Nghiên cứu phân biệt về thực vật và hóa học của một số dược liệu mang tên sâm cau

Nhằm góp phần vào việc phân biệt các dược liệu mang tên “Sâm cau” đang có trên thị trường, giúp người dùng cũng như người kinh doanh sử dụng đúng, đồng thời mong muốn đưa ra một số tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HUY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT VỀ THỰC VẬT VÀ HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU MANG

TÊN „„SÂM CAU‟‟

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HUY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT VỀ THỰC VẬT VÀ HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU MANG

TÊN „„SÂM CAU‟‟

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến PGS.TS Nguyễn

Viết Thân – Giảng viên bộ môn Dược liệu, người thầy đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn

và truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS Nguyễn Thanh Tùng – Giảng

viên bộ môn Dược liệu, cùng Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô,

các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên trên bộ môn Dược liệu đã giúp đỡ tận tình

trong quá trình học tập, nghiên cứu tại trường

Lời cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các anh chị, bạn bè đồng nghiệp

đã luôn khuyến khích, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống, công việc và học tập

Hà Nội, Ngày 02 tháng 04 năm 2018

Nguyễn Huy Dương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Sâm cau 2

1.1.1 Mô tả 2

1.1.2 Phân bố, thu hái 3

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng dược lý 8

1.1.6 Tính vị, công năng 12

1.1.7 Công dụng 12

1.1.8 Bài thuốc có Sâm cau 13

1.2 Sâm cau Tam Đảo (Sâm cau đỏ) 14

1.2.1 Mô tả 14

1.2.2 Phân bố, thu hái 14

1.2.3 Bộ phận dùng 14

1.2.4 Thành phần hóa học 14

1.2.5 Tác dụng dược lý 19

1.2.6 Tính vị, công năng 20

1.2.7 Công dụng 20

1.3 Sâm cau Quảng Nam 21

1.3.1 Mô tả 21

1.3.2 Phân bố, thu hái 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.2 Phương tiện nghiên cứu 22

2.2.1 Thiết bị nghiên cứu 22

2.2.2 Hóa chất 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 23

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 23

2.3.2.1 Định tính sơ bộ 23

2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Dịch chiết Methanol) 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Nghiên cứu về thực vật 31

3.1.1 Đặc điểm thực vật 31

3.1.2 Vi phẫu 37

3.1.3 Đặc điểm bột………41

3.2 Nghiên cứu về hóa học 44

3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 44

3.2.1.1 Định tính flavonoid 44

3.2.1.2 Định tính coumarin 44

3.2.1.3 Định tính saponin 45

3.2.1.4 Định tính glycosid tim 45

3.2.1.5 Định tính tanin 45

3.2.1.6 Định tính acid hữu cơ 46

3.2.1.7 Định tính alcaloid 46

3.2.1.8 Định tính anthranoid 46

3.2.1.9 Định tính acid amin 46

3.2.1.10 Định tính chất béo 46

3.2.1.11 Định tính caroten 47

3.2.1.12 Định tính sterol 47

3.2.1.13 Định tính đường khử 47

3.2.2 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng 51

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 59

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 75

HMGB1 High-mobility group box 1 protein

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của là Triterpenoid ketone, Syringic acid,

Curculigine A, Orcinol glucoside, Curligoside B 7

Hình 1.5

Công thức cấu tạo của Orcinosides I, Orcinosides J, Curculigines J, Curculigines K, Curculigines L, Curculigines M, Curculigines N

7

Hình 1.6

Công thức cấu tạo của Drangustosides A, Drangustosides B, Alliospiroside A, p-hydroxybenzaldehyd, (E)-cinnamic acid, Ethyl (E)-4-hydroxycinnamat, Ethyl 4-hydroxybenzoat, Benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, Methyl 2,3-dimethoxy-4-

Hình 3.7 Một số đặc điểm bột thân rễ Sâm cau 44 Hình 3.8 Một số đặc điểm bột rễ Sâm cau đỏ 45 Hình 3.9 Một số đặc điểm bột rễ Sâm cau Quảng Nam 46

Hình 3.10 Sắc ký đồ dịch chiết methnol các dược liệu triển khai với hệ 1

Toluen – Ethyl acetat (7: 3) 54

Hình 3.11 Sắc ký đồ dịch chiết methnol các dược liệu triển khai với hệ 2:

Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) 55

57

63

Hình 3.24

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM d/c methanol Sâm cau đỏ với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) quan sát ở λ= 366 nm

64

Hình 3.25

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM d/c methanol Sâm cau Quảng Nam với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) quan sát ở λ= 366 nm

64

Hình 3.26

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM dịch chiết methanol Sâm cau với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) quan sát ở λ= 366 nm

65

Hình 3.27

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM d/c methanol Sâm cau đỏ với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) sau khi phun thuốc thử

66

Hình 3.28

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM d/c Methanol Sâm cau Quảng Nam với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) sau khi phun thuốc thử

66

Hình 3.29

Đồ thị, sắc kí đồ, và bảng biểu diễn các giá trị của SKLM d/c Methanol Sâm cau với hệ 2: Toluen – Ethyl acetat – Aceton – Acid formic (3: 2: 2: 1) sau khi phun thuốc thử

67

Bảng 3.2 So sánh đặc điểm vi phẫu của thân rễ Sâm cau, rễ Sâm cau đỏ và

Bảng 3.3 Kết quả định tính các phản ứng của rễ Sâm cau đỏ, rễ Sâm cau

Quảng Nam và thân rễ Sâm cau 51 Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm chất của rễ Sâm cau đỏ, rễ Sâm cau

Quảng Nam và thân rễ Sâm cau 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm cau là một loại dược liệu quen thuộc với người dân Việt Nam Tác dụng của Sâm cau đã được các thầy thuốc biết tới từ xa xưa Theo Y học cổ truyền Việt Nam, Sâm cau có vị cay, tính ấm, có tác dụng trợ dương, trừ hàn, cường dương, mạnh gân xương Đồng bào các dân tộc thường sử dụng thân rễ cây Sâm cau như một loại thuốc bổ - có thể dùng riêng hoặc kết hợp cùng với các vị thuốc khác - để điều trị các bệnh như: liệt dương, đau lưng, viêm khớp, viêm thận, vàng da, vô sinh

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại dược liệu mang tên “Sâm cau”, dễ gây nhầm lẫn và tiềm ẩn nguy hại sức khỏe cho người sử dụng Các loại dược liệu này khi còn tươi có thể nhận biết bằng mắt thường, nhưng khi đã sấy khô chế biến, sản xuất thành các chế phẩm thì rất khó xác định Nhằm góp phần vào việc phân biệt các dược liệu mang tên “Sâm cau” đang có trên thị trường, giúp người dùng cũng như người kinh doanh sử dụng đúng, đồng thời mong muốn đưa ra một số tiêu chuẩn có thể làm

cơ sở cho việc xây dựng những chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu sau này, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân biệt về thực vật và hóa học của một số

dƣợc liệu mang tên “Sâm cau” với mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học của ba loài mang tên “Sâm cau”

- Khảo sát và bước đầu so sánh thành phần hóa học của ba loài nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung sau:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học của ba mẫu nghiên cứu mang tên “Sâm cau”

- Nghiên cứu phân biệt về giải phẫu thực vật của ba mẫu nghiên cứu mang tên “Sâm cau”: đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu

- Nghiên cứu phân biệt về hóa học của ba mẫu nghiên cứu mang tên “Sâm cau”: Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối với dịch chiết toàn phần của dược liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Với mục đích nghiên cứu phân biệt một số dược liệu mang tên Sâm cau thường dùng, góp phần giúp cho việc sử dụng dược liệu đúng, an toàn Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi nhận thấy có 3 loại dược liệu được bán cũng như sử dụng phổ biến với tên gọi “Sâm cau” Chính vì vậy chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu về

3 loài cây này:

- Sâm cau: Curculigo orchioides Gaertn- họ Sâm cau (Hypoxidaceae)

- Sâm cau Tam Đảo (Sâm cau đỏ) : Dracaena angustifolia Roxb- họ Huyết giác

(Draceanaceae)

- Sâm cau Quảng Nam: Ophiopogon aff caulescens- họ Mạch môn đông

(Convallariaceae)

Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn

Tên đồng nghĩa: Curculigo ensifolia R Br

Tên khác: Ngải cau, cồ nốc lan, tiên mao

Họ: Thuỷ tiên (Amaryllidaceae)

1.1.1 Mô tả

Theo tiêu chuẩn DĐVN IV và DĐTQ, vị thuốc Sâm cau hay còn gọi Tiên mao

là thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.), họ

Thuỷ tiên (Amaryllidaceae) Thân rễ hình trụ, hơi cong queo, dài 3 - 10 cm, đường kính 4 - 12 mm Mặt ngoài màu nâu đen tới màu nâu, xù xì, có các lỗ sẹo rễ con và nhiều vết nhăn ngang Chất cứng và giòn, dễ bẻ gãy, mặt gãy không phẳng, màu nâu nhạt tới nâu hoặc nâu đen ở giữa Mùi thơm nhẹ, vị đắng và cay [2], [22]

Cây thảo cao khoảng 40 cm Thân rễ kéo dài, hình trụ to bằng ngón tay út, có rễ phụ nhỏ, vỏ thô màu nâu, trong nạc màu vàng ngà Lá 3 - 6, xếp nếp tựa như lá cau, phiến hình mũi mác hẹp, dài khoảng 25 - 50 cm (bao gồm cả cuống), độ rộng 3cm Phát hoa ở mặt đất, cụm hoa nằm trên một trục ngắn và mảnh giữa các bẹ lá, gồm 3-5 hoa, lá bắc hình trái xoan nhọn, bao hoa nằm đầu một cái mỏ dài của bầu Lá đài 3, có lông dài ở lưng Cánh hoa 3, cùng dạng lá đài, nhẵn Nhị 6, xếp 2 dãy, bằng nhau, chỉ nhị ngắn hơn bao phấn Bầu hình thoi, kéo dài thành mỏ, đầu nhụy hình trái xoan, chia

3 nhánh mập Quả nang thuôn, dài 1.2 - 1.5cm, chứa 1 - 4 hạt phình ở đầu, phía dưới

có một phần phụ hình liềm [2], [ 4], [5], [7], [9], [12]

1.1.2 Phân bố

Phân bố: Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malayxia, Indonexia, Philippin Ở nước ta, mọc phổ biến ở miền Bắc, có gặp từ Hà Tây (nay là

Hà Nội) vào tới Lâm Đồng [4], [5], [9], [12]

Cây mọc trên các đồi cỏ nơi ẩm mát vùng núi, ven rừng Ra hoa vào cuối mùa

Rễ của Sâm cau đã được nghiên cứu có chứa phenol và phenolic glycosid [48, 54], triterpene và triterpenoid glycoside [49],[51],[53], và flavone, eudesmanes và alkaloid [40]

Năm 2013, Zhen-Hui Wang và cộng sự đã phân lập được từ thân rễ khô của Sâm cau năm dẫn chất clorophenolic glycosid mới là curculigine E-I và một phenolic glycosid mới là orcinoside H, cùng với tám phenolic glycosid đã biết là: orcinol glucosid, orcinol glucosid B, curculigosid, curculigosid B, curculigosid C, curculigosid

G, glucosyringic acid và benzyl-O-β-D-glucopyranosid.:

Curculigine E: 2,4-dichloro-3-methoxyl-5-methylphenol-1-O-β-D-glucopyranoside Curculigine F: 2,4-dichloro-5-methoxyl-3-methylphenol-1-O-β-D-glucopyranoside Curculigine G: thus 4-chloro-3-methoxyl-5-methylphenol-1-O-β-D-glucopyranoside Curculigine H: 2,4-dichloro-3,5-dimethoxyl-benzyl-O-β-D-glucopyranoside

Orcinoside E

apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside

orcinol-1-O-β-D-O

O O

O OH OH

orcinol-3-O-β-D-Orcinoside G

1-O-β-D-glucopyranosyl-4-hydroxymethylphenol

ethoxyl-3-O O

O HO HO

OH OH

OH

Từ dịch chiết thân rễ của Sâm cau, Jun Ping Xu và cộng sự (1991) đã nghiên cứu ra bốn hợp chất mới cycloartan triterpen glycosid được đặt tên là curculigosaponin

Curculigosaponin J Glc(1→3)Rham(1→2)Glc– (p)Ara–

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Curculigosaponin G, Curculigosaponin H,

Curculigosaponin I, Curculigosaponin J.

Akihito Yokosuka và cộng sự (2010) đã phân lập được từ dịch chiết methanol thân rễ Sâm cau 10 dẫn chất cycloartan glycosid mới, được xác định là cycloartan glycosid [51]

Năm 2012, Ai-Xue Zuo và cộng sự đã phân lập từ thân rễ của Curculigo orchioides

hai cycloartan triterpenoid glycosid mới, có tên là Curculigosaponin N và

Curculigosaponin O [53]

Curculigosaponin N: R= Rha (1-2)Glc

Curculigosaponin O: R = Glc (1-3)Glc(1-2)Glc

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Curculigosaponin N, Curculigosaponin O

Nghiên cứu của Wei Jiao đã tìm ra một cycloartan mới là triterpenoid ketone cùng với bốn hợp chất đã biết là syringic acid, curculigine A, orcinol glucoside và curligoside B [30]

OH O

O HO

HO

OH O OH

O HO

HO

OH O

HO HO

O

HO

O HO

Curligoside B

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của là Triterpenoid ketone, Syringic acid,

Curculigine A, Orcinol glucoside, Curligoside B

Nghiên cứu của Chen đã tìm ra bảy phenolic glycoside mới gồm hai dẫn xuất heterocyclic phenolic là orcinosides I-J (1–2) và năm clorophenolic glycoside là curculigines J-N (3–7), cùng với 19 hợp chất đã biết [21]

O HO

R4 R3

OR2

R1

O HO

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Orcinosides I, Orcinosides J, Curculigines J,

Curculigines K, Curculigines L, Curculigines M, Curculigines N

X

Tại Việt Nam nghiên cứu của Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phương Lan (2001), đã nhận dạng được loài Sâm cau mọc hoang ở Sơn Dương, Hà Giang,

sơ bộ kết luận rễ sâm cau Việt Nam chứa phytosterol, đường khử, saponin, chất béo, carotene và phân lập được một hợp chất tinh khiết từ dịch chiết aceton – nước là 4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid [11]

Năm 2015 tác giả Phương Thiện Thương cùng cộng sự đã phân lập được ba hợp chất phenolic glycoside từ thân rễ của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) được thu hái tại Tây Nguyên Ba hợp chất được phân lập từ cắn phân đoạn ethyl acetat thân rễ của Sâm cau dựa vào các dữ kiện phổ và so sánh với những tài liệu đã công bố, được xác định gồm orcinol-1-O-β-D-glucopyranosid (1), orcinol-1-O-(6′-O-acetyl)-α-D-glucopyranosid (2) và curculigoside (3) Hợp chất số 2 là hợp chất mới phân lập được [10]

1.1.5 Tác dụng dƣợc lý

Tác dụng với các kích ứng:

Các thí nghiệm cho thấy rằng chiết xuất ethanol của Sâm cau có tác dụng tăng khả năng đáp ứng của cơ thể với các kích ứng, như tăng cường khả năng dung nạp của

cơ thể khi sốt hoặc giảm oxy trong máu Dịch chiết Sâm cau cũng có tác dụng chống

co giật và có tác dụng giống androgen Bên cạnh đó, dịch chiết cũng làm tăng khả

năng miễn dịch (ở chuột thí nghiệm) [20]

Điều hòa miễn dịch:

Chiết xuất methanol của thân rễ Sâm cau được nghiên cứu tác dụng trên đối tượng chuột bị ức chế miễn dịch do cyclophosphamide gây ra Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng làm tăng số lượng bạch cầu, tăng kháng thể dịch thể và tăng tính nhạy cảm ở những con chuột này Các kết quả này chỉ ra rằng chiết xuất methanol của Sâm cau có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua các tế bào trung gian và kháng thể dịch thể, điều này cũng cho thấy tiềm năng của Sâm cau là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại các thuốc gây độc tế bào [13]

Phenolic glucoside chiết xuất từ Sâm cau có khả năng làm tăng cường kháng thể dịch thể và tăng tính nhạy cảm [33]

Nghiên cứu của Lacaille - Dubois và Wagner vào năm 1996 đã chỉ ra rằng, Curculigosaponin – một saponin triterpen cycloartan được chiết từ rễ của Sâm cau có khả năng làm tăng sinh tế bào lympho lách chuột trong thí nghiệm, nhưng không có tác dụng lên quá trình hình thành kháng thể [32]

Polysaccaride chiết xuất từ Sâm cau cho thấy tác dụng kích thích tăng sinh tế bào lách chuột nhưng không có tác dụng trên tế bào tuyến ức ở những con chuột đã bị

ức chế miễn dịch Zhou và cộng sự (1996) đã tiến hành các thí nghiệm in vitro chứng minh rằng các polysaccharide được chiết xuất từ Sâm cau có khả năng chống lại hoạt động gây ức chế của hydrocortisone với sự tăng sinh của tế bào lách chuột, đồng thời các polysaccharide này cũng khôi phục lại sự tăng sinh của tế bào tuyến ức và tế bào lách Những tác dụng này cũng làm gia tăng trọng lượng toàn phần của tuyến ức và lá lách [52]

Các polysaccharide chiết xuất từ Sâm cau cũng làm tăng mức độ chỉ số lách, chỉ số tuyến ức, tăng độ đậm đặc và chỉ số tan máu ở chuột bình thường; những kết quả này chỉ ra rằng các polysaccharide có thể có tác dụng tăng cường chức năng miễn dịch của chuột [28]

Chống loãng xương:

Nghiên cứu của Cao và cộng sự (2008) trên chuột đã cắt buồng trứng cho thấy chiết xuất ethanol của rễ Sâm cau có tác dụng làm giảm sự mất xương trong các bè xương của xương ống chân [15]

Năm 2009, nghiên cứu Jiao và cộng sự chỉ ra rằng chiết xuất ethanol và các glycosid phenolic, bao gồm 2,6-dimetoxy benzoic acid, curculigoside, curculigoside B, curculigine A, và 3,3 ', 5,5'-tetramethoxy-7, 9 ': 7', 9-diepoxylignan-4,4'-di-O-β-D-glucopyranoside có hoạt động chống loãng xương Các hoạt động này bao gồm tăng hoạt động tăng osteoblastic và alkaline phosphatase (ALP), giảm diện tích hố phân hủy xương, giảm sự hình thành xương và sự hoạt động của TRAP [29]

Curculigoside làm kích thích tăng sinh cũng như hoạt động ALP và tăng lắng đọng canxi trong xương, làm giảm các gốc oxy tự do hoạt động (ROS) và sự peroxy hóa lipid và làm tăng hoạt động của các enzyme chống oxy hoá trong tế bào osteoblast

bị tổn thương do H2O2 [45]

Wang và cộng sự đã thử nghiệm khả năng chống loãng xương của các hợp chất khi chống lại hoạt động của tế bào MC3T3-E1, chứng dương được sử dụng là Icarrin Kết quả cho thấy phenolic glycoside không có hoặc có tác dụng yếu chống loãng xương, glucophenolic glucosides cho thấy hoạt động chống loãng xương vừa phải, clorophenolic glucoside có tác dụng chống loãng xương trung bình [46]

Gây động dục và tác động lên hành vi tình dục:

Chiết xuất ethanol của rễ Sâm cau cho thấy có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng của tử cung, tăng hàm lượng glycogen tử cung, và độ dày niêm mạc tử cung ở những con chuột bạch bị cắt bỏ buồng trứng Những tác dụng này cho thấy chiết xuất

rễ Sâm cau có hoạt tính giống estrogen [43]

Chiết xuất từ rễ Sâm cau đã được chứng minh là làm tăng số lần và tần suất giao phối ở động vật đồng thời cũng rút ngắn thời gian trước khi giao phối Những ảnh hưởng này cho thấy nó có thể có hiệu quả trong điều trị rối loạn chức năng cương dương và có thể tăng cường hoạt động tình dục ở chuột [17], [37]

Chiết xuất ethanol có ảnh hưởng rõ rệt đến sự định hướng của chuột đực đối với chuột cái trong nghiên cứu Con đực được điều trị bằng chiết xuất rễ Sâm cau thể hiện khả năng đánh hơi và khả năng tăng cường sinh dục thường xuyên và mạnh mẽ hơn Chuột đực đem nghiên cứu cũng có gia tăng sự sinh tinh được chứng minh bằng sự gia tăng số lượng tinh bào và tinh tử [19]

Nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng chất chiết xuất làm tăng đáng kể hàm lượng hormon kích thích phôi, hormon luteinizing và testosteron ở chuột Các kết quả này ủng hộ giả định rằng chiết xuất ethanol của thân rễ Sâm cau điều chỉnh hành vi tình dục của chuột bằng cách điều chỉnh hệ thống miễn dịch-nội tiết-thần kinh [18]

Chiết xuất từ nước của Sâm cau cũng cải thiện tình trạng lo lắng do tăng đường huyết gây ra bởi streptozotocin và rối loạn chức năng tình dục sau đó ở chuột cống, những ảnh hưởng này được chứng minh bằng hành vi tình dục ở chuột đực, số tinh trùng, chỉ số cương dương và hàm lượng fructose trong tinh dịch [38]

Chống oxy hoá:

Chiết xuất methanol từ rễ Sâm cau đã được chứng minh rất hiệu quả trong việc loại bỏ các gốc tự do superoxide và có tác dụng trung bình trong việc thu dọn các gốc DPPH, các gốc nitric oxit và sự ức chế lipid peroxidation [14]

Các hoạt động chống oxy hoá của Curculigo orchioides được xác nhận thêm

bởi các xét nghiệm ABTS, DPPH và FRAP [36] Đã có báo cáo rằng các hợp chất phenolic là những chất đóng góp chính cho hoạt động chống oxy hoá của Sâm cau [47]

Sâm cau đã ngăn ngừa tổn thương do H2O2 gây ra bởi các tế bào màng trong tĩnh mạch của người và giảm chu trình gây chết tế bào Curculigoside cũng làm giảm hoạt tính của sự biểu hiện mRNA của caspase-3 và p53, được biết là đóng một vai trò quan trọng trong quá trình gây chết tế bào do H2O2 gây ra [44]

Bảo vệ gan:

Chiết xuất methanol của thân rễ Sâm cau làm tăng tiêu hóa thực phẩm và tăng cân, giảm mức huyết thanh aspartate aminotransferase, alanine huyết thanh aminotransferase, alkaline phosphatase và gamma glutamyl transpeptidase, giảm nồng

độ protein trong huyết thanh và gan, làm giảm mức lipid, triglyceride, cholesterol và phospholipid trong huyết thanh đến mức bình thường ở chuột được điều trị bằng carbon tetrachloride Những kết quả này cho thấy thân rễ Sâm cau có hoạt tính bảo vệ gan [42]

Các tác dụng khác: Kháng khuẩn, chống viêm, điều trị mất thính lực

Nghiên cứu của Jaiswal và cộng sự năm 1984 cho thấy dầu từ rễ Sâm cau có

hoạt tính chống lại các chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Salmonella pullorum, Salmonella newport và Staphylococcus aureus, và các

chủng nấm như Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Aspergillus flavus và Cladosporium spp [27]

Năm 2009, Nagesha và Shanthamma chiết xuất được từ Sâm cau chất có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh Gram dương

(Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhimurium), đồng thời có

thể được sử dụng như một chất khử trùng để phòng chống các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn [35]

Cả dịch chiết từ nước và ethanol đều cho thấy tác dụng chống tăng đường huyết

ở chuột cống bình thường và chuột cống bị gây đái tháo đường bởi alloxan [17]

Curculigoside làm tăng sự biểu hiện của procollagen –I và giảm sự biểu hiện thái quá của các matrix metalloproteinase (MMP)-1 ở các nguyên bào sợi da người, nghĩa là curculigoside có thể hữu ích trong điều trị lão hóa da [34]

Các công thức dạng gel từ thân rễ Sâm cau có tác dụng chống viêm đáng kể trên bàn chân chuột cống bị gây phù bằng carrageenan [23]

Một số nghiên cứu cũng cho thấy Sâm cau làm giảm ngưỡng nghe, cải thiện chức năng của trung tâm thính giác và ốc tai, điều này cho thấy Sâm cau là một sản phẩm trị liệu tự nhiên tiềm năng cho chứng nghe kém gây ra bởi tiếng ồn ở chuột [25]

rễ sâm cau tán bột được dùng làm thuốc bổ chung, thuốc hồi sức để điều trị suy nhược

cơ thể, đau lưng, viêm khớp, viêm thận mạn tính Thuốc còn làm tăng huyết áp, và điều kinh

Ở Ấn Độ người ta xem cây này có tính chất nhầy dịu, lợi tiểu, bổ, kích dục, được dùng chữa trĩ, vàng da, ho, hen suyễn, ỉa chảy, lậu Dùng ngoài da giã đắp chữa ngứa và bệnh ngoài da Người ta còn dùng thân rễ sâm cau để gây sẩy thai dưới dạng thuốc sắc, hoặc thuốc bột uống với đường trong một cốc sữa Rễ sâm cau là một thành phần trong bài thuốc cổ truyền Ấn Độ gồm 10 dược liệu trị sỏi niệu Dùng ngoài, rễ sâm cau giã nát, đắp chữa ngứa và bệnh ngoài da Ở Thái Lan, thân rễ sâm cau là thuốc lợi tiểu và trị tiêu chảy Ở Papua Niu Guine, thân rễ và lá sâm cau được hơ nóng cho mềm, rồi chà xát trên cơ thể làm thuốc tránh thai

Ghi chú: dùng sâm cau liều cao kéo dài sẽ gây cường dương, làm tinh hao kiệt sức Người hư yếu không dùng [4], [5], [7], [9], [12]

1.1.8 Bài thuốc có Sâm cau

- Chữa liệt dương do rối loạn thần kinh chức năng:

Sâm cau 8g; sâm Bố Chính, hoài sơn, trâu cổ, kỷ tử, ngưu tất, tục đoạn, thạch hộc, mỗi vị 12g; cam thảo nam, cáp giới, ngũ gia bì, mỗi vị 8g Sắc uống ngày một thang

- Chữa phong thấp, lưng lạnh đau, thần kinh suy nhược, liệt dương:

Sâm cau 50g thái nhỏ sao vàng, rượu trắng 650ml Ngâm trong 7 ngày hay hơn Mỗi ngày uống hai lần vào trước hai bữa ăn chính, mỗi lần 25-30ml

- Chữa nam giới liệt dương, phụ nữ tử cung lạnh khó thụ thai:

Sâm cau 20g; thục địa, ba kích, phá cố chỉ, bồ đào nhục, mỗi vị 16g, hồi hương 4g Sắc uống ngày một thang

- Chữa tê thấp, đau mình mẩy:

Sâm cau, hy thiêm, hà thủ ô, mỗi vị 50g, rượu trắng 650ml Ngâm trong 7 ngày hay hơn Ngày uống 50ml chia hai lần

- Chữa sốt xuất huyết:

Sâm cau 20g sao đen, cỏ nhọ nồi 12g, trắc bách diệp 10g sao đen, quả dành dành 8g sao đen Sắc uống ngày một thang

- Chữa huyết áp cao, nhất là với phụ nữ ở thời kỳ mãn kinh:

Sâm cau, ba kích, dâm dương hoắc, tri mẫu, hoàng bá, đương quy, mỗi vị 12g Sắc uống ngày một thang [12]

1.2 Sâm cau Tam Đảo (Sâm cau đỏ)

Tên khoa học: Dracaena angustifolia Roxb

Tên đồng nghĩa: Pleomele angustifolia (Roxb.) N.E.Br., Dracaena ensifolia Wall

Tên khác: Bồng bồng, Sâm cau nếp, Hồng sâm, Co phạc hia (Thái), Phất dũ sậy, Phất

Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép, dài khoảng 35 – 40cm, các nhánh dài tới 20cm; hoa màu vàng lục, hình ống; 6 thùy giống nhau, cùng màu; nhị 6, chỉ nhị hẹp; bầu hình trụ, 3 ô, mỗi ô có một noãn

Quả mọng, hình cầu, chứa 1 hạt

Mùa hoa quả: tháng 3 – 5

1.2.2 Phân bố

Sâm cau đỏ hay Bồng bồng là cây bụi ưa ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc dưới tán rừng ẩm còn nguyên sinh hoặc tương đối nguyên sinh, nhất là ở rừng núi đá vôi Độ cao phân bố có thể đến 1300m Các tỉnh có nhiều Bồng bồng như Bắc Cạn, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Yên Bái, Sơn La, Hòa Bình, Nghệ

An, Hà Tĩnh và một số tỉnh ở phía nam Cây này cũng phân bố ở vùng thấp Himalaya của Ấn Độ (Khashi), vùng đảo Adaman, Malaysia, Indonesia và Trung Quốc Ở Việt Nam, Bồng bồng được trồng làm cảnh ở các đình, chùa và một số địa phương, trồng bằng gốc hay bằng cành Sau 2 – 3 năm cây bắt đầu có hoa quả Khi quả chín rụng xuống đất, hạt nảy mầm sau 4 – 5 tháng [12]

1.2.3 Bộ phận dùng

Rễ, lá và hoa [12]

1.2.4 Thành phần hóa học

Năm 2013, Hui – Chi Huang và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết MeOH của lá

cây Dracaena angustifolia Roxb (thu hái tại Đài Loan) được 2 saponin steroid mới (có

tác dụng kháng viêm) đặt tên là drangustosides A – B, một saponin steroid đã biết là alliospiroside A [31] và bảy benzenoid [26]

Methyl

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Drangustosides A, Drangustosides B, Alliospiroside A, p-hydroxybenzaldehyd, (E)-cinnamic acid, Ethyl (E)-4-

hydroxycinnamat, Ethyl 4-hydroxybenzoat, Benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid,

Methyl 2,3-dimethoxy-4-hydroxybenzoat

Năm 2010, Xu Min và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết MeOH thân

lá Dracaena angustifolia sáu saponin steroid mới đặt tên là angudracanoside A – F

[50]

Trần Lê Quân và cộng sự (2001) đã phân lập được từ rễ và thân rễ của

Dracaena angustifolia chín hợp chất mới, trong đó có ba spirostanol sapogenin, được

đặt tên là namogenin A-C (1-3), bốn spirostanol saponin, được đặt tên là namonin A-D (4-7), một furostanol saponin được đặt tên namonin E (8) và một pregnant glycoside tên namonin F (9) Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định nhờ phương pháp phân tích phổ và phân tích hóa học [41]

Bảng 1.1 Công thức hóa học của Nanogenin A, Nanogenin B, Nanogenin C, Namonin A,

Namonin B, Namonin C, Namonin D, Namonin E, Namonin F

1-O-{[2,3,4-tri-O-acetyl-α-Namonin B

(23S,24S)-spirosta-5,25(27)-dien-1β,3β,23,24-tetrol L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[4-O-acetyl-β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-α-L- arabinopyranoside} 24-O-β-D-fucopyranoside

1-O-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-Namonin F

1β,3β,16β-triol-20-one 1-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L- arabinopyranoside

16β-O-(4-methylidene-5-O-β-D-glucopyranosylpentanoyl)pregn-5-en-Ryan J Case và cộng sự đã phân lập từ lá Dracaena angustifolia 3 hợp chất:

Ergosterol-5,8-endoperoxit, Acid linoleic và E-phytol [16]

Các nghiên cứu tại tỉnh Manus, Papua New Guinea được tiến hành để xác định

về các loại thảo dược được người dân địa phương sử dụng để chữa trị lao phổi và các bệnh có triệu chứng lâm sàng tương tự Các cây này được thu thập và đánh giá Kết

quả thu được D angustifolia được đánh giá có khả năng điều trị bệnh lao do những tác

dụng kháng trực khuẩn lao in vitro của nó [16]

Làm thuốc bổ, chữa bệnh bạch cầu, tiêu chảy, hen suyễn:

Các bộ phận dưới mặt đất, được sắc uống có tác dụng làm thuốc bổ và chữa trị bệnh bạch cầu Lá được dùng chữa tiêu chảy, hoa tươi có thể làm đồ ăn, nụ khô sắc lên

chữa hen suyễn [3]

Ức chế tăng sinh tế bào:

Năm 1998, Trần Lê Quân và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm tác dụng ức chế tăng sinh của dịch chiết MeOH, H2O và MeOH/ H2O (tỉ lệ 1:1) của thân rễ Draceana angustifolia Roxb thu hái tại Quảng Nam trên tế bào ung thư biểu mô ruột già 26-L5

và tế bào biểu mô ác tính B16-BL6 ở chuột và các dòng tế bào u xơ HT-1080 ở người Thử nghiệm cho thấy rằng chiết xuất trong MeOH có hoạt tính ức chế tăng sinh dòng

tế bào fibrosarcoma HT-1080 ở người với giá trị IC là 66 µg/mL, trong khi chiết xuất

trong MeOH/H2O và chiết xuất trong H2O đều không tác dụng với dòng tế bào được thử nghiệm Chiết xuất saponin sprinostanol có khả năng ức chế tăng sinh tế bào mạnh hơn so với nhóm furostanol, và nhóm acetyl trong phân tử đường đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động này [41]

Kháng nấm:

Xu Min và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng nấm của thân cây tươi

Dracaena angustifolia thu thập tại Tây Nam Trung Quốc Nghiên cứu đã chỉ ra hai

saponin steroid được đặt tên là Angudracanoside F có CTHH C37H58O12 và Alliospiroside A có CTHH C38H60O11 có hoạt tính chống nấm đối với C neoformans,

với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) tương ứng là 9,5 và 20,0 μg/mL, chứng dương được

sử dụng là Amphotericin B có IC50 là 2,5 μg/ml [50]

Chống viêm:

Hui – Chi Huang và cộng sự đã phân lập từ lá của Dracaena angustifolia Roxb

2 hợp chất có CTHH là C45H72O17 và C39H62O13 [26] Các hợp chất có tác động ức chế thuần túy đối với việc tạo ra superoxide và phóng thích elastase trong các neutrophils của con người gây ra bởi fMLP/CB

Ở Vân Nam (Trung Quốc), rễ và lá dùng trị khái huyết, thổ huyết, nục huyết, đại tiểu tiện xuất huyết, hen suyễn, trẻ em cam tích, đòn ngã ngoại thương xuất huyết Thái y dùng trị cảm nhiễm niệu đạo, tiêu bố phúc tả, bệnh về dạ dày, sản hậu hư nhược, giải thuốc độc, tiêu giảm, tim đập nhanh Theo một nghiên cứu ở Ấn Độ, toàn cây Bồng bồng bỏ rễ có độc, khi dùng phải thận trọng [12]

Độc tính cấp thử trên chuột nhắt trắng tiêm trong màng bụng thấy LD50 khoảng 175mg/kg, chứng tỏ Bồng bồng có độc tính khá Ngoài ra, ở Madagasca đã phát hiện Bồng bồng độc với thai, có thể gây sẩy thai ở động vật thí nghiệm [12]

1.3 Sâm cau Quảng Nam

Tên khoa học: Ophiopogon aff caulescens

Tên đồng nghĩa: Chloosis caulescens Blume., Ophiopogon wallichianus (Kunth) Hook., Ophiopogon malayanus Ridl

ở mặt trên, gân bên mảnh, song song, mép nguyên hoặc có răng cưa nhỏ, không cuống, phía dưới dạng ẹ, ôm lấy thân, mép có màng mỏng Cụm hoa chùm, mọc ở nách lá hoặc trong bó lá ở đỉnh thân, có 10-12 hoa, trục cụm hoa dài tới 33cm, màu đỏ tía, dẹp, thường có 2 cánh, trong mỗi lá bắc có 1-3(4) hoa, lá bắc nhỏ, hình mũi giáo-trứng, chóp nhọn dài, lá bắc ở dưới cùng dài 1,2-2,5 cm Hoa nhỏ màu trắng hoặc màu tím nhạt; cuống hoa dài 3-8mm, có đốt ở giữa Bao hoa 6 mảnh, hình thuôn-trứng, dính nhau ở gốc, chóp tù, xếp 2 vòng; các mảnh vòng trong thường nhỏ hơn vòng ngoài, dài 4,5-5,7 mm, rộng 2-2,3(3,2)mm, khi nở trải ra Nhị 6; chỉ nhị dính nhau ở gốc, dài 0,6-1,2 mm, dính nhau toàn bộ chiều dài; bao phấn hình trứng hẹp, dài 1,7-2,8 mm, đính gốc, 2 ô, hướng trong, mở bằng khe dọc Bầu hạ, đỉnh lõm xuống, 3 ô; vòi nhụy hình dùi, dài 3,5-5 mm; đầu nhụy 3 răng Hạt hình cầu [6], [7]

1.3.2 Phân bố, thu hái

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 3-6, mùa quả tháng 7-12 Mọc nơi ẩm, nhiều mùn, hốc đá, ven suối, dưới tán rừng lá rộng thường xanh ẩm

Phân bố: Lào Cai ( Sa Pa) Còn có ở Indonexia, Malaixia, Philippin [6], [7]

1.3.2 Thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý

Chưa có thông tin về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của loài này

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Nguyên vật liệu nghiên cứu là:

- Nhóm 1: Thân rễ, lá, hoa của Sâm cau thu hái tại Văn Chấn, Yên Bái trong tháng

Thu mẫu và bảo quản: [1]

- Dược liệu tươi được phơi sấy khô, cho vào các túi PE đóng kín, để nơi thoáng mát, khô ráo

- Một phần dược liệu tươi được cắt thành từng đoạn bảo quản trong hỗn hợp cồn – nước – glycerin

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị nghiên cứu

- Bếp điện Heidolph MR 3001K, Tủ sấy memmerl

- Kính hiển vi Leica DM1000, LABOMED

- Máy ảnh kỹ thuật số

- Hệ thống HPTLC: Hệ thống chấm, chụp ảnh sắc ký lớp mỏng CAMAG LINOMAT

5 và có kết nối với máy tính cài đặt phần mềm VisionCATs

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Dụng cụ trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Thước, máy cắt vi phẫu cầm tay, cốc

có mỏ, la men, lam kính, kim mũi mác, chày cối, kéo…

- Dụng cụ trong sơ bộ xác định thành phần hóa học: Bình nón, cốc có mỏ, bộ dụng cụ chiết hồi lưu, ống nghiệm, lam kính, mảnh nhôm…

- Dụng cụ trong triển khai sắc ký lớp mỏng: Bộ dụng cụ chiết hồi lưu, cốc có mỏ, ống nghiệm, bình phun thuốc thử, bản mỏng silicagel 60 F254

2.2.2 Hóa chất

- Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn theo Dược Điển Việt Nam IV

- Hóa chất: Javen, Cloramin B, acid acetic 5%, cloralhydrat 50%, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất, glycerin, natri sulfat khan, Acid sulfuric đặc…

- Dung môi hữu cơ: Toluen, ethylacetat, methanol, ethanol, acid formic, ether dầu hỏa, chloroform…

- Thuốc thử: một số thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng như: Thuốc thử Vanilin/H2SO4 đặc…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

Quan sát đặc điểm hình thái:

 Giám định tên khoa học:

 Mô tả hình thái: Quan sát, chụp ảnh cây tại thực địa, làm vi phẫu dược liệu

Quy trình làm tiêu bản vi phẫu thực vật:

- Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang bằng dụng cụ cắt vi phẫu hoặc dao lam, chọn các lát cắt mỏng

- Ngâm nước Javen hay dung dịch cloramin (20-30 phút) Rửa bằng nước

- Ngâm acid acetic (15-30 phút) Rửa bằng nước cất 3 lần

- Nhuộm vi phẫu bằng xanh methylen (1-2 phút) Rửa bằng nước

- Nhuộm đỏ son phèn (2-10 phút) Rửa bằng nước

- Nhỏ một giọt glycerin trên phiến kính, đặt vi phẫu vào, đậy lá kính soi trên kính hiển vi Quan sát, chụp ảnh [1, 8]

 Đặc điểm vi học: Quan sát cấu tạo giải phẫu bột dược liệu bằng kính hiển vi

- Thân rễ cây Sâm cau, Sâm cau Quảng Nam, Sâm cau đỏ sau khi rửa sạch, sấy khô, tán thành bột mịn Rây qua rây kích thước 150µm lấy phần bột mịn

- Tiếp theo dùng kim mũi mác cho một lượng nhỏ bột dược lệu lên trên phiến kính

có sẵn giọt nước cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi quang học Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm bột dược liệu [8]

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

Dược liệu được đem nghiên cứu về hóa học là thân rễ các loài “Sâm cau”

2.3.2.1 Định tính sơ bộ:

 Định tính flavonoid

Tiến hành: Lấy 4g dược liệu cho vào bình nón 50ml, thêm 40ml ethanol 90%

Đun sôi cách thủy 5 phút Lọc nóng, dịch lọc thu được tiến hành thực hiện các phản ứng định tính sau:

a Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút, phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

b Phản ứng với kiềm

Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi

hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt thì phản ứng dương tính

Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài

giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, thêm 1ml nước cất tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch được tăng thêm

Tiến hành: Lấy khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 10 ml

cồn 90° Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:

a Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:

- Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

- Ống 2: để nguyên

Phản ứng dương tính khi xảy ra các hiện tượng sau:

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

- Ống 1: không có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

c Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng từ ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác

dụng của tia tử ngoại)

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che

 Định tính saponin

a Dựa trên tính chất tạo bọt

Tiến hành: Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột dược liệu, thêm 5ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ

bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

b Phản ứng với thuốc thử Liebermann- Burchard

Tiến hành: Cho vào bình nón 100ml khoảng 5g dược liệu, đun hồi lưu với 30ml

Methanol Gạn lấy dịch lọc, cho vào dịch lọc khoảng 10ml HCl 10% Đun cách thủy trong 2 giờ Lấy dịch chiết sau thủy phân, đem lắc với Chloroform (3 lần, mỗi lần 5ml) Gạn lấy lớp chloroform, gộp lại với nhau Đem cô đến cắn

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45° Cho từ từ theo thành ống 0.5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu hồng đến tím đỏ là loại saponin triterpen, xuất hiện màu xanh lá thì là loại saponin steroid

 Định tính glycosid tim

Tiến hành: Cho vào bình nón 50ml khoảng 5g dược liệu, thêm 20 ml cồn 25%

ngâm trong 24h, lọc lấy dịch lọc Dịch chiết thu được đem loại tạp bằng chì acetat 30%, khuấy đều, lọc lấy dịch lọc Sau đó cho thêm chì acetat 30% nếu có tủa thì cho thêm chì acetat vào Lặp lại nhiều lần đến khi không còn tủa Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, lắc 2 lần với CHCl3-EtOH (4:1) Gạn lớp CHCl3-EtOH vào cốc có

mỏ, gộp các dịch chiết CHCl3-EtOH và loại nước bằng natri sulfat khan, lấy dịch đem

cô bay hơi thu được cắn Cắn đem làm các phản ứng sau:

a Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann- Burchard

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45° Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng ở phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá – phản ứng dương tính

b Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dd acid picric 1% và 9 phần dd NaOH 10%) mới pha, phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ da cam

Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam

c Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy

Phản ứng Keller – Kiliani:

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều

Nghiêng ống 45° Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ – phản ứng dương tính

 Định tính tanin

Tiến hành: Lấy khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm

20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để định tính

- Ống 1: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) sẽ xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt – phản ứng dương tính

- Ống 2: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) sẽ xuất hiện tủa bông – phản ứng dương tính

- Ống 3: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng – phản ứng dương tính

 Định tính acid hữu cơ

Tiến hành: Cân khoảng 3g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml

nước cất đem đun sôi trực tiếp trong 10 phút, để nguội, lọc qua giấy lọc Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3, nếu có acid hữu cơ sẽ xuất hiện bọt khí

 Định tính alcaloid

Tiến hành: Cân 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 40ml

dung dịch sulfuric 1N Đun đến sôi, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9 – 10 (thử bằng giấy quỳ) Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính

Lấy một phần dịch chiết chloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 – 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

- Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu từ trắng đến vàng–phản ứng dương tính

- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu – phản ứng dương tính

- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa vàng cam đến đỏ – phản ứng dương tính

 Định tính anthranoid

Tiến hành: Lấy khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm

20 ml nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng trong bình gạn dung tích 50ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5ml ether (hoặc chloroform) Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước Giữ lớp ether (hoặc chloroform) để làm phản ứng

a.Phản ứng Borntraeger: Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự

do):

Nguyên tắc của phản ứng: Các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm

(ammoniac, natri hydroxyd, hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo ra các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước

- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1ml dung dịch amoniac Lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp ether (hoặc chloroform) có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dưng dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Lớp ether (hoặc chloroform) sẽ mất màu còn lớp nước đậm màu hơn

- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dd NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim

b Vi thăng hoa

Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút Lấy lam kính ra để nguội, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng Sau khi nhỏ dd NaOH lên lam kính, phản ứng dương tính khi dd có màu đỏ

 Định tính acid amin

Tiến hành: Cân khoảng 5g dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 30ml nước cất,

đun sôi vài phút Lọc qua giấy lọc vào 4 ống nghiệm khác

- Ống nghiệm: Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3% vào ống nghiệm Đun cách thủy sôi 10 phút, phản ứng dương tính khí thấy xuất hiện màu tím

 Định tính chất béo, caroten, sterol

Tiến hành: Cân khoảng 5g bột dược liệu vào cốc có mỏ 100ml, thêm 10ml ether

dầu hỏa, bọc kín, ngâm 1 giờ Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc thu được dịch lọc

- Định tính chất béo: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi, phản ứng dương tính khi trên giấy lọc còn vết mờ

- Định tính caroten: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa trên, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh ve

- Định tính sterol: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa trên,

cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kĩ cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 45° Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc Phản ứng dương tính khi mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu tím đỏ, lớp trên có màu xanh lá

 Định tính đường khử

Tiến hành: Cho khoảng 3g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 1ml nước

cất, đun sôi Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Thêm 1 ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B Đun cách thủy sôi vài phút, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện đỏ gạch

2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml

Thêm methanol ngập dược liệu Chiết hồi lưu cách thủy trong 30 phút Lọc lấy dịch chiết Methanol, cô cách thủy đến 5ml, triển khai sắc ký

Dịch chiết dùng chấm sắc ký phải đảm bảo những yêu cầu sau: trong suốt, không lắng cặn, không phân lớp, không tạo váng, không bị nhũ hóa và đồng nhất về màu sắc

-Bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254

Chấm sắc ký: Sử dụng hệ thống chấm sắc ký Linomat 5, đưa 8µl dịch chiết lên bản

mỏng, triển khai sắc ký với hệ dung môi thích hợp

-Hệ dung môi: Thăm dò khả năng tách vết của dịch chiết trên các hệ dung môi có độ

phân cực khác nhau để tìm ra hệ có khả năng tách tốt nhất