Xây dựng công tác xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN LỆ HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN LỆ HOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT

ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN LỆ HOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT

ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 8720210

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều

Anh, người đã hướng dẫn và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu,

hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm Nghiệm

Thuốc Trung Ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong quá trình tạo nền mẫu của nghiên cứu

Tôi xin gửi lời chân thành cám ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, tháng 3 năm 2018

Học viên Trần Lệ Hoa

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình trộn các chất tân dược trong các chế phẩm đông dược 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam 6

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 8

1.2.1 Amlodipin besylat 8

1.2.2 Nifedipin 9

1.2.3 Valsartan 10

1.2.4 Felodipin 11

1.3 Các nghiên cứu xác định các thuốc hạ huyết áp trộn trái phép vào các chế phẩm Đông Dược 12

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 14

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 14

1.4.2 Phương pháp HPLC 15

Phần 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Chế tạo nền mẫu 20

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 20

2.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 22

2.2.5 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường 22 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23

Phần 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

3.1 Chuẩn bị nền mẫu 24

3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 25

3.2.1 Xây dựng phương pháp HPLC 25

3.2.2 Xây dựng phương pháp HPTLC 29

3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32

3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 36

3.5 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường 49

3.5.1 Kết quả phân tích mẫu thực bằng HPTLC 50

3.5.2 Kết quả phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPLC 52

Chương 4 : BÀN LUẬN 54

4.1 Tạo nền mẫu 54

4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 54

4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 54

4.2.2 Xây dựng phương pháp sắc ký 55

4.2.3 Lựa chọn xử lý mẫu 56

4.3 Thẩm định phương pháp 57

4.4 Ứng dụng 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association

of Official Analytical Chemists)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin

Layer Chromatography) ICH International Conference on Harmonisation

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Các nền mẫu nghiên cứu 24

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thành phần pha động HPLC 26

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) 35

Bảng 3.4: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống 36

Bảng 3.5: Kết quả xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của AML, NIF, VAL, FEL bằng HPLC 39

Bảng 3.6: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính 40

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại (phương pháp HPLC) 43

Bảng 3.8: Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày (phương pháp HPLC) 44

Bảng 3.9: Kết quả xác định LOD của phương pháp HPTLC 49

Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu ứng dụng bằng phương pháp HPLC 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của amlodipin besylat 8

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của nifedipin 9

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của valsartan 10

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của felodipin 11

Hình 1.5: Sơ đồ hệ thống HPLC 16

Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích các chất với pha động MeOH : Dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (55 – 45) 27

Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký 28

Hình 3.3: Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu 28

Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC 30

Hình 3.5: Sắc ký đồ lựa chọn hệ pha động HPTLC 31

Hình 3 6: Sắc ký đồ phát hiện ở 366 nm 32

Hình 3.7: Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết 33

Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp (238nm) 38

Hình 3.9: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp (360 nm) 38

Hình 3.10: Sắc ký đồ LOD AML, NIF nồng độ 0,5µg/ml (nền N03) 39

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của AML, NIF, VAL, FEL 41

Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp HPTLC 46

Hình 3.13: Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của phương pháp HPTLC 48 Hình 3.14: Sắc ký đồ analog xác định LOD của phương pháp HPTLC 49

Hình 3.15: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPTLC 51

Hình 3.16: Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu chuẩn và mẫu M05 53

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2000, toàn thế giới có tới 972 triệu người bị tăng huyết áp (THA) và con số này được ước tính là vào khoảng 1,56 tỷ người vào năm 2025 Tại Việt Nam, năm 2000 có khoảng 16,3% người lớn bị THA, đến năm 2009 tỷ lệ THA ở người lớn tuổi là 25,4% và năm

2016 tỷ lệ người lớn tuổi bị THA đang ở mức báo động là 48%, một mức báo động đỏ trong thời điểm hiện tại [16]

Cùng với tỷ lệ người mắc bệnh tăng huyết áp ngày càng cao thì nhu cầu sử dụng thuốc hạ huyết áp ngày càng lớn Phác đồ điều trị bằng thuốc hạ huyết áp

là thường xuyên và liên tục, dẫn đến sự lo ngại của người dùng về những tác dụng phụ do thuốc hóa dược gây ra Xu hướng hiện nay người sử dụng thường tìm về với những sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược Trên thị trường, có nhiều chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết

áp cũng như các bệnh liên quan đến tăng huyết áp (tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim,…) được lưu hành để đáp ứng nhu cầu của người bệnh Tuy nhiên, với mục đích nâng cao lợi nhuận có một số đơn vị sản xuất trộn thuốc tân dược vào chế phẩm thuốc đông dược hay thực phẩm bảo vệ sức khỏe Đã có nhiều công bố trên thế giới phát hiện được một số thuốc hạ huyết áp như amlodipin, nifedipin, valsartan, hydrochlorothiazid, clonidin,… thêm bất hợp pháp vào các chế phẩm đông dược [32], [41], [23],[36] Sự gian lận này được thực hiện nhằm tạo ra các khả năng trị liệu không phải từ các thành phần được khai báo Đây đang là một trong những vấn đề rất đáng lo ngại

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn không khai báo trong các sản phẩm Đông dược, chủ yếu tập trung vào các nhóm thuốc như glucocorticoid, thuốc chống viêm không steroid, thuốc giảm hạ glucose máu, thuốc giảm béo, thuốc ức chế PDE -5,… [2], [9], [10], [13], [15], nhưng chưa công bố nghiên cứu nào về việc trộn lẫn các nhóm thuốc hạ huyết áp trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng Phương pháp hay được sử dụng trong

Với mục đích góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn

lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng phương pháp xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC” Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định amlodipin besylat, nifedipin, valsartan, felodipin trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để xác định amlodipin besylat, nifedipin, valsartan, felodipin trộn lẫn trong một số chế phẩm đông dược (nếu có)

3

Phần 1 : TỔNG QUAN 1.1 Tình hình trộn các chất tân dược trong các chế phẩm đông dược 1.1.1 Trên thế giới

Trong những năm gần đây, xu hướng chọn sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên để phòng, hỗ trợ và điều trị bệnh ngày càng được ưa chuộng hơn bởi người ta cho rằng các sản phẩm này ít có những tác động có hại và phù hợp với sinh lý của cơ thể Theo WHO và cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ cho rằng các thuốc từ thảo dược bao gồm các vitamin, khoáng chất, thảo dược, sản phẩm thực vật, acid amin, các chất dinh dưỡng Các chế phẩm từ thảo dược thường được bán hoặc mua qua đơn thuốc qua quầy thuốc (OTC) hoặc là người dùng tự sử dụng Mặc dù các loại thảo dược đã sử dụng từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về an toàn và hiệu quả của nó Chế phẩm từ thảo dược chưa được quy định và được tự do mua bán từ các cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị, và trên internet Do quy định ít chặt chẽ, thuốc thảo dược dễ

bị kém chất lượng và pha trộn với thuốc tổng hợp (tân dược) không khai báo Các nhóm thuốc tân dược hay được trộn vào là nhóm thuốc giảm glucose máu, thuốc glucocorticoid, thuốc giảm đau không steroid, thuốc hạ huyết áp, thuốc giảm béo, thuốc ức chế phosphodiestarase-5, thuốc kháng histamin, chất kích thích tăng khả năng thi đấu trong thể thao,

Nhóm dược chất hay bị trộn nhất là glucocorticoid Ở Anh đã phát hiện nhiều trường hợp người bệnh nhập viện điều trị do tác dụng phụ khi dùng kem dược liệu có trộn lẫn hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, clobetason propopnat [38] Tại Ả Rập Xê Út, Maciej Bogus và cộng sự đã tiến hành khảo sát 80 loại thuốc tân dược thuộc nhiều nhóm dược lý khác nhau, thường được trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC-MS/MS, kết quả phát hiện bột dược liệu “Jamu Ragel” từ Indonesia với chỉ định giảm đau thấp khớp chứa tân dược giảm đau chống viêm phenylbutazon và dipyron [26] Tại Ấn Độ, Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược

4

chất gồm cả giảm đau, chống viêm steroid và không steroid bằng LC-MS/TOF

và phát hiện mẫu đông dược chứa các thuốc giảm đau chống viêm như diclofenac, dexamethason, piroxicam [40] Tại Singapore, năm 2003 Aik-Jiang Lau và cộng sự đã phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký hai lần khối phổ (LC-MS/MS) [34]

Một nhóm dược chất cũng hay bị trộn vào chế phẩm đông dược là thuốc chống đái tháo đường Mei Cui sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp với DAD để xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp trong các thuốc cổ truyền của Trung Quốc Kết quả có 7 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid, metformin, phenformin, rosiglitazon, gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ 9 trong số 26 mẫu thuốc cổ truyền thu thập được [27] Ning Li sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất hợp pháp trong thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng của Trung Quốc Kết quả có 9 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin, gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30 mẫu thu thập từ thị trường [37] Đặc biệt, chất có tác dụng tăng cường sinh lý nam giới cũng là một trong những nhóm thuốc có tỷ lệ trộn rất cao thông qua nhiều nghiên cứu đã phát hiện

ra Ở Hàn Quốc, một nghiên cứu tiến hành trong 4 năm (2009 - 2012) trên 164 mẫu thực phẩm chức năng được quảng cáo tăng cường sinh lý nam giới cho thấy 77 mẫu phát hiện có chứa chất ức chế PDE-5 gồm có 55 mẫu phát hiện tadalafil, 36 mẫu phát hiện sildenafil, 17 mẫu phát hiện đồng phân của tadalafil (aminotadalafil, chloropretadalafil, octylnortadalafil), 17 mẫu phát hiện đồng phân sildenafil (dimethylsildenafil, dimethylthiosildenafil, hydroxyhomosildenafil, …), một số mẫu phát hiện vardenafil cùng đồng phân (hydroxyvardenafil) và Icariin [31], [35] Khảo sát gần đây được tiến hành bởi một nhóm người Pháp phát hiện ra rằng 61% trong số 150 thực phẩm

5

chức năng đã được pha trộn với các chất ức chế PDE-5 (27% sildenafil, tadalafil

và vardenafil; 34% từ các chất có cấu trúc tương tự) [29]

Khaled Al-Tahami sử dụng phương pháp HPLC và TLC để phát hiện sildenafil, tadalafil và vardenafil trộn trong các thực phẩm chức năng Kết quả

đã phát hiện ra 21 mẫu sản phẩm có chứa sildenafil trong đó có 1 sản phẩm chứa sildenafil và tadalafil và 1 sản phẩm chứa đồng thời cả ba chất sildenafil, tadanafil và vardenafil [25]

Tiên T.K Do và cộng sự đã sử dụng HPTLC và HPTLC- ESI/MS để phát hiện 3 chất ức chế PDE -5 (sildenafil, vardenafil, tadalafil) và 8 chất tương tự chúng trong viên nén, viên nang, cafe, kẹo nhai Kết quả thu được cho thấy trong 45 mẫu được kiểm tra thì có 31 mẫu có chứa ít nhất 1 trong các chất sildenafil, tadalafil, propoxyphenyl, dimethyl sildenafil hydroxyhomosildenafil [28]

Reni Septiani và Sophi Damayanti đã sử dụng HPTLC để phát hiện caffein, acetaminophen, sildenafil citrat, tadalafil và vardenafil HCl trong các thuốc cổ truyền của Indonesia [39]

Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các thuốc điều trị cao huyết áp cũng là nhóm thuốc thường được trộn trái phép Julie Regitze Kesting và cộng sự đã sử dụng LC–HRMS và LC–MS–SPE/NMR phân tích viên nang mềm Gold Night một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp, kết quả phát hiện ba chất amlodipine, indapamin, valsartan được trộn trái phép trong viên nang với hàm lượng amlodipine, indapamin và valsartan trong mỗi viên lần lượt khoảng 1,3 mg; 1,3 mg và 30,8 mg [32] Rui Zhang và cộng sự sử dụng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại (NIR) để phát hiện nifedipin, diclofenac, metformin trong các thực phẩm bổ sung Trong số các mẫu mua được trên thị trường phát hiện 38 mẫu dương tính với nifedipin, 13 mẫu dương tính với diclofenac, 35 mẫu dương tính với metformin Phương pháp này được kiểm tra lại bằng HPLC và 100% không có kết quả dương tính giả [41]

6

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ thuốc không đạt chất lượng theo tiêu chuẩn đăng ký chiếm khoảng 1,59% trong tổng số mẫu lấy để kiểm tra chất lượng [14] Trong

đó tỷ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng cao hơn nhiều so với các thuốc hóa dược Do nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược trong nước ngày càng tăng Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng tăng Hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài thuốc gia truyền được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược; các chế phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược Các chế phẩm này thường được sử dụng để điều trị hoặc hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh gan, thận, tim-mạch…

Tại Việt Nam, chế phẩm đông dược có mặt trên thị trường trong nước hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, đa cấp, siêu thị, … nên có nguy cơ cao các sản phẩm này được làm giả gây ra nhiều tác dụng không muốn khi sử dụng cho người dùng Năm 2009, VKN thuốc Trung ương phát hiện thuốc Giải Biểu Hoàn của một lương y ở Bắc Giang và thuốc Chỉ Thống của một lương y ở Bắc Ninh có trộn paracetamol Năm 2010 đã phát hiện cơ sở sản xuất thuốc Y học cổ truyền Hinh Hòa có mẫu Khu Phong Tê Thấp Thủy và Truy Phong Tê Thấp Thủy bị trộn betamethason Một số mẫu thuốc đông dược điều trị gút cũng bị phát hiện có paracetamol, indomethacin hay dexamethason acetat [15] Trịnh Thị Quy đã tiến hành phân tích ba glucocorticoid (dexamethason, prednislon acetat, dexamethason acetat) trộn trái phép trong thuốc đông dược bằng phương pháp

29 mẫu thu thập trên thị trường [9]

Tiếp tục những nghiên cứu về các chất không khai báo được trộn trong các

chế phẩm đông dược nhóm nghiên cứu Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự đã sử

dụng phương pháp HPTLC để phát hiện và định lượng 2 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp metformin và glibenclamid trộn trái phép trong 41 mẫu chế phẩm đông dược và TPCN Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên, thuốc tán, trà túi lọc Kết quả, 41 mẫu âm tính với metformin; glibenclamid được tìm thấy từ 8 trong số 41 mẫu thu thập được Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi 0,18 mg/viên tới 2,21 mg/viên, lượng này tính theo liều dùng với 1 số mẫu là từ 1,8 mg/liều đến 2,2 mg/liều [12]

Năm 2010, VKN thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên

Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng, dùng để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép sildenafil (một chất ức chế men phosphodiestarase -5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98 mg/ viên Năm 2014, Cục an toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty TNHH Thương mại dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên)

và sildenafil (123 mg/viên) Gần đây, sản phẩm “Avena plus” của công ty TNHH MTV đầu tư và thương mại xuất nhập khẩu Việt Nam Canoves và sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Uy Mãnh Nang của Công ty TNHH Xuất Nhập khẩu Thiết bị Y tế Minh Bang Việt Nam đã bị Viện kiểm nghiệm an

8

toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia phát hiện có chứa sildenafil và cục An toàn thực phẩm đã có quyết định tạm dừng lưu thông, thu hồi lô 2 sản phẩm trên Một số nghiên cứu trên đã chỉ rõ nhưng nhóm thuốc tổng hợp gồm nhóm thuốc giảm đau, chống viêm, thuốc giảm glucose máu, thuốc ức chế PDE-5, nhóm thuốc giảm béo, nhóm thuốc hạ huyết áp và lợi tiểu nhau thường xuyên được trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp, gout, bệnh tiểu đường, bệnh liệt dương, bệnh tim mạch và bệnh béo phì Việc trộn các tân dược vào đông dược rất khó phát hiện, vì trong đông dược có chứa nhiều thành phần, nền mẫu phức tạp Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi,

do đó cần phải áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại có tính chọn lọc và độ nhạy cao mới có thể phát hiện được các chất giả mạo này

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.2.1 Amlodipin besylat

Công thức cấu tạo

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của amlodipin besylat

- Công thức phân tử: C20H25ClN2O5.C6H6O3S

- Khối lượng phân tử: 567, 05

- Tên khoa học: 3Ethyl 5methyl (±) 2 [(2aminoethoxy)methyl] – 4 (o chlorophenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-3,5-pyridinedicarboxylate=,

-monobenzensulfonate [18]

9

- Tính chất: Dễ tan trong MeOH, khó tan trong nước và 2-propanol [1], [17]

- Đặc tính phổ hấp thụ UV: Dung dịch AML trong dung dịch HCL 0,1N trong MeOH có cực đại hấp thụ tại 360 nm (quét phổ từ 300nm đến 400nm) [1]

- Nhiệt độ nóng chảy: 209,98oC

- Công dụng: AML thuộc nhóm phong bế kênh calci làm hạ huyết áp Chỉ định trong tăng huyết áp và phòng cơn đau thắt ngực

- Loại thuốc: Chẹn kênh calci

- Tác dụng không mong muốn: Giãn mạch gây hạ huyết áp quá mức khi không có điều chỉnh liều, nhất là khi phải dùng thuốc kéo dài; hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, phù ngoại vi [4], [8]

- Dạng thuốc và hàm lượng: Viên nén 2,5 mg, 5 mg, 10 mg Viên nang 5 mg,

10 mg

- Liều lượng: Để điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực, liều phải phù hợp cho từng người bệnh Nói chung, khởi đầu với liều bình thường là 5 mg, 1 lần cho 24h Liều có thể tăng đến 10 mg cho 1 lần trong 1 ngày [7]

1.2.2 Nifedipin

Công thức cấu tạo

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của nifedipin

- Công thức phân tử: C17H18N2O6

10

2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

trong aceton Dưới ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng nhân tạo ở bước sóng nhất định, chế phẩm dễ dàng chuyển thành dẫn chất nitrosophenylpyridin Dưới ánh sáng tử ngoại chế phẩm chuyển thành dẫn chất nitrophenylpyridin Các dung dịch chế phẩm phải được pha ngay trước khi sử dụng, pha trong tối hoặc dưới ánh sáng có bước sóng dài (> 420 nm) và bảo quản tránh ánh sáng thường hoặc

uống 2 lần Hoặc 30 – 90 mg ngày uống 1 lần tùy theo chế phẩm [7]

1.2.3 Valsartan

Công thức cấu tạo

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của valsartan

- Công thức phân tử: C24H29N5O3

11

- Khối lượng phân tử: 435,52

- Tên khoa học: N-[p-(o-1H-Tetrazol-5-yl phenyl) benzyl]-N-valeryl-Lvaline [18]

- Tính chất vật lý – hóa học: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm Không tan trong nước, tan tự do trong ethanol khan, hơi tan trong methylen clorid

- Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp, điều trị suy tim

- Loại thuốc: Đối kháng thụ thể angiotensin II

- Tác dụng không mong muốn: Hạ kali máu, suy thận cấp, phù mạch thần kinh…[8]

- Dạng dùng: Viên nang 40, 80 mg

- Liều lượng: Uống 40 – 80 mg/ ngày [4]

1.2.4 Felodipin

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của felodipin

- Công thức phân tử: C18H19Cl2NO4

- Khối lượng phân tử: 384,523

- Tên khoa học: 5-O-ethyl 3-O-methyl 1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethyl Tính chất vật lý, hóa học: Bột màu trắng hoặc gần như trắng Khó tan trong nước và 2-propanol, tan nhiều trong MeOH [17]

12

- Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp

- Loại thuốc: Chẹn kênh calci

- Tác dụng không mong muốn: Chậm nhịp tim, nghẽn nhĩ thất, rối loạn tiêu hóa

- Chế phẩm và liều dùng: Viên nén 2,5 mg, 5 mg, 10 mg tác dụng kéo dài Liều khởi đầu 2,5 mg Thường dùng 5 – 10 mg/lần/ngày [4]

1.3 Các nghiên cứu xác định các thuốc hạ huyết áp trộn trái phép vào các chế phẩm Đông Dược

Ana P L Moreira và cộng sự xây dựng phương pháp UHPLC-ESI-MS/MS định lượng đồng thời 13 thuốc nhóm hạ huyết áp (β-block, angiotensin II, ức chế men chuyển angiotensin và lợi tiểu) Thời gian phân tích 6 phút, triển khai trên cột Zorbax SB - C18 với hệ dung môi gồm MeOH và dung dịch acid acetic 0,1% Các chất trong mẫu thử được chiết bằng dung môi là MeOH Giới hạn phát hiện từ 0,02 đến 2,52 mg/L; độ chính xác từ 80,56% đến 111,28% đối với các chất nghiên cứu Các chất hydrochlorothiazid và furosemid được khai báo trong 5/34 mẫu được phân tích Tuy nhiên hàm lượng được tìm thấy lại thấp hoặc cao hơn liều dùng được khuyến cáo Hydrochlorothiazid phát hiện với liều

từ 5,24 – 39,98 mg/liều/ngày, với liều dùng được khuyến cáo từ 12,5 – 25 mg/ngày Furocemid được tìm thấy với mức 38,44 - 92,7 mg/liều ngày, với liều được khuyến cáo là 20 – 40 mg/ngày [33]

Trong nghiên cứu của mình, Julie Regitze Kesting và cộng sự đã sử dụng LC–HRMS và LC–MS–SPE/NMR phân tích viên nang mềm Gold Night một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp Mẫu được chiết bằng hỗn hợp ACN : H2O ( 1: 1) và phân tích trên thiết bị LC -HRMS với cột ZORBAX Eclipse Plus (C-18; 1,8 m) 3,0 mm×50 mm), pha động ACN : nước : dung dịch acid formic 0,1% chạy theo chế độ gradient, tốc dòng 1 mL/phút Thiết bị LC–MS–SPE/NMR sử dụng cột Phenomenex Max-RP (C-12; 4 m) 4,6 mm×250 mm), pha động ACN : nước : dung dịch acid formic 0,1% chạy theo

13

chế độ gradient, tốc dòng 0,75 mL/phút Nghiên cứu phát hiện ba chất amlodipin, indapamin, valsartan được trộn trái phép trong viên nang với hàm lượng amlodipin, indapamin và valsartan trong mỗi viên lần lượt khoảng 1,3 mg, 1,3 mg và 30,8 mg Độ chính xác của phương pháp khá cao với độ thu hồi amlodipin 97,79 ± 3,4%, indapamin 100,08 ± 5,47% và valsartan 105,81% Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một phần valsartan được hấp thu vào vỏ nang gelatin [32]

Để xác định 18 loại thuốc dùng để điều trị cao huyết trong các thực phẩm chức năng và các thuốc cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản, Y.L Lu và cộng sự sử dụng phương pháp LC/MS với cột XtimateTM 5 µm; 250 x 4,6 mm Pha động

là MeOH : ACN ( kênh A) và dung dịch đệm amoni format 20mM chạy theo chế độ gradient Mẫu được chiết bằng dung môi MeOH : H2O, siêu âm 30 phút,

ly tâm thu được dịch sắc ký Giới hạn phát hiện từ 6,5 – 86 µg/kg Độ thu hồi của phương pháp từ 71 – 109% Trong số các mẫu được kiểm tra hydroclorothiazid, clonidin được tìm thấy trong 9/35 mẫu thuốc được tìm được với tỷ lệ khoảng 1,1% - 1,3 % với hydrochlorothiazid và 0,11% - 6,5% đối với clonidin [36]

Tại Hàn Quốc Seok Heo và cộng sự đã sử dụng phương pháp UPLC – UV

để phát hiện đồng thời 25 chất có tác dụng điều trị cao huyết áp trong thực phẩm

bổ sung 25 chất được xác định là amlodipin, atenolol, candesartan, cilexetil, carteolol, celiprolol, diltiazem, doxazosin, felodipin, irbesartan, lercanidipin, losartan, minoxidil, nadolol, nilvadipin, nisoldipin, nitrendipin, olmesartan, penbutolol, phentolamin, pindolol, prazosin, propranolol, telmisartan, terazosin

và valsartan Hệ thống UPLC của Waters, sử dụng cột Waters UPLC HSS C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,8 µm) Sử dụng pha động gồm A là dung dịch natri 1-hexanesulfonat 0,5 mM và B là ACN 95% Mẫu được chiết siêu âm bằng MeOH trong 30 phút Trong số 97 mẫu được kiểm tra phát hiện 2 mẫu chứa atenolol có hàm lượng 16,81 – 28,07 µg/kg [30]

14

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HPTLC là một hình thức tân tiến của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, trong HPTLC người ta

sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì

15

vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC[22]

❖ Ưu điểm của HPTLC

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng

- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ,

độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu

1.4.2 Phương pháp HPLC

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [3]

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector Nếu ghi quá trình sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc ký đồ gồm nhiều pic Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ [3] Cấu tạo chung của một máy HPLC được trình bày trong hình 1.4

16

Hình 1.5:Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó:

1: Bình chứa pha động 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

2: Bộ phận khử khí 6: Đầu dò

3: Bơm cao áp 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín

hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống

4: Bộ phận tiêm mẫu 8: In dữ liệu

❖ Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất

phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

- Detector UV-VIS: Detector này thực chất là một máy đo quang phổ UV – VIS Hạn chế của detector này là chỉ sử dụng được bước sóng đã lựa chọn Đối với các chất không hấp thụ quang tại bước sóng đã chọn thì không phát hiện được Đối với các chất hấp thụ quang yếu tại bước sóng đã chọn thì cho độ nhạy thấp

- DAD (phosphodior array detector): Có khả năng quét và chồng phổ để định tính các chất dựa trên phổ hấp thụ của các chất và phổ của nó so với chuẩn

- Detector huỳnh quang: Sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang Đối với các chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa phân tích để tạo sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

17

- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường

- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa

Ngoài ra còn tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối (MS) trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký

❖ Ứng dụng của HPLC

Định tính

Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử là cơ sở của phép thử định tính Với detector DAD hệ số Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng sử dụng đánh giá định tính chất phân tích [3], [4]

Định lượng

Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký là cơ sở của phép định lượng

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng:

- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện sắc ký Kết quả hàm lượng mẫu thử được tính toán dựa trên nồng độ đã biết của mẫu chuẩn và đáp ứng của chất phân tích (diện tích hay chiều cao pic) của mẫu chuẩn và mẫu thử

- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội Từ những dữ kiện về diện tích pic (hay chiều cao pic) và nồng độ của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử

- Phương pháp thêm chuẩn: chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi

có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (Ví dụ: tá dược) Dung dịch mẫu thử

18

được thêm vào một lượng xác định chất chuẩn Các pic thu được của hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải được tiến hành trong cùng điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích pic (hoặc chiều cao pic)

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: nồng độ của mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic tính theo tỉ lệ phần trăm diện tích pic chất thử trên tổng diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nếu không như nhau thì khi đó với mỗi chất cần có một hệ số hiệu chỉnh Phương pháp này thường dùng để định lượng tạp chất không định danh hoặc tạp chất liên quan [6], [5]

❖ Ưu điểm của phương pháp HPLC:

Phương pháp HPLC có khả năng phát triển với nhiều hệ pha tĩnh khác nhau, hiệu lực tách tốt, có thể phát hiện các chất bằng nhiều loại detector khác nhau, mang tính chọn lọc và độ nhạy cao như detector huỳnh quang, khối phổ Đối với kiểm nghiệm thuốc, HPLC đang là phương pháp được áp dụng nhiều nhất để định tính và định lượng các dược chất đặc biệt là trong phân tích các thuốc đa thành phần, các chất có hàm lượng thấp Cùng với sự phát triển về công nghệ chế tạo chất nhồi cột đặc biệt, tối ưu hóa và đa dạng về detector, thiết kế cấu hình hệ thống sắc ký ngày càng ưu việt hơn, khả năng ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc ngày càng hiệu quả và phổ biến

- Hạn chế: Khi phân tích các chất có nền mẫu phức tạp như các chế phẩm

đông dược thì hiệu lực tách của cột giảm nhanh, việc làm sạch hệ thống sắc ký sau khi phân tích cũng cần lưu ý hơn

Hiện nay, HPTLC và HPLC là hai phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong phân tích nói chung và kiểm nghiệm thuốc nói riêng HPTLC là phương pháp sàng lọc sẽ tiết kiệm được thời gian, chi phí, HPLC với detector DAD có khả năng quét, chồng phổ trong định tính và định lượng khẳng định thêm được

sự chắc chắn của kết quả mang lại

19

Phần 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển WinCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc kí, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Hệ thống HPLC Shimazu 20AD với detector UV-PDA, Nhật

- Cân phân tích METTLER – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)

- Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ, (d = 0,01 mg)

- Máy lắc siêu âm DAIHAN WUC – A06H – Hàn Quốc

20

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức

- Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức

- Máy đo pH Eutech pH700 – Singapore

- Máy lọc hút chân không

- Các dụng cụ thủy tinh : bình định mức, pipet, ống ly tâm

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thử : Chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng dạng bào chế viên nén, viên nang cứng, trà hòa tan, được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tăng huyết áp đang lưu hành tại Việt Nam

- Nền mẫu : Nền mẫu dùng xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng dược lý hạ huyết áp

đã công bố và một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tăng huyết áp có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam hiện nay

- Mẫu chuẩn tự tạo : Chất chuẩn trộn cùng nền mẫu với tỉ lệ nhất định

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chế tạo nền mẫu

Dựa vào các bài thuốc cổ phương và các bài thuốc gia truyền có thành phần gần giống các mẫu trên thị trường tiến hành bào chế 03 nền mẫu viên nang cứng, trà hòa tan, viên nén

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp HPLC

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời được

các đối tượng nghiên cứu bao gồm:

- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc

21

- Pha động: Dựa vào các nghiên cứu đã công bố [11], [17], [18], [30], tiến hành khảo sát thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động cho thời gian lưu

của chất phân tích phù hợp, tách tốt, sắc ký đồ đẹp

- Detector và bước sóng phát hiện: chọn bước sóng tại đó đáp ứng phân tích là

tối ưu (có đáp ứng cao nhất và loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu)

Lựa chọn điều kiện sắc ký đơn giản, thiết bị phù hợp với đa số các phòng thử nghiệm trong hệ thống kiểm nghiệm: dung môi phân tích thông dụng, rẻ tiền, ít độc hại; detector UV-VIS thông dụng

2.2.2.2 Xây dựng phương pháp HPTLC

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 hoặc bản mỏng silica gel 60 F254 hiệu năng cao với kích thước khác nhau

- Pha động: Dựa vào các nghiên cứu đã công bố, khảo sát các dung môi với tỷ

lệ phù hợp đối với các thuốc nghiên cứu

✓ Cloroform : MeOH : aceton : formic (7,3 : 1,3 : 0,5 : 0,03) [24]

✓ Ethyl acetat – MeOH – amoniac ( 8 : 2 : 0,1) [20]

✓ Cloroform – ethyl acetat – acid acetic (5 : 5 : 0,2) [19]

✓ Cloroform : Ethyl acetat : Acid acetic (7 : 3 : 0,1) [20]

- Thể tích chấm sắc ký: 5 µl

- Phát hiện: Quét phổ lựa chọn bước sóng thích hợp cho đáp ứng của các chất cao nhất và ít ảnh hưởng bởi nền mẫu nhất

2.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của các nhóm thuốc tân dược, và tham khảo các nghiên cứu đã công bố [23], [30], [36] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi như sau :

- MeOH

- Ethanol (EtOH)

- ACN

22

Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/2 liều dùng vào bình định mức 25ml, thêm dung môi chiết, lắc đều Siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng Thêm vừa đủ thể tích bằng dung môi chiết Lắc đều Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45µm Tiến hành phân tích bằng HPLC Đối với HPTLC: Quy trình xử lý mẫu tương tự như trên Sau khi ly tâm, lấy chính xác 10 ml dịch trong, cô dưới luồng khí nitơ đến cắn Hòa tan cắn bằng 1ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích bằng HPTLC

- Giới hạn phát hiện (LOD)

2.2.5 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị

trường

- Áp dụng phương pháp HPTLC phát hiện AML, NIF, VAL, FEL trong một

số thuốc điều trị hoặc thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp được trộn lẫn trong một số chế phẩm thu thập trên thị trường (nếu có)

23

- Áp dụng phương pháp HPLC để định tính, định lượng AML, NIF, VAL, FEL trong một số thuốc điều trị hoặc thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp được trộn lẫn trong một số chế phẩm thu thập trên thị trường (nếu có)

24

Phần 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chuẩn bị nền mẫu

Dựa vào các bài thuốc cổ phương có thành phần gần giống với mẫu trên thị trường, trong nghiên cứu đã tiến hành tạo 3 nền mẫu với các dạng bào chế viên nang cứng, trà hòa tan, viên nén Thành phần các cao chế nền mẫu được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Các nền mẫu nghiên cứu

Dạ giao đằng 16 g Câu đằng 6 g

Nền 2

(N02) Trà hòa tan

Hoa hòe 10 g Dừa cạn 4 g Cúc hoa 4 g Tâm sen 5 g

Hạ khô thảo 10 g Bạch thược 12 g Đẳng sâm 10 g Sinh địa 8 g

Cách tiến hành:

• Mỗi nền mẫu tiến hành trên 10 thang thuốc theo thành phần tỷ lệ một thang nêu trên

• Thêm lượng nước ngập dược liệu, đun sôi

• Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 3 tiếng, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu

25

• Sau 3 tiếng, lọc qua vải xô thu được dịch chiết lần 1

• Lặp lại qui trình trên 2 lần nữa

• Gộp dịch chiết 3 lần

• Cô cách thủy đến cao đặc

• Sấy khô cao đặc đến khi thu được cao khô

• Xay cao khô thu được bột cao khô

• Tiến hành bào chế các nền:

- Nền 1: Cao dược liệu 170 g Lấy 60 g hoa hòe sấy khô, rây qua rây 0,32

mm Trộn lẫn với bột cao dược liệu Trộn tá dược silic keo tỷ lệ 10% so với bột cao dược liệu, sát hạt Sấy khô Rây qua rây 1,00 mm Trộn với các tá dược talc 1,5%; magie stearat 0,5% Đóng nang số 0 Khối lượng trung bình viên 0,5228g

- Nền 2: Cao dược liệu 48,6 g Trộn lẫn với các tá dược silic keo, lactose, glucose với tỷ lệ 10% Sát hạt ướt Sấy khô Trộn với các tá dược talc 1,5%, magie stearat 0,5% Đóng gói Khối lượng trung bình gói 2,9380 g

- Nền 3: Cao dược liệu 25,2 g Xay nhỏ 8 g linh chi, rây qua rây 0,32 mm Trộn đều với bột dược liệu và cao dược liệu Trôn tá dược silic keo và tá dược DST với tỷ lệ 1: 4: 1 Sát hạt Sấy khô Rây qua rây 1,0 mm Trộn bột talc 1,5%, magie stearat 0,5% Đem dập viên khối lượng trung bình 0,8734 g

3.2 Xây dựng phương pháp phân tích

3.2.1 Xây dựng phương pháp HPLC

3.2.1.1 Lựa chọn hệ pha động

Sử dụng điều kiện sắc ký: Cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5µm), nhiệt

độ cột 30oC; Tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện

238 nm Tiến hành pha các dung dịch chuẩn đơn AML, NIF, VAL, FEL trong MeOH có nồng độ tương ứng mỗi chất là 10 µg/ml

Tiến hành sắc ký với các pha động với tỷ lệ khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Thay đổi tỷ lệ thành phần pha động: MeOH được thay đổi theo các tỷ lệ 80% (C = 5%) Nhận thấy khi giảm tỷ lệ MeOH thời gian lưu các chất tăng, các pic tách rời nhau

30-Sau khi khảo sát các tỷ lệ MeOH và đệm nhận thấy với hệ pha động MeOH : Dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (55 : 45) cho pic các chất tách rời nhau, nhưng thời gian lưu của felodipin kéo dài tới 80 phút Tiến hành thay đổi tỷ lệ pha động theo chế độ gradient để rút ngắn thời gian phân tích Lựa chọn được với chế độ gradient sau rút ngắn được thời gian phân tích xuống còn khoảng 45 phút (hình 3.1)

Chế độ gradient: từ 0 - 28 phút MeOH 55%; từ 28 – 32 phút tăng tuyến tính MeOH từ 55% đến 75% và duy trì tỷ lệ này tới 43 phút; từ 43 - 44 phút giảm tuyến tính MeOH từ 75% đến 55% và duy trì tỷ lệ này tới 50 phút Tốc độ dòng 1,5 ml/phút

27

Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích các chất với pha động MeOH : Dung dịch

đệm phosphat pH 3,0 (55 – 45) 3.2.1.2 Khảo sát cột sắc ký

Kết quả tách 4 chất bằng cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5µm), pic VAL xuất hiện trong khoảng thay đổi tỷ lệ dung môi, nên không đạt độ phân giải đường nền Do đó, tiếp tục tiến hành khảo sát trên các cột:

- Hypersil C18 BDS 250 x 4,6mm; 5µm

- Inertsil ODS- 3 250 x 4,6mm; 5µm

Kết quả được trình bày ở hình 3.2

a)

28

b)

Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký

Kết quả ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy, cột Inertsil ODS- 3 250 x 4,6 mm; 5 µm

là phù hợp với phép phân tích này

3.2.1.3 Bước sóng phát hiện

Quét phổ UV tại vị trí ứng với thời gian lưu pic từng chất trên sắc ký đồ phân tích các chuẩn đơn AML, NIF, VAL, FEL trong MeOH trong khoảng từ

200 – 400 nm Kết quả được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3: Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu

Kết quả cho thấy AML có hai cực đại hấp thụ ở 238 và 361 nm; FEL là 238

và 360 nm; NIF là 236 và 332 nm; VAL có dáng phổ không rõ ràng Đối với AML, NIF, FEL ở khoảng bước sóng 236 – 238 nm có đáp ứng cao gấp hơn 2

29

lần so với ở cực đại khoảng 330 -360 nm, nhưng để giảm ảnh hưởng của nền mẫu dược liệu, lựa chọn 360 nm để phát hiện, còn VAL phát hiện tại bước sóng

238 nm

Từ kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

- Cột: InertSil ODS-3 (4,6 mm × 25 cm; 5µm), cột bảo vệ Inersil ODS-3; nhiệt độ cột 30oC

- Pha động: MeOH – Dung dịch đệm phosphat 50 mM pH 3,0; gradient dung môi: Từ 0 - 28 phút MeOH 55%; từ 28 – 32 phút tăng tuyến tính MeOH từ 55% đến 75% và duy trì tỷ lệ này tới 43 phút; từ 43 - 44 phút giảm tuyến tính MeOH

từ 75% đến 55% và duy trì tỷ lệ này tới 50 phút;

❖ Khảo sát hệ dung môi

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn đơn AML, NIF, VAL, FEL và chuẩn hỗn hợp

4 chất trong MeOH có nồng độ 1 mg/ml Tiến hành khảo sát trên bản mỏng HPTLC Silicagel gel F254 (10×10cm) Thể tích chấm 5 µl, bước sóng phát hiện

254 nm, triển khai sắc ký với các hệ dung môi:

Hệ 1 : Ethyl acetat – MeOH – amoniac (8 : 2 : 0,1)

Hệ 2 : Cloroform : MeOH : aceton : acid formic (7,3 : 1,3 : 0,5 : 0,03)

Hệ 3 : Cloroform – ethyl acetat – acid acetic (5 : 5 : 0,2)

Hệ 4 : Cloroform : Ethyl acetat : acid acetic (7 : 3 : 0,1)

Kết quả được trình bày ở hình 3.9

30

Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC

Kết quả ở hình 3.9 cho thấy:

Hệ 1 và hệ 2 vết AML, VAL tách được nhưng vết FEL và NIF đi lên cùng đường dung môi Hệ 3 tách được 3 chất là VAL, NIF và FEL tuy nhiên vết AML không di chuyển vẫn nằm tại vị trí chấm mẫu Hệ 4 tách được cả 4 chất nhưng vết AML không gọn và dính với vết VAL Do đó, lựa chọn hệ 1 để tách AML và hệ 3 để tách đồng thời VAL, NIF và FEL

31

Tiếp tục tiến hành thay đổi tỉ lệ thành phần hệ 3 để tìm pha động tối ưu nhất tách 3 chất VAL, NIF, FEL Khảo sát hệ cloroform : ethyl acetat : acid acetic băng với tỉ lệ thay đổi như sau:

Hình 3.5: Sắc ký đồ lựa chọn hệ pha động HPTLC a) Hệ dung môi Ethyl acetat – MeOH – amoniac 25% (8 : 2 : 0,1); b) Hệ dung môi Cloroform – ethyl acetat – acid acetic (6 : 5 : 0,2)

❖ Bước sóng phát hiện

Qua kết quả khảo sát hệ dung môi, nhận thấy AML, FEL cho tín hiệu ở cả 2 bước sóng 254 nm và 366 nm Để tăng tính chọn lọc, loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu lựa chọn bước sóng 366 nm để phát hiện AML, FEL với tín hiệu huỳnh quang màu xanh, còn VAL và NIF chỉ phát hiện được tại bước sóng 254 nm (hình 3.10b) cho nên lựa chọn bước sóng này để phát hiện hai chất Kết quả sắc

ký đồ của AML và FEL khi phát hiện tại bước sóng 366 nm được trình trong hình 3.11