Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng chống viêm của cây dóng xanh (justicia ventricosa wall họ ô rô acanthaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY DÓNG XANH Justicia ventricosa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY DÓNG XANH

(Justicia ventricosa Wall Họ Ô rô Acanthaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG

VIÊM CỦA CÂY DÓNG XANH

(Justicia ventricosa Wall Họ Ô rô Acanthaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển

2 PGS TS Nguyễn Duy Thuần

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình

PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Đại học Dược Hà Nội, người đã động

viên, dành nhiều thời gian quí báu hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện bản Luận văn này

PGS TS Nguyễn Duy Thuần – –Học viện Y Dược học cổ truyền Việt

Nam người đã chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu Luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn DS Lưu Thị Quỳnh Trang đã luôn giúp đỡ, động

viên tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược cổ truyền- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn, các anh chị em chuyên ngành Dược học cổ truyền, các em sinh viên khóa 68 làm đề tài tại bộ môn Dược cổ truyền- Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới gia đình, các bạn đồng nghiệp, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và đạt kết quả như ngày hôm nay

Học viên

Lê Thị Thu Hà

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN 3

1.1 Họ Acanthaceae và chi Justicia 3

1.1.1 Về thực vật 3

1.1.1.1 Họ Acanthaceae 3

1.1.1.2 Chi Justicia 3

1.1.2 Thành phần hóa học, tác dụng sinh học chi Justicia 7

1.1.2.1 Thành phần hóa học 7

1.1.2.2 Tác dụng sinh học 9

1.2 Cây Dóng xanh 12

1.2.1 Mô tả thực vật 12

1.2.2 Phân bố 13

1.2.3 Tác dụng sinh học 13

1.3 Đại cương về viêm và một số loại thuốc chống viêm……… 14

1.3.1 Khái niệm về viêm và nguyên nhân gây viêm………. 14

1.3.2 Các chất trung gian hoá học trong viêm……… 15

1.3.3 Các loại thuốc chống viêm ……… 16

1.3.3.1 Thuốc chống viêm không steroid……… 16

1.3.3.2 Thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid)……… 17

1.3.3.3 Thuốc chống viêm theo y học cổ truyền……… 17

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 20

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu về thực vật học 20

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 21

2.2.3.1 Phương pháp định tính 22

2.2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất 23

2.2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 23

2.2.4 Phương pháp thử tác dụng dược lý 24

2.2.4.1 Thử độc tính cấp 25

2.2.4.2 Thử tác dụng chống viêm in vitro……… 27

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU… 31

3.1 Ngiên cứu về thực vật ……… 31

3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 31

3.1.2 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 33

3.1.3 Đặc điểm vi học……… 36

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 39

3.2.1 Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 39

3.2.2 Phân lập một số chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat 40

3.3 Kết quả thử độc tính cấp và tác dụng chống viêm 49

3.3.1 Kết quả thử độc tính cấp……….…… 49

3.3.2 Kết quả thử tác dụng chống viêm in vitro……… 56

PHẦN 4 BÀN LUẬN 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số loài Justicia phân bố ở Việt

2 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái mẫu nghiên

cứu với đặc điểm mô tả trong các thực vật chí

10 Bảng 3.9: Kết quả sàng lọc hoa ̣t tính ức chế sản sinh

nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7 của mẫu

56

11 Bảng 3.10: Kết quả giá trị IC 50 của mẫu 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

2 Hình 2.2 Sơ đồ chiết các phân đoạn 24

3 Hình 3.1 Hình ảnh cây Dóng xanh 32

5 Hình 3.3 Ảnh chụp các đặc điểm hình thái cây

Dóng xanh

33

9 Hình 3.7 Sơ đồ tách chiết và phân lập chất từ cây

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IC50 Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50% (nồng độ ức chế trung

bình) 1

H-1H

COSY

1H-1H Correlation Spectroscopy Phổ 1

EtOAc

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bò

Interleukin LD50 Median lethal dose Liều gây chết trung bình

MS-ESI Mass Spectrometry Phổ khối lượng phun mù

điện tử

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NMR Nuclear Magnetic Resonace Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

NSAID Non-Steroidal Anti-Inflammatory

TSI Thermospray Ionization

Viêm là hiện tượng bệnh lý phổ biến, theo thống kê có tới hơn 30% bệnh nhân đến khám và điều trị tại các bệnh viện có tình trạng viêm nhiễm

Các thuốc chống viêm, giảm đau (CVGĐ) nguồn gốc hóa dược có tác dụng nhanh và mạnh, được sử dụng điều trị triệu chứng là chủ yếu, gồm có: Thuốc giảm đau trung ương nhóm morphin, thuốc CVGĐ không steroid (NSAID) và corticoid Các nhóm thuốc này có có ưu thế trong điều trị các viêm và đau cấp tính Tuy nhiên, hầu hết các thuốc này đều có nhiều tác dụng phụ gây trở ngại cho việc điều trị dài ngày, đặc biệt là trong điều trị viêm và đau xương khớp mạn tính, tỉ lệ tái phát tới hơn 90% Bên cạnh đó, các thuốc CVGĐ nguồn gốc thảo dược thường có tác dụng chậm và lâu hơn, ít tác dụng không mong muốn, có ưu thế trong điều trị viêm và đau mạn tính Vì vậy, việc phát hiện và nghiên cứu các thuốc CVGĐ mới có hiệu quả và khắc phục được những hạn chế của các thuốc CVGĐ hiện nay là vấn đề luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam, không chỉ đối với các thuốc hóa dược mà các thuốc từ dược liệu

Trong quá trình tìm hiểu về kinh nghiệm sử dụng cây, con thuốc để chữa bệnh của đồng bào các tỉnh miền núi phía Bắc, chúng tôi đã được người dân ở vùng núi Yên Thế, tỉnh Bắc Giang giới thiệu về kinh nghiệm sử dụng cây thuốc

có tên là “Dóng xanh”, cây mọc tự nhiên dưới tán rừng thấp hoặc được trồng

Đồng bào dân tộc Tày ở Lạng Sơn sử dụng cây Dóng xanh (Justicia ventricosa

Wall) để trị bệnh đau xương, thấp khớp

Theo Võ Văn Chi: Ở Trung Quốc, toàn cây Dóng xanh (Justicia ventricosa

Wall.) dùng trị: Đòn ngã, gãy xương, phong thấp đau nhức xương, đau ngang thắt lưng, viêm mủ da, áp xe vú Liều dùng 15-30g dạng thuốc sắc Dùng ngoài giã đắp Tại Việt Nam, cây thường được trồng làm cây cảnh Lá được dùng giã lấy nước uống và bã đắp trị rắn cắn, còn dùng nấu nước xông trị đau răng.[16]

Cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào về cây “Dóng xanh” được thực hiện

Để có cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây “Dóng xanh” làm thuốc chữa bệnh ở cộng đồng, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống

viêm của phần trên mặt đất cây Dóng xanh (Justicia ventricosa Wall họ Ô

rô Acanthaceae)" với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu

2 Xác định thành phần hóa học, chiết xuất và phân lập một số chất của bộ phận trên mặt đất cây Dóng xanh

3 Thử độc tính cấp và tác dụng chống viêm của cao chiết toàn phần

bộ phận trên mặt đất của cây Dóng xanh

Đặc điểm thực vật của các loài thuộc họ Acanthaceae là cây thảo đứng hay thân leo, thân thường chia đốt Một số loài có dạng cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ

Lá đơn mọc đối, không có lá kèm Hoa lưỡng tính, không đều, có khi có lá bắc

và lá bắc con rõ Đài gồm năm lá có khi dính lại với nhau, đôi khi bắt gặp có bốn lá ởmột số loài do bị tiêu biến Tràng có ống hình trụ phình to ở gốc, chia năm nhưng không đều, hầu như chia hai môi, môi trên chẻ đôi, môi dưới chia hai thuỳ Nhị hai hoặc nhị bốn, trong đó có hai nhị trội hơn hẳn về kích thước Bầu trên hai ô, vòi nhuỵ có dạng sợi đơn, đầu nhuỵ chẻ đôi Quả nang có hai

ô, gồm nhiều noãn có chân Khi già quả tự mở bằng cách co giãn từ đỉnh xuống chân, các mảnh vỏ cong và rời khỏi trục giữa Hạt có cuống ngắn, phôi lớn và thường không có nội nhũ

1.1.1.2 Chi Justicia

* Vị trí phân loại chi Justicia

Vị trí của chi Justicia trong phân loại thực vật của Armen Takhtajan[47] được

phân loại như sau:

Giới thực vật ( plantae)

Ngành Ngọc lan ( Magnoliophyta)

Phân ngành Ngọc lan ( Magnoliophytina)

* Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Justicia

Cây bụi, sống hàng năm, vỏ thân sần sùi Lá có cuống hoặc không, phiến lá thường nguyên, hiếm khi xuất hiện răng cưa Hoa dạng cụm xim ngù (hiếm khi mọc đơn lẻ) thường mọc ở các kẽ lá, mọc thành chùm hoặc phân nhánh thành các cụm chùy hoa nhỏ hơn Lá bắc có hình thù đa dạng, hai lá bắc thường giống nhau hoặc một lá nhỏ một lá to hơn Đài dài, tiền khai hoa 4 hoặc 5, đều hoặc không Tràng hình ống hình phễu, hoặc hình hoa môi, cánh hoa mọc hướng lên trên và xếp hình xoắn ốc Nhị 2, bao phấn 2, các bao phấn đều hoặc không đều, song song hoặc vuông góc với nhau Bầu nhụy 2 ô, mỗi ô

có 1 noãn Quả nang, 2-4 hạt, hạt hình dẹt, có cánh

Chi Justicia là một trong những chi lớn nhất trong họ Acanthaceae, theo ước

tính có khoảng 700 loài Trung Quốc có khoảng 43 loài Ở Việt Nam có khoảng 30 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Tây Ninh, Đà Nẵng [14][47]

Bảng 1.1 Một số loài Justicia phân bố ở Việt Nam[14]

STT Tên Việt Nam Tên khoa học Nơi phân bố

2 Xuân tiết bằng Justicia qequalis R Ben Tuyên Quang

Đà Nẵng

Ben

Núi Dinh, núi Dày (Châu Đốc, An Giang)

Trị, Tây Ninh

Giang

Anders

Phú Khánh, Đồng Nai

Wassh

Thành phố Hồ Chí Minh

1.1.2 Thành phần hóa học, tác dụng sinh học của chi Justicia

1.1.2.1 Thành phần hóa học

Chi Justicia đã được chú ý nghiên cứu về hóa học từ những năm 1960 Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Justicia khá đa dạng Theo các

công trình nghiên cứu đã công bố trên thế giới, từ các bộ phận khác nhau của

các loài thuộc chi Justicia đã phân lập được nhiều hợp chất thuộc các nhóm

polyphenol (lignan, flavonoid, coumarin) tecpenoid, alcaloid,

❖ Các lignan

Lignan là lớp hợp chất chủ yếu được phân lập từ các loài thuộc chi

Justicia Đây là lớp hợp chất tự nhiên có sự đa dạng sinh học (chống ung thư,

chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tiểu cầu, kháng virus ) góp phần phát triển thành các chế phẩm điều trị bệnh mới Nhiều lignan có khung

arylnaphtalid được tìm thấy trong chi Justica với tỷ lệ tương đối cao Ví dụ,

jusmicaranthin 22 được phân lập từ phần chiết CHCl3 của Justicia neessi cho

hiệu suất 0,025% [43] Phần chiết ethanol của lá Justicia extensa chứa khoảng

1% justicidin P 47 [45] Một số arylnaphtalid lignan ở dạng dẫn xuất glycosid

và các lignan hỗn tạp khác cũng được tìm thấy trong các loài Justicia

❖ Các hợp chất khác

Ngoài lignan là lớp hợp chất chính như đã nói ở trên, các nghiên cứu về hóa học cho thấy sự có mặt của nhiều lớp chất có hoạt tính sinh học khác trong chi

Justicia như flavonoid, tecpenoid (với các khung fridelan, ursan, oleanan

tritecpen), alcaloid và các hợp chất chứa nitơ Umbeliferon và scopoletin là hai

cumarin được phân lập từ Justicia pectoralis Jacq., Justicia procumbens [39],

[48] Các hợp chất steroid như stigmasterol, sitosterol, daucosterol cũng được

phân lập từ lá và rễ của các loài Justicia gendarussa, Justicia flava [22], [29]

Một số flavonoid được phân lập như apigenin, vitexin từ dịch chiết methanol

của loài Justicia gendarussa [50]; 3’,4’- dihydroflavonol từ dịch chiết ethanol toàn cây của loài Justicia cataractae, kaempferitrin từ dịch chiết chloroform lá của loài Justicia spicigera [62]

jusmicaranthin justicidin P

Umbeliferon scopoletin

3’,4’- dihydroflavonol kaempferitrin

1.1.2.2 Tác dụng sinh học của chi Justicia

Nhiều loài thuộc chi Justicia, họ Ô rô (Acanthaceae) đã được sử dụng

rộng rãi trong y học cổ truyền của một số nước để chữa các loại bệnh khác nhau Toàn bộ cây hoặc phần trên mặt đất thường được sử dụng để làm thuốc, hay dùng nhất là dịch chiết nước của lá cây, của bột rễ cây, hoặc sử dụng kết hợp với các loài cây khác Việc khảo sát, nghiên cứu về hoạt tính sinh học

nhằm làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh của các loài Justicia

* Kháng virus

Một số loài Justicia có hoạt tính kháng virus, chẳng hạn như Justicia betonica L và Justicia flava có khả năng kháng virus gây viêm miệng Dịch chiết nước của phần trên mặt đất của Justicia gendarussa có khả năng chống

sự sao chép ngược của virus HIV type 1 [50] Dựa trên những kết quả nghiên

cứu thu được, một số loài Justicia có thể được dùng làm thuốc điều trị bệnh do

virus gây ra

* Kháng khuẩn

Justicia pectoralis có hoạt tính kháng khuẩn cao khi kháng được các vi khuẩn E coli, E faecalis và S epidermidis Hơn nữa, loài này thể hiện hoạt

tính kháng sốt rét khi cho các test dương tính khi theo dõi sự tăng trưởng và

phát triển của ấu trùng của muỗi Aedes aegypti giai đoạn IV Các dịch chiết

thực vật với nồng độ 0,05 đến 0,50 mg/ml là đạt yêu cầu cho việc thử hoạt tính diệt ấu trùng Trong số các dịch chiết được thử nghiệm thì dịch chiết của

Justicia pectoralis được nhận thấy là độc đối với ấu trùng muỗi [24]

* Chống ung thư

Một số loài thuộc chi Justicia có hoạt tính chống ung thư đối với các

dòng tế bào ung thư khác nhau Dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất của

Justicia neesii Ramamoorthy có hoạt tính chống ung thư kháng lympho bào

bạch cầu P-388 ở chuột Dịch chiết methanol của Justicia procumbens L ức chế đáng kể sự tăng trưởng của lympho bào bạch cầu P-388 in vivo và có hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với dòng ung thư biểu mô người [25]

Elenosid, một arylnaphtalen lignan phân lập từ loài Justicia hyssopifolia

L., đã được nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học Khảo sát về hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này có nhiều hoạt tính như gây độc tế bào, kháng virus, kháng côn trùng, giãn cơ, kích thích hoạt động của hệ thống thần kinh trung ương ở chuột nên được sử dụng làm thuốc an thần và thư giãn cơ bắp tương tự như một số loại thuốc an thần, giảm đau khác [41] Elenosid đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người trong khoảng nồng độ

từ 10-5 đến 10-4 M, với LD50 là 305 mg/kg ở chuột, suy yếu dần ở các liều 25,50 và 100 mg/kg Kết quả là sau 5 ngày tiêm hợp chất này đã không quan sát thấy liều gây chết [20] Ngoài ra, hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu [41]

Helioxanthin có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của virus viêm gan B ở

người Hợp chất này được phân lập từ Justicia flava và được sử dụng phổ biến

trong việc điều trị HIV/AIDS ở Uganda [9]

Hoạt tính kháng của phần lớn các lignan như cilinaphtalid A, diphyllin, justicidin E, patentiflorin A, patentiflorin B, justicidin A, justicidin B, taiwanin E, tubeculatin, diphyllin apiosid, và diphyllin apiosid-5-axetat có liên

quan đến việc sử dụng phổ biến của các loài Justicia procumbens, Justicia ciliata, Justicia rhodoptera, và Justicia patentiflora trong liệu pháp chống ung thư Diphyllin, justicidin A và tubeculatin được phân lập từ Justicia ciliata,

có tác dụng chống ung thư đáng kể đối với một số dòng tế bào ung thư người như ung thư biểu mô, ung thư cổ tử cung, ung thư đại trực tràng và ung thư vú… [28] Justicidin A còn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khi kháng các

dòng tế bào ung thư T-24, CaSki, SiHa, HT-3, PLC/PRF/5 in vitro [26]

Justiciresinol được phân lập từ Justicia glauca có hoạt tính gây độc tế

bào thấp khi ức chế ba dòng tế bào ung thư người là A-549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), và HT-29 (ung thư tuyến ruột kết) [51] Podophyllotoxin được ứng dụng rộng rãi trong hóa trị liệu ung thư và đã được sử dụng như là một tiền chất để bán tổng hợp thành dược phẩm trong điều trị bệnh ung thư[23]

Một số lignan khác như tawanin E methyl ether, diphyllin, helioxanthin, elenosid, justicidin A, justicidin B, tuberculatin, cilinaphtalid A cũng thể hiện

hoạt tính chống ung thư mặc dù chúng được phân lập từ các loài Justicia khác

nhau không thể hiện hoạt tính này

Allantoin, một hợp chất thuộc nhóm alcaloid được phân lập từ loài

Justicia spicigera, có hoạt tính kháng viêm và chống ung thư rất hiệu quả

[29] Ba alcaloid là vasicin, vascinon và vascinol được phân lập từ lá của

Justicia adhatoda có hoạt tính giãn phế quản và được sử dụng phổ biến trong

điều trị bệnh viêm phế quản [19] Các hợp chất jusbetonin và 10H-quindolin

được phân lập từ lá của Justicia betonica có hoạt tính kháng u mạnh [52], mặc

dù loài này được sử dụng loài phổ biến trong y học cổ truyền của Ấn Độ, Thái Lan để điều trị tiêu chảy các bệnh viêm nhiễm và HIV/AIDS [36], [38]

*Một số tác dụng khác

Nhiều lignan được phân lập từ các loài Justicia có một số hoạt tính sinh

học khác đáng chú ý Hoạt tính ức chế kết tập tiểu cầu của các lignan cilinaphtalid B, chinensinaphtol methyl ether, taiwanin E methyl ether, 4’-dimethyl chinensinaphtol methyl ether , neojusticin A, usticidin B, taiwanin E

[27] Đặc biệt, phần chiết methanol của Justicia procumbens cũng có hoạt

tính này khi ức chế 50% acid arachidonic trong tiểu cầu thỏ [25]

Neojusticin A và justicidin B là hai lignan có khả năng ức chế các tập hợp thứ cấp gây ra bởi adrenalin Hơn nữa, những hợp chất này cũng có hoạt

tính đối với enzym cyclooxygenase-1 (COX-1) với tác dụng kháng một phần tiểu cầu tụ tập do hoạt tính của COX-1 và làm giảm sự tạo thành thromboxan [49]

Một số ít các polyphenol được phân lập từ các loài Justicia đã được

khảo sát về hoạt tính sinh học Hợp chất 3’,4’-dihydroxyflavon thuộc nhóm

flavonoid có khả năng làm giãn mạch và loài Justicia cataractae Leonard có

hoạt tính hạ huyết áp (anti-hypertensive activity), được dùng làm thuốc trị các bệnh cao huyết áp [23], tiểu đường [48] Apigenin có tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm và giúp ngăn chặn một số yếu tố gây viêm [54] Vitexin, một

flavonoid được phân lập từ lá của Justicia gendarussa, có tác dụng như một

loại thuốc chống viêm có hiệu lực cao, có hoạt tính kháng enzym lipoxygenase và cyclooxynase-2 (COX-2) [50] Các hợp chất apigenin và

5-vitexin được phân lập từ phần chiết ethanol của Justicia gendarussa, được sử

dụng trong y học dân gian điều trị các chứng viêm, thấp khớp, viêm khớp [55] Các hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng viêm của kaempferitrin [29] và tác dụng làm giảm nồng độ glucose trong máu có liên quan đến việc loài

Justicia spicigera được sử dụng phổ biến làm thuốc để điều trị các bệnh tiểu

đường, ung thư và tiêu chảy, đau bụng, đầy hơi, chống viêm… trong y học cổ truyền của một số nước Hợp chất có khung coumarin là umbeliferon được

phân lập từ phần chiết alcol của lá Justicia pectoralis có các hoạt tính kháng viêm, giãn phế quản, do đó, loài Justicia pectoralis thường được dùng phổ

biến trong điều trị viêm bệnh phế quản và các bệnh về đường hô hấp [39]

1.2 Cây Dóng xanh Justicia ventricosa Wall

1.2.1 Đặc điểm thực vật [47][16]

Cây bụi hoặc cây thảo, sống lâu năm, cao khoảng 1m Thân nhẵn, chia thành từng đốt, phình mạch ở các đốt, tại các mắt đốt có chồi 2 mm Lá có cuống, cuống lá dài 0,5-1,5 cm, nhẵn, không có lông, lá thon hẹp ở gốc và nhọn ngắn lại ở đầu, quay mặt ra phía ngoài, kích thước 6-17 × 2-6 cm, lá có

6-8 gân Cụm hoa bông, dài 5-10 cm, dày đặc các lá bắc xếp thành 4 dãy trên một bông, thường có 1-3 bông hoa trên một cụm Lá bắc có màu từ xanh lá đến nâu đỏ, hình bầu dục, có lông, kích thước 1-1.5 × 0.8-1 cm Đài 5 thùy, thùy hình mác, kích thước 3mm Tràng hoa màu trắng nhạt với sọc màu hồng tía ở mặt trên, kích thước 1,5-1,8 cm, mặt dưới lõm, cánh hoa nhọn ở phân cuống và tròn dần ở phần đầu Nhị hoa có chỉ nhị dài 6 mm, nhẵn, có túi phấn hình oval Bầu nhụy có nhiều lông, kích thước 1,6 cm Quả nang, mỗi quả có khoảng 4 hạt

1.2.2 Phân bố

Cây mọc nhiều ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, và Vân Nam) và các nước Đông Nam Á (Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan

và Việt Nam)[47]

Tại Việt Nam cây mọc rải rác ở chỗ ẩm, gần suối trong rừng phân bố chủ yếu

ở Lạng Sơn, Thái Nguyên, Ninh Bình, Quảng Trị, Tây Ninh[16]

1.2.3 Tác dụng sinh học [16]

Ở Trung Quốc, toàn cây Dóng xanh (Justicia ventricosa) dùng trị: Đòn

ngã, gãy xương, phong thấp đau nhức xương, đau ngang thắt lưng, viêm mủ

da, áp xe vú Liều dùng 15-30g dạng thuốc sắc Dùng ngoài giã đắp

Tại Việt Nam, cây Dóng xanh (Justicia ventricosa ) thường được trồng

làm cây cảnh Lá được dùng giã lấy nước uống và bã đắp trị rắn cắn, còn dùng nấu nước xông trị đau răng Đồng bào dân tộc Tày ở Lạng Sơn sử dụng

Justicia ventricosa Wall để trị bệnh đau xương, thấp khớp[16]

* Một số bài thuốc trong dân gian:

1 Trị rắn cắn: dùng lá Dóng xanh 50g giã nát thêm nước gạn uống Lá trầu không 10g, nấu nước, rửa sạch vết cắn Vỏ cây Nóng 30g Giã nhỏ đắp xung quanh vết cắn

2 Gãy xương: Dóng xanh, Thanh táo, Chua me đất, Xuyên tiền tất cả đều dùng tươi, mỗi vị 30g, nghiền nát thêm ít rượu vang đắp xung quanh vết thương sau khi đã chỉnh lại tư thế của xương và có nẹp xương Hàng ngày thay thuốc

3 Áp xe vú: dùng lá tươi và thân cây giã ra với mật đường đỏ và bã rượu

để đắp ngoài

Dóng xanh thuộc họ Ô rô, một trong những họ có nhiều công dụng được sử dụng trong y học dân gian từ rất lâu Các cây thuộc họ Ô rô nói chung

và chi Justicia nói riêng đều ít nhiều được đưa vào nghiên cứu nhằm chứng

minh công dụng của nó trong dân gian

1.3 Đại cương về viêm và một số loại thuốc chống viêm

1.3.1 Khái niệm về viêm và nguyên nhân gây viêm[4],[5]

Viêm là phản ứng của cơ thể tại mô liên kết – một mô có mặt ở mọi cơ quan – biểu hiện bằng sự thực bào tại chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn thương, đồng thời kèm theo những biểu hiện bệnh lý Các triệu chứng của viêm là sưng, nóng, đỏ, đau và tổn thương chức năng Trong phản ứng viêm, nhiều loại tế bào được hoạt hóa, tập trung đến ổ viêm như đại thực bào, bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho, dưỡng bào, tiểu cầu, tế bào nội mạc giải phóng ra các chất trung gian hóa học (prostaglandin, leucotrien, histamin, serotonin…) Các chất trung gian hóa học này lại hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng các enzym tiêu protein (proteinase), interleukin 1, 2, 3, TNF, superoxyd, ion hydroxyl, hydroperoxyd Những chất này tiếp tục gây thương tổn mô, khép kín quá trình viêm mạn tính Các nguyên nhân gây viêm có thể là[4],[15]:

- Nguyên nhân bên ngoài: Cơ học, vật lý, hóa học, sinh học

- Nguyên nhân bên trong: Thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng, do phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể…

1.3.2 Các chất trung gian hoá học trong viêm[15]

* Prostaglandin (PG)

Trong viêm cấp, các mô và mạch máu sản xuất ra PGE2 và PGI2, tế bào mast giải phóng ra PGD2 Trong viêm mạn các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng ra PGE2 và thromboxan A2 Các chất PGE2, PGI2, PGD2 làm tăng tính thấm thành mạch gián tiếp thông qua histamin và bradykinin Tuy nhiên, bên cạnh chức năng trung gian trong viêm, một số PG còn đóng vai trò chống viêm đáng kể do làm giảm hoạt tính của các tế bào viêm, ví dụ PGE2 làm giảm giải phóng các enzym của lysosom và các chất chuyển hóa gây độc

từ bạch cầu trung tính, làm giảm giải phóng histamin từ tế bào mast

* Leucotrien

Leucotrien B4 lôi kéo bạch cầu tới lớp nội mạc của các mạch máu bị tổn thương, nó cũng cũng hoạt động như một chất hóa ứng động thực bào LTC4

và LTD4 gây co thắt phế quản mạnh và đã được tìm thấy trong các trường hợp

dị ứng LTC4, LTD4 và LTE4 là những chất gây phản ứng chậm của phản ứng sốc phản vệ được tiết ra trong trường hợp dị ứng (hen suyễn, sốc phản vệ) [15]

* Histamin

Histamin được hình thành và dự trữ sẵn trong các hạt và được giải phóng

do sự vỡ hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích như: tổn thương vật lý, phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với dưỡng bào Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch với các tiểu tĩnh mạch

* Serotonin

Serotonin có tác dụng tương tự như histamin Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) PAF hoạt động trên các receptor đặc hiệu của nó và có khả năng gây ra nhiều hiện tượng trong viêm PAF hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các men của tiêu thể, gây hoạt hóa và kết dính tiểu cầu

* Các cytokine

TNF, IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống Tại chỗ, chúng làm hoạt hóa nội mô Chúng còn gây sốt, làm tăng lượng bạch

cầu đa nhân trung tính, tăng nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen Còn IL-8 là một tác nhân gây hóa ứng động và hoạt hóa mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác, chủ yếu là TNF và IL-1

* Hệ thống bổ thể

Hệ thống bổ thể có các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch C5a hoạt hóa con đường chuyển hóa LOX của acid arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng các chất trung gian hóa học của quá trình viêm, C5a còn là tác nhân gây hóa ứng động mạnh bạch cầu

* Bradykinin: Bradikinin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch

Hệ thống đông máu và tiểu tơ huyết Hệ thống đông máu là một loạt những protein huyết tương có thể bị hoạt hóa bởi yếu tố Hageman Bước cuối cùng là

sự chuyển fibrinogen thành fibrin Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid được hình thành, nó gây tăng tính thấm mao mạch và nó có hoạt

tính hóa ứng động đối với bạch cầu

* Oxyd nitơ: NO do đại thực bào sản xuất, có tác dụng làm giãn mạch,

tăng tính thấm thành mạch, tăng sản xuất các PG gây viêm Tuy nhiên nếu đại thực bào bị hoạt hóa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây giãn mạch quá mức, gây sốc nhiễm khuẩn

1.3.3 Các loại thuốc chống viêm [5]

1.3.3.1 Thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs, CVKS)

Các CVKS có tác dụng trên hầu hết các loại viêm không kể đến nguyên nhân, theo các cơ chế sau:

- Ức chế sinh tổng hợp prostaglandin (PG) do ức chế có hồi phục cyclooxygenase (COX), làm giảm PGE2 và PGF1α là những trung gian hóa học của phản ứng viêm (Vane và cộng sự 1971)

- Làm vững bền màng lysosom (thể tiêu bào): ở ổ viêm, trong quá trình thực bào, các đại thực bào làm giải phóng các enzym của lysosom (hydrolase, aldolase, phosphatase acid, collagenase, elastase ), làm tăng thêm quá trình

viêm Nhờ khả năng làm vững bền màng lysosom, các thuốc CVKS có thể ngăn cản giải phóng các enzym phân giải, ức chế quá trình viêm

- Ngoài ra có thể còn có thêm một số cơ chế khác như đối kháng với các chất trung gian hoá học của viêm do tranh chấp với cơ chất của enzym, ức chê

di chuyển bạch cầu, ức chế phản ứng kháng nguyên- kháng thể

Một số thuốc: aspirin, indomethacin, piroxicam, ibuprofen, diclfenac

1.3.3.2 Thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid)

Glucocorticoid là thuốc chống viêm mạnh nhất và thường được dùng nhất trong các bệnh viêm cấp và mạn tính như hen, viêm mũi dị ứng, thấp khớp, lupus ban đỏ Thuốc tác dụng trên nhiều giai đoạn khác nhau của quá trình viêm do bất cứ nguyên nhân gì, nên ngăn cản được các biểu hiện lâm sàng của viêm như sốt, tấy đỏ, sưng, đau Ở giai đoạn sớm của viêm glucocorticoid ức chê các yếu tô hóa ứng động và các cytokin thúc đẩy viêm, làm giảm luồng đại thực bào và bạch cầu hạt kéo đến ổ viêm Hơn nữa, glucocorticoid còn làm giảm tiết các chất vận mạch như serotonin, histamin và

do đó đối kháng với sự tăng tính thấm thành mạch Glucocorticoid ức chế phospholipase A2, làm giảm tổng hợp và giải phóng leucotrien, PG Tác dụng này là gián tiếp vì glucocorticoid làm tăng sản xuất lipocortin, là protein có mặt trong tế bào, có tác dụng ức chế phospholipase A2 Khi phospholipase A2

bị ức chế, phospholipid không chuyển được thành acid arachidonic Điều đó giải thích tác dụng chống viêm của glucocorticoid mạnh hơn tác dụng chống viêm của các CVKS vì các thuốc này chỉ ức chế được sinh tổng hợp PG mà thôi Glucocorticoid tác dụng ngay cả ỏ giai đoạn đang viêm: ức chế mạnh nitric oxyd (NO) synthetase, làm giảm sản xuất gốc tự do NO trong đại thực bào Thuốc còn ức chê sản xuất các protease trung tính như collagenase, elastase

1.3.3.3 Thuốc chống viêm theo y học cổ truyền

Theo quan điểm của y học cổ truyền, viêm là triệu chứng của cơ thể khi

bị nhiễm độc Nguyên nhân nhiễm độc có thể do bên trong ( do phủ tạng hoạt động yếu, không đủ sức thanh thải chất độc ), hoặc do bên ngoài ( do côn trùng cắn, hơi hóa chất, ngộ độc thức ăn ) Các thuốc chống viêm theo y học

cổ truyền thường là các thuốc có tác dụng thanh, tiêu, hoạt như thuốc thanh nhiệt giải độc, thanh nhiệt táo thấp, thuốc trừ thấp, thuốc hoạt huyết

Có rất nhiều dược liệu và bài thuốc cổ truyền có tác dụng chống viêm

đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian Các dược liệu như: Kim ngân, Ngưu tất, Núc nác, Khương hoạt, Dây đau xương, Cốt toái bổ

Một số bài thuốc chống viêm như là: Độc hoạt tang ký sinh, Cao tiêu viêm, Ngân kiều tán

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về các dược liệu và các bài thuốc có tác dụng chống viêm đã và đang được thực hiện

Như : Nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm đau của bài “Độc hoạt II” trong một số bệnh viêm khớp của Hoàng Bảo Châu và các cộng sự, được đăng trên Thông tin YHCT số 68/1992

Nghiên cứu tác dụng giảm đau chống viêm của loài Stephania dielsana.Y.C thu hái ở Ba Vì ( Hà Nội), của Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh

Kỳ, Nguyễn Trọng Thông, Trần Thanh Tùng Trường Đại học Dược HN, trường Đại học Y HN

Nghiên cứu tính chất hóa thực vật, độc tính cấp và tác dụng chống viêm của cây Sang pác trên động vật thực nghiệm của tác giả Phan Văn Các và cộng sự Được đăng trên " Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học trường Đại học y Thái Nguyên năm 1998

Ngiên cứu dược lý thực nghiệm và lâm sàng của thuốc PT5 trên các bệnh thấp khớp Luận án phó tiến sĩ khoa học Y Dược, trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh của Nguyễn Thị Bay năm 1996

Tại Việt Nam, cây Dóng xanh thường được trồng làm cây cảnh Lá được dùng giã lấy nước uống và bã đắp trị rắn cắn, còn dùng nấu nước xông trị đau răng Đồng bào dân tộc Tày ở Lạng Sơn sử dụng cây Dóng xanh

Justicia ventricosa Wall để trị bệnh đau xương, thấp khớp.[16]

Tuy nhiên Dóng xanh lại chưa được nghiên cứu và chưa có bất kì công trình khoa học trong nước hay trên thế giới nghiên cứu về loại dược liệu này

Vì vậy nhằm góp phần làm sâu sắc hơn tri thức cũng như cung cấp các bằng chứng khoa học nhằm chứng minh tác dụng của Dóng xanh trong dân gian và

cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn, tiềm năng phát triển thuốc mới

từ loài dược liệu này, chúng tôi thiết kế nghiên cứu nhằm chứng minh đặc điểm thực vật và một số tác dụng sinh học của loài dược liệu này

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu cây “Dóng xanh” thu hái bộ phận trên mặt đất, huyện Thường

Tín - Hà Nội Cây Dóng xanh lấy giống từ Lạng Sơn, được mang về Thường Tín – HN trồng Các mẫu cây được chụp ảnh, xử lý, làm tiêu bản và lưu trữ tại: Bộ môn Thực vật – Trường Đại Học Dược Hà Nội

- Toàn cây phần trên mặt đất thu hái vào tháng 3 (mẫu T3), năm 2017, rửa sạch, phơi âm can, sấy khô ở nhiệt độ 40o C

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu( Hình 2.1)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu về thực vật học

❖Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của cây: Theo

phương pháp mô tả phân tích, so sánh hình thái trong phân loại thực vật Việc

xác định này được dựa theo các khóa phân loại chi Justicia L của

A.L.Takhtajan (1996) [11] [46] Với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật cây thuốc của Trường Đại học Dược Hà Nội

❖Nghiên cứu đặc điểm vi học: Nghiên cứu đặc điểm vi học theo

phương pháp thông thường: Cắt, làm tiêu bản vi phẫu thân Dóng xanh, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi

❖ Soi bột: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C, sau đó dùng thuyền tán nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hoá học

❖ Hóa chất, dụng cụ đã dùng trong nghiên cứu

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại

ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi hơ nóng từ từ cho đến khi hiện màu

Cây Dóng xanh (phần trên mặt đất)

Tác dụng chống viêm

Định tính

Chiết tách nhóm chất

Phân lập và xác định cấu trúc

- Sắc ký cột (CC) được tiến hành với pha tĩnh là pha thường (Silica gel

60, 0,04-0,06mm, Merck) hoặc pha đảo YMC-C18 (Fujisilisa - Nhật Bản), và bột sắc ký Sephadex LH-20 (Sigma)

- Các dung môi kỹ thuật gồm cồn 96%, methanol, ethyl acetat, acetone, hexan và nước cất 1 lần

- Dụng cụ thuỷ tinh gồm cốc thuỷ tinh, phễu chiết, cột sắc ký, ống nghiệm, ống đong, bình cầu nhám…

❖ Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu:

- Bể chiết siêm âm Elma S40/H

- Máy cất quay chân không Buchi

- Máy hứng phân đoạn tự động Eyela

- Cân phân tích Ohaus

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi bằng máy BRUKER AVANCE 500 MHz

- Phổ khối lượng phun mù điện tử đo trên máy Agilent 1260 series LCMS single quadrupole

2.2.3.1 Phương pháp định tính

Định tính các nhóm chất hữu cơ thường có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm hợp chất

2.2.3.2 Phương pháp chiết xuất phân lập các hợp chất [13]

Phân lập các hợp chất trong dược liệu Dóng xanh bằng sắc ký cột và SKLM điều chế Theo dõi các phân đoạn sắc ký bằng SKLM:

+SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G

F254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại

ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

+ SKLM điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, phản hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

+ Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa

Chemical Ltd.)

2.2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật

lý và các phương pháp phổ bao gồm: phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

+ Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D và 2D-NMR) được đo trên máy NMR AM500 FT–NMR Spectrometer

Hình 2.2 Sơ đồ chiết các phân đoạn

2.2.4 Phương pháp thử tác dụng dược lý

❖ Mẫu nghiên cứu

- Các chế phẩm chiết từ phần trên mặt đất của cây Dóng xanh dùng nghiên cứu độc tính (liều dùng trong các thí nghiệm được qui từ dược liệu) :

+ Dịch chiết nước từ phần trên mặt đất tỉ lệ (1:1): Dược liệu Dóng xanh phơi phô, xay nhỏ, thêm nước tỷ lệ 1:2, đun sôi trong 6h, rút dịch chiết, cô

❖ Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu:

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu thử

- Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường

- Thử nghiệm thăm dò: nghiên cứu thăm dò trên một số chuột hạn chế để xác định được khoảng liều từ liều cao nhất không gây chết động vật đến liều thấp

nhất gây chết 100% động vật (nếu có) và liều cao nhất chuột có thể dung nạp được qua đường uống

- Thử nghiệm chính thức: động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô

10 động vật Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật

- Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi uống chế phẩm thử lần cuối)

❖ Theo dõi, đánh giá

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu…

- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

- Liều cao nhất mà động vật có thể dung nạp được

- Liều thấp nhất bắt đầu thể hiện độc tính- Số động vật chết: xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính toán LD50

- Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu có dấu hiệu đáng nghi ngở mà không xác định được rõ nguyên nhân, nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

- Tiếp tục theo dõi động vật cho đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử

❖ Phương pháp xử lý số liệu

- Xác định LD50 bằng phương pháp phân tích hồi qui probit trên phần mềm SPSS

- Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Mỹ)

- Phosphate buffer saline (PBS, Gibco, Mỹ)

- Fetal bovine serum (FBS, Gibco, Mỹ)

hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng

viêm

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các

thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite) Phản ứng này đòi hỏi rằng

nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate

reductase

tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với

thuốc thử Griess

Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các

thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo

thành màu hồng

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh

giá khả năng sống sót của tế bào Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase

hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng

formazan không hoà tan, màu tím đậm Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra

từ lượng formazan tạo thành từ MTT Lượng formazan tạo thành được hoà tan

bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570

mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc

đánh giá khả năng sống sót của tế bào