Tinh chế và xác định độ tinh khiết của cleistantoxin phân lập từ quả của cây chà chôi (cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi, xác định hàm lượng tạp chất vô cơ, xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn ...25 2.2.3.1.. Bảng 3.18: Kết quả địn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đoàn Thị Mai Hương - Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam và NCS.Ths Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất - Trường Đại học

Dược Hà Nội, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tôi có thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS Lê Công Vinh và các anh chị ở trung tâm

tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, cùng các em Nguyễn Văn Hoàng, Bùi Bích Phương sinh viên K68 – Trường Đại Học Dược Hà Nội đã hỗ trợ và phối hợp với tôi trong quá trình thực hiện Những kinh nghiệm và kỹ năng học hỏi được đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác hơn, thực tế hơn

Cuối cùng tôi xin kính chúc các thầy, cô và các em dồi dào sức khoẻ và thành công trong sự nghiệp Đồng kính chúc các cô chú, anh chị trong Viện Hóa Sinh Biển luôn mạnh khoẻ, đạt được nhiều thành tựu trong công việc

Trân trọng!

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2018

Ds Đào Tú Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thực vật của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 3

1.1.1 Vị trí và phân loại 3

1.1.2 Sơ lược về thực vật họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) 3

1.1.3 Sơ lược về thực vật chi Cách Hoa (Cleistanthus) 3

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3.3 Hoạt tính sinh học 4

1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis 4

1.2 Hợp chất Cleistantoxin 5

1.2.1 Tính chất 5

1.2.2 Bộ dữ liệu phổ cleistantoxin 5

1.2.3 Các nghiên cứu trước đây về cleistantoxin 6

1.2.4 Một số nghiên cứu xác định tạp chất liên quan trong etoposid 7

1.3 Chất chuẩn và quy trình thiết lập chuẩn 8

1.3.1 Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu 8

1.3.2 Phân loại chất đối chiếu hóa học 9

1.3.2.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (PCRS- chuẩn gốc) 9

1.3.2.2 Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SRCS-Chuẩn thứ cấp) 10

1.3.3 Tổng quan về thiết lập chất chuẩn 10

1.4 Các kỹ thuật phân tích xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn .13

1.4.1 Bản chất và nguồn gốc của tạp chất trong hoạt chất 13

1.4.2 Các kỹ thuật xác định tạp chất 14

1.4.2.1 Kỹ thuật xác định gián tiếp 14

1.4.2.2 Kỹ thuật xác định trực tiếp (phương pháp tuyệt đối) 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Tinh chế và xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập được từ quả cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 23

2.2.2 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC-DAD……… 24

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 24

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp 24

2.2.3 Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi, xác định hàm lượng tạp chất vô cơ, xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn 25

2.2.3.1 Định lượng tạp chất bay hơi 25

2.2.3.2 Xác định hàm lượng tạp chất vô cơ 25

2.2.3.3 Xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn 25

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Tinh chế và xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của

cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 27

3.1.1 Tinh chế cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) 27

3.1.1.1 Giai đoạn 1: Tách phân đoạn cao cồn (168 g) được chiết xuất từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) trên cột tổng silicagel .27

3.1.1.2 Giai đoạn 2: Phân lập từ phân đoạn 7 (6,5273 g) trên cột silicagel 28

3.1.1.3 Giai đoạn 3: Phân lập chất cleistantoxin (7B) từ dịch cái trên cột sephadex 29

3.1.1.4 Giai đoạn 4: Quy trình tinh chế cleistantoxin bằng phương pháp kết tinh 31

3.1.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistatoxin tinh chế được 31

3.1.2.1 Tính chất: 31

3.1.2.2 Góc quay cực riêng: 31

3.1.2.3 Xác định nhiệt độ nóng chảy 31

3.1.2.4 Dự đoán giá trị pka của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chuẩn bằng phần mềm ChemBioOffice 2014 33

3.1.2.5 Bộ dữ liệu phổ 33

3.2 Xây dựng phương pháp xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC-DAD .42

3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 42

3.2.1.1 Khảo sát và lựa chọn cột và dung môi pha động 42

3.2.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện 45

3.2.1.3 Khảo sát thể tích tiêm 47

3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 48

3.2.2.1 Độ đặc hiệu 48

3.2.2.2 Độ phù hợp hệ thống 55

3.2.2.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 57

3.2.2.4 Độ tuyến tính 58

3.2.2.5 Độ chụm 59

3.2.2.6 Độ ổn định của dung dịch phân tích 64

3.3 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn 64

3.3.1 Xác định hàm lượng tạp bay hơi bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô……… ……… 64

3.4 Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 67

3.5 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin ……….67

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 70

4.1 Tính mới và ứng dụng: 70

4.2 Quy trình phân lập, tinh chế .70

4.3 Bộ dữ nhận dạng cleistantoxin 70

4.4 Xây dựng phương pháp xác định tạp chất liên quan bằng HPLC-DAD 70

4.5 Xác định hàm lượng tạp bay hơi và tạp chất vô cơ 72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

KẾT LUẬN 73

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số điều kiện sắc ký xác định tạp chất liên quan trong etoposid 7

Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn 12

Bảng 1.3: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan 14

Bảng 1.4: Các chỉ tiêu cần thẩm định của một số quy trình phân tích 17

Bảng 1.5: Các phương pháp định lượng tạp bay hơi 18

Bảng 1.6: Các phương pháp định lượng tạp vô cơ 20

Bảng 2.1: Dung môi hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin bằng DSC và mao quản theo DĐVN V phụ lục 6.7 32

Bảng 3.2: Các đỉnh phổ IR đặc trưng của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 34

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn so với tài liệu đã công bố [28] .37

Bảng 3.4: Bộ dữ liệu nhân dạng cleistantoxin 41

Bảng 3.5: Chương trình gradient 1 43

Bảng 3.6: Tối ưu hóa chương trình dung môi (chương trình gradien 2) 44

Bảng 3.7: Khảo sát bước sóng 203 nm và 286 nm 46

Bảng 3.8: Chương trình Gradien 2 48

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống 56

Bảng 3.10: Độ lặp lại tại LOQ 57

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tuyến tính 58

Bảng 3 12: Kết quả thẩm định độ lặp lại 60

Bảng 3.13: Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian 61

Bảng 3.14: Kết quả thẩm định độ tái lặp 62

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá sự khác biệt của phương sai giữa 2 phòng thí nghiệm .63

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch phân tích 64

Bảng 3.17: Kết quả định lượng tạp bay hơi bằng 65

Bảng 3.18: Kết quả định lượng tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulphat 66 Bảng 3.19: Kết quả xác định độ tinh khiết của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chuẩn .66 Bảng 3.20: Tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cleistantoxin 5

Hình 1.2: Dữ liệu NMR của cleistantoxin (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl3) 6

Hình 1.3: Cấu trúc của Cleistantoxin và Etoposid….……….8

Hình 3.1: Quy trình phân lập và tinh chế cleistantoxin 30

Hình 3.2: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin trước tinh chế 30

Hình 3.3: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin sau tinh chế 31

Hình 3.4: Giản đồ nhiệt DSC xác định nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistatoxin 32

Hình 3.5: Kết quả dự đoán hằng pka của cleistantoxin 33

Hình 3.6: Phổ IR của cleistantoxin trong tài liệu đã công bố [28] 33

Hình 3.7: Phổ IR của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 34

Hình 3.8: Phổ UV-VIS của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 35

Hình 3.9: Phổ HR-MS của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 35

Hình 3.10: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 36

Hình 3.11: Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500MHz) của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .36

Hình 3.12: Phổ 1H-1H COSY của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 39

Hình 3.13: Phổ HMBC của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 39

Hình 3.14: Phổ NOESY của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 40

Hình 3.15: Phổ CD của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin 41

Hình 3.16: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan tách khỏi cleistantoxin trên cột phenyl và hệ pha động ACN: đệm acetat pH 4 theo chương trình gradient 1 43

Hình 3.17: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ pha động ACN: Acid formic : Triethylamin : nước theo chương trình gradient 1 43

Hình 3.18: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ pha động ACN: nước theo chương trình gradient 1 44

Hình 3.19: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ pha động ACN: nước theo chương trình gradient 2 45

Hình 3.20: Phổ UV của cleistantoxin và các tạp chất liên quan 46

Hình 3.21: Kết quả khảo sát thể tích tiêm 47

Hình 3.22: Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng và cleistantoxin 1000 ppm 50

Hình 3.23: Xác định độ tinh khiết pic cleistantoxin 1000 ppm .50

Hình 3.24: Phổ 3D của dung dịch cleistantoxin 1000 ppm 51

Hình 3.25: Sắc ký đồ dung dịch phân giải cleistonkinensis B - cleistantoxin - cleistonkinensis A 52

Hình 3.26: Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1000 ppm phân hủy trong môi trường acid/base .53

Hình 3.28: Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1000 ppm phân hủy trong các môi trường khắc nghiệt 54 Hình 3.29: Sắc ký đồ dung dịch phân giải 56 Hình 3.30: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cleistantoxin 0,05 ppm xác định LOQ .57 Hình 3.31: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ.59 Hình 3.32: Kết quả xác định độ tinh khiết bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 67

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C

nguyên tử

cao

Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng

dò khối phổ

LOQ Limit of quantification, giới hạn định lượng

ᵟ H, ᵟ C ᵟ H, ᵟ C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết trong năm 2015 [30] Nhiều liệu trình điều trị đã được áp dụng như: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn tuy nhiên kết quả vẫn chưa như mong đợi Chính điều này đã thúc đẩy nhiều nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu các phương pháp cũng như các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này và tạo ra một xu thế chung trên toàn cầu

Cùng bắt nhịp với xu thế chung tại Việt Nam, một hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm là phát triển các thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ dược liệu Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã được khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã được đem thử tác dụng trên dòng ung thư KB để sàng lọc hoạt tính kháng ung Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết

ethylacetat từ quả của cây Cách Hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis) đã

cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư KB đạt khoảng 88,40 - 95,17% Từ dịch chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dương, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế

và xác định cấu trúc được 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thư thử

(tương đương với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [6] Bên cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập được từ quả của cây Cách Hoa Đông Dương có

bộ khung phân tử rất giống như etoposid và teniposid hiện đang được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả tiếp tục nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế phân đoạn giàu cleistantoxin và các aryltetralin lignan được chiết xuất từ quả của cây Chà Chôi (một cây cùng chi với Cách Hoa Đông Dương) để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư

Nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn dược liệu để chiết xuất và phân lập các hoạt chất có tác dụng hóa trị liệu ung thư này, các chất chuẩn rất cần được thiết lập để

tiến hành định tính và định lượng các chất đã phân lập trên Chính vì vậy, chúng tôi

tiến hành đề tài: "Tinh chế và xác định độ tinh khiết của cleistantoxin phân lập từ

quả của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn" được thực hiện với các mục tiêu:

1) Tinh chế và xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistatoxin phân lập được từ quả

cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis)

2) Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin bằng HPLC-DAD

3) Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô, xác định hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulfat, xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin

1.1.2 Sơ lƣợc về thực vật họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae)

Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của

thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài Trước đây chia thành 5 phân họ

bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và

Phyllanthoideae Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân

họ sau là hai lá mầm [24] Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [3]

1.1.3 Sơ lƣợc về thực vật chi Cách Hoa (Cleistanthus)

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật

Là cây gỗ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thường ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc Hoa đực có 4-6 lá đài, thường là 5, xếp van Cánh hoa 5 nhỏ, thường nguyên Đĩa mật phẳng hay lồi Bầu không lông hoặc có lông nhung Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lưng; hạt hình

trứng - 3 góc [24] Chi Cleistanthus gồm tới 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn

Độ đến Australia Ở nước ta theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của tác giả Phạm Hoàng

Hộ thì chi Cleistanthus có 14 loài [4] Trong đó, một số loài đã được sử dụng trong

dân gian với nhiều mục đích khác nhau phục vụ cuộc sống [2], [3]

1.1.3.2 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu hóa học về chi Cleistanthus ở trên thế giới còn rất hạn chế Các hợp chất được phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể được phân loại như

sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác

Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dương (cùng chi với Chà Chôi) và xác định được cấu trúc của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới gồm cleistantoxin, demethoxycleistantoxin, podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid

C, cleindosid D, cleindosid E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là acid gallic và amentoflavon Các hợp chất mới là thành phần chính của quả, đều có khung cơ sở là aryl tetralin lignan và các dẫn xuất glycosid của chúng [6]

1.1.3.3 Hoạt tính sinh học

Ở chi Cleistanthus, người ta mới chỉ biết đến hoạt tính chống ung thư từ dịch

chiết cồn của loài Cleistanthus collinus kháng lại ung thư biểu mô nuôi cấy trong

mũi hầu người [22] Năm 2012, trong khuôn khổ Dự án hợp tác Pháp - Việt về sàng lọc hoạt tính sinh học của thảm thực vật Việt Nam, hợp chất cleistantoxin đã lần đầu tiên được phân lập từ quả của cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis Merr ex Croiz) bởi Trịnh Thị Thanh Vân và các cộng sự Kết quả cho thấy hợp chất cleistantoxin cho hoạt tính ức chế rất mạnh trên các dòng tế bào thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM [6]

1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis

Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; cao 7 mm Cây phân bố ở khu vực

Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hòa Pháp) đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật Việt Nam trong đó có cây Chà Chôi về hoạt tính kháng tế

bào ung thư trên dòng ung thư KB Kết quả cho thấy dịch chiết từ Cleistanthus

tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư, cụ thể,

nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư KB lên tới 88,40 - 95,17% Đây là tiền đề cho các nghiên cứu phân lập và tinh chế các hợp chất từ cây Chà chôi, hướng tới mục tiêu phát triển một thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để điều trị ung thư

1.2 Hợp chất Cleistantoxin

Danh pháp IUPAC:

(7R,8R,7’R,8’R)-7-hydroxy-6-methoxy-3',4':4,5-bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclo lignan-9',9-olid

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cleistantoxin

1.2.1 Tính chất

Tinh thể rắn, màu trắng Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN, kém tan

1.2.2 Bộ dữ liệu phổ cleistantoxin

Bộ dữ liệu phổ đã được công bố trong các nghiên cứu bao gồm [28]

- Phổ khối HRESI pic [M+Na]+ cho tín hiệu m/z 421.0888 phù hợp với công

biểu diễn dưới hình 1.2

Hình 1.2: Dữ liệu NMR của cleistantoxin (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl 3 )

1.2.3 Các nghiên cứu trước đây về cleistantoxin

eberhardtii là các loài đặc thù ở Việt Nam Trên thế giới có một số nghiên cứu về

các cây thuộc chi này, nhưng chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng hoạt

và Công nghệ Việt Nam đã phát hiện ra hoạt chất cleistantoxin được phân lập từ quả của một số loài thuộc chi cleistanthus có tác dụng kháng tế bào ung thư Vì thế, dịch chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang được nghiên cứu, phát triển thành cao định chuẩn chứa hàm lượng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều trị ung thư trong pha tiền lâm sàng Xuất phát từ thực tế trên rất cần có chất chuẩn

để định lượng cleistantoxin trong cao và tìm nguồn dược liệu để chiết xuất cao định chuẩn này Vì vậy chúng tôi cần thiết lập chất chuẩn cleistantoxin

1.2.4 Một số nghiên cứu xác định tạp chất liên quan trong etoposid

Do phân tử cleistantoxin có cấu trúc khá giống etoposid là một thuốc đang được điều trị ung thư nên chúng tôi tiến hành tìm kiếm các tài liệu liên quan đến việc định lượng và xác định tạp chất liên quan của etoposid Kết quả thu thập được một

số thông tin liên quan đến điều kiện sắc ký, được trình bày dưới bảng 1.1 và hình 1.1

Bảng 1.1: Một số điều kiện sắc ký xác định tạp chất liên quan trong etoposid

USP40

(Etoposid) [27]

Cột phenyl 3,9 mm x 300 mm, đường kính trong < 5μm Dung dịch A: ACN: đệm = 20:80

Pha động A: acid formic:

trimethylamin: nước (1 : 1 : 998)

Pha động B: acid formic : trimethylamin : ACN (1 : 1 : 998)

Pha động B: acid formic:

trimethylamin : ACN ( 1 : 1 : 998)

Hình 1.3: Cấu trúc của Cleistantoxin và Etoposid

1.3 Chất chuẩn và quy trình thiết lập chuẩn

1.3.1 Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu

Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu” còn có nhiều cách gọi khác như “chất đối chiếu hóa học” hay “chất chuẩn đối chiếu hóa học” Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), chất đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất đã được chứng thực, được

sử dụng cho các mục đích cụ thể: phép thử vật lý và hóa học, trong đó tính chất của

nó được so sánh với các đối tượng kiểm tra và có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [31]

1.3.2 Phân loại chất đối chiếu hóa học

1.3.2.1 Chất chuẩn gốc (PCRS)

Chất chuẩn gốc là chất đối chiếu hóa học có phẩm chất phù hợp với từng mục đích sử dụng và đặc tính của nó được chấp nhận mà không cần phải so sánh với chất hoá học nào khác [7], [9], [11], [31] Các PCRS có thể tìm được tại trung tâm hợp tác về chất chuẩn đối chiếu của WHO; Hội Đồng Dược Điển Châu Âu; các phòng thí nghiệm trực thuộc Hội Đồng Dược điển Anh [9], [14]

Một số chất chuẩn gốc chính thức:

- Chất đối chiếu hóa học quốc tế (ICRS) là các chất đối chiếu hoá học được thành lập theo khuyến cáo của ủy ban chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới về tiêu chuẩn chất lượng Dược phẩm [31]

- Chuẩn Dược Điển Mỹ: Được thiết lập và phân phối bởi Hội Đồng Chất Đối Chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard Committee) [26]

- Chuẩn Dược Điển Châu Âu được thiết lập và cung cấp bởi Ban Thư Ký Kỹ thuật Thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission) [20]

- Chuẩn Dược Điển Anh được các phòng thí nghiệm trực thuộc Hội Đồng Dược Điển Anh thiết lập [20]

Ngoài ra trong trường hợp chưa có chất chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có thể được xây dựng chất chuẩn gốc cơ sở (in-house primary reference standard) Chất chuẩn gốc cơ sở là các chất được sản xuất và thiết lập bởi cơ sở hay nhà sản xuất theo các quy trình và các tiêu chí của cơ sở Chất chuẩn gốc cơ sở được tinh chế, mô tả đầy đủ và xác định rõ cấu trúc (IR, UV, NMR, MS…), thường được sử dụng cho các chất hóa học mới (New Chemical Entity - NCE) chưa có chuyên luận

1.3.2.2 Chất chuẩn thứ cấp (SRCS)

Là chất đối chiếu hóa học mà các đặc tính của nó được đánh giá và/hoặc hiệu chuẩn theo chất cguaanr gốc [7], [9], [20], [31] Mức độ tinh khiết và hiệu lực kiểm tra của một chuẩn thứ cấp có thể thấp hơn đối với một chất chuẩn sơ cấp [9], [31] Chất đối chiếu hóa học thứ cấp có hai loại:

- SRCS “chính thức” là chất đối chiếu hóa học chính thức của khu vực hay quốc gia

do các phòng thí nghiệm của các Hội Đồng Dược Điển, viện kiểm nghiệm quốc gia thiết lập nếu trong quá trình thiết lập chuẩn có sử dụng PCRS so sánh [19]

 Được thiết lập tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – Bộ Y tế hoặc Viện

Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh – Bộ Y tế

 Được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm (KTN): khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện

 Đu ợc liên kết với chất chuẩn gốc

- Chuẩn làm việc là một chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp do một nhà sản xuất hoặc một phòng thí nghiệm cung cấp

1.3.3 Tổng quan về thiết lập chất chuẩn

 Tình hình nghiên cứu thiết lập chuẩn gốc trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn gốc chủ yếu phát triển mạnh ở các nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến như Anh, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc các chất chuẩn được thiết lập được theo hướng dẫn của Dược Điển hoặc WHO với các bước cơ bản sau:

Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập các chất chuẩn sơ cấp

Bước 2: Tìm kiếm nguồn nguyên liệu

Bước 3: Đánh giá nguyên liệu theo mục đích sử dụng

Bước 4: Đánh giá nguyên liệu dùng thiết lập chất đối chiếu hóa học

Bước 5: Xác định giá ấn định

Bước 6: Phê duyệt

Bước 7: Đóng gói, bảo quản, phân phối, kiểm tra định kỳ

Khi tiến hành đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn, độ tinh khiết được tính thông qua việc xác định hàm lượng các loại tạp chất bằng cách sử dụng các phương

pháp phân tích phù hợp và áp dụng nguyên tắc bảo toàn khối lượng [11], [31]

Độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tính theo công thức sau [25], [32]

[%] HL = (100 – [%] tạp liên quan) x (100 – [%] tạp bay hơi – [%] tạp vô cơ)/100

Trong đó:

[%] HL: là độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn (%)

[%] tạp liên quan: hàm lượng tổng tạp chất liên quan tính theo chuẩn hóa diện tích (%)

Một ví dụ minh họa cho việc xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO được trình bày dưới bảng 1.2 [32]

Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn

1,0% (xác định bằng HPLC đối quang)

 Tình hình nghiên cứu thiết lập chất chuẩn trong nước

Hiện nay, Việt Nam gần như chưa có nghiên cứu nào được công bố về thiết lập chất chuẩn gốc Việc thiết lập chất chuẩn trong nước chủ yếu thực hiện bằng cách nối chuẩn với chất chuẩn gốc được nhập từ nước ngoài, nhưng giá thành cao và thường phải chờ đợi lâu Thực trạng này đặt ra vấn đề cấp thiết phải tự chủ về nguồn chất chuẩn

Mặt khác tình hình quản lý chất lượng các sản phẩm thuốc đông dược lưu hành trên thị trường cũng đang gặp rất nhiều khó khăn do thiếu chất chuẩn có nguồn gốc dược liệu Hiện nay, có hai đơn vị phân phối chất chuẩn chính thức là Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (10 chất chuẩn dược liệu) và Viện Kiểm nghiệm thuốc

TP HCM (18 chất chuẩn dược liệu), tuy nhiên số lượng này vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu thị trường Do vậy, cần phải bổ sung thêm nguồn chất chuẩn đặc biệt là các chất chuẩn dược liệu để đảm bảo việc kiểm soát chất lượng thuốc

Từ những lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm tiếp cận với hướng nghiên cứu thiết lập chất chuẩn gốc nhằm chủ động nguồn chất chuẩn phục

vụ cho công tác kiểm tra và quản lý chất lượng thuốc có nguồn gốc dược liệu

1.4 Các kỹ thuật phân tích xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập

Trong loại tạp chất này có một nhóm tạp chất có cấu trúc liên quan mật thiết với hoạt chất được gọi là tạp chất liên quan Trong luận văn này việc định lượng tạp chất hữu cơ chỉ xoay quanh vấn đề định lượng tạp liên quan

b Tạp vô cơ

Các tạp chất vô cơ là kim loại nặng hoặc các kim loại còn sót lại, muối vô cơ và các nguyên liệu khác (ví dụ than hoạt tính, các muối phosphate, Asen…)

Đối với các hoạt chất có nguồn gốc dược liệu thì loại tạp này chủ yếu xuất hiện

từ môi trường sống của dược liệu bao gồm đất và nguồn nước, chúng cũng có thể bị nhiễm từ các thiết bị sử dụng trong quá trình phân lập, tinh chế…

c Dung môi bay hơi

Đây là các chất lỏng vô cơ hoặc hữu cơ được sử dụng trong quá trình sản xuất chất chuẩn đối chiếu

Đối với hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu thì dung môi dùng trong quá trình kết tinh, sắc ký, dung môi do hấp phụ trong môi trường (hay gặp nhất là nước)

 Phân loại tạp chất bay hơi [1], [27]

Dung môi tồn dư bao gồm nước và các dung môi hữu cơ được phân loại: 3 nhóm

- Loại 1: Dung môi phải tránh gồm những chất gây ung thư hoặc nghi ngờ gây ung thư trên người, có mối nguy hại với môi trường không nên được sử dụng trong sản xuất hoạt chất, tá dược, hoặc thành phẩm Nếu việc sử dụng chúng là

bắt buộc thì nên sử dụng với lượng phù hợp theo các khuyến cáo hướng dẫn Một số dung môi điển hình: Benzen, Carbon tetraclorid, Dicloroethan …

- Loại 2: Các dung môi nên hạn chế sử dụng, không gây ung thư nhưng gây độc tính trên sinh dục hoặc có thể gây ra độc tính không hồi phục như độc tính thần kinh hoặc gây quái thai mà cần được hạn chế do độc tính của chúng Một

số dung môi điển hình: ACN, Cloroform, Cyclohexan…

- Loại 3: Dung môi có nguy cơ độc thấp đối với con người Có PDEs từ 30 mg/ngày trở lên và nhìn chung có thể bị hạn chế bởi GMP hoặc các yêu cầu về chất lượng khác Một số dung môi điển hình: Aceton, Acid Acetic, 1-Butanol

1.4.2.1 Kỹ thuật xác định gián tiếp

a Định lượng tạp chất liên quan

Các phương pháp định lượng tạp hữu cơ trong các tài liệu hướng dẫn được trình bày dưới bảng 1.3

Bảng 1.3: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan

Guidelines for the establishment, handling, storage

and use of ASEAN reference substances [9]

HPLC

Herbal Reference Standards: applications,

definitions and regulatory requirements [25]

HPLC

Reference-standard material qualification [14] HPLC/UV hoặc LC-MS

Từ việc tham khảo tài liệu hướng dẫn ta thấy phương pháp HPLC được sử dụng rất phổ biến do đó chúng tôi chỉ đề cập chi tiết đến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các kỹ thuật định lượng tạp chất liên quan bằng HPLC [13]

 Kỹ thuật 1: Chuẩn hóa diện tích

Hàm lượng của một tạp chất liên quan riêng lẻ được tính theo phương trình sau:

Spic (tạp đơn) là diện tích của pic tạp đơn tương ứng

∑ là tổng diện tích pic các tạp đơn

Đây là một trong những cách đơn giản nhất để định lượng tạp chất liên quan vì không cần chất chuẩn đối chiếu Phương pháp được áp dụng khi đáp ứng các tiêu chí dưới đây

- Khoảng nồng độ tuyến tính: do hàm lượng các tạp chất liên quan thường dưới

1% và hoạt chất trên 95% do đó điều quan trọng là phải có sự tuyến tính từ ngưỡng nồng độ các chất liên quan

- Độ nhạy của phương pháp: Trong một số trường hợp, hình dạng pic của hoạt

chất có thể không hoàn toàn đối xứng ở nồng độ cao nên có thể dẫn đến sự mất tuyến tính Vì thế, để duy trì tính tuyến tính ở nồng độ của hoạt chất, các nhà khoa học có thể cố gắng giảm nồng độ mẫu để cải thiện hình dạng peak hoạt chất Tuy nhiên, nếu nồng độ mẫu quá thấp, có thể sẽ không phát hiện được đầy đủ các tạp chất liên quan Do đó phương pháp phải đáp ứng được độ nhạy cần thiết để có thể phát hiện được đầy đủ các pic tạp chất khi mẫu ở nồng độ thấp

- Hệ số đáp ứng: Các hệ số đáp ứng tương đối của các chất liên quan với hoạt

chất nên gần với 1, ngưỡng cho phép (0,8 – 1,2) [11], [26] Nếu không, phải xác định hệ số hiệu chỉnh để tính toán Trong trường hợp hàm lượng tạp chất quá nhỏ, dưới mức 0,05% thì có thể không cần xác định chính xác tap [27], [32] Mặt khác, khi xác định độ tinh khiết của hoạt chất tự nhiên thì sai số do

sự chênh lệch về đáp ứng là không thể tránh khỏi, do thành phần phức tạp ngăn cản việc xác định và định lượng tất cả các thành phần [25]

 Kỹ thuật 2: pha loãng dung dịch thử

Kỹ thuật này có thể khắc phục được hạn chế của kỹ thuật chuẩn hóa diện tích khi không đáp ứng được yêu cầu về khoảng tuyến tính Trong kỹ thuật này, mẫu được chuẩn bị ở cả nồng độ cao (tương tự như phương pháp chuẩn hóa diện tích) và nồng độ thấp, chúng đều được tiêm để phân tích Mục đích tiêm các mẫu có nồng

độ cao, nhằm phát hiện tất cả các pic tạp từ đó tăng độ nhạy của phương pháp Tiêm mẫu ở nồng độ thấp được sử dụng để đảm bảo sự tuyến tính trong đáp ứng của hoạt chất Mặt khác đáp ứng của hoạt chất trong mẫu có nồng độ thấp tương tự như tạp chất liên quan có trong mẫu nồng độ cao Do đó, chỉ cần một khoảng tuyến tính hẹp

để định lượng Hạn chế của phương pháp này là tổng thời gian phân tích sẽ tăng lên gấp đôi và có thể mắc phải sai số do pha loãng

 Kỹ thuật 3: Sử dụng chất chuẩn tạp

Trong kỹ thuật này, nồng độ các tạp chất liên quan được xác định dựa trên đáp ứng (diện tích pic của mỗi tạp) và đường chuẩn sau khi đã hiệu chỉnh Một chất

trường hợp đáp ứng của tạp chất liên quan và hoạt chất khác nhau nhiều Có hai hình thức hiệu chuẩn là hiệu chuẩn đơn điểm và đa điểm Hiệu chuẩn đơn điểm áp dụng khi hệ số chắn trên trục tung không đáng kể Nếu không, phải sử dụng hiệu chuẩn đa điểm Kỹ thuật sử dụng tạp chuẩn có một số lợi thế so với phương pháp chuẩn hóa diện tích

- Giảm khoảng tuyến tính: thường khoảng nồng độ của đường chuẩn cũng tương

tự như nồng độ các tạp chất liên quan trong mẫu (ví dụ 1 đến 5% nồng độ định danh của hoạt chất) Do đó, phương pháp này chỉ yêu cầu dải tuyến tính nhỏ

- Cải thiện độ nhạy của phương pháp: do chỉ dùng diện tích pic của các tạp chất liên quan để tính Vì thế diện tích pic hoạt chất không cần cho việc tính toán nên có thể sử dụng nồng độ mẫu cao mà không lo lắng về đáp ứng ngoài khoảng tuyến tính của hoạt chất

- Một trong những hạn chế của phương pháp này là cần phải có một chất chuẩn đối chiếu tốt Thêm vào đó, mỗi phép phân tích đòi hỏi phải cân chính xác một lượng nhỏ (ví dụ, 10 mg) chất chuẩn đối chiếu Do đó, lỗi khi cân có thể ảnh hưởng đến độ chụm của phương pháp và độ đúng

* Trong quá trình tính toán ngưỡng cho phép bỏ qua một số pic tạp thường là khi diện tích pic tạp nhỏ hơn 0,1% hoặc 0,05% [32]

 Thẩm định phương pháp

Các tài liệu tham khảo đều qui định các phép thử cần thẩm định là định tính, định lượng, xác định giới hạn tạp chất [5], [8], [16], [17], [27] Tùy theo từng phép thử

cụ thể và mục đích sử dụng của phép thử mà các chỉ tiêu cần thẩm định cũng khác nhau (bảng 1.4)

Bảng 1.4: Các chỉ tiêu cần thẩm định của một số quy trình phân tích

Loại quy trình phân tích

Các chỉ tiêu

Định tính

- Hàm lượng/ hoạt lực

Định lượng

Thử giới hạn

- + + +

- + +

-

-

-

+ +

-

- + +

Dấu - nhằm chỉ các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá

Dấu + nhằm chỉ các chỉ tiêu này cần phải đánh giá

b Các kỹ thuật định lượng tạp chất bay hơi

Tham khảo các phương pháp được sử dụng trong Dược Điển và một số tài liệu Kết quả được trình bày ở bảng 1.5

Bảng 1.5: Các phương pháp định lượng tạp bay hơi

WHO pharmacopoeia Library [32] Mất khối lượng do làm khô (General notices);

chuẩn độ Karl Fisher (định lượng nước - 2.8);

Fisher (5.12) Dược điển Châu Âu 9.0 [15] Mất khối lượng do làm khô; Chuẩn độ Karl

Fisher

chuẩn độ Karl Fisher (921)

(9.6); chuẩn độ Karl Fisher (10.3) Herbal Reference Standards:

applications, definitions and

regulatory requirements [25]

Sắc ký khí; chuẩn độ Karl Fisher

Reference-Standard Material

Qualification [14]

Phân tích nhiệt trọng lượng; chuẩn độ Karl Fisher

và sắc ký khí khối phổ

A review on reference substances [20] Sắc ký khí khối phổ

Từ việc tham khảo các tài liệu hướng dẫn ta thấy phương pháp mất khối lượng do làm khô được sử dụng khá phổ biến do đó chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp này và những phương pháp liên quan

 Phương pháp mất khối lượng do làm khô “Loss on drying”

- Đây là kỹ thuật đầu tay trong hướng dẫn của các dược điển và ICH khi xác định tạp bay hơi Kỹ thuật cho phép định lượng chất dễ bay hơi thuộc bất kỳ dạng nào (nước và dung môi tồn dư) bị bay hơi trong điều kiện áp suất thường và/hoặc chân không

- Nguyên tắc chung của phương pháp này dưới ảnh hưởng của nhiệt độ hằng định các thành phần dễ bay hơi sẽ bay hơi và có thể đo được độ mất khối lượng (bao gồm cả nước và dung môi dễ bay hơi khác) dựa vào khối lượng trước và sau khi sấy [1], [11], [18], [26], [32] Tuy nhiên, không cho biết cụ thể phần khối lượng giảm đi là của nước hay các dung môi khác

 Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

- Nguyên lý: giống với phương pháp mất khối lượng do làm khô Tuy nhiên trong quá trình phân tích nhiệt độ được thay đổi theo chương trình đã cài đặt

và khối lượng mẫu được theo dõi liên tục như là một hàm số của nhiệt độ/thời gian

- Phương pháp này cho phép xác định tổng hàm lượng của nước và/hoặc các dung môi khác ở dạng tự do hoặc liên kết Tuy nhiên, không cho biết cụ thể phần khối lượng giảm đi là của nước hay các dung môi khác Trong trường hợp xảy ra sự chồng chéo giữa các quá trình việc định lượng các thành phần riêng có thể mắc nhiều sai số Tuy nhiên, có thể giải quyết bằng việc lựa chọn

các điều kiện đo tối ưu: giảm tốc độ gia nhiệt và lượng mẫu, hoặc dùng một khí dẫn nhiệt tốt (ví dụ heli) độ phân giải tăng lên [23]

Tham khảo các phương pháp được sử dụng trong Dược Điển và một số tài liệu kết quả tìm kiếm được trình bày dưới bảng 1.6

Bảng 1.6: Các phương pháp định lượng tạp vô cơ

ký ion (1065)

quang phổ phát xạ plasma, huỳnh quang tia X WHO pharmacopoeia library [32] Xác định tro sulfat (2.3)

Herbal Reference Standards:

applications, definitions and

regulatory requirements [25]

ICP-MS, AAS, chuẩn độ

Dược điển Việt Nam V [1] Xác định tro sulfat (9.6)

hợp khác như AAS…

Trong dược điển Mỹ phương pháp “Xác định tro Sulfat” được gọi dưới tên khác là

“Xác định cắn sau nung” Do đó có thể thấy trong đa số các dược điển phương pháp

“Xác định cắn sau nung” là một phương pháp rất phổ biến, vì vậy trong luận văn chúng tôi chỉ đề cập chi tiết đến phương pháp này

Xác định cắn sau nung là phương pháp phổ biến và nhanh nhất để xác định tổng hàm lượng tạp chất vô cơ qua việc xác định cắn sau nung

1.4.2.2 Kỹ thuật xác định trực tiếp (phương pháp tuyệt đối)

Các phương pháp điển hình cho cách làm này như chuẩn độ, sử dụng phản ứng

có hệ số tỷ lượng đã biết… Các phương pháp nên được bổ sung để xác nhận lại giá trị độ tinh khiết thu được khi định lượng bằng các phương pháp khác [9], [11], [31], [32]

Một số phương pháp khác như phân tích độ hòa tan, quét nhiệt vi sai cũng có thể

sử dụng [31] Tuy nhiên trong nội dung của luận văn này chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp quét nhiệt vi sai

- Nguyên liệu phải có độ tinh khiết cao > 95% và tốt hơn > 97% [21]

- Nguyên lý: dựa trên hiện tượng rằng trong các hệ eutecti nhiệt nóng chảy của các tinh thể bị giảm dưới ảnh hưởng của tạp chất Khi đó độ tinh khiết được xác định dựa trên phương trình cơ bản của định luật Van’t Hoff [29]:

=

*

hằng số khí

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu: Cao cồn khô chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis

Jabl Euphorbiace) được thu hái ngày 06/06/2016 tại La Bằng, Đại Từ, Thái

Nguyên

Mẫu thực vật được định danh bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (xem phụ lục 1)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Hệ thống HPLC Agilent Technologies 1200 (Mỹ)

Cột Inerstil ODS-3 (250 mm x 4,6 mm, 5μm) (Nhật)

Máy quét nhiệt vi sai SHIMADZU DSC

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan)

Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan)

Máy lọc hút chân không Rocker 400

Cân phân tích METTLER - TOLEDO XPE 105 – Thụy Sĩ (d = 0,01)

Bảng 2.1: Dung môi hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tinh chế và xác định cấu trúc cleistatoxin phân lập được từ quả cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis)

- Tinh chế: sử dụng phương pháp kết tinh để tinh chế cleistantoxin để đạt độ tinh khiết phù hợp

- Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất cleistatoxin tinh chế được bao gồm tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng và các loại phổ UV, IR, MS, NMR kết hợp đồng thời so sánh với dữ liệu phổ trong các bài báo khoa học

đã công bố và đối chiếu với công thức cấu tạo của cleistantoxin để khẳng

định lô nguyên liệu thiết lập chất chuẩn là cleistantoxin

2.2.2 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC-DAD

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

- Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất của Cleistantoxin, đồng thời tham khảo các tài liệu hướng dẫn để tìm ra các điều kiện phù hợp: bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, chương trình sắc ký, bước sóng phát hiện

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp

- Độ đặc hiệu: Sử dụng dung dịch cleistantoxin, đánh giá độ tinh khiết pic, khả năng tách trong sắc ký, đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chất khác đến kết quả phân tích như sử dụng dung dịch phân giải thêm vào đó các tạp chất có thể

có, dung dịch phân hủy trong các môi trường khắc nghiệt

- Độ phù hợp hệ thống: tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần trên cùng một dung dịch cleistantoxin 5 ppm Kết quả đánh giá dựa trên các chỉ tiêu số đĩa lý thuyết, thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng, giá trị RSD% diện tích pic và thời gian lưu của các lần tiêm lặp lại dung dịch cleistantoxin

* Độ tái lặp: Tiến hành tại hai phòng thí nghiệm độc lập, mỗi phòng tiến hành tiêm sắc ký 6 mẫu cleistantoxin 1000 ppm So sánh kết quả phân tích giữa hai phòng thí nghiệm dựa trên giá trị trung bình độ tinh khiết sắc ký, RSD% độ tinh khiết sắc ký kết hợp sử dụng kiểm định thống kê

- Xác định giới hạn định lượng (LOQ) bằng cách so sánh đáp ứng của tín hiệu tạo

ra bởi hoạt chất và nhiễu đường nền Giá trị LOQ xác định tại nồng độ mà S/N =

- Tính tuyến tính: Sử dụng một dãy các dung dịch chất phân tích có nồng độ tăng dần, tiến hành tiêm sắc ký và quan sát đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic với nồng độ, xây dựng đường hồi quy tuyến tính dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu, xác định hệ số tương quan tuyến tính

- Độ ổn định của dung dịch phân tích: Tiến hành tiêm lặp lại dung dịch cleistantoxin 1000 ppm sau các khoảng thời gian nhất định Đánh giá kết quả dựa trên RSD% độ tinh khiết sắc ký

 Xác định hàm lượng tạp chất liên quan

Hàm được tạp liên quan được xác định theo kỹ thuật chuẩn hóa diện tích theo công thức:

Trong đó:

% tạp đơn: là phần trăm của tạp đơn

∑ là tổng diện tích pic các tạp đơn

2.2.3 Xác định hàm lƣợng tạp chất bay hơi, xác định hàm lƣợng tạp chất vô

cơ, xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn

2.2.3.1 Định lượng tạp chất bay hơi

Tiến hành bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô (phụ lục 9.6 DĐVN V)

2.2.3.2 Xác định hàm lượng tạp chất vô cơ

Định lượng tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulfat (phụ lục 9.9 DĐVN V)

2.2.3.3 Xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn

Sau khi xác định được hàm lượng từng loại tạp, giá trị độ tinh khiết của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chuẩn được xác định theo công thức sau:

[%] HL = (100 – [%] tạp liên quan) x (100 – [%] tạp bay hơi – [%] tạp vô cơ)/100

Trong đó:

[%] HL: là độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn (%)

[%] tạp liên quan: hàm lượng tổng tạp chất liên quan tính theo chuẩn hóa diện tích (%)

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tinh chế và xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của

cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis)

3.1.1 Tinh chế cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của cây Chà Chôi

 Nhồi cột:

Cân 450 g silicagel 60 (kích thước hạt 63 - 200 μm) thêm 300 ml dicloromethan, trộn đều, nhẹ nhàng đưa lên cột, mở khoá cho dung môi chảy tuần hoàn đến khi silicagel được nén chặt (có thể sử dụng máy nén khí) thì khóa cột Ổn định cột trong vòng vài giờ

 Đưa mẫu lên cột:

 Rửa giải

lệ tăng dần từ 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% Hứng dịch rửa giải vào bình nón dung tích 100 ml, mỗi bình hứng khoảng 50 ml, thu được 215 bình

 Kiểm tra các phân đoạn có chứa chất cleistantoxin (7B) bằng SKLM