Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý tận tình của quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh trường Đại học Dược Hà Nội đã dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu tài liệu, thực nghiệm để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ dược học

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô trong ban Giám hiệu, phòng sau Đại học, bộ môn Hóa phân tích - trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn ban lãnh đạo

và cán bộ phòng phân tích Kiểm nghiệm - Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia và thầy cô bộ môn Hóa lý đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập và quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài

Tôi xin cảm ơn công ty cổ phần Traphaco đã tạo điều kiện về thời gian,

hỗ trợ mẫu nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp, bố mẹ, anh chị em trong gia đình, chồng

và con gái - những người luôn động viên, là chỗ dựa tinh thần giúp đỡ tôi hoàn thiện luận văn

Trong phạm vi khả năng của mình, tôi đã cố gắng hoàn thành luận văn một cách tốt nhất có thể, tuy nhiên cũng không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý quý báu của quý thầy cô, các anh chị em và các bạn đồng nghiệp

Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018

Nguyễn Thị Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các dược liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm Bổ gan 3

1.1.1 Actiso 3

1.1.2 Rau đắng đất 4

1.1.3 Bìm bìm biếc 5

1.2 Acid chlorogenic 6

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 6

1.2.2 Tác dụng 7

1.2.3 Các phương pháp xác định acid chlorogenic 7

1.3 Tổng quan về cao thuốc 11

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Phương pháp điều chế 12

1.3.3 Yêu cầu chất lượng 13

1.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dược 14

1.5 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao 15

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và trang thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 20

2.1.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu 21

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 22

2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan 23

2.2.4 Ứng dụng 24

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 26

3.1.1 Khảo sát dung môi loại chất béo 26

3.1.2 Khảo sát dung môi chiết 27

3.1.3 Khảo sát thời gian chiết 28

3.2 Thẩm định phương pháp 37

3.2.1 Độ chọn lọc: 37

3.2.2 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 39

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 39

3.2.4 Độ chính xác 40

3.2.5 Độ đúng 42

3.2.6 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 44

4 Ứng dụng 45

4.1 Định lượng acid chlorogenic trong cao actiso 45

4.2 Định lượng acid chlorogenic trong một số lô chế phẩm viên nang mềm Bổ gan trên thị trường 46

PHẦN 4 BÀN LUẬN 49

1 Lựa chọn phương pháp phân tích 49

2 Về xây dựng phương pháp phân tích 50

3 Về thẩm định phương pháp phân tích 51

4 Về ứng dụng phương pháp xây dựng được trong phân tích mẫu thực 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACG Acid chlorogenic

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức

(Association of Official Analytical Chemists) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin

Layer Chromatography) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) ICH International Conference on Harmonisation

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Kết quả khảo sát dung môi loại béo khi xử lý mẫu viên nang

mềm Bổ gan

26

Bảng 13 Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu viên nang

mềm Bổ gan

47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3 Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết acid

chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan (n = 2)

28

Hình 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết acid chlorogenic trong viên

nang mềm Bổ gan (n=2)

29

Hình 6 Sắc ký đồ khảo sát gradient pha động chương 1(a), hệ 2(b) và

hệ 3(c)

33

Hình 10 Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017

(a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)

37

Hình 11 Sắc ký đồ của mẫu cao actiso (a), mẫu chuẩn (b), mẫu

placebo (methanol 60%) (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)

37

Hình 12 Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu viên nang mềm Bổ

gan

38

Hình 14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

pic

40

Hình 15 Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp dung dịch

chuẩn/placebo (a) và dung dịch chuẩn/MeOH 60% (b)

44

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ ngàn năm các bài thuốc YHCT phòng và chữa bệnh lưu truyền trong dân gian đã trở thành nhu cầu của con người và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò rất quan trọng trong nhiệm vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân Sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng chữa bệnh tốt, giúp điều hòa, cân bằng hoạt động các cơ quan, bộ phận trong cơ thể Với xu hướng “trở về thiên nhiên” thì việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng

do thuốc ít độc hại và ít gây tác dụng phụ so với thuốc tân dược

Thuốc Đông dược nói chung và dược liệu nói riêng cần phải qua chế biến trước khi đưa vào sử dụng Trước đây, dược liệu được dùng dưới dạng cây tươi hoặc phơi sấy khô, chế biến (trích, tẩm, sao…) sau đó được hãm, sắc uống và dùng theo kinh nghiệm nên không kiểm soát được hàm lượng, chất lượng cũng như hiệu quả điều trị Ngày nay, với thành tựu vượt bậc của công nghiệp hóa, hiện đại hóa trong ngành Dược đã nghiên cứu, phát triển và ứng dụng bào chế các dạng chế phẩm như viên nang, viên nén… từ bột dược liệu, cao dược liệu và dịch chiết dược liệu Việc tiêu chuẩn hóa ổn định chất lượng các sản phẩm này cần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu đầu vào Tuy nhiên, nguyên liệu sản xuất được lấy từ nhiều nguồn nên mức hàm lượng hoạt chất chính giữa các lô nguyên liệu không đồng nhất Do đó, để ổn định chất lượng sản phẩm cần tiêu chuẩn bán thành phẩm trước khi đưa vào sản xuất

Actiso được trồng trên quy mô lớn và được sử dụng làm nguyên liệu chính trong nhiều chế phẩm Đông dược Cao Actiso cùng với cao Rau đắng đất

và cao Bìm bìm biếc có trong công thức bào chế các chế phẩm Bổ gan như viên nang mềm và viên bao đường Boganic của công ty CP Traphaco, viên nang mềm Giadogane của HD Pharma, viên nang cứng Chobil của DHG Pharma, nang mềm (cứng) Liverbil của công ty CP Dược OPC, Sự phối hợp của 3 vị thuốc quý này có tác dụng tăng cường chức năng gan - giải độc - mát gan

Hoạt chất acid chlorogenic có trong Actiso có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống sự đột biến gen của tế bào;

38 [26], yêu cầu định lượng phenol tổng (trong đó có thành phần acid

chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam Asteraceae) và Echinacea pallida (Nutt.) (Fam Asteraceae) bằng HPLC; Dược điển Châu Âu [14] quy

định định lượng ACG trong lá và cao khô chiết xuất từ lá actiso bằng phương pháp HPLC, với yêu cầu hàm lượng CGA không ít hơn 0,8% trong lá và 0,6% trong cao khô chiết xuất từ lá Nhưng chuyên luận actiso trong Dược điển Việt Nam IV [1] mới chỉ yêu cầu định lượng cynarin trong lá và cao đặc bằng phương pháp quang phổ

Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm viên nang mềm có thành phần chứa Actiso, Rau đắng đất và Bìm bìm biếc chúng tôi tiến

hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic

trong viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, với các mục

3

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các dƣợc liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm

Bổ gan

1.1.1 Actiso

 Đặc điểm thực vật, phân bố của cây actiso

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) Cây thảo lớn, sống hai năm hoặc lâu năm, cao 1 - 1,2 m, có thể

đến 2 m Thân ngắn, thẳng và cứng, có khía dọc, phủ lông trắng như bông Lá

to, dài, mọc so le, phiến lá xẻ thùy sâu và có răng không đều, mặt trên xanh lục, mặt dưới có lông trắng; cuống lá to và ngắn

Cụm hoa to mọc ở ngọn thân thành đầu màu đỏ tím hoặc tím lơ nhạt; lá bắc ngoài của cụm hoa rộng, dày và nhọn, đế cụm hoa nạc, phủ đầy lông tơ, mang toàn hình ống

Quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng [6], [2], [4]

Hiện nay cây được trồng nhiều nhất ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và Sa Pa (Lào Cai), tổng diện tích lên tới vài trăm hecta

Lá, hoa (phần trên mặt đất)

Dược điển Việt Nam IV [1], quy định dùng lá đã phơi hoặc sấy khô

Rễ và thân cũng được dùng làm thuốc [3]

Lá actiso chứa:

- Acid hữu cơ bao gồm: Acid phenol: Cynarin (acid 1-3 dicafeyl quinic)

và các sản phẩm thủy phân (acid cafeic, acid chlorogenic, acid neo chlorogenic).Acid alcol: acid hydroxymethylacrilic, acid malic, acid lactic, acid fumaric,…

4

- Hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin) bao gồm cynarosid (luteolin -

7 - D - glucopyrano - sid), scolymosid (luteolin - 7 - rutinosid) và cynarotriosid (luteolin - 7 - rutinosid - 3’ - glucosid)

- Thành phần khác: Cynaropicrin, enzym: oxidase, peroxidase, oxigenase, catalase Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, sấy, chế biến Nhiều chất vô cơ

Dược điển châu Âu (EP) 8.0 qui định hàm lượng acid chlorogenic trong lá actiso khô phải không dưới 0,8% [14]

Ngoài việc có thể dùng đế hoa hoặc lá bắc để ăn, actiso dùng làm thuốc thông tiểu tiện, thông mật, các bệnh yếu gan, thận, viêm thận cấp tính và kinh niên, sưng đau khớp

Nhuận và tẩy nhẹ đối với trẻ em

Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5-10% hoặc cao lỏng 10/ngày

2-Có thể chế thành cao mềm hay khô để chế thuốc viên

1.1.2 Rau đắng đất

Rau đắng đất có tên khoa học là Glinus oppositifolius (L) A.DC Thuộc họ rau đắng đất (Aizoaceae) Cây cỏ nhỏ, mọc bò, thân và cành mọc tỏa tròn gần

sát mặt đất, màu đỏ tím, đôi khi mọc cao tới 10 - 30cm Lá nhỏ, mọc so le, có bẹ chìa Phiến lá dài 1,5 - 2 cm, rộng 0,4cm Hoa nhỏ, màu hồng tím, mọc tụ từ 1 đến 5, thường 3 - 4 hoa ở kẽ lá.Quả ở cạnh, chứa một hạt đầu đen.Mùa hoa từ tháng 5 - 6, kéo dài suốt mùa hè

Tên gọi khác: rau đắng lá vòng Phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, cây mọc nhiều ở các tỉnh như Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Bắc Giang

5

 Thành phần hóa học: Theo các tài liệu [3], [6] rau đắng đất chứa chủ yếu

là saponin và flavonoid Một số tác giả đã phân lập được Spergulagenin Theo một số nghiên cứu gần đây, trong Rau đắng đất có chứa acid chlorogenic

Trong nhân dân, rau đắng đất được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa đái buốt, sỏi thận [3], [6]

1.1.3 Bìm bìm biếc

Bìm bìm biếc có tên khoa học là Pharbitis nil, thuộc họ Bìm bìm (Convovulaceae) Bìm bìm biếc là một loại dây leo, cuốn, thân mảnh, có điểm

những lông hình sao Lá hình tim, xẻ 3 thùy, nhẵn và xanh ở mặt trên, xanh nhạt

và có lông ở mặt dưới, dài 14cm, rộng 12cm, cuống dài 5 - 9cm, gầy, nhẵn Hoa màu hồng tím hay lam nhạt, lớn, mọc thành xim 1 - 3 hoa, ở kẽ lá Quả nang hình cầu, nhẵn, đường kính 8mm, có 3 ngăn Hạt 2 - 4, hình 3 cạnh, lưng khum, hai bên dẹt, nhẵn nhưng ở tễ hơi có lông, màu đen hay trắng tùy theo loài, dài 5 - 8mm, rộng 3 - 5mm

Tên gọi khác: Khiên ngưu tử, Hắc sửu

Phân bố, thu hái và chế biến: mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta Vào các tháng 7 - 10 quả chín, người ta hái về, đập lấy hạt phơi khô

Hạt chưa chín của Bìm bìm biếc chứa giberelin A3, giberelin A5, giberelin

A20, giberelin A26, giberelin A27, giberelin glucosid

 Công dụng: bìm bìm có vị cay, tính nóng hơi có độc dùng để chữa tiện bĩ,

cước khí, lợi tiểu tiện, sát trùng [3], [6]

1.2 Acid chlorogenic

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Hình 1 Công thức cấu tạo acid chlorogenic

Công thức phân tử: C16H18O9

Trọng lượng phân tử: 354,31

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 1-oxo-2- propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic

Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic

Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid…Nhiệt độ nóng chảy: 210ºC

Acid chlorogenic là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là

ở 4ºC

7

1.2.2 Tác dụng

Acid chlorogenic có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u, chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp

Acid chlorogenic được ứng dụng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hóa dưới tên Sveltol (tại Anh

và Na uy) Là một thành phần thêm vào thực phẩm để thúc đẩy quá trình giảm cân và dùng trong mỹ phẩm để làm đẹp [12], [16], [20]

Tất cả các nghiên cứu riêng lẻ các hợp chất trong actiso cho thấy acid chlorogenic, lutein, luteolin-7-O-glucoside có hiệu quả chống oxy hoá cao, trong

đó acid chlorogenic là hợp chất chống oxy hóa mạnh nhất

1.2.3 Các phương pháp xác định acid chlorogenic

Schütz K (2004) đã phát triển phương pháp định tính và định lượng các hợp chất phenolic từ nước ép và bã của búp actiso bằng HPLC với detector mảng diod và khối phổ [23] Hàm lượng phenolic toàn phần xấp xỉ 12 g/kg trên dược liệu khô cho thấy actiso là một nguồn các hợp chất phenolic triển vọng để

sử dụng làm chất chống oxy hoá tự nhiên hoặc là thành phần thực phẩm chức năng

Qing LI cùng cộng sự (2005) đã nghiên cứu xác định đồng thời Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin

and Isofraxidin trong bột dược liệu Acanthopanax senticosus bằng phương pháp

HPLC – DAD [22] Bột dược liệu siêu âm với nước, bốc hơi lấy cắn, hòa tan trong MeOH Điều kiện sắc ký: cột Agilent SB-C18 column (250 x 4.6mm; 5 μm), nhiệt độ cột được duy trì ở 35°C, pha động (gradient nước (0,05% v/v phosphoric acid) - acetonitrile (0,01 phút, 94: 6, 50 phút, 65:35)), tốc độ dòng : 0,9 ml/phút, detector: DAD 200 - 370 nm, thời gian lưu của pic CGA khoảng 15,5 phút

8

Yuan và cộng sự đã nghiên cứu định lượng đồng thời arctiin, acid chlorogenic và glycyrrhizin trong một số thuốc viên của 7 thương hiệu khác nhau của “Yin Qiao Jie Du” bằng phương pháp HPLC [27] Mẫu được xử lý bằng ethanol 50% Sử dụng cột Phenomenex (Lichrosorb 10RP18, 240x4mm, 10µm, USA), thể tích tiêm 10µl, tốc độ dòng 1 ml/min Pha động gồm: hỗn hợp dung dịch B gồm 0,4% acetic acid và 4,5% tetrahydrofuran (dd B); acetonitril (dd A) Chạy theo chương trình gradient, bước sóng phát hiện: 254nm, 280nm

và 326nm Pic của acid chlorogenic phát hiện ở 15 phút đầu tiên

Năm 2007, Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu tiến hành định lượng đồng thời acid chlorogenic, linarin và luteolin trong viên đạn Flos chrysantheni Indici [28] Sau khi xử lý mẫu, hòa tan mẫu thử vào dung dịch acetonitril – nước (20: 80) Dùng cột Hypesil ODS (4,6mm x 250mm, 5µm), detetor UV phát hiện trong khoảng từ 210 – 400nm, nhiệt độ cột 250C, thể tích tiêm 20µl, tốc độ dòng 1ml/min [ 23 ] Chạy theo chương trình gradient

Li-Mei Wang và các cộng sự (2009) đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong kim ngân [20] như sau: Hoa tươi được cắt nhỏ thành miếng nhỏ (5 mm) Thêm ethanol 70o vào 0,50 g mẫu thử theo cái tỷ lệ dung môi và mẫu 20:1 (tt/kl) Siêu âm mẫu thử trong 30 phút Tiến hành chiết lặp lại 2 lần Lấy dịch chiết và cô đặc để thu được dung dịch acid chlorogenic đặc Tiếp tục làm khô ở 45ºC trong chân không Lấy 4 mg cắn hòa tan trong 20 ml methanol

và lọc Mẫu thử được phân tích bằng HPLC với điều kiện là cột XDB-C18 (4,6

×150mm, 5µm), pha động là methanol/nước/acid acetic (15:85:0,4) phát hiện ở bước sóng 327 nm, khoảng nồng độ của acid chlorogenic khảo sát (10-50 µg/ml) với R2: 0,9994.

Các nhà khoa học Trung Quốc Tingting Wang, Xinhang Jiang, Lu Yang, Shihua Wu đã định lượng acid chlorogenic trong hoa kim ngân bằng HPLC [25] với điều kiện là cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 2,1mm, 3,5µm) Pha động methanol - dung dịch acid trifluoroacetic 0,03% theo chế độ gradient methanol 5-80% trong 20 phút, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 330 nm, tiêm mẫu 2 µm, thời gian lưu khoảng 10 phút [20]

9

Mirna Leonor Sua rez-Quiroz và các cộng sự đã phân lập acid chlorogenic trong cà phê xanh sử dụng than hoạt tính [21] Phương pháp TLC được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 (4 cm x 6,6 cm), thể tích mẫu 5 µl, dung môi khai triển gồm butanol - nước - acid acetic (6: 2: 2), hiện màu bằng thuốc thử iod và quan sát ở 254 và 366 nm Phương pháp HPLC: Mẫu pha loãng được lọc qua màng lọc 0,45µm, thể tích tiêm 10 µl, dùng cột C18 (5 µm; 250 mm 4,6 mm), bước sóng phát hiện tại UV 276 nm Pha động sử dụng nước methanol - nước(70:30) với tốc độ dòng 1 ml / phút [17].

Jiagen Wen và cộng sự (2012), nghiên cứu định lượng acid chlorogenic

trong bột dược liệu Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching,

Polypodiaceae bằng HPLC – UV [19] Chiết siêu âm với nước sau đó thêm MeOH cất quay Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm, 5μm), pha động: acetonitrile (acid phosphoric 0,5% (11,5:88,5 tt/tt), tốc độ dòng : 1ml/phút, detector: UV 327 nm Thời gian lưu của pic CGA khoảng 15,7 phút Hàm lượng CGA trong L.drymoglossoides xấp xỉ đạt 0,24%.[29]

Jan Fritsche đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (Sephadex LH-20) kết hợp với các phương pháp phân tích (HPLC-DAD-MS và HPLC-DAD) để phân tách, định tính và định lượng các hợp chất trong actiso [18] Nồng độ acid chlorogenic trong khoảng 0,35-18,34 mg/g dịch chiết nước

Abdul Mutalib A.G Nasser và cộng sự đã tiến hành xác định Cynarin và

acid chlorogenic trong Cynara scolymus L bằng HPLC [10] Mẫu thử dược liệu

được chiết bằng methanol 80%, sau đó tách 2 polyphenol bằng cột C18, tốc độ dòng 1,3ml/ phút; pha động là nước: methanol: acid acetic (78,5:20:2,5); thể tích tiêm 20 µl, phát hiện tại UV 316nm, thời gian lưu của cynarin và acid chlorogenic lần lượt là 4,78 và 5,47 phút

Florinda Fratianni và cộng sự đã nghiên cứu xác định polyphenol và hoạt

tính sinh học của Cynara cardunculus var.scolymus [15] bằng HPLC sử dụng

cột pha đảo (BEH C18; 1,7µm; 2,1×100mm); pha động gồm dung môi A (acid acetic 7,5 mM) và dung môi B (acetonitril) với tốc độ dòng 250 µl/phút, rửa giải theo chế độ gradient Phát hiện bằng detectơ phạm vi quét: 210-400nm, thể tích

10

tiêm là 5 µl Kết quả phân tích sắc ký đã xác định các polyphenol khác nhau, gồm acid gallic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, 1-3 dicaffeoylquinic (cynarin), cũng như epicatechin, rutin và luteolin

Theo Dược điển Trung Quốc [13], acid chlorogenic trong dược liệu kim ngân hoa được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40o

C; hệ pha động là gồm A: acetonitil, B: acid phosphoric 0,4% chạy đẳng dòng theo tỷ lệ acetonitril:acid phosphoric 0,4% (13:87), phát hiện bằng detector UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 15 phút Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 7 phút

Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [14], acid chlorogenic trong lá và cao actiso được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40o

C; hệ pha động là gồm A: acid phosphoric – nước (0,5:99,5), B: acid phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient thành phần pha động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 phút Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 phút Hàm lượng acid chlorogenic yêu cầu không nhỏ hơn 0,8% tính theo dược liệu khô

Theo Dược điển Mỹ 38 [26], acid chlorogenic trong một số dược liệu được định tính bằng phương pháp HPTLC với điều kiện tương tự như trong EP 8.0 về pha tĩnh, cách phát hiện; cách xử lý mẫu và pha động có thay đổi, cụ thể

là đối với Echinacea angustifolia DC (Fam Asteraceae), Echinacea pallida (Nutt.)Nutt.(Fam Asteraceae) và Echinacea purpurea (L.) Moench (Fam

Asteraceae) thì mẫu thử được chiết với methanol bằng siêu âm trong 10 phút; pha động gồm ethyl acetat, methylethyl ceton, nước, - acid formic (5:3:1:1) Còn

với Ginkgo biloba L (Fam Ginkgoaceae) thì mẫu thử được chiết với methanol

hồi lưu cách thủy trong 5-10 phút, pha động là acid formic khan – acid acetic – nước – ethyl acetat (1,1:1,1:2,6:10) Đồng thời, định lượng phenol tổng (trong

đó có thành phần acid chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam Asteraceae) và Echinacea pallida (Nutt.)Nutt.(Fam Asteraceae) bằng HPLC

được thực hiện với điều kiện tương tự EP 8.0

11

Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng [5] Trong đó định lượng acid chlorogenic sử dụng cột Phenomenex RP 18, (5µm, 5mm x 250mm), pha động (Acetonitril : Dung dịch acidphosphoric 0,4% tỷ lệ 13 : 87 (v/v)) tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, detector UV : 327 nm

Vũ Bình Dương và cộng sự đã nghiên cứu định lượng acid chlorogenic

trong ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) bằng sắc ký lỏng hiệu năng

cao [9], bột dược liệu được chiết siêu âm bằng MeOH Acid chlorogenic trong mẫu thử được tách bằng cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, Mỹ), pha động: hệ dung môi acid acetic 0,1% : Acetonitril tỷ lệ 70 : 30 (v/v), tốc độ dòng: 1,2 ml/phút, thể tích tiêm: 10 µl, detector UV: 320 Thời gian lưu của pic ACG khoảng 6,7 phút

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự (2016) đã phân lập và thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ actiso đạt độ tinh khiết 92,39% [7]

Phí Thị Bảo Thoa (2017) đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, acid chlorogenic trong cao actiso được chiết siêu âm bằng MeOH 60%, tách trên bản mỏng silica gel 60 F254, pha động etylacetat: acid acetic: acid formic: nước (10: 1,1: 1,1: 2,7), thể tích chấm 25 µl, bước sóng phân tích 330nm Kết quả hàm lượng acid chlorogenic trong cao actiso từ 0,7 đến 4,57% [8]

1.3 Tổng quan về cao thuốc

1.3.1 Định nghĩa

Theo Dược điển Việt Nam IV [1] cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hay sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất cần được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dung hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác

Cao thuốc được chia làm 3 loại:

12

 Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dung để chế cao thuốc

 Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

 Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

ẩm với một lượng dung môi vừa đủ rồi đậy kín để yên trong 2 - 4h Sau đó, chuyển khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm lượng dung môi vừa đủ đến khi ngập hoàn toàn khối dược liệu Thời gian ngâm lạnh và tốc độ chảy trong quá trình chiết có thể thay đổi theo khối lượng và bản chất của dược liệu thô đem chiết

Ở tốc độ chậm: không quá 1 ml dịch chiết/ phút

13

Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút

Ở tốc độ nhanh: 3 - 5 ml dịch chiết/ phút

Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem chiết Sau

đó đem cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thủy hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C cho đến khi loại hết dung môi Hoà tan cắn thu được trong dịch chiết đầu đậm đặc nếu cần thêm dung môi vào để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày rồi lọc

Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy đến khi độ ẩm còn lại không quá 5% Để đạt được thể chất quy định , quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600

1.3.3 êu cầu chất lượng

Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây:

Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc

đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ

14

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều

chế cao

Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc không

quá 20 % Cao khô không quá 5 %

Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn (áp

dụng cho cao lỏng và cao đặc)

Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng

Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước

hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong DĐVN IV

Dư lượng hóa chất o vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong

DĐVN IV

Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong DĐVN IV

o qu n Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ ít thay đổi

1.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dƣợc

Dược liệu và các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu thường có rất nhiều thành phần, nên việc đặt ra tiêu chuẩn cho tất cả các chế phẩm Đông Dược gặp nhiều khó khăn, không thống nhất Mỗi chế phẩm do một công ty sản xuất đều

có tiêu chuẩn riêng

Dược điển Việt Nam là một văn bản quy phạm kỹ thuật quan trọng, là cơ

sở xem xét đánh giá, và xác định chất lượng thuốc ở phần lớn các cơ sở sản xuất trên cả nước Trong đó, có nhiều chuyên luận quy định tiêu chuẩn chất lượng dược liệu (phần lớn là dược liệu chưa chế biến), một số bài thuốc Tuy nhiên, việc đi vào thực tế để kiểm tra chất lượng dược liệu đã vấp phải rất nhiều khó khăn như: nguồn dược liệu lưu hành trên thị trường chủ yếu là dược liệu chế,

Trên thực tế, việc sử dụng các phương pháp hiện đại như HPLC, sắc ký lớp mỏng siêu hiệu năng, sắc ký khối phổ có sử dụng chất đối chiếu chưa được

sử dụng nhiều, giá thành chất chuẩn, dược liệu chuẩn cao Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương là đơn vị đứng đầu trong ngành kiểm nghiệm đã và đang nghiên cứu bổ sung nguồn dược liệu chuẩn, tinh chế chất chuẩn dược liệu Tuy nhiên, với tốc độ phát triển của thị trường ngày càng có nhiều dạng chế phẩm khác nhau lưu hành, thành phần cũng ngày càng đa dạng hơn đặt ra dấu hỏi lớn

về chất lượng sản phẩm Do vậy, xu hướng hiện nay là cần phải xây dựng các phương pháp tối ưu đảm bảo độ chính xác, tính khách quan và khả thi để nâng cao tiêu chuẩn cũng như chất lượng của chế phẩm đông dược

1.5 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột

Hình 2 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

16

Pha tĩnh

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là chất nhồi cột để tách sắc

ký chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính hạt từ 3 - 10µm Các hạt có hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu

Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính trong khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký Cột có đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột Nhiệt độ của cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích (nhiệt độ cột không được quá

60oC)

Trong sắc ký lỏng pha đảo, pha tĩnh gồm nhiều chất dạng biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc than graphit xốp Thường các cột sắc ký pha đảo chế tạo trên nền silica được coi là ổn định với pha động

có pH từ 2,0 đến 8,0 Cột chứa than graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer ổn định ở khoảng pH rộng hơn

Pha động

Pha động là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký Thành phần pha động có thể chỉ gồm một dung môi hay hỗn hợp dung môi trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp của acetonitril, methanol với nước hoặc dung dịch đệm, …

Các yếu tố thuộc về pha động ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký gồm :

+ Bản chất của dung môi pha chế pha động : Đối với sắc ký lỏng pha thuận thường sử dụng dung môi ít phân cực Đối với sắc ký lỏng pha đảo sử dụng pha đảo chứa nước với dung môi hữu cơ Dựa vào chỉ số phân cực P’ và UV cut-off của dung môi để lựa chọn dung môi pha động phù hợp rửa giải chất phân tích và dung môi không hoặc ít hấp thụ quang ở vùng bước sóng phát hiện nếu như sử dụng detector tử ngoại

Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký :

 Thời gian lưu (tR) là thời gian được tính từ lúc nạp mẫu cho đến lúc chất được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại Thời gian lưu là thông

số sử dụng để định tính chất phân tích Nó phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp; bản chất, thành phần, pH của pha động; cấu tạo và bản chất phân tử của chất phân tích

 Hệ số dung lượng k’ thể hiện sứa chứa của cột tách sắc ký, cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong 2 pha và được tính theo sức chứa của cột k’ cho biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố trong pha tĩnh so với pha động

k’=

= k

= –

Nếu k’ nhỏ thì tR nhỏ nên sự tách kém, k’ lớn thì pic doãng, độ nhạy kém

 Hệ số chọn lọc (α): đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất KA

Trong đó: W1/20: độ rộng pic ở chiều cao 1/20

A là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ơ 1/20 chiều cao pic

 Hệ số phân giải Rs: là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Độ phân giải của hai chất cạnh nhau được tính theo công thức:

Rs = 2 –

= 1,18.

– =

 Phương pháp chuẩn ngoại

 Phương pháp chuẩn nội

 Phương pháp chuẩn hóa điện tích

19

Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện, so sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hay chuẩn hóa nhiều điểm:

Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của mẫu thử

Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức: Cx = Cs.

Cx, Cs lần lượt là nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn

Sx, Ss là diện tích của chất phân tích trong mẫu thử, mẫu chuẩn

Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng

dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích pic ở mỗi điểm nồng độ chuẩn Thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

+ Dựa vào dữ liệu diện tích pic của chất thử trên đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của chất đó

+ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối quan hệ giữa diện tích pic hoặc chiều cao với nồng độ chất cần xác định: Y = a + bCx

Y là diện tích pic

a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b là độ dốc của đường chuẩn

Cx là nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử Cx

20

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và trang thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu cao Actiso: gồm các mẫu cao actiso mua ở nhiều nơi và được mã hóa nơi mua (CA) số thứ tự mẫu (01, 02, 03 ) và ngày lấy mẫu (ngày/ tháng/ năm); cách nhau bằng dấu chấm Sử dụng mẫu CA.06.0192017 trong xây dựng

- Mẫu placebo gồm Sáp ong trắng, Palm oil, Lecithin, Colloidan silicon dioxid, Dầu đậu nành với tỷ lệ theo công thức công bố

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn: Acid chlorogenic (C16H18O9) hàm lượng 99,60% (nguyên

trạng); SKS: 71121F của AK Scientific, TnC, Mỹ

Hóa chất, dung môi: Cloroform, n- hexanloại thuốc thử (Trung quốc); acid phosphoric 85% loại PA của JTBaker, Mỹ; acetonitril và methanol loại HPLC của Merck, Đức

2.1.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 series với detector DAD, phần mềm điều khiển Chemstation

- Cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) AB204 (d = 0,1),cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) XPE105 (d =0,01)

- Máy siêu âm Daihan WUC - A06H

21

- Dụng cụ: các loại pipet, micropipet, bình định mức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), bình gạn (Đức), cốc có mỏ, vial,…

- Máy ly tâm Hermile 2306, tủ sấy Memmert ULM – 500

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu

2.2.1.1 Với nền mẫu cao Actiso

Tham khảo tài liệu [8], tiến hành nghiên cứu quy trình xử lý mẫu: Cân chính xác khoảng 0,24g cao Actiso vào cốc có mỏ 100ml, thêm khoảng 30 ml MeOH 60% Siêu âm 15 phút Chuyển toàn bộ vào bình định mức 50 ml, tráng cốc 3 lần bằng MeOH 60% mỗi lần 5ml Thêm MeOH 60% đủ đến vạch, lắc đều Ly tâm dịch thu được ở 6000 vòng/ phút, trong 10 phút, lọc qua màng lọc 0,22 μm PTFE

2.2.1.2 Với mẫu viên nang mềm Bổ gan

Dựa vào độ tan của acid chlorogenic, phương pháp xử lý mẫu với nang mềm trong Dược điển Việt Nam IV [1] và các tài liệu công bố như Dược điển Trung Quốc [13], Dược điển châu Âu [14], Dược điển Mỹ 38 [26] và tiến hành

khảo sát khả năng chiết acid chlorogenic trong mẫu như sau:

- Cân từng viên với 20 viên nang mềm, cắt hở vỏ nang khoảng 0,5 cm, bóp thuốc trong nang ra cốc có mỏ Dùng kẹp giữ vỏ nang và cắt tiếp vỏ nang để bộc lộ hết phía trong của nang, lau sạch thuốc dính ở vỏ nang, lau vỏ nang bằng cloroform, để khô tự nhiên, cân vỏ nang Tính khối lượng thuốc trung bình trong nang.

- Cân lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên vào cốc có mỏ, thêm nước, siêu

âm Chuyển toàn bộ vào bình gạn 100ml, tráng rửa cốc đựng thuốc 2 lần với dung môi chiết và tập trung vào bình gạn Chiết, dịch chiết nước chuyển vào bình định mức 50ml, thêm methanol, lắc siêu âm sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm tiếp methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều

22

- Ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm PTFE

Kh o sát các điều kiện chiết:

- Dung môi chiết: sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - nước với tỷ lệ methanol từ 50 - 100% với  C = 10%

- Khảo sát dung môi loại dầu béo: n-hexan và cloroform, đồng thời khảo sát số lần chiết

-Thời gian lắc siêu âm: 5, 10, 15, 20 phút

Mỗi điều kiện khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình Lựa chọn điều kiện chiết cho hiệu suất chiết cao

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Lựa chọn cột và tỷ lệ pha động

Tham khảo các tài liệu [5], [7], [13], [29] lựa chọn sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 để phân tích acid chlorogenic

Khảo sát các hệ pha động và tỷ lệ như sau:

- Hệ 1: MeCN và dung dịch acid acetic 0,1%, tỷ lệ 30: 70%;

- Hệ 2: MeCN và acid formic 0,1%, tỷ lệ (10: 90);

- Hệ 3: MeCN và dung dịch acid phosphoric 1,0%, với tỷ lệ (10: 90);

- Hệ 4: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,4%, với tỷ lệ (10: 90);

- Hệ 5: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,1%, với tỷ lệ của MeCN từ

5 - 20% (  C = 5%)

Thực nghiệm trên mẫu chuẩn và mẫu thử

Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ dòng để pic của acid chlorogenic tách tốt,

pic cân đối, thời gian sắc ký phù hợp

23

Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm để pic của acid chlorogenic tách

tốt, pic cân đối, pic có đáp ứng (diện tích) phù hợp

ước sóng phân tích: Quét phổ của pic ứng với acid chlorogenic trong

khoảng UV, lựa chọn bước sóng ứng với cực đại hấp thụ

2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan

Xử lý mẫu theo qui trình đã lựa chọn, sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH [17] Đánh giá tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ của phương pháp.

Yêu cầu: đường hồi qui phải dạng đường thẳng với r ≥ 0,99

Độ chính xác gồm Độ lặp lại và độ chính xác trung gian

24

Độ lặp lại của phương pháp:

- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song

- Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng

Yêu cầu: (RSD) phải ≤ 2,0%

Độ chính xác trung gian: định lượng lặp lại trên 6 mẫu thử độc lập, thực

hiện trên cùng một thiết bị, trên 2 ngày khác nhau với cách tiến hành và điều kiện sắc ký như trên Yêu cầu RSD phải ≤ 3,0% (n = 12)

Độ đúng: độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị

thực Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn Thêm một lượng chính xác chất chuẩn thích hợp vào mẫu thử sao cho tổng lượng chất phân tích trong dung dịch (sau khi xử lý) nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn Tiến hành phân tích theo điều kiện đã chọn Dựa vào hàm lượng acid chlorogenic đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của mẫu thử thêm chuẩn, tính được lượng acid chlorogenic thu hồi lại trong mẫu thử Yêu cầu lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 98 – 102%

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dịch chiết từ mẫu placebo được dung dịch có nồng độ chính xác Pha loãng lần lượt gấp đôi dung dịch thu được bằng dịch chiết từ mẫu placebo Tiến hành sắc ký Nồng độ tại đó có tỷ lệ S/N lần lượt bằng 3 và bằng 10 được coi là LOD và LOQ của phương pháp

SD 100 RSD  

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký (Y)

26

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo át và l a chọn điều kiện lý mẫu

3.1.1 Khảo sát dung môi loại chất béo

Viên nang mềm Bổ gan trong thành phần chế phẩm có một lượng lớn dầu béo nên cần loại để giảm thiểu ảnh hưởng tới độ bền cột tách, cũng như cản trở tách trong quá trình sắc ký Dung môi loại béo khảo sát gồm cloroform và n- hexan

Cố định các thông số chiết: số lần chiết (02 lần); dung môi chiết: MeOH 60%; thể tích dung môi: 50 ml; lượng mẫu thử: 01 viên Sau khi chiết, thu dịch chiết nước vào bình định mức 50ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,22 µm

Mỗi dung môi tiến hành lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình Khả năng chiết acid chlorogenic từ mẫu viên nang mềm Bổ gan được biểu diễn bằng thông

số diện tích pic acid chlorogenic (A) và khối lượng dược liệu của mẫu thử (m) Kết quả được thể hiện trong bảng 1

Bảng 1 Kết qu kh o sát dung môi loại éo khi xử lý mẫu viên nang mềm Bổ

gan

Dung môi

Lần 1 Lần 2

Trung bình (A/m)

Lượng cân

m (mg)

Diện tích pic (A) A/m

Lượng cân m(mg)

Diện tích pic (A) A/m

Cloroform 804,6 970,6 1,206 805,1 977,3 1,214 1,210

n-hexan 803,5 1056,3 1,315 808,3 1078 1,334 1,324

27

Kết quả cho thấy cả 2 dung môi đều có khả năng loại chất béo tốt, nhưng cloroform có thể tạo nhũ gây khó khăn trong quá trình chiết và làm mất một phần hoạt chất ở lớp dung môi cloroform nên lựa chọn n-hexan làm dung môi chiết loại béo Để làm sạch tốt mẫu thử thực hiện chiết bằng n-hexan lặp lại 2 lần trong quá trình xử lý mẫu

3.1.2 Khảo sát dung môi chiết

Do acid chlorogenic dễ tan trong MeOH, nước nên dùng dung môi này làm dung môi chiết, khảo sát tỷ lệ dung môi MeOH và nước, với thể tích 50ml, lượng mẫu thử tương ứng 01 viên Cố định thời gian siêu âm 20 phút, dung môi loại béo là n-hexan Mỗi điều kiện khảo sát lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả được trình bày trong bảng 2 và hình 3

Bảng 2 Kết qu kh o sát dung môi chiết

MeOH

(%)

A/m Trung bình

m (g) A

(mAU.s) A/m m (g)

A (mAU.s) A/m

28

Hình 3 Biểu đồ kết qu kh o sát nồng độ dung môi chiết acid chlorogenic trong

viên nang mềm Bổ gan (n = 2)

Kết quả cho thấy đối với mẫu viên nang mềm Bổ gan, khi sử dụng dung môi chiết MeOH 60%, lượng acid chlorogenic thu được đều cao hơn rõ rệt khi

sử dụng các dung môi còn lại Vì vậy, lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là MeOH 60%

3.1.3 Khảo sát thời gian chiết

Cố định các thông số: dung môi loại béo n-hexan, số lần chiết là 2 lần, dung môi chiết: MeOH 60%, thể tích 50ml Khảo sát thời gian chiết siêu âm từ 5

- 20 phút (  t = 5 phút), mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung

bình Kết quả được thể hiện ở bảng 3 và hình 4

Bảng 3 Kết qu kh o sát thời gian chiết

m (g) A

(mAU.s) A/m m (g)

A (mAU.s) A/m

Nồng độ MeOH (%)

âm 20 phút Do đó, tôi lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút

 Kiểm tra lƣợng acid chlorogenic còn lại trong cắn:

Cân chính xác 1 lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên nang mềm vào cốc có

mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút Chuyển toàn bộ mẫu vào bình gạn 100

ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan và tập trung vào bình gạn Lắc 5 phút, để lắng,

bỏ lớp n-hexan.Tiếp tục chiết như vậy thêm 1 lần nữa với 25 ml n-hexan Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, lọc lấy dịch lọc, tráng rửa phễu và bình bằng methanol, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng 0,22 μm

Lấy phần cắn còn lại ở trên, thêm 10ml methanol 60%, siêu âm 15 phút, sau đó lý tâm 6000 vòng/ phút thu được dịch lọc, lọc qua màng 0,22 μm, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký Kết quả: trên sắc ký đồ không thấy xuất hiện pic acid chlorogenic Do đó, chiết một lần bằng MeOH 60% đảm bảo chiết được hết acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan

Từ kết quả khảo sát, qui trình xử lý mẫu được lựa chọn như sau:

Lấy 20 viên nang mềm, cân và tính khối lượng trung bình thuốc trong viên Trộn đều Cân chính xác một lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên vào cốc

0200400600800100012001400

Thời gian (phút)

30

có mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút Chuyển toàn bộ mẫu vào bình gạn

100 ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan và tập trung vào bình gạn Lắc 5 phút, để lắng, bỏ lớp n-hexan.Tiếp tục chiết như vậy thêm 1 lần nữa với 25 ml n-hexan Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Ly tâm dịch chiết

6000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy phần dịch trong Lọc qua màng 0,22 μm PTFE

3.1.4 Khảo sát điều kiện sắc ký

Thực hiện trên cột C18, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, bước

sóng phát hiện 330 nm Khảo sát trên mẫu chuẩn acid chlorogenic (ACG), qua tham khảo một số tài liệu tiến hành khảo sát các hệ pha động sau:

- Hệ 1: MeCN và dung dịch acid acetic 0,1% tỷ lệ 30: 70;

- Hệ 2: MeCN và acid formic 0,1%, tỷ lệ 10: 90;

- Hệ 3: MeCN và dung dịch acid phosphoric 1,0% tỷ lệ 10: 90;

- Hệ 4: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,4% tỷ lệ 10: 90;

- Hệ 5: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,1%, với tỷ lệ của MeCN từ

5 - 20% (  C = 5%)

Kết quả được trình bày ở hình 5

(a)

Hệ 1