Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định dư lượng một số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ trong huyết tương bằng GC MS

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI .... DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN 1 Bảng 1 : Phân loại thuốc BVTV theo đố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DS ĐOÀN THỊ TRANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DS ĐOÀN THỊ TRANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT

TƯƠNG BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thế

Hưng – Trường đại học Y tế Công cộng, PGS TS Vũ Đặng Hoàng – Trường

đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm xét nghiệm –

Trường đại học Y tế Công cộng, đã giúp tôi trong suốt quá trình thực tập và thực

hiện luận văn này

Tôi xin cám ơn Ban giám đốc – Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội đã tạo điều

kiện cho tôi được tham gia chương trình đào tạo thạc sỹ Dược tại trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô giáo của trường

Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức và

kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân gia đình, cùng toàn thể bạn

bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, Ngày 04 tháng 04 năm 2018

Đoàn Thị Trang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1: TỔNG QUAN 4

1.1 THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Phân loại 4

1.2 THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ 5

1.2.1 Khái niệm và phân loại 5

1.2.2 Tính chất, công thức của một số thuốc trừ sâu clor hữu cơ đặc trưng 6

1.2.3 Đặc tính và cơ chế gây độc 12

1.2.4 Dư lượng thuốc BVTV trong huyết tương 13

1.3 PHÂN TÍCH THUỐC BVTV TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG GC-MS 15 1.3.1 Các kỹ thuật xử lý mẫu 15

1.3.2 Sắc ký khí - khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectometry) 17

1.3.3 Các yêu cầu, chỉ tiêu thẩm định phương pháp GC-MS phân tích thuốc BVTV trong huyết tương 23

Phần 2 : ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT VIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 26

2.2.2 Chất chuẩn 26

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu 28

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 28

2.3.2.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định thuốc BVTV 28

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 28

2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương 29

2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ 30

2.3.3.1 Độ chọn lọc 30

2.3.3.2 Xây dựng đường chuẩn 30

2.3.3.3 Xác định LOQ, LOD 30

2.3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 30

Phần 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng thuốc BVTV 31

3.1.2 Xác định thời gian lưu của các chất phân tích 33

3.1.3 Xác định các chất theo mảnh phổ (m/z) 35

3.1.4 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương 40

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống GC-MS 44

3.2.2 Độ chọn lọc 45

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 47

3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 51

3.2.4 Độ lặp lại, độ thu hồi 52

3.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 54

Phần 4: BÀN LUẬN 56

4.1 VIỆC LỰA CHỌN THUỐC BVTV NGHIÊN CỨU 56

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ 56

4.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 56

4.4.VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƯƠNG 58

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

5.1 KẾT LUẬN 59

5.2 KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC : Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists)

DDE : Diclor diphenyl dicloretylen

DDD : Diclor diphenyl dicloretan

DDT : Diclor diphenyl tricloretan

HCH : Hexaclorocyclohexan

ECD : Detector bắt điện tử (Electron capture detector)

EI : Va chạm điện tử (Electron impact)

GC-MS : Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectometry ) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

NCI : Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization)

NPD : Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector)

NTN : Người tình nguyện

PCI : Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization)

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SPE : Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

Thuốc BVTV : Thuốc bảo vệ thực vật

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

1 Bảng 1 : Phân loại thuốc BVTV theo đối tượng sinh vật gây hại 4

2 Bảng 2 : Một số phương pháp phân tích thuốc BVTV nhóm clor hữu

3 Bảng 3 : Điều kiện thích hợp để xác định thuốc BVTV trên thiết bị

4 Bảng 4 : Chương trình nhiệt độ cột tách để phân tích các thuốc BVTV

5 Bảng 5 : Thời gian lưu của các chất trong hỗn hợp 18 chất chuẩn nhóm

6 Bảng 6 : Các mảnh phổ đặc trưng và mảnh chính sử dụng trong phân

tích nhóm clor hữu cơ theo GC-MS/SIR 40

7 Bảng 7: Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn CC-W 43

8 Bảng 8: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương 44

9 Bảng 9 : Tính thích hợp hệ thống GC-MS của α-HCH 44

10 Bảng 10: Độ lặp lại của hệ thống GC-MS 44

11 Bảng 11: Sự phụ thuộc giữa đáp ứng pic và nồng độ thuốc BVTV

nhóm clor hữu cơ trong huyết tương 47

12 Bảng 12: Kết quả xác định LOD, LOQ 48

13 Bảng 13: Kết quả khảo sát độ lặp lại, độ thu hồi của thuốc BVTV

14 Bảng 14: Kết quả trên mẫu thử NTN 53

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

1 Hình 1 : Sơ đồ cấu tạo hệ thống GC 17

2 Hình 2: Thiết bị GC-MS dùng trong phân tích 27

3 Hình 3: Sắc kí đồ chạy theo chương trình nhiệt 1 32

4 Hình 4: Sắc kí đồ chạy theo chương trình nhiệt 2 32

5 Hình 5: Sắc kí đồ chạy theo chương trình nhiệt 3 33

6 Hình 6: Sắc ký đồ của hỗn hợp 18 chất theo chế độ quét SCAN 34

8 Hình 8: Phổ khối của δ-HCH 36

9 Hình 9: Phổ khối của Methoxyclor 37

10 Hình 10: Phổ khối của Heptaclor epoxid 38

11 Hình 11: Phổ khối của Aldrin 39

12 Hình 12: Sắc kí đồ mẫu huyết tương khi chiết lỏng-lỏng 41

13 Hình 13: Sắc kí đồ mẫu huyết tương khi chiết lỏng-lỏng và làm sạch

14 Hình 14: Sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn 46

15 Hình 15: Đường chuẩn phân tích thuốc BVTV trong huyết tương 50

16 Hình 16: Sắc kí đồ của các thuốc BVTV ở nồng độ LOQ 52

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) (bao gồm thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm, thuốc trừ cỏ) đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp của tất cả các quốc gia trên thế giới Hàng năm, ở Mỹ lượng thuốc BVTV được sử dụng chiếm 1/3 tổng số thuốc BVTV trên toàn thế giới, chủ yếu là hóa chất diệt cỏ [6] Châu Âu cũng sử dụng nhiều thuốc BVTV chiếm 30%, trong khi đó con số này ở các nước còn lại là 20%tổng số thuốc BVTV trên toàn thế giới [25] Tại Việt Nam, vào năm 1957 tại miền Bắc nước ta sử dụng khoảng 100 tấn Đến trước năm 1985 khối lượng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 - 9.000 tấn; trong 03 năm gần đây, Việt Nam nhập và

sử dụng 70.000 - 100.000 tấn/năm, tăng gấp hơn 10 lần Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2014 Việt Nam nhập khẩu từ 70.000 đến 100.000 tấn thuốc BVTV, trong đó thuốc trừ sâu chiếm 20,4%, thuốc trừ bệnh chiếm 23,2%, thuốc trừ cỏ chiếm 44,4%, các loại thuốc BVTV khác như thuốc xông hơi, khử trùng, bảo quản lâm sản, điều hòa sinh trưởng cây trồng chiếm 12% [6] Theo số liệu của cục BVTV, hiện nay việc kiểm soát sản xuất và sử dụng thuốc BVTV ở nước ta thường gặp nhiều khó khăn Thêm vào đó, việc sản xuất nhỏ lẻ không áp dụng đúng quy chuẩn phun và thu hoạch nông sản khiến cho dư lượng thuốc BVTV trên nông sản là phổ biến và còn cao, đặc biệt trên rau, quả, chè… Kết quả kiểm tra, năm 2000 - 2002 của cục BVTV cho thấy ở vùng Hà Nội số mẫu có

dư lượng quá mức cho phép khá cao, trên rau, nho, chè từ 10% - 26%, ở TPHCM từ

10 - 30% Một số nghiên cứu về việc sử dụng thuốc BVTV trên chè, lúa và rau ở Thái Nguyên, đồng bằng sông Hồng và ở Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy số lần phun thuốc bảo vệ thực vật rất cao, có nơi lên đến 26-32 lần/năm, có nồng độ cao hơn rất nhiều cũng như không thực hiện việc thu hoạch theo quy định, do đó việc tồn dư thuốc BVTVtrong các sản phẩm nông nghiệp là rất cao [3], [7]

Thuốc BVTV có thể ảnh hưởng trực tiếp gây ngộ độc mãn tính, ngộ độc cấp tính dẫn đến tử vong hoặc làm biến đổi gen, gây nên các bệnh về di truyền ảnh hưởng đến nhiều thế hệ sau Thuốc BVTV có nhiều cơ chế dẫn đến nguy cơ gây ung thư Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, thuốc BVTV có khả năng gây ung thư

thông qua cơ chế mất cân bằng oxy hóa (oxidative stress) tạo ra nhiều phân tử có gốc tự do có khả năng phá hủy cấu trúc DNA Một số khác lại cho rằng thuốc BVTV có khả năng hoạt động như những hormone khiến tế bào tăng trưởng bất thường làm mất/giảm khả năng kiểm soát tăng sinh của tế bào [10] Một số chất gây ức chế (hoặc gây kích thích giả) đến tuyết nội tiết, gây mất cân bằng hoạt động của các loại hooc-mon (hormone), từ đó gây ra các phản ứng tiêu cực đến hoạt động bình thường trong cơ thể và có thể là nguyên nhân gây ung thư vú

Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu và khả năng tăng nguy cơ ung thư vú trên đối tượng phụ nữ Nghiên cứu của Cohn và cộng sự chỉ ra rằng việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu DTT (dichloro diphenyl trichlorothane) trước thời kỳ dậy thì có nguy cơ ung thư vú cao hơn rất nhiều so với việc phơi nhiễm thuốc trừ sâu sau lứa tuổi dậy thì [13] Nghiên cứu trên đối tượng những người vợ của người nông dân bị phơi nhiễm với thuốc trừ sâu tại Iowa và miền bắc Carolina, Mỹ từ năm 1993-2000 chỉ ra rằng những người vợ của nông dân

sử dụng thuốc BVTV có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn so với những người không sử dụng thuốc BVTV [20]

Hiện nay, ung thư vú là ung thư có tỷ lệ cao nhất trên phụ nữ ở Hà Nội, và ung thư vú ngày càng có xu hướng trẻ hóa, chứng tỏ sự thay đổi lối sống và ô nhiễm môi trường ở Việt Nam là một trong những nguyên nhân liên quan đến sự gia tăng

và trẻ hóa của bệnh [24] Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, 75-80% ung thư phát sinh

do tác động của môi trường và lối sống, trong khi đó gen di truyền chỉ chiếm 25% [9] [28]

20-Việt Nam là một trong những nước có nền nông nghiệp phát triển lâu đời với nhiều mặt hàng nông sản Để đạt năng suất cao trong nông nghiệp việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật là cần thiết, nhờ sự ứng dụng này năng suất thu hoạch tăng lên rõ rệt, cuộc sống vật chất của người dân no đủ hơn Tuy nhiên, hàm lượng tồn

dư vượt mức của thuốc BVTV trong sản phẩm nông nghiệp, trong đất và nước sẽ

thuốc bảo vệ thực vật, trong đó clor hữu cơ là một trong những nhóm thuốc bảo vệ thực vật đã từng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp Thuốc này thường gây độc mãn tính, thuốc lưu tồn lâu trong môi trường Do độc tính cao và đặc biệt là khả năng tồn tại kéo dài gây ô nhiễm môi trường và nhiễm độc thứ phát cho người và gia súc qua thực phẩm nên một số hoá chất loại này như DDT, 666 hiện nay không còn được dùng nữa Tuy nhiên hiện nay trên thị trường vẫn có rất nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng rộng rãi và nguy cơ gây nhiễm độc cho người vẫn rất cao

Xuất phát từ nhu cầu thực tế với mong muốn xây dựng được một phương pháp phân tích có độ tin cậy cao để đánh giá mối tương quan giữa thuốc BVTV clor

hữu cơ và bệnh ung thư vú, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng và

thẩm định phương pháp xác định dư lượng một số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu

cơ trong huyết tương bằng GC-MS” với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng một số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ trong huyết tương bằng GC-MS

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ trong huyết tương người bệnh ung thư vú

Theo qui định tại điều 1, chương 1, điều lệ quản lý thuốc BVTV (ban hành kèm theo Nghị định số 58/2002/NĐ-CP ngày 03/6/2002 của Chính phủ), ngoài tác dụng phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật, thuốc BVTV còn bao gồm cả những chế phẩm có tác dụng điều hoà sinh trưởng thực vật, các chất làm rụng lá, làm khô cây, giúp cho việc thu hoạch mùa màng bằng cơ giới được thuận tiện (thu hoạch bông vải, khoai tây bằng máy móc, …) và những chế phẩm có tác dụng xua đuổi hoặc thu hút các loài sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt

1.1.2 Phân loại

Để thuận tiện trong quá trình sử dụng cũng như công tác quản lý, thuốc BVTV thường được phân loại thành các nhóm khác nhau theo mục đích sử dụng, tác dụng, nhóm hoạt chất, thành phần nguyên tố hay độc tính…Thông thường, chúng ta chỉ quan tâm đến tác dụng và thành phần nguyên tố hay nhóm hoạt chất trong thuốc trừ sâu [4]

Phân loại dựa trên đối tượng sinh vật gây hại:

Bảng 1: Phân loại thuốc BVTV theo đối tượng sinh vật gây hại

Thuốc trừ bệnh Thuốc trừ nhện

Thuốc trừ sâu Thuốc trừ tuyến trùng

Thuốc trừ cỏ Thuốc điều hòa sinh trưởng

Thuốc trừ ốc Thuốc trừ chuột Phân loại theo thành phần hóa học và nhóm hoạt chất:

Nhóm thuốc thảo mộc: có độ độc cấp tính cao nhưng mau phân hủy trong môi

trường

Nhóm clo hữu cơ : DDT, 666, Endosulfan, nhóm này có độ độc cấp tính

tương đối thấp nhưng tồn lưu lâu trong cơ thể người, động vật và môi trường, gây độc mãn tính nên nhiều sản phẩm bị cấm hoặc hạn chế sử dụng

Nhóm lân hữu cơ : Wofatox Bi-58, Metaphos, Parathion, độ độc cấp tính của

các loại thuốc thuộc nhóm này tương đối cao nhưng mau phân hủy trong cơ thể người và môi trường hơn so với nhóm clo hữu cơ

Nhóm Carbamat : Mipcin, Bassa, Sevin,…đây là thuốc được dùng rộng rãi bởi

vì thuốc tương đối rẻ tiền, hiệu lực cao, độ độc cấp tính tương đối cao, khả năng phân hủy tương tự nhóm lân hữu cơ

Nhóm Pyrethoid (Cúc tổng hợp): Decis, Sherpa, Sumicidine,… nhóm này dễ

bay hơi và tương đối mau phân hủy trong môi trường và cơ thể người

Các hợp chất pheromon: Là những hóa chất đặc biệt do sinh vật tiết ra để kích

thích hành vi của những sinh vật khác cùng loài, chúng rất ít độc với người và môi trường

Nhóm thuốc trừ sâu vi sinh (Dipel, Thuricide, Xentari, NPV, ): rất ít độc với

người và các sinh vật không phải là dịch hại

1.2.1 Khái niệm và phân loại

Thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được hình thành khi thay thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon bằng các nguyên tử clor Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị vòng (chứa dị tố O, N, hay S) Các chất này thường là các dẫn xuất clor của một số hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [1]

Về mặt cấu tạo, thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ

[30]:

- Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…

- Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH),

pentaclorophenol…

- Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin,

endosulfan sulfat…

- Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen

1.2.2 Tính chất, công thức của một số thuốc trừ sâu clor hữu cơ đặc trưng

Hexaclorocyclohexan (HCH)

Công thức phân tử : C6H6Cl6

Công thức cấu tạo :

Tên gọi (IUPAC): 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane

HCH đầu tiên được sản xuất để xử lí hạt, sau đó cũng được sử dụng làm thuốc trừ sâu rộng rãi Do độc tính cao nhiều nước đã cấm sử dụng HCH Tuy nhiên, hiện nay HCH vẫn còn được sử dụng ở mức hạn chế ở nhiều nước (Ấn Độ, Trung Quốc

và nhiều nước đang phát triển ) Trong thành phần, đồng phân γ chiếm khoảng 99% HCH, còn lại các đồng phân khác [2],[4]

- Đồng phân γ của HCH còn được gọi là Lindane được sử dụng để chống côn trùng và ong trong trồng cây ăn trái, nông nghiệp, và lâm nghiệp Trong môi trường, Lindane có thể bị phân hủy dần bởi các vi sinh vật có trong đất ở cả hai điều kiện hiếu khí và kỵ khí tạo thành các dẫn xuất clo của benzen và phenol Lindane biến thành đồng phân α khi tiếp xúc với ánh sáng có bước sóng trên 230 nm Con người

có thể tiếp xúc thuốc trừ sâu này từ nước uống bị ô nhiễm hoặc ăn các sản phẩm thực phẩm từ cá hay động vật bị nhiễm Lindane cũng có thể tích tụ trong các mô

mỡ ở người và động vật Nó cũng được phát hiện trong sữa mẹ [15] Lindane bị cấm ở Hoa Kỳ và hầu hết các nước châu Âu

Khi đun nóng để phân hủy, HCH phát ra các khí độc như khí clo, hydroclorua

và phosgene HCH rất bền vững trong điều kiện bình thường, bền với tác động của ánh sáng, chất oxy hóa, môi trường acid nhưng bị phân hủy trong môi trường kiềm

Con đường phân huỷ chung nhất của HCH là sự thơm hoá cho các clobenzen khác nhau và những dẫn xuất của chúng (chủ yếu là các dẫn xuất hydroxy) Sản phẩm đầu tiên của sự chuyển hoá của HCH ở hầu hết các loài là sự khử clor cho γ-1,3,4,5,6 pentaclocyclohexen (γ-PCCH)

Aldrin

Công thức phân tử : C12H8Cl6

Công thức cấu tạo:

Tên gọi (IUPAC): 1,2,3,4,10,10-Hexachloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahydro 1,4:5,8dimethanonaphthalene

Trong số các hợp chất loại hexaclorooctahydronaphthalen, Aldrin là loại thuốc trừ sâu được tổng hợp đầu tiên Nó được tổng hợp đầu tiên tại Hoa Kỳ vào năm

1948 Aldrin dễ dàng chuyển đổi thành Dieldrin khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời hoặc vi khuẩn Cả Aldrin và Dieldrin được sử dụng rộng rãi vào những năm 1950-

1970 để bảo vệ cây ngô, bông, cam, quýt và trong bảo quản gỗ

Vì độc tính cao và nguy hiểm cho sức khỏe con người, việc sản xuất các loại thuốc trừ sâu đã bị cấm ở Hoa Kỳ vào năm 1974 Sau năm 1974, chúng được sử dụng hạn chế để kiểm soát mối mọt

Endrin và sản phẩm chuyển hóa

Công thức phân tử của Endrin: C12H8Cl6O

Công thức cấu tạo:

Tên gọi (IUPAC): (1aR,2S,2aS,3S,6R,6aR,7R,7aS) 1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahydro-2,7:3,6-dimethanonaphtho[2,3-b]oxirene

-3,4,5,6,9,9-hexachloro-Công thức phân tử của Endrin keton:C12H8Cl6O

Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử : Endrin aldehydC12H8Cl6O

Công thức cấu tạo:

Endrin là thuốc trừ sâu clo hữu cơ cấu trúc giống Aldrin dùng để kiểm soát côn trùng, động vật gặm nhấm và các loài chim Endrin là một sản phẩm phụ trong quá trình tổng hợp hexaclorocyclopentadien Trong môi trường, Endrin được sinh ra

từ sự phân hủy của Dieldrin Endrin có thể bám vào đất và tồn tại trong môi trường trong nhiều năm Nó cũng có thể chuyển đổi để Endrin keton hoặc Endrin aldehyd khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Vì độc tính cao và tác hại đối với sức khỏe con người, việc sử dụng và bán thuốc trừ sâu này đã bị cấm ở Hoa Kỳ vào năm 1986

Diendrin

Công thức phân tử: C12H8Cl6O

Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: (1a R , 2 R , 2a S , 3 S , 6 R , 6a R , 7 S , 7a S) hexachloro-1a, 2,2a, 3,6, 6a, 7,7a-octahydro-2,7: 3,6-dimethanonaphtho [2,3- b ]

-3,4,5,6,9,9-oxirene

Diendrin là thuốc BVTV đã được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp trên toàn thế giới Hiện nay, Diendrin đã bị cấm sử dụng do độc tính cao và tính bền vững trong môi trường

Endosulfan, Endosulfal sulfat

Công thức phân tử của Endosulfan: C9H6Cl6O3S

Tên gọi IUPAC: 6,7,8,9,10,10-Hexachloro-1,5,5a, 6,9,9a-hexahydro- methano-2,4,3-benzodioxathiepine-3-oxit

6,9-Công thức phân tử của Endosulfan sulfat: C9H6Cl6O4S

Công thức cấu tạo:

Endosulfan là một thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ gồm hai đồng phân endo

và exo, đƣợc gọi là Endosulfan I và Endosulfan II Endosulfan sulfate là một sản phẩm của quá trình oxy hóa chứa thêm một nguyên tử O gắn với nguyên tử

S Endosulfan đã trở thành một hóa chất gây tranh cãi cao do độc tính cấp tính của

nó, khả năng gây tích lũy trong cơ thể, và vai trò nhƣ một chất gây rối loạn nội tiết Endosulfan hiên nay đã bị cấm sử dụng trên thế giới

Heptaclor, Heptaclor epoxid

Công thức phân tử Heptaclor: C10H5Cl7

Công thức cấu tạo:

Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: 1,4,5,6,7,8,8-Heptachloro-3a,

4,7,7a-tetrahydro-4,7-methano-1 H –indene

Công thức phân tử Heptaclor epoxid: C10H5Cl7O

Công thức cấu tạo:

Heptachlor là một hợp chất clo hữu cơ được sử dụng như một chất diệt côn trùng Do cấu trúc bền vững của nó, heptachlor có thể tồn tại trong môi trường trong nhiều thập kỷ Heptaclor bị các vi sinh vật chuyển hóa thành heptaclor epoxid

p,p’- DDT, p,p’- DDE, p,p’- DDD

Công thức phân tử: C 14H 9Cl 5

Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: 1,1 '- (2,2,2-Trichloroethane-1,1-diyl) bis (4-chlorobenzene)

Các hợp chất DDT được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1874 Tuy nhiên, hoạt tính trừ sâu của nó lại được phát hiện vào năm 1939, nhiều năm sau khi được tổng hợp Thuốc trừ sâu này được dùng trong cải tạo sản xuất nông nghiệp và kiểm soát bệnh sốt rét DDT được sản xuất chủ yếu làm thuốc bảo vệ thực vật, với nồng độ cao nó trở thành thuốc diệt cỏ DDT còn được dùng làm thuốc diệt muỗi trong y tế

Tuy nhiên, tác động có hại của DDT đối với sức khỏe con người, môi trường

và hệ sinh thái đang trở thành một mối quan tâm khi sử dụng với số lượng lớn Do

đó, hiện nay DDT đac bị cấm sử dụng trên thế giới và ở Việt Nam

DDT chuyển hóa thành DDD, DDE nhờ khả năng phân hủy của vi sinh vật, đây là những chất có hoạt tính sinh học cao

Các đồng phân của DDT và chất chuyển hóa

Methoxyclor

Công thức phân tử: C16H15Cl3O 2

Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: 1,1,1-Trichloro-2,2-bis (4-methoxyphenyl) etan

Methoxyclor là một hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự như DDT được dùng để thay thế DDT sau lệnh cấm Nó ít độc hơn DDT và giảm nhanh hơn trong môi trường Methoxyclor được dùng để kiểm soát côn trùng và các ký sinh trùng

Việc sử dụng methoxyclor như thuốc trừ sâu đã bị cấm tại Hoa Kỳ vào năm

2003 và ở Liên minh châu Âu vào năm 2002

1.2.3 Đặc tính và cơ chế gây độc

Các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng Các chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [5][15] Vì vây hầu hết các loại thuốc

Việt Nam, các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ vẫn còn được sử dụng ở mức độ hạn chế như Dicofor, Endosulfan Phần lớn thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ khó phân hủy nên chúng vẫn tồn tại trong môi trường, đất canh tác, nguồn nước Do vậy, chúng có thể thông qua thức ăn, nước uống nhiễm vào cơ thể người

Cơ chế gây độc của các thuốc BVTV hữu cơ clor là cơ chế gây độc kênh ion: một số hợp chất cơ clor như DDT có cơ chế gây độc cho hệ thống thần kinh bằng cơ chế kênh ion Sự vận chuyển ion là trung tâm của sự dẫn truyền xung thần kinh dọc theo dây thần kinh trục và ở khớp thần kinh; rất nhiều chất độc thần kinh thể hiện các ảnh hưởng của mình do cản trở sự vận chuyển bình thường của các ion này Thế tác dụng của sợi trục thần kinh được duy trì bởi nồng độ cao của natri ở bên ngoài so với nồng độ thấp ở bên trong tế bào Các chất vận chuyển natri hoạt động (các Na+ K+ ATPaza) vận chuyển natri ra ngoài tế bào thiết lập lên thế tác dụng này Một tác động của thuốc trừ sâu DDT gây ra độc tính cấp của nó là ức chế các Na+ K+ ATPaza dẫn đến làm mất khả năng thiết lập thế tác dụng Các thuốc trừ sâu pirethroit cũng thể hiện tính độc thần kinh theo cơ chế này DDT cũng ức chế các Ca2+ Mg2+ ATPaza là những chất vận chuyển ion quan trọng trong giai đoạn tái phân cực và làm dừng sự truyền xung qua các khớp

Thụ thể GABA được gắn với các kênh clorid trên vùng sau khớp của tế bào thần kinh và sự liên kết acid gamma – aminobutiric (GABA) vào thụ thể gây ra sự

mở kênh clorid Điều này xảy ra sau sự truyền xung thần kinh qua khe khớp thần kinh và sự khử phân cực sau khớp Sự kích hoạt như vậy của GABA phục vụ cho việc ngăn chặn sự kích thích quá mức của tế bào thần kinh sau khớp Nhiều chất độc thần kinh hoạt động bằng ức chế thụ thể GABA, gây ra sự đóng kéo dài kênh clorid và kích thích thần kinh quá mức, với kết quả là co giật, suy hô hấp, và tử vong [3]

1.2.4 Dư lượng thuốc BVTV trong huyết tương

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thuốc trừ sâu được tìm thấy trong máu, nước tiểu, sữa mẹ, tinh dịch, mô mỡ, nước ối, trẻ sơ sinh, máu dây rốn Cơ thể

người tích lũy thuốc trừ sâu thông qua thức ăn, nước uống, không khí, bụi, đất có chứa thuốc trừ sâu Việc theo dõi dư lượng thuốc trừ sâu trong máu là thích hợp nhất vì tính khả thi cao Hơn nữa, nồng độ các chất độc hại trong máu tại một khoảng thời gian cụ thể sau khi phơi nhiễm sẽ vẫn như nhau nếu như lượng hấp thụ

là không thay đổi; do không có sự điều chỉnh để pha loãng nên không ảnh hưởng đến nồng độ chất phơi nhiễm [32] Dưới đây là một số nghiên cứu trên thế giới về xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong các mẫu máu:

Một nghiên cứu từ Ontario - Canada, trong đó kết hợp nghiên cứu các mô mỡ

và mẫu máu khi khám nghiệm tử thi các nạn nhân tai nạn ở Norfolk và 52 mẫu máu

từ những người tham gia vào việc sử dụng DDT trong nông nghiệp ở Canada và

315 mẫu máu của người dân ở Hà Lan được phân tích dư lượng DDT Kết quả thu được giá trị trung bình dư lượng DDT trong mô mỡ và trong máu tương ứng là 5,83

và 0,032 ppm, kết quả có sự tương quan có ý nghĩa thống kê giữa lượng DDT trong

mô mỡ và máu Giá trị trung bình của DDT trong máu của các nạn nhân ở Norfolk

là 0,032ppm, của người dân ở Hà Lan là 0,016 ppm, của 26 người bị phơi nhiễm trong quá trình sử dụng DDT trong nông nghiệp là 0,063 ppm [11]

Trong một nghiên cứu, có 41 mẫu máu mẹ, sữa, mỡ dưới da và máu dây rốn được phân tích từ các bà mẹ sinh con bằng phẫu thuật mổ lấy thai tại Bệnh viện quốc gia Kenyatta ở Nairobi năm 1986 Các thuốc BVTV chính được tìm thấy trong tất cả các mẫu phân tích là pp '-DDT (100%), pp' DDE (100%), op 'DDT (59%), dieldrin (27%), transnonachlor (15%), β- HCH (12%) và lindane (2%) Mức trung bình (mg/kg mỡ) của t-DDT là 5,9 ở mỡ dưới da, 4,86 trong sữa mẹ, 2,75 trong huyết thanh mẹ và 1,9 trong huyết thanh rốn Mức trung bình của beta- hexachlorocyclohexane (β- HCH) trong mỡ dưới da và chất béo của sữa tương ứng

là 0,034 và 0,26 mg/kg mỡ [18]

Mẫu máu của 135 cư dân sống gần cửa sông Elb (Schleswig-Holstein, Đức) đã được tìm thấy các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ (ví dụ: β- HCH: 0,5-22,9 ng/ml),

benzen hexacloride (HCB: 0,8-55,2 ng/ml), DDE: 0,5-29,2 ng/ml và octachlorostyrene (0-9,2 ng/ml) [21]

Trong một nghiên cứu ở Veracruz (Mexico), trong mô mỡ và huyết thanh của

64 các bà mẹ làm tình nguyện viên được phân tích dư lượng thuốc trừ sâu hữu cơ HCB, α, β, γ, δ - HCH, aldrin, dieldrin, heptachlor, heptachlor epoxide, pp'-DDT,

op'-DDT, pp'- DDD, α, β, endosulfan, endosulfan sulfate, chlordane, và

methoxychlor Nồng độ t-HCH trong mô mỡ, huyết thanh của người mẹ tương ứng

là 0,17 và 0,22 mg/kg mỡ tương ứng và lần lượt t-DDT là 5,851, 5,2626 mg/kg và hexachloro benzen là 0,065 và 0,18 mg/kg [33]

Phân tích tổng cộng 96 mẫu huyết thanh và 46 mẫu mô mỡ của phụ nữ vô sinh

ở các trung tâm y tế sinh sản ở Bỉ từ năm 1996 đến năm 1998 cũng đã tìm thấy 7 thuốc trừ sâu clor hữu cơ và 7 biphenyl polychlorinated, cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa dư lượng trong mô mỡ và trong huyết thanh [26]

Phân tích mẫu máu từ 18 tình nguyện viên khoẻ mạnh của khu vực Ahmedabad (Ấn Độ) cho thấy sự có mặt trong huyết của pp 'DDE, op'- DDT, pp' DDD, pp 'DDT và t-DDT với giá trị trung bình lần lượt là 20,85, 1,15, 2,03, 9,28 và 32,61 μg/l Nồng độ α, β và γ - và t-HCH trong huyết thanh là 4,49, 35,06, 1,69 μg/l

và 41,23 μg/l tương ứng Hexachlorobenzene đã có mặt trong 7 mẫu ở nồng độ

tố cần quan tâm nhất là độ phân cực của dung môi phải phù hợp với chất phân tích

Khi cần thiết phải phối hợp các loại dung môi khác nhau để thay đổi độ phân cực,

độ nhớt, lực dung môi

Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật đơn giản, hiệu quả và khá ổn định Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng nhiều dung môi, gây ảnh hưởng đến môi trường, một số dung môi độc hại còn có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người làm Bên cạnh đó, trong quá trình làm còn có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch kết quả

b) Chiết pha rắn (SPE):

Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó chất phân tích được chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp Chiết pha rắn là kỹ thuật khắc phục được các nhược điểm của chiết lỏng – lỏng Lượng dung môi sử dụng ít, dịch chiết dễ xử lý khi kết nối GC, HPLC, khả năng làm sạch và làm giàu mẫu tốt Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là đối với các hợp chất có bản chất khác nhau thì cần loại cột SPE khác nhau, khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu cho những nghiên cứu trên đa dư lượng thuốc BVTV Mặt khác, không phải phòng thí nghiệm nào cũng được trang bị thiết

bị chiết pha rắn

c) Kỹ thuật tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid:

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong xử lý các mẫu sinh học Nguyên tắc của kỹ thuật là sử dụng các tác nhân gây tủa protein (TFA, acid tricloroacetic, acid percloric, MeOH, ACN) để làm đông vón protein trong mẫu huyết tương theo cơ chế làm thay đổi sự solvat hóa của dung môi dẫn đến làm giảm khả năng tan trong huyết tương của các protein Một số chất phân tích dễ hỏng bởi acid có thể sử dụng kỹ thuật chiết kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ Ưu điểm của phương pháp là đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên, đôi khi mẫu chưa được làm sạch tốt

 Trong thực tế khi tiến hành nghiên cứu, nhiều tác giả sử dụng các kỹ thuật

xử lý mẫu bao gồm quá trình chiết lỏng – lỏng với hỗn hợp dung môi hữu cơ, kết

Theo nghiên cứu của Khizar Hayat và cộng sự (2010) [19], sử dụng hỗn hợp dung môi hexan : aceton (1:1) và kết hợp với SPE florisil để làm sạch mẫu Kết quả thu được nền mẫu sạch và ổn định Sắc ký đồ thu được có độ nhiễu đường nền thấp

Một nghiên cứu khác của Luz E Ruiz-Suárez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp chiết với hỗn hợp dung môi ethanol:amonisulfat:hexan (1:1:3), sau đó làm sạch với cột SPE florisil Kết quả thu được nền mẫu sạch và ổn định

1.3.2 Sắc ký khí - khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectometry)

Sắc ký khí khối phổ là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại với

độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC-MS bao gồm 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tách chất cần phân tích ra khỏi hỗn hợp, phần khối phổ (MS) để cung cấp thông tin về tỉ

số khối lượng/điện tích của chất phân tích Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này chúng

ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lượng

 Sắc ký khí:

Hình 1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống GC

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, ứng dụng tốt đối với những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt Pha động trong GC là chất khí (thường sử dụng các khí trơ như He, Ar, N2…) Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ Chất phân tích được pha động đưa vào cột dưới dạng

hơi Trong cột, xảy ra quá trình tương tác giữa chất phân tích trong pha động (hơi) với pha tĩnh Do các chất phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng được tách

ra khỏi nhau [8][16]

Mẫu được tiêm vào hệ thống qua buồng tiêm mẫu Trong sắc ký khí có thể sử dụng bộ tiêm mẫu trực tiếp, bộ tiêm mẫu chia dòng/không chia dòng, bộ tiêm mẫu hóa hơi chương trình nhiệt độ Thao tác tiêm mẫu có thể bằng tay hoặc sử dụng bộ tiêm mẫu tự động Tiêm mẫu tự động cho độ lặp lại tốt và khả năng tự động hóa cao [8][16]

Cột là trái tim của quá trình sắc ký Quá trình tách các chất xảy ra toàn bộ trên cột sắc ký Trong GC, có hai loại cột chủ yếu là cột nhồi và cột mao quản Trong

đó, cột mao quản là loại cột được sử dụng phổ biến hiện nay Hiện nay, hầu hết các

hệ thống sắc ký khí sử dụng thường ngày trong phòng phân tích đều dùng cột mao quản WCOT (Wall coated open tubular) - pha tĩnh là chất lỏng bao xung quanh thành phía trong của cột Cột phân tích được đặt trong lò, có vai trò điều khiển nhiệt

độ theo chương trình đẳng nhiệt hoặc gradient nhiệt độ [8]

Detetor là bộ phận thu nhận, xử lý các tín hiệu của chất phân tích, chuyểnthành các tín hiệu điện có thể đo lường được Một số detector được sử dụng trong GC để phân tích thuốc BVTV gồm detector quang hóa ngọn lửa (FPD), detector bắt điện tử (ECD), detector nitơ phosphor (NPD) và detector khối phổ (MS) [8][16]

 Khối phổ kết nối với sắc ký khí

Khối phổ (MS) là một detector đặc biệt Ngoài việc cung cấp thông tin sắc

ký đồ, MS còn có thể cung cấp các thông tin về phổ khối lượng của từng chất Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao, do đó rất phù hợp để ứng dụng trong phân tích những vết [31]

Khối phổ gồm có 3 phần là nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phát hiện

Mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, chuyển tín hiệu vào máy tính để xử lý

Nguồn ion hóa:

Nguồn ion hóa đóng vai trò chuyển các phân tử chất phân tích thành dạng ion Các loại nguồn ion hóa phổ biến trong GC-MS bao gồm:

- Va chạm điện tử (Electron impact, EI): Mẫu sau khi qua cột sắc ký ở dạng hơi đi vào buồng ion hóa, ở đây xảy ra tương tác với chùm electron có năng lượng

70 eV tạo thành các các electron thứ cấp và một số phân mảnh của phân tử

- Ion hóa hóa học dương (PCI): Cũng sử dụng chùm electron làm nguồn ion hóa,nhưng chùm electron ion hóa các phân tử khí và ít ion hóa các phân tử mẫu (tỷ

lệ phân tử khí thường cao gấp 1.000 – 10.000 lần so với phân tử mẫu) Khí được sử dụng phổ biến nhất là methan (CH4), với các ion chính tạo thành là CH5+, C2H5+,

C3H5+

- Ion hóa hóa học âm (NCI): Trong kỹ thuật NCI, một loại khí thử bị bắn phá bởi điện tử năng lượng cao, tạo thành các điện tử nhiệt có mức năng lượng thấp hơn nên chính các điện tử nhiệt này sẽ phản ứng với phân tử mẫu tạo các ion âm

Bộ phân tích khối:

Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm lựa chọn các ion cần thiết Đặc trưng cho các ion là thông số m/z (tỷ số khối lượng trên điện tích) Thông thường, giá trị của z là 1 nên m/z cũng chính là khối lượng của ion

Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích tứ cực, ba

tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay [27]

- Tứ cực: Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

- Ba tứ cực: Gồm ba tứ cực ghép nối với nhau Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1)

có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion phân tử với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến tứ cực thứ 2 (Q2) Ở Q2, các ion phân tử chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He cùng với năng lượng thích hợp phân ly tạo ra tạo ra các ion sản phẩm Sau đó, tất cả các ion sản phẩm được chuyển đến tứ cực thứ 3 (Q3) Q3 có cấu tạo giống Q1, tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện Bộ phân tích khối ba tứ cực có thể thực hiện MS/MS

- Bẫy ion: Các ion từ nguồn được đưa đến một bộ phận bẫy, có cấu tạo gồm 4 điện cực có các bề mặt hình hyperbol ở bên trong Các ion này cũng có thể được lựa chọn và giữ lại trong bẫy, sau đó tiếp tục được bắn phá để tạo thành các ion sản phẩm sau đó các ion còn lại được lựa chọn tiếp

- Phân tích thời gian bay (TOF): Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Các ion có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian các ion đi tới detector sẽ khác nhau, do đó được tách khỏi nhau

Bộ phận khuếch đại và phát hiện:

Thường có hai loại nhân electron và nhân quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện và khuếch đại để đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

- Nhân electron (electronmultiplier): Tác động của một ion lên bề mặt của bán dẫn sẽ tạo ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các bán dẫn khác để tạo ra các electron khác Các electron được thu nhận và chuyển thành tín hiệu điện

- Nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo ra sẽ va chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon và được khuếch đại Các photon này được thu nhận

và chuyển thành tín hiệu điện

 Một số ứng dụng của sắc ký khí trong định lượng thuốc BVTV nhóm clor

hữu cơ trong huyết tương

Trong phân tích thuốc BVTV, GC với detector ECD hay được ứng dụng để phân tích thuốc BVTV nhóm clor hưu cơ và những thuốc BVTV thuộc nhóm khác

có chứa clor Còn NPD được sử dụng cho phân tích thuốc BVTV có chứa N, P trong phân tử như thuốc BVTV nhóm phospho hữu cơ

Bên cạnh các detector thông thường thì MS là detector có nhiều ưu điểm vượt trội, đóng vai trò hết sức quan trọng Khi phân tích các thuốc BVTV bằng GC-MS thường hay sử dụng nguồn ion hóa EI Với ưu điểm là có thể phân tích được hàng trăm hóa chất BVTV trong cùng một lần phân tích và đã đáp ứng được yêu cầu phân tích các hợp chất có hàm lượng rất nhỏ (1-2 ppb) với độ chính xác cao

Bảng 2: Một số phương pháp phân tích thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ trong huyết tương

Nguồn Tác giả Thiết bị

sử dụng

Số HCBVTV phân tích

Thời gian phân tích LOD

[14]

Deepti S Deshpande và cộng sự (2016)

HPLC-UV 7 20 phút

0,14-0,35 µg/ml

[23] Mathur và cộng

sự (2005) GC-ECD 14 59,5 phút 0,01ng/ml

[22]

Luz E Suárez và cộng

Ruiz-sự (2010)

GC-ECD 16 19,36 phút 0.55–1.14

ng/ml

Nguồn Tác giả Thiết bị

sử dụng

Số HCBVTV phân tích

Thời gian phân tích LOD

[29]

Venugopal Dhananjayan và cộng sự (2010)

Từ các kết quả nghiên cứu trước về phân tích thuốc BVTV trong huyết tương

chúng tôi thấy:

Phương pháp HPLC – UV [14] của Deepti S Deshpande và cộng sự (nghiên cứu tại Ấn Độ) với detector UV ở bước sóng 230nm có ưu điểm là thiết bị phân tích phổ biến có thể áp dụng ở nhiều cơ sở phân tích Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là thời gian phân tích dài (20 phút phân tích được 7 chất) và giới hạn phát hiện cao dao động từ 0,14-0,35 µg/ml

Phương pháp GC-ECD [23] của Mathur và cộng sự (nghiên cứu tại Ấn độ) có

độ nhạy tốt LOD là 0,01ng/ml, nhưng thời gian phân tích mẫu dài hơn so với phương pháp HPLC

Phương pháp GC-MS [19] của Khizar Hayat và cộng sự (2010) có độ giới hạn định lượng (LOQ) dao động từ 0,0125-0,500 mg/kg tùy loại chất, thời gian phân tích mẫu ngắn (38 phút cho 383 chất) Phương pháp có ưu điểm là phân tích được đồng thời nhiều thuốc BVTV trong cùng một lần phân tích Tuy nhiên phương pháp này lại có giới hạn định lượng khá cao

1.3.3 Các yêu cầu, chỉ tiêu thẩm định phương pháp GC-MS phân tích thuốc

BVTV trong huyết tương

Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn thẩm định của AOAC

 Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính (Linearity):

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng pic và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Mối quan hệ này được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được

từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất) Đường chuẩn nên được xây dựng từ 5 điểm trở nên và phải bao trùm toàn bộ khoảng nồng

độ cần khảo sát Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu:

- Phân tích mẫu trắng là huyết tương của người khỏe mạnh

- Pha dãy chuẩn trên nền dịch chiết mẫu trắng

- Vẽ đường biểu diễn phụ thuộc giữa tín hiệu của từng thuốc BVTV theo nồng

độ thuốc BVTV tương ứng: y = ax + b

Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên hai tiêu chí:

- Hệ số tương quan tuyến tính, 0,98≤ r ≤1

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆i ≤ 15%, (∆i ≤ 20% tại LOQ) Độ chệch được tính theo công thức sau:

 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Trong nghiên cứu này LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (n=6) và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo hệ số biến thiên CV(%):

2

n

x x

trong đó: xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ “i”

x : Nồng độ trung bình tính đƣợc của n lần thử nghiệm

Trong đó: R(%): Độ thu hồi (%)

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Phần 2 : ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT VIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích sử dụng:

+ Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương không có thuốc BVTV

+ Mẫu tự tạo: là các mẫu huyết tương có thuốc BVTV ở các nồng độ thích hợp

Trong nghiên cứu trên mẫu thực:

+ Mẫu máu của người bệnh ung thư vú

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử

Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao

gồm :

- Aceton của Merck, Đức

- n-Hexan của Merck, Đức

- Dicloromethan của Merck, Đức

2.2.2 Chất chuẩn

Chất chuẩn hóa chất BVTV: sử dụng chuẩn hỗn hợp 18 chất bao gồm: Aldrin, α-HCH, β-HCH, δ-HCH, γ-HCH, Heptaclor, Heptaclor epoxide, Diendrin, Endosulfan I, Endosulfan II, Endosulfan sulfat, Endrin, Endrin aldehyde, Endrin keton, p,p’ DDD, p,p’ DDT, p,p’DDE, Methoxyclor

Hàm lượng mỗi chất trong hỗn hợp: 200ppm

Mã chuẩn:N9331029; Số lô: LK150619006; Hãng sản xuất: PerkinElmer,Mỹ

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC-MS) gồm máy sắc ký khí GC clarus 680

và khối phổ MS clarus SQ 8T của PerkinElmer

Hình 2: Thiết bị GC-MS dùng trong phân tích

- Máy lắc vortex, IKA

- Máy li tâm Z383K, Hermle

- Cột sắc ký khí Elite 5 ( 5% Diphenyl, 95% Polysiloxane) (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) của PerkinElmer, Mỹ

- Cột chiết pha rắn Florisil (1000 mg, 6 ml), Merck, Đức

- Micropipet điều chỉnh được thể tích: 10-100 µL, 100-1000 µL, 1000-5000

µL

- Ống ly tâm Teflon 50 mL, có nắp kín

- Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho tiêm mẫu GC

- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm: cốc, ống đong, phễu, giấy lọc…

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

Tổ chức lấy các mẫu máu của người khỏe mạnh và người bệnh ung thư vú tại bệnh viện K theo đúng quy định của Bộ Y tế Nội dung đã được hội đồng Y Đức của trường Đại học Y tế Công cộng thông qua

Xử lý các mẫu máu : tách chiết huyết tương, bảo quản lạnh -800C cho tới khi tiến hành phân tích

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.2.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định thuốc BVTV

- Xác định các mảnh đặc trưng cho các chất

- Tối ưu hóa điều kiện ở nguồn ion hóa

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Qua nghiên cứu tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với các nội dung sau :

- Cột sắc ký khí Elite 5 (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) của PerkinElmer, Mỹ

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 2300C

- Chế độ tiêm: không chia dòng

- Khí mang heli, tốc độ dòng: thay đổi từ 0,8-1,2 ml/phút

- Chương trình nhiệt độ: khảo sát 3 chương trình sau:

CT 1: 400C giữ 1 phút, tăng 300C/phút đến 1300C, sau đó tăng 50C/phút đến 2500C, tiếp tục tăng 100C/phút đến 3000C giữ 5 phút

CT 2: 1200C duy trì 2 phút, sau đó tăng 120C/phút đến 2000C giữ 3 phút, tiếp tục tăng 80C/phút đến 2700C giữ 9 phút, tăng 50C/phút đến 2800C giữ 3 phút

CT 3: ban đầu 1000C tăng 150C/phút đến 1800C giữ 2 phút, tiếp tục tăng

30C/phút đến 2300C giữ 2 phút, tăng 200C/phút đến 2800C giữ 3 phút

- Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 280 0C

- Thể tích tiêm: 1μl hoặc 2μl

Từ kết quả khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng các thuốc BVTV trong huyết tương người trên hệ thống GC-MS

2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương

Dựa trên các nguyên tắc của kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương, dựa trên tính chất lý hóa của thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ, tiến hành khảo sát các phương pháp

xử lý mẫu:

- Tủa protein bằng các tác nhân gây tủa khác nhau như: acid (tricloacetic,

percloric, trifloroacetic ); dung môi hữu cơ (methanol, acetonitril) hoặc hỗn hợp các tác nhân gây tủa protein

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n-hexan

- Chiết lỏng-lỏng với các hệ dung môi kết hợp làm sạch bằng chiết qua

cột chiết pha rắn Florisil

2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ

2.3.3.1 Độ chọn lọc

Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng và 06 mẫu tự tạo có chứa các thuốc BVTV ở nồng độ 2 ppb của đường chuẩn Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn tại thời gian lưu của các thuốc BVTV

2.3.3.2 Xây dựng đường chuẩn

Phân tích 6-8 mẫu chuẩn có nồng độ bao phủ khoảng nồng độ cần khảo sát Ghi lại sắc ký đồ và tính tỷ lệ đáp ứng pic thuốc BVTV tại các nồng độ tương ứng Xây dựng phương trình hồi quy giữa đáp ứng pic thuốc BVTV và nồng độ thuốc BVTV có trong mẫu

2.3.3.3 Xác định LOQ, LOD

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ thấp (1-2 ppb) và xác định giá trị S/N Dựa vào S/N để ước lượng các giá trị LOD, LOQ

2.3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở ba mức nồng độ đại diện cho điểm đầu, giữa và cuối đường chuẩn, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ (n = 6)

Phần 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng thuốc BVTV

1 Điều kiện thích hợp cho phân tích các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ

Dựa trên những khuyến cáo sử dụng của thiết bị, lựa chọn tiến hành sắc ký hỗn hợp các chuẩn thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ với các điều kiện thích hợp như

Chế độ bơm mẫu Không chia dòng

Chế độ chạy SIR hoặc SCAN

2 Chương trình lò cột trong GC-MS

Khi phân tích một hỗn hợp các chất khác nhau về nhiệt độ sôi thì chương trình lò cột rất cần thiết, nó giúp cho quá trình phân tích giữ được sự ổn định về chiều cao, diện tích píc cũng như đảm bảo độ phân giải giữa các píc

Tiến hành: pha dung dịch chuẩn các thuốc BVTV trong n-hexan ở nồng độ khoảng 1,0 ppm Tiêm các dung dịch chuẩn vào trong hệ thống Lựa chọn chế độ

phân tích khối phổ 1 lần và quét toàn phổ (Full scan MS) Từ quá trình thực nghiệm nhận thấy:

Khi phân tích các thuốc BVTV theo chương trình nhiệt 1 và 2 thì khả năng tách của các chất trong hỗn hợp chưa được tốt, chưa phát hiện đủ 18 chất, tín hiệu

về diện tích và chiều cao chưa cao (Hình 3, Hình 4)

Hình 3: Sắc kí đồ chạy theo chương trình nhiệt 1

Hình 4: Sắc kí đồ chạy theo chương trình nhiệt 2