ và ion con của cafein sau khi bắn phá 23

Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS 28

Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 29

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu 30

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu 33

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 35

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 37

Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu 40

Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 43

Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính 44

Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin 45

Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng 46

Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc 47

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng 47

Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng 49

Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc 50

Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng 51

Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng 52

Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin 54

Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng 56

Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK 58 Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc 59

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 3

Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin 6

Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS) 18

Hình 3.1: Phổ khối của crinamidin sau khi bắn phá ion 23

Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion 23

Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein 24

Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH 25

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN 25

Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng 26

Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) 27 Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl 3 , chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**) 27

Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu 31

Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC 32

Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu 34

Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu 36

Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết 38

Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 39

Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl 3 41

Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein 41

Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein 42

Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 42

Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL 43 Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein 44

Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL 45

Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền viên nang cứng 48

Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc 48

Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền cao lỏng 48

Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng 49

Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin 49

Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin 50

Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin 50

Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC) 55

Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS) 55

Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) 57

Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC-MS/MS) 57

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức tạp Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống con người Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc

và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên

Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra, trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định

hướng quan trọng trong thời gian tới [6], [15] Trinh nữ hoàng cung (Crinum

latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết

đến với tác dụng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt [10] Lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin, lycorin, Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình, đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin Chế phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online Mỗi chế phẩm lại có một công thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau Trong khi tiêu chuẩn cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố trên nhãn Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện đang

là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và dư

luận thời gian qua Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC là vô cùng quan trọng và cấp thiết

Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm

tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], mà chưa đưa ra quy định đối với các chế phẩm chứa thành phần TNHC Để xác định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu được lựa chọn Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp HPLC GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC

Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài

nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ

sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc thảo dược và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ

2 Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc thảo dược và TPBVSK

3

Phần 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa

học là Crinum latifolium L., thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [7], [10]

TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 – 15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra trồng riêng dễ dàng [10], [14], [39]

Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng

TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Cây TNHC hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc Ở Việt Nam, cây mọc hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam, sau được trồng ở các tỉnh phía Bắc [7], [18]

TNHC được xếp vào nhóm Thanh nhiệt giải độc [5] Bộ phận sử dụng là lá

(Folium Crinii latifolii) dùng tươi hay phơi hoặc thái nhỏ sao vàng dùng dần [10],

[13], [18]

1.1.3 Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L

Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần

hóa học của cây Crinum latifolium L như sau:

+ Crinum latifolium L Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β-

2-Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin, Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-1-0-β-glucosid, Pratorimin, Pratorinin, Pratosin, Pseudolycorin-1-0-β-D-glucosid [27]

+ Crinum latifolium L Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin,

Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin, Demethylcrinamin), Hipeastrin, Latifin (S), Powellin, Undulatin [35]

+ Crinum latifolium L Việt Nam: 9-Octadecenamid,

Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin, Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin,

1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranosid [8], [14], [39]

Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin,

5

crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3 alkaloid đơn chất [8]

Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L

+ Crinum latifolium L Nhật Bản có Glucan a và Glucan b

+ Crinum latifolium L Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ,

amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl,

keampferol-3-4-di-O-β-D-glucopyranosit

1.1.4 Tác dụng sinh học

Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ Còn dịch lá dùng làm thuốc nhỏ tai chữa đau tai [18]

Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư tuyến tiền liệt (ở nam giới) [10], [31]

TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa Hoạt tính chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32] Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) và điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể [33], [40]

Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 invitro [20]

Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp khớp, sang chấn [3]

1.2 Tổng quan về crinamidin

Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức

cấu tạo như hình 1.2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin

Crinamidin Công thức phân tử

(Khối lượng phân

Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng

7

1.3 Một số nghiên cứu xác định crinamidin

Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng

và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng crinamidin trong lá TNHC Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC

Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính Chưa

có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS Các nghiên cứu xác định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét

Tài

30 µg/mL đến 300 µg/mL

Thời gian sắc ký dài, quy trình chiết chưa thực sự tối

ưu, cụ thể:

- Quy trình áp dụng cho lá: phải siêu âm và lọc

Tác dụng sinh học

Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa

và kích thích miễn dịch [20], [32]

Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và

sự phát triển của khối u [32] Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người [33], [40]

 Phương pháp xử lý mẫu:

- Lá: Làm ẩm bột dược liệu bằng

phút, lọc Bã chiết thêm 4 lần Cô

dịch chiết Hòa cắn bằng 20 mL

HCl 0,1N

ngâm qua đêm Đun hồi lưu 5

giờ Cô dịch chiết Hòa cắn bằng

HCl nhiều lần Kiềm hóa đến pH

nhiều lần, phương pháp chưa có bước loại tạp

- Quy trình áp dụng cho viên nang: quy trình chiết xuất mất nhiều thời gian do thời gian ngấm kiệt kéo dài và một số giai đoạn tiến hành làm lặp nhiều lần

theo dược liệu khô kiệt

Thời gian sắc ký dài, quy trình chiết chưa thực sự tối

ưu, phải siêu âm và lọc nhiều lần, phương pháp chưa

có bước loại tạp

lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết cao

toàn phần bằng cách ngấm kiệt

GĐ1: Làm ẩm bột lá TNHC bằng

cồn 96% trong 12 giờ Nạp vào

bình chiết, thu hồi dung môi được

Cao alkaloid toàn phần có thể chất sạch, ít tạp nhày, nhựa, tuy nhiên hệ thống chiết SFE không phổ biến tại các phòng thí nghiệm, vận hành phức tạp, tốn kém Thời gian chiết xuất kéo dài

ngấm kiệt với ethanol 96%, cô

thu hồi dung môi được cao

ethanol

Tiếp tục chiết xuất thu được cao

chiết pH = 4 (2,5kg), cao chiết

thời gian lưu ~ 6,8 phút

Thu được 1,5 g crinamidin đạt tiêu chuẩn chuẩn gốc với hàm lượng 99,85%

Quy trình được xây dựng để thiết lập chuẩn crinamidin

và phương pháp này chưa thật sự phù hợp để cải tiến thành phương pháp

crinamidin trong TNHC do thời gian chiết xuất kéo dài

pH = 9 (210g)

Cao pH 9 (130g) được sắc ký cột

nhanh (VLC) trên silicagel với hệ

Chiết cao cồn: làm ẩm dược liệu

bằng dung môi chiết 12 giờ,

ngâm dược liệu 24 giờ Gộp dịch

chiết, cô cách thủy được cao cồn

Hòa tan cao cồn trong HCl Lắc

dịch acid với ethyl acetat Kiềm

phân đoạn alkaloid

Chiết SFE bột lá thu được cao

SFE và dược liệu sau SFE Hòa

tan cao trong acid, kiềm hóa, lắc

Xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 6

Không có sự khác biệt kết quả định lượng alkaloid và flavonoid trong lá

HPLC hoặc CE

Kết hợp chiết alkaloid và flavonoid, định lượng đồng thời

alkaloid và flavonoid Tuy nhiên trang thiết bị SFE tốn kém, vận hành phức tạp, cần phải thực hiện nhiều khảo sát để tìm các thông số tối ưu áp suất, thời gian, nhiệt độ, khối lượng mẫu, dung môi hỗ trợ và tỷ lệ dung môi hỗ trợ Phương pháp này tốn nhiều thời gian

và chi phí cao, khó phổ biến trên thực

tế

Alkaloid trong cây

11

alkaloid

Dược liệu sau SFE được chiết

ngấm kiệt với cồn Lấy phần dịch

chiết đã loại cồn, acid hóa, lắc

với ethyl acetat Dịch chiết được

đoạn alkaloid

tồn tại chủ yếu ở dạng muối cũng là trở ngại lớn trong chiết SFE

Cột DB 15m silica tan chảy, khí

mang heli Chương trình nhiệt

eV EIMS với nhiệt độ nguồn

crinamidin sau khi

so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3 alkaloid đơn chất

Nghiên cứu này nêu phương thức chuyển đổi alkaloid chiết xuất

từ lá TNHC thành những chất dễ bay hơi để có thể dễ dàng tách bằng sắc

ký khí

Nghiên cứu này mới chỉ dừng ở việc khảo sát sơ bộ các alkaloid chiết

từ cây TNHC, xác định sự hiện diện của một số chất phân lập từ cắn alkaloid toàn phần (phải qua giai đoạn tinh chế) mà chưa đưa ra

chiết cồn được trung hòa, cô thu

hồi dung môi và chỉnh đến pH =

8, lắc với heptan, rồi tiếp tục

chỉnh đến pH = 10, lắc với

heptan được cắn (A) và thu hồi

được alkaloid toàn phần tinh

khiết, cắn (A) và (B) được thực

hiện sắc ký khí

phương pháp định lượng cho các

alkaloid của TNHC

Lá TNHC được chiết với nước

sôi, acid hóa, rồi chiết với light

ký

Xác định được 16 alkaloid (trong đó

có 1 là tạm thời)

Một số thành phần không xác định được do thiếu chất chuẩn và thư viện phổ chuẩn

Quy trình chiết đơn giản, có bước loại tạp Tuy nhiên hiệu suất chiết không cao, phù hợp hơn trong định tính alkaloid

13

Nhận xét: Hiện nay, duy nhất DĐVN IV bản bổ sung đưa ra tiêu chuẩn cho

lá khô TNHC thông qua hàm lượng crinamidin, sử dụng kỹ thuật HPLC Các nghiên cứu trên đã đưa ra nhiều quy trình chiết xuất khác nhau; định tính, định lượng và phân lập crinamidin chủ yếu trên đối tượng nguyên liệu lá TNHC Quy trình chiết xuất cần nhiều thời gian và công sức, đa phần các nghiên cứu dừng lại

ở định tính hoạt chất trong cây Các nghiên cứu về chế phẩm chứa TNHC còn hạn chế Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất đóng vai trò quan trọng trong tiêu chuẩn hóa

- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ ít phân cực cho hiệu suất chiết cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại tạp Hiện nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để chiết alkaloid

từ dược liệu, đặc biệt là các dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao

- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước có ưu điểm là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thiết

bị đơn giản, đầu tư ít Tuy nhiên dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp, mất mát nhiều trong khâu tinh chế nên thường cho hiệu suất chiết thấp

Với mục đích tạo được hiệu suất chiết cao nhất trong thời gian chiết xuất ngắn nhất phục vụ việc định lượng một cách chính xác nhất, chúng tôi cải tiến phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV đồng thời so sánh với phương pháp chiết bằng dung dịch acid

HPLC Đây là phương pháp phổ biến trong định lượng hầu hết các chất hiện nay Tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài; hình dạng pic, độ phân giải chịu ảnh hưởng nhiều của pH Có thể xuất hiện nhiều pic tạp quanh thời gian lưu của pic chính dẫn đến khó xác định đúng pic crinamidin, do đó tính đặc hiệu không cao

Nhận thấy phương pháp GC–MS được sử dụng ở nghiên cứu [8], [38] tách các pic khá tốt, độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ tập trung tách và

phân lập hoạt chất crinamidin trong lá TNHC Các nghiên cứu này cần mẫu có hàm lượng lớn của TNHC mà các chế phẩm thuốc và TPBVSK trên thị trường là sự kết

hợp của nhiều thành phần dược liệu và tá dược nên hàm lượng crinamidin trong

thuốc và TPBVSK cũng khác nhau và nhỏ hơn nhiều lần so với hàm lượng crinamidin trong nguyên liệu lá TNHC Với hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần trong chế phẩm, nền mẫu phức tạp, để trả lời chính xác nhất hàm lượng crinamidin, cần lựa chọn phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn

Trên cơ sở các ưu điểm của phương pháp GC–MS/MS và các nghiên cứu đã thực hiện, với mục đích xác định hoạt chất trong những chế phẩm chứa TNHC ở hàm lượng nhỏ, GC–MS/MS là phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc cao được lựa chọn để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK

15

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng mẫu được lựa chọn là một số mẫu thuốc thảo dược, cao và TPBVSK TNHC trên thị trường cùng một số mẫu cao và TPBVSK tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

Đối tượng mẫu được lựa chọn để khảo sát điều kiện và thẩm định phương pháp là mẫu nang cứng, mẫu trà túi lọc và mẫu cao lỏng TNHC

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Chất chuẩn

Số lô: ATNHC01

Dung dịch chuẩn gốc crinamidin: cân chính xác khoảng 4,30 mg chất chuẩn

mức tới vạch Dung dịch chuẩn gốc crinamidin có nồng độ 200 µg/mL được bảo quản ở 2-8°C

Dung dịch chuẩn trung gian crinamidin: dùng pipette có bầu hút 5 mL dung dịch chuẩn gốc crinamidin 200 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức

độ 100 µg/mL Dung dịch chuẩn trung gian crinamidin 100 µg/mL được bảo quản ở 2-8°C

Dung dịch chuẩn làm việc crinamidin: pha các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,5 đến 50 µg/mL từ dung dịch chuẩn trung gian crinamidin 100

SKS: 0316099.03

Hàm lượng: 99,57% C8H10N4O2 (Nguyên trạng)

Dung dịch chuẩn gốc cafein: cân chính xác khoảng 10,04 mg chất chuẩn

tới vạch Dung dịch chuẩn gốc cafein có nồng độ 1000 µg/mL được bảo quản

ở 2-8°C

Dung dịch chuẩn làm việc cafein: dùng micropipette hút chính xác 2500 µL dung dịch chuẩn gốc cafein 1000 µg/mL vào bình định mức 20 mL, định

2-8°C

2.2.2 Hóa chất, dung môi

ACN (Merck)

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

2.2.3.1 Thiết bị:

Hệ thống sắc ký khối phổ hai lần GC-MS/MS gồm thiết bị khối phổ kiểu ba

tứ cực 7000B Tripple Quad kết nối với máy sắc ký khí GC7890 và bộ tiêm mẫu tự động CTC của hãng Agilent, Mỹ Khí Heli (Messer, Đức) được sử dụng làm khí mang và khí va chạm Sử dụng cột tách DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) của Agilent, Mỹ để khảo sát quá trình tách và xác định crinamidin

Hệ thống HPLC của Shimadzu, Nhật gồm bơm LC20ADVP, detector PDA

và bộ phận tiêm mẫu tự động Cột Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và tiền cột C18 (3,9 mm x 5 mm x 5m µm) của Waters, Mỹ được sử dụng để tách crinamidin

Cân phân tích Metler Toledo; cân kỹ thuật XT220A của Precisa; máy đồng nhất mẫu, Philips; máy lắc Vortex Genie; máy rung siêu âm; bếp đun bình cầu Wise Therm; máy lắc ngang; máy ly tâm Hermle; bơm chân không Ca-mi; máy cô nitơ Organomation; máy cô quay chân không và các thiết bị cần thiết của phòng thí nghiệm

17

2.2.3.2 Dụng cụ:

Bình định mức dung tích 10, 20, 25 mL; micropipet 10-100 µL, 100-1000

µL, 500-5000 µL của Eppendorf và đầu côn tương ứng; pipet Pasteur

Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 250 mL; ống đong chia vạch dung tích 25, 100,

500 mL; ống nhựa ly tâm 50 mL; bình cầu đáy tròn 250 mL

Phễu lọc, giấy lọc thô; kim tiêm, màng lọc 0,45 µm; 0,2 µm; vial 2,0 mL Các dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK

2.3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định crinamidin và chuẩn nội

a Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa, nhiệt độ bay hơi, các mảnh đặc trưng của các chất để lựa chọn chuẩn nội, để đảm bảo chuẩn nội được chọn bền vững, tách hoàn toàn khỏi pic crinamidin trên sắc ký đồ và không có mảnh đặc trưng nào trùng với mảnh đặc trưng của crinamidin

Dựa vào tính chất lý hóa của cafein đồng thời tham khảo tài liệu [16], cafein được lựa chọn để khảo sát làm chất chuẩn nội cho crinamidin

b Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định crinamidin và chuẩn nội cafein

Xác định các mảnh phổ đặc trưng cho crinamidin, cafein Mỗi chất chọn

1 ion con có cường độ cao và ổn định nhất để định lượng, và ít nhất 1 ion con

khác nhau về khối lượng của chúng MS là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Phương pháp này mang tính đồng bộ vì những chất phù hợp cho sắc ký khí đều tương thích với yêu cầu của phân tích bằng MS [22], [24], [25]

Khảo sát chọn điều kiện phân tích thích hợp nhằm định lượng crinamidin trong các mẫu nghiên cứu để tách hoạt chất và chuẩn nội, sắc ký đồ rõ nét và thời gian phân tích không quá dài bằng thiết bị GC-MS/MS

Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS)

Các điều kiện cần khảo sát bao gồm:

nhau Khảo sát và lựa chọn cột DB5-MS (5% phenyl, 95% methylpolysiloxane), kích thước 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm

Khí mang và tốc độ khí mang: Trong sắc ký khí, pha động (khí mang) giữ vai trò vận chuyển chất phân tích qua cột Khí mang thường là các khí trơ về mặt hóa học, có phân tử lượng nhỏ, đảm bảo độ tinh khiết và phù hợp với từng loại detector Hiện nay, phổ biến nhất là khí heli [1], [4], [11], [22]

Chế độ tiêm mẫu: chia dòng hoặc không chia dòng

Nhiệt độ buồng tiêm mẫu và chương trình nhiệt độ cột tách

19

Nhiệt độ đường chuyển giữa GC và MS

Từ kết quả khảo sát có thể lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để có thể định lượng crinamidin trong các chế phẩm bằng GC-MS/MS

2.3.1.3 Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa trên các nguyên tắc của chiết alkaloid từ dược liệu, dựa trên các tính chất hóa lý của crinamidin, tiến hành khảo sát hai phương pháp xử lý mẫu:

- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước acid: sử dụng nước nóng và acid hydrocloric

Xây dựng quy trình xử lý mẫu chung cho các đối tượng nền mẫu

2.3.1.4 So sánh quy trình đã xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV

Minh chứng bằng thực nghiệm nhằm so sánh hiệu quả của 2 phương pháp: phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV bản bổ sung (sử dụng kỹ thuật HPLC) và phương pháp xây dựng (sử dụng kỹ thuật GC-MS/MS) dựa trên các tiêu chí: LOD,

LOQ, hàm lượng crinamidin chiết xuất được theo mỗi quy trình

2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS

Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiến hành sắc ký lặp lại dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic qua các lần chạy

- Yêu cầu: chênh lệch đáp ứng giữa các lần chạy của cùng một dung dịch, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 5% [37]

Tính đặc hiệu: trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác

Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn và bao trùm tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc

Cách xác định: Tiến hành đo và so sánh các mẫu: mẫu dung môi, mẫu placebo thêm chuẩn nội, mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn

Yêu cầu: Thời gian lưu của pic chính xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu chuẩn tương ứng với pic cùng thời gian lưu trong mẫu thử Trong mẫu trắng tại thời điểm

đó không xuất hiện pic Ngoài ra theo tiêu chuẩn EC của châu Âu, đối với phương pháp GC-MS/MS thì cần chọn tối thiểu 3 ion, số điểm IP tối thiểu là 4

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Cách xác định: Chuẩn bị dãy 5 – 7 dung dịch chuẩn crinamidin có chứa

quan giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn chia cho nội chuẩn phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy

Yêu cầu: đường hồi qui thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan phải không nhỏ hơn 0,995 Ngoài ra, độ chệch của từng điểm không được vượt quá 15%

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử

có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích

mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 3 (S/N=3)

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 10 (S/N=10) Có

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) thể hiện sự gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại, độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD%

21

Cách xác định: tiến hành phân tích ở mức nồng độ 100% với 6 mẫu thử độc lập của cùng một chế phẩm, tính toán hàm lượng crinamidin tìm lại được Đánh giá

độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD (%)

Yêu cầu: Tại mức hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 0,01% tới nhỏ hơn 0,1%, theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp (RSD) phải ≤ 5,3%

Độ đúng của phương pháp được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi

Cách xác định: xác định trên mẫu tự tạo Khảo sát với 3 nồng độ của mẫu tự tạo: thêm chuẩn ở các mức 80%, 100% và 120% so với hàm lượng trên nhãn vào mẫu thử Ở mỗi mức nồng độ của mẫu tự tạo, tiến hành thực nghiệm 3 phép thử riêng biệt

Yêu cầu: độ đúng được phản ánh qua tỷ lệ phần trăm giữa kết quả định lượng

so với hoạt chất cho vào Theo AOAC, lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 0,01% tới nhỏ hơn 0,1%

2.4 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK

Thu thập một số mẫu cao, thuốc và TPBVSK TNHC trên thị trường

Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng Tiến hành phân tích trên thiết bị GC–MS/MS

2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được định tính và định lượng bằng phần mềm Mass Hunter của Agilent Tính toán và xác định các đại lượng đặc trưng của các mẫu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS

3.1.1.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký khí khối phổ và lựa chọn chuẩn nội

Qua tham khảo tính chất lý hóa của crinamidin và cafein, điều kiện khối phổ

từ các nghiên cứu [8], [30], [34], [38] và điều kiện thực tế, chúng tôi tiến hành khảo sát nguồn ion hóa EI với năng lượng bắn phá 70 eV, bộ phân tích khối phổ loại ba

tứ cực, chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Chuẩn bị 3 dung dịch chuẩn như sau:

 Dung dịch chuẩn hỗn hợp crinamidin nồng độ khoảng 20 µg/mL và

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn crinamidin, dung dịch chuẩn nội cafein vào

hệ thống GC-MS/MS, lựa chọn chế độ quét toàn phổ (full scan) Mẫu sau khi qua cột sắc ký ở dạng hơi đi qua buồng ion hóa, ở đây xảy ra tương tác với chùm electron có năng lượng là 70 eV tạo thành các ion ban đầu Ion đặc trưng

có cường độ cao và ổn định được lựa chọn để tiếp tục phân mảnh ở tứ cực thứ 2 tạo thành các ion con Trong số các ion con được tạo thành, ion con có cường

độ cao và ổn định nhất được lựa chọn để định lượng, các ion còn lại được dùng

để xác nhận

Trong nghiên cứu này, ion có số khối m/z 217 của crinamidin và ion có số khối m/z 82 của chuẩn nội cafein được lựa chọn để định lượng Kết quả sắc ký của crinamidin và chuẩn nội cafein sau khi bắn phá được thể hiện qua bảng 3.1, bảng 3.2, hình 3.1 và hình 3.2

23

Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá

Với điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS đã xây dựng, tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp crinamidin và cafein, nhận thấy trong cùng một điều kiện khối phổ, trên sắc ký đồ tổng (TIC – Total ion chromatogram), các pic sắc ký tách khỏi nhau hoàn toàn, hình dạng pic cân xứng, không có các mảnh đặc trưng của chuẩn crinamidin và chuẩn nội cafein trùng nhau Với điều kiện sắc ký này, crinamidin cho thời gian lưu ở 16,7 phút còn cafein cho thời gian lưu ở 8,0 phút Điều kiện trên

là tối ưu hóa cho phân tích đồng thời crinamidin và chuẩn nội cafein Vì vậy, cafein được lựa chọn là chuẩn nội cho xác định hàm lượng crinamidin

Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein

3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu và chương trình nhiệt độ GC-MS/MS

các dung dịch sau: dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ 20 µg/mL trong dung môi MeOH, dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ 20 µg/mL trong dung môi ACN, dung

Tiến hành phân tích trên thiết bị GC-MS/MS Khảo sát lựa chọn dung môi và chương trình nhiệt độ phù hợp để pic crinamidin trên sắc ký đồ gọn, hình dạng pic cân xứng Kết quả thu được các sắc ký đồ hình 3.4, hình 3.5 và hình 3.8

Crinamidin

Cafein

25

Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN

Nhận thấy khi sử dụng dung môi pha mẫu là MeOH hoặc ACN thì pic bị chẻ

Tiếp tục khảo sát chế độ tiêm không chia dòng (splitless) và chế độ tiêm chia

Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.6 và 3.8

Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng

Nhận thấy chế độ tiêm chia dòng 10 : 1 cho pic đẹp và cân xứng hơn (hình 3.8) Vì vậy lựa chọn chế độ tiêm chia dòng 10 : 1 để xác định hàm lượng

crinamidin

chương trình nhiệt độ tối ưu cho phân tích trên thiết bị GC-MS/MS Có 2 chương trình nhiệt độ được lựa chọn để khảo sát là:

 Chương trình gradient nhiệt độ (**) bao gồm 2 chương trình nhiệt độ:

27

Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.7 và 3.8

Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ

(*)

Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl 3 ,

chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**)

Chương trình nhiệt độ (**) cho thời gian lưu của crinamidin chỉ khoảng 17 phút, pic gọn và đối xứng

Dựa trên điều kiện thực nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài với các điều kiện tối

ưu hóa được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS

Thông số điều kiện sắc ký khí

Thông số điều kiện khối phổ

29

3.1.2 Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS

3.1.2.1 Xây dựng quy trình chiết mẫu

Dựa trên nguyên lý về chiết xuất alkaloid ra khỏi dược liệu [9], chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình xử lý mẫu, gồm có:

dựa trên phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV bản bổ sung [3] và cải tiến phương pháp phù hợp với điều kiện sắc ký GC-MS/MS

trên nghiên cứu [38]

Khảo sát điều kiện chiết trên 3 nền mẫu riêng biệt: viên nang cứng, trà túi lọc

và cao lỏng Viên nang cứng được loại bỏ vỏ nang, đồng nhất bột dược liệu trong nang bằng máy đồng nhất mẫu Trà túi lọc được loại bỏ túi lọc, xay nhỏ đồng nhất Cao lỏng được trộn đều đồng nhất

Tiến hành xử lý các mẫu song song theo quy trình xử lý mẫu bảng 3.4

Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu

đặc trong bình cầu Sau 1

giờ, thêm hỗn hợp dung

âm 30 phút mỗi lần đến

khi chiết kiệt hoạt chất Cô

dịch chiết đến cắn, hòa tan

cắn bằng HCl 0,1N Loại

đặc trong bình cầu Sau 1 giờ, thêm hỗn hợp dung

hồi lưu 1 giờ mỗi lần đến khi chiết kiệt hoạt chất Cô dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn bằng HCl 0,1N, loại tạp bằng dung môi hữu cơ

Kiềm hóa và chiết lỏng –

Thêm nước nóng vào mẫu Sau 30 phút, acid hóa mẫu bằng acid acetic đến pH 4

Khảo sát và so sánh hiệu suất chiết của 3 quy trình trên dựa trên hàm lượng crinamidin của mỗi phương pháp trong cùng điều kiện sắc ký Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần đối với mỗi dạng bào chế Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.9

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu

trung bình (n = 3)

Spic cafein trung bình (n = 3)

Nồng độ (µg/mL)

Hàm lượng (µg/g)

31

Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu

Nhìn chung, trên cả 3 đối tượng nền mẫu, quy trình chiết sử dụng kiềm trong dung môi hữu cơ (quy trình 1 và quy trình 2) cho hiệu suất chiết cao hơn quy trình chiết sử dụng dung dịch acid (quy trình 3), phù hợp với tài liệu tham khảo [9]

Có sự khác biệt lớn về hàm lượng crinamidin đối với các nền viên nang cứng

và trà túi lọc, tuy nhiên không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng crinamidin đối với nền cao lỏng khi phân tích khi phân tích theo 3 quy trình xử lý mẫu trên

Quy trình 1 được cải tiến dựa trên phương pháp xử lý mẫu của DĐVN IV bản bổ sung, phải siêu âm và lọc 5 lần, cần nhiều thời gian và khả năng mất mẫu trong quá trình xử lý lớn hơn

Quy trình 2 được cải tiến dựa trên quy trình 1 bằng cách thay thế 5 lần siêu

âm bằng 2 lần đun hồi lưu Quy trình 2 cho kết quả định lượng với hiệu suất chiết cao hơn, tiết kiệm thời gian và dung môi hơn so với quy trình 1

Vì vậy, quy trình 2 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất như: tỷ lệ dung môi chiết, số lần chiết xuất và thời gian chiết xuất Quy trình xây dựng và các yếu tố khảo sát được thể hiện trong hình 3.10