Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số paraben trong mỹ phẩm

Do đó, một phương pháp phân tích sử dụng thiết bị vốn phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm là sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod cần được phát triển để xác định các paraben nà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VIỆT ÁI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ

PARABEN TRONG MỸ PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VIỆT ÁI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ

PARABEN TRONG MỸ PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hường Hoa

GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể thầy hướng dẫn, TS Lê Thị

Hường Hoa vàGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu - những người thầy đã không quản

ngại khó khăn, dành nhiều thời gian quý báu và giúp đỡ tận tình cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa kiểm nghiệm Mỹ phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành việc học và làm đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích đã cho tôi một môi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi bồi đắp kiến thức và hoàn thiện bản thân

Không thể nói hết sự cảm kích của tôi đối với đồng nghiệp và gia đình đã luôn yêu thương, động viên, nhường nhịn để tôi đi đến chặng cuối của chương trình học Thạc sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Việt Ái

MỤC LỤC

Lơ ̀ i cảm ơn

Danh mu ̣c các kí hiê ̣u, các từ viết tắt

Danh mu ̣c các bảng

Danh mu ̣c các hình

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ PARABEN 3

1.1.1 Đặc điểm chung 3

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn của paraben và việc sử du ̣ng paraben trong thực tiễn sản xuất 5

1.1.3 Sự hiện diện của paraben trong môi trường 7

1.1.4 Tác động của paraben đối với cơ thể con người 8

1.1.5 Một số phương pháp phân tích paraben trong mỹ phẩm 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 25

1.2.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 25

1.2.2 Cấu tạo máy HPLC 25

1.2.3 Detector và bộ phận ghi tín hiệu 26

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí 26

1.2.5 Ứng dụng HPLC 27

CHƯƠNG 2 31

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 31

2.2.1 Thiết bị và dụngcụ 31

2.2.2 Dung môi và hóa chất 31

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

CHƯƠNG 3 36

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 36

3.1 XỬ LÝ MẪU 36

3.1.1 Điều kiện xử lý mẫu 36

3.1.2 Cách chuẩn bị mẫu 36

3.2 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 37

3.2.1 Điều kiện sắc kí 37

3.2.2 Thẩm định quy trình 40

3.3 ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG 67

CHƯƠNG 4 72

BÀN LUẬN 72

4.1 VỀ CÁC PARABEN NGHIÊN CỨU 72

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 72

4.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu 74

4.2.2 Về xây dựng quy trình phân tích 75

4.2.3 Về thẩm định phương pháp 75

4.3 VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM 76

KẾT LUẬN 77

KIẾN NGHỊ 77

Ta ̀i liê ̣u tham khảo

Phu ̣ lu ̣c

Phu ̣ lu ̣c 1: Các mẫu mỹ phẩm được sử dụng để xác định sự có mặt của 5 paraben

cấm

Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích xác định paraben trong mỹ phẩm

Phu ̣ lu ̣c 3: Thường quy kĩ thuâ ̣t - Đi ̣nh tính và đi ̣nh lượng 5 chất bảo quản

Phụ lục 4: Một số sắc kí đồ phân tích 5 paraben IPP, PheP, BzP, IBP, PeP

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên tiếng Việt (tiếng Anh)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

ppm Phần triệu (parts per million)

r Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

UV-VIS Tử ngoại- khả kiến (Ultraviolet-visible)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Một số tính chất vật lý, hóa học 5 paraben bị cấm dùng trong mỹ phẩm 4

Bảng 2 1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích 31

Bảng 3 1 Độ thích hợp của hệ thống sắc kí củ a IPP, PheP và BzP 40

Bảng 3 2 Độ thích hợp của hệ thống sắc kí củ a IBP và PeP 41

Bảng 3 3 Thời gian lưu của IPP, PheP, BzP trên các loại mẫu thử khác nhau 46

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IPP, PheP, BzP 46

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của IBP và PeP 47

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền sữa rửa mặt 49

Bảng 3 7 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền sữa rửa mặt 50

Bảng 3 8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền sữa rửa mặt 50

Bảng 3 9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền sữa rửa mặt 51

Bảng 3 10 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền sữa rửa mặt 52

Bảng 3 11 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IPP trên nền nước súc miệng 53

Bảng 3 12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PheP trên nền nước súc miệng 53

Bảng 3 13 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với BzP trên nền nước súc miệng 54

Bảng 3 14 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với IBP trên nền nước súc miệng 54

Bảng 3 15 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với PeP trên nền nước súc miệng 55Bảng 3 16 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt 56Bảng 3 17 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền sữa rửa mặt 57Bảng 3 18 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng 58Bảng 3 19 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với IBP và PeP trên nền nước súc miệng 59Bảng 3 20 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền sữa rửa mặt 60Bảng 3 21 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP

và PeP trên nền sữa rửa mặt 61Bảng 3 22 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IPP, PheP, BzP trên nền nước súc miệng 62Bảng 3 23 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với IBP

và PeP trên nền nước súc miệng 63

Bảng 3 25 Kết quả phân tích các paraben cấm 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc chung của paraben 3

Hình 1 2 Phương pháp phân tích chính thức do liên minh châu Âu ban hành để định tính và định lượng paraben trong mỹ phẩm 14

Hình 1 3 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 25

Hình 1 4 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 30

Hình 3 1 Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn 5 paraben bi ̣ cấm (trái) và hỗn hợp chuẩn 9 paraben (phải) với pha động ACN - nước (40 : 60) 38

Hình 3 2 Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn IPP, PheP, BzP (a), hỗn hợp chuẩn IBP và PeP (b) và hỗn hợp 9 paraben (c) trên cột Luna với pha động ACN - nước (35 : 65) 39

Hình 3 3 Sắc kí đồ phân tích hỗn hợp chuẩn 9 paraben trên cột Luna với pha động ACN - nước (45 : 55) 40

Hình 3 4 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben IPP, PheP, BzP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn 42

Hình 3 5 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn 43

Hình 3 6 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu sữa rửa mặt so với mẫu chuẩn 44

Hình 3 7 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với 2 paraben IBP và PeP trên nền mẫu nước súc miệng so với mẫu chuẩn 45

Hình 3 8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của 47

Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ 48

Hình 3 10 Sắc kí đồ xác định LOD của PheP và BzP 64

Hình 3 11 Sắc kí đồ thể hiện LOD của IPP 65

Hình 3 12 Sắc kí đồ thể hiện LOD của IBP, PeP 66

Hình 3 13 So sánh phổ UV-VIS của các píc trên mẫu thử 48L02 và 48L01 68

Hình 3 14 Sắc kí đồ phát hiện các paraben trong 48L07 69

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự kỳ vọng về thời hạn sử dụng lâu dài và các sản phẩm tiêu dùng không chứa vi sinh vật đòi hỏi phải sử dụng chất bảo quản Lý tưởng nhất là chất bảo quản hoạt động ở nồng độ thấp mà có tác dụng với nhiều loại vi sinh vật khác nhau và không ảnh hưởng đến các thành phần khác trong sản phẩm, đồng thời không gây độc cho người và có giá rẻ cho các nhà sản xuất Paraben đã được sử dụng gần 100 năm làm chất bảo quản, chủ yếu là trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân, dược phẩm và thực phẩm Chúng đã từng được coi là một trong những chất bảo quản an toàn nhất và được dung nạp tốt nhất Việc sản xuất và sử dụng rộng rãi paraben trong thời gian dài trên toàn cầu đã dẫn đến sự xuất hiện của chúng ở nhiều nơi trong môi trường Paraben đã được phát hiện trong nước mặt, đất và trầm tích, sinh vật, cũng như trong không khí và bụi trong nhà Tuy nhiên, nguồn phơi nhiễm chính với paraben của con người là các sản phẩm chăm sóc cá nhân và dược phẩm Phơi nhiễm paraben liên tục ngay cả ở nồng độ thấp có thể dẫn đến sự tồn tại lâu dài và tích tụ Tác động và sự an toàn của paraben đã được các báo cáo khoa học đề cập đến khả năng tiềm tàng gây rối loạn nội tiết và mối liên hệ có thể có với ung thư vú Những phát hiện này cũng chỉ ra tác động tiềm ẩn có hại đối với việc dùng các mỹ phẩm có chứa paraben trên da người, đặc biệt khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời Khi con người có thể liên tục tiếp xúc với nhiều paraben khác nhau và nhiều chất

được, hỗn hợp các chất này có thể gây tác dụng bất lợi tiềm tàng không thể bỏ qua

Các nước châu Âu và ASEAN đã đưa ra những quy định nhằm quản lý việc

sử dụng paraben Trong số chín paraben được sử du ̣ng trong thực tế thì

đưa vào danh mu ̣c các chất bi ̣ cấm sử du ̣ng trong mỹ phẩm

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục quản lý dược (Bộ Y tế) ban hành ngày

13 tháng 4 năm 2015 về việc quyết định ngừng lưu hành các sản phẩm mỹ phẩm

các nước ASEAN trong tiến trình xây dựng cộng đồng chung, nhằm bảo vệ sức khỏe của người dân trong khu vực Do đó, một phương pháp phân tích sử dụng thiết

bị vốn phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm là sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod cần được phát triển để xác định các paraben này trong các sản phẩm mỹ phẩm

Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng các quy trình phát hiện và định lượng những paraben bị cấm trong mỹ phẩm với các mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình phân tích các paraben isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben va ̀ pentylparaben trong mỹ phẩm dạng sữa rửa mặt và nước súc miệng

2 Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường

Hình 1 1 Cấu trúc chung của paraben

Ở điều kiện bình thường các paraben là những tinh thể không màu hoặc tinh thể màu trắng, không có mùi, vị Paraben tan trong các dung môi như methanol, ethanol, ete, glycerin, propylen glycol và tan ít hoặc gần như không tan trong nước Paraben tan tốt hơn trong nước nóng Mặc dù ít tan trong nước nhưng độ tan trong nước của paraben là vừa đủ để cho phép tạo được nồng độ có tác dụng Khi tăng chiều dài chuỗi alkyl, độ tan trong nước giảm Paraben hút ẩm và có hệ số phân bố dầu / nước cao Bảng 1.1 tóm tắt một số tính chất vật lý và hóa học của paraben

Trong thương mại, paraben được sản xuất bằng ester hóa acid hydroxybenzoic với một alcol thích hợp với sự có mặt của một chất xúc tác (ví dụ acid sulfuric đậm đặc hoặc acid p-toluenesulfonic) Trong môi trường acid thì

p-hydroxybenzoic và alcol tương ứng Nói chung, với sự gia tăng chiều dài chuỗi

Methylparaben được báo cáo là bị thủy phân cho acid p-hydroxybenzoic

đến vài chục ngày đối với sự thủy phân phi sinh học [11] Paraben đã được mô tả là

dễ phân huỷ sinh học trong điều kiện hiếu khí, với khả năng phân huỷ sinh học khoảng 90% nhu cầu oxy lý thuyết (đối với methylparaben, ethylparaben và propylparaben) [11] Tuy nhiên, González-Mariño và cộng sự (2011) lại cho rằng việc phân hủy sinh học bùn hoạt tính được thực hiện dễ hơn là các quá trình phi sinh học hoặc hấp phụ [18] Các paraben đã nghiên cứu (methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben) gần như hoàn toàn phân hủy sinh học (99%) trong vòng dưới 5 ngày, với thời gian bán hủy không quá

3 ngày Độ bền của các hợp chất tăng nhẹ với chiều dài của chuỗi alkyl và mức độ clo hóa Thời gian bán hủy của dẫn chất halogen hóa của methylparaben lên đến 10 ngày [18]

Bảng 1 1 Một số tính chất vật lý, hóa học 5 paraben bị cấm dùng trong mỹ phẩm

Isopropyl Phenyl Isobutyl Benzyl Pentyl

Chlorin ở nồng độ thấp khi dùng để xử lý nước có thể phản ứng với paraben

để tạo ra dẫn xuất clo [6] Canosa và cộng sự (2006) quan sát thấy rằng ngay cả vài phút tiếp xúc giữa mỹ phẩm có chứa paraben (ví dụ: gel tắm) và nước máy có chlorin sẽ tạo thành các sản phẩm phụ có chứa clo và brom Tỉ lệ phản ứng tăng theo nhiệt độ Hiện tượng này là đáng báo động do sự ổn định cao của dẫn xuất di-clo và tiềm ẩn tác dụng estrogen chưa được xác định rõ [6] Hơn nữa, các dẫn xuất

clo có độc tính đáng kể đối với các sinh vật thủy sinh so với các hợp chất mẹ tương ứng

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn của paraben và viê ̣c sử du ̣ng paraben trong thực tiễn sản xuất

Các paraben có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc nên thường được sử dụng làm chất bảo quản Cơ chế hoạt động của các paraben hiện vẫn chưa được xác định rõ Paraben được cho là phá vỡ quá trình vận chuyển chất qua màng hoặc ức chế tổng hợp ADN và ARN hay một số enzym quan trọng Khả năng ức chế sự tăng trưởng vi khuẩn của paraben tăng lên cùng với sự gia tăng chiều dài của chuỗi alkyl Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng chiều dài của chuỗi alkyl, giá trị của hệ số phân tán octanol-nước tăng lên, dẫn đến giảm độ tan trong nước Chính vì vậy để vừa đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn lại vừa tan tốt, có thể thấy trong thực tế methylparaben kết hợp với propylparaben được sử dụng rộng rãi trong hoạt động bảo quản Hoạt tính kháng khuẩn của paraben mạnh nhất với vi

khuẩn Gram (+) và kém nhất đối với Pseudomonas [14]

Paraben có tính ổn định hóa học cao trong một khoảng biến thiên nhiệt độ rộng và dải pH từ 3 đến 8 [14] Do có tính trơ về mặt hóa học, nó ít khi phản ứng với các thành phần trong sản phẩm Paraben không có mùi hay vị, không gây ra sự thay đổi trong tính đồng nhất và màu sắc của sản phẩm Sự kết hợp của các tính chất này làm cho việc tìm kiếm chất bảo quản thay thế thỏa đáng cho paraben sẽ là tương đối khó khăn Các loại mỹ phẩm không chứa paraben thường có giá thành đắt

và thời hạn sử dụng ngắn Một số chất bảo quản thông dụng khác bao gồm formaldehyd (dung dịch trong nước còn gọi là fooc-môn), quaternium-15, imidazolidinyl urê, diazolidinyl urê và dimethyloldimethyl hydantoin [54] Nhưng các chất bảo quản này thường gây phản ứng dị ứng và một số gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ, như formaldehyd và mối liên hệ nhân quả với ung thư [54] Việc sử dụng các chất bảo quản tự nhiên đã được ủng hộ, bao gồm chiết xuất từ hạt nho (GSE) [39] Thật không may, GSE có thể tương tác với các thuốc do khả năng ức chế CYP3A4, một enzym quan trọng liên quan đến sự chuyển

hóa của thuốc [39] Các chất bảo quản tự nhiên khác bao gồm thymol, cinnamaldehyd, allyl isothiocyanat, acid citric, acid ascorbic và chiết xuất thảo mộc [39] Các chất bảo quản tự nhiên này ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong ống nghiệm, tuy nhiên một vài nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn trong các sản phẩm thực phẩm đã mang lại kết quả không rõ ràng [39] Vì vậy hiệu quả, an toàn và độc tính của chúng cần được bảo đảm trước khi sử dụng rộng rãi

Paraben từng được phân loại là hợp chất "thường được coi là an toàn" (GRAS) và được chấp thuận sử dụng trong thực phẩm bởi Cục quản lý thực phẩm

và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Liên minh châu Âu (EU) Paraben được sử dụng lần đầu tiên vào giữa những năm 1920 dưới dạng chất bảo quản trong dược phẩm Sau này chúng được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản, phổ biến nhất là trong mỹ phẩm, rồi đến dược phẩm, ngoài ra còn dùng trong các mặt hàng thực phẩm và các sản phẩm công nghiệp Một nghiên cứu đã xác định paraben có trong 44 % mỹ phẩm được thử nghiệm [64] Trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân được thử nghiệm tại Hoa Kỳ, nồng độ methylparaben lên đến 1,0%, với son môi chứa nồng

độ cao nhất từ 0,15% đến 1,0% Các paraben khác được sử dụng ở nồng độ thấp hơn methylparaben Methylparaben và propylparaben là những chất paraben được

sử dụng phổ biến nhất trong các sản phẩm dược phẩm với nồng độ lên đến 20% [9]

Cả hai chất bảo quản này cũng được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm như mứt, thạch, chất độn và các lớp phủ với nồng độ lên đến 0,1% [39] Trong mỹ phẩm, paraben được coi là thành phần phổ biến nhất, chỉ sau nước Ước tính khác cho thấy butylparaben có trong 13% mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân

thay đổi thành phần của các sản phẩm mỹ phẩm của họ bằng cách thay paraben bằng các hệ bảo quản khác và đưa ra các công thức được gọi là "không paraben"

[32], trong khi năm 2006 nó đã lên đến 22.000 [8] Tuy nhiên, hàm lượng paraben

nồng độ cho một paraben duy nhất lên đến 25% đối với methylparaben và

trong 215 sản phẩm thử nghiệm trên thị trường Đan Mạch dao động từ 0,01% đến 0,87% [48]

1.1.3 Sự hiện diện của paraben trong môi trường

Việc sử dụng rộng rãi paraben trên toàn cầu đã dẫn đến sự xuất hiện của chúng ở nhiều nơi trong môi trường Paraben đã được tìm thấy trong các dòng chảy của nhà máy xử lý nước thải [11] Do đó, các hợp chất này đã được xác định trong các dòng sông và các nguồn nước uống [11] Paraben đã được phát hiện trong đất từ các cánh đồng nông nghiệp, có thể từ phương pháp tưới tiêu hoặc bón phân [11] Bụi trong nhà cũng được tìm thấy chứa paraben [65] Nồng độ paraben phát hiện

độ paraben trong bụi cao hơn nhiều so với các chất paraben phát hiện trong bùn thải [65] Mặc dù paraben được sử dụng thương mại có nguồn gốc tổng hợp, một số paraben được sinh ra từ các sinh vật sống, cụ thể là do thực vật và vi khuẩn, một

chủng vi khuẩn biển thuộc chi Microbulbifer Các loại cây như việt quất, cà rốt, ô

liu, dâu tây và các loại khác tạo ra paraben (chủ yếu là methylparaben) giúp cho hoạt động kháng khuẩn của chúng [11] Paraben có ở khắp mọi nơi và có thể nguồn

ô nhiễm chính là các nhà máy xử lý nước thải Mặc dù tỉ lệ loại bỏ paraben trong các công trình xử lý nước thải là cao (trung bình là 96,1-99,9%) [18] nhưng các chất gây ô nhiễm vẫn tồn tại trong nước thải (ở nồng độ lên đến 4000 ng/L) [86] dẫn đến

rò rỉ vào môi trường Tuy nhiên, các giá trị nồng độ quan sát thấy trong môi trường

tự nhiên có vẻ như quá thấp để tạo ra các phản ứng phụ Các nguồn chính mà con người tiếp xúc với paraben là các sản phẩm chăm sóc cá nhân và dược phẩm Mức

độ tiếp xúc được phản ánh qua việc thường xuyên phát hiện các hợp chất paraben

propylparaben được phát hiện trong hầu hết các mẫu nước tiểu được phân tích (trong đó methylparaben xấp xỉ 100%, propylparaben trên 80%) [11] Hơn nữa, các chất bảo quản đã được phát hiện trong huyết thanh, sữa mẹ, mô nhau thai, tinh dịch, đáng lưu ý nhất là phát hiện ở mô vú từ những bệnh nhân ung thư vú [3], [10] Tuy nhiên, cần phải xem xét liệu nồng độ paraben mà chúng ta tiếp xúc đã đủ cao để gây

ra một mối đe dọa đối với sức khoẻ con người hay chưa

1.1.4 Tác động của paraben đối với cơ thể con người

1.1.4.1 Dược động học của paraben

Paraben có thể xâm nhập vào cơ thể người qua da và qua đường tiêm Nồng

độ phơi nhiễm paraben trung bình hàng ngày ước tính khoảng 76 mg trong đó 50

mg từ mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân, 25 mg từ các sản phẩm dược phẩm, và 1 mg từ thực phẩm [54] Vì độ tan trong nước thấp, các paraben dễ dàng xâm nhập qua lớp sừng của da, và sau đó được giữ lại trong các lớp biểu bì Paraben dùng cho da được chuyển hóa bằng enzym carboxylesterase của tế bào sừng, ở mức

độ thấp hơn nhiều so với gan và các chất chuyển hóa liên hợp được bài tiết qua nước tiểu và mật Paraben đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch được chuyển hóa bởi các enzym esterase trong ruột và gan [9]

Sản phẩm chính của quá trình thủy phân paraben là acid hydroxybenzoic (pHBA) Các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm trên chuột cho thấy trên 50% liều paraben không bị hấp thu sau khi dùng qua da [11] Paraben uống hoặc tiêm dưới da chủ yếu được bài tiết qua nước tiểu, chủ yếu trong 24 giờ đầu Tuy nhiên, 2% liều được áp dụng đã được giữ lại trong các mô, trong khi chưa tới 4% được thải trừ với phân [11] Paraben và sản phẩm thủy phân của chúng được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng tự do hoặc dạng liên hợp glycin, glucuronid và sulfat Hiệu quả và mô hình thủy phân paraben trong cơ thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào độ dài chuỗi xoắn và mô [11] Mặc dù da người chứa các chất đồng phân carboxylesterase,

kết ester có thể không đủ để thủy phân hoàn toàn paraben được sử dụng trong cơ thể Thật thú vị, các nghiên cứu in vitro cho thấy paraben chịu sự thủy phân chậm

hơn nhiều trong da người so với gan người, gan chuột và da chuột [33] Sau khi tiêm dưới da, một phần của methylparaben không bị thủy phân và do đó một lượng hợp chất chưa được chuyển hóa có thể vẫn còn có sẵn trong cơ thể [45] Ngoài ra, tổn thương da có thể dẫn đến tăng tỉ lệ hấp thụ methylparaben Pažoureková và các cộng sự (2013) ước tính rằng sau khi dùng nhũ tương có chứa paraben trên da bị tổn thương thì lượng methylparaben không bị thủy phân tích lũy trong cơ thể có thể lên tới 923 μg/kg/ngày [45] Hơn nữa, phơi nhiễm paraben liên tục có thể dẫn đến sự tồn tại lâu dài và tích tụ [23]

1.1.4.2 Mẫn cảm paraben

Ở những người có làn da bình thường, paraben hầu như không gây kích ứng Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da, viêm da và gây bệnh rosacea ở những người dị ứng paraben (chiếm một tỉ lệ nhỏ trong dân số) Tỉ lệ báo cáo nhạy cảm đối với paraben dao động từ 0,5% đến 3,5% [39] Tỉ lệ nhạy cảm này là thấp nhất trong số các chất bảo quản [54] Ngoài ra, có các báo cáo về phản ứng dị ứng quá mẫn tức thời với paraben dẫn đến nổi mày đay, trong một trường hợp dẫn đến co thắt phế quản Tuy nhiên, các phản ứng dị ứng tức thời là rất hiếm

1.1.4.3 Paraben và hiện tượng lão hóa da

Đáng chú ý là methylparaben vốn được coi là chất ít có khả năng gây ra phản ứng bất lợi đã được phát hiện thấy có ảnh hưởng không tốt đối với tế bào sừng của

da người trong điều kiện kết hợp với tiếp xúc ánh sáng (UVB) [21] Sự sản sinh các

đáng kể bởi methylparaben Hơn nữa, sự gia tăng đáng kể peroxid hóa lipid của tế bào sừng HaCaT đã xảy ra sau khi kết hợp UVB và tiếp xúc methylparaben Sự thay đổi của các yếu tố này có thể góp phần làm tăng sự chết tế bào [21] Những phát hiện này chỉ ra tác động tiềm ẩn có hại đối với việc dùng các mỹ phẩm có chứa paraben trên da người, đặc biệt khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời

1.1.4.4 Paraben tiềm ẩn khả năng gây rối loạn nội tiết và ung thư vú

Các nghiên cứu trên người và động vật đã không chứng minh được rằng paraben có bất kỳ mức độ độc tính cấp tính nào theo các đường dùng khác nhau Vì vậy, nhiều nghiên cứu kiểm tra độc tính paraben đã tập trung vào các tác động lâu dài của tiếp xúc mạn tính

Hoạt tính estrogen của paraben lần đầu tiên được xác định vào năm 1998 và

đã được xác nhận in vitro và in vivo [9], [49] Paraben gắn với các thụ thể estrogen của con người, mặc dù có sự tương đồng kém hơn từ 10.000 đến 1.000.000 lần so với estradiol [49] Butylparaben và propylparaben có hoạt tính estrogen cao hơn methylparaben hoặc ethylparaben, nhưng butylparaben và propylparaben được phát hiện có nồng độ thấp hơn methylparaben ở người từ 10 đến 1000 lần [17] Các tác dụng estrogen ở cơ thể đã được chứng minh bằng thử nghiệm tăng trưởng tử cung (uterine growth) ở chuột cống và chuột nhắt [9], [56] Tuy nhiên, hiệu ứng này không ngăn được sự hình thành trứng thụ tinh, được coi là biện pháp nhạy nhất về độc tính của estrogen [56]

Mặc dù nhiều báo cáo đã xác nhận rằng paraben chịu sự thủy phân trong sinh vật [11], chúng được tìm thấy là hoàn toàn ổn định trong các tế bào ung thư vú MCF7 đồng nhất Sự ổn định của paraben có thể dẫn đến sự tích tụ của chúng trong

mô khối u vú Tuy nhiên, Barr và cộng sự (2012) đã không tìm thấy bất kỳ mối tương quan đáng kể giữa mức paraben trong mô vú và tuổi của bệnh nhân [3] Paraben đã được tìm thấy trong các mẫu mô của khối u vú ở người Giá trị trung bình của nồng độ tổng paraben trong mô khối u của vú tương ứng là 20,6 ± 4,2 ng/g (n = 20) và 9.794 ng/g (n = 9) đối với các mẫu từ Anh và Ấn Độ [10], [55] Nồng

độ phát hiện cao nhất trong khối u là 26.469 ng/g đối với butylparaben [55] Darbre

và cộng sự (2004) cho rằng sự hiện diện của paraben trong mô khối u vú có thể liên quan đến sự sinh ung thư [10] Một số nhà khoa học cũng đã tranh luận về sự hiện diện của paraben trong mô ung thư vú và tác động có hại của paraben [17] Dữ liệu

về ung thư vú của paraben cho thấy không có hoặc có nồng độ thấp paraben ở một nhóm nhỏ các bệnh nhân và không có sự so sánh với các kiểm soát thông thường

[3], [10] Cũng không thể nhận dạng được nguồn paraben ở 7/40 bệnh nhân được xác định có nhiễm paraben nhưng lại chưa bao giờ sử dụng mỹ phẩm Cũng không

có mối tương quan giữa nồng độ paraben và tuổi bệnh nhân (37-91 tuổi), thời gian cho bú sữa (0-23 tháng), vị trí khối u hoặc bản chất thụ thể estrogen khối u [3] Do

đó, không có mối liên hệ rõ ràng, rất khó để đưa ra mối quan hệ nhân quả giữa paraben và sự phát triển của ung thư vú

Một hướng nghiên cứu khác là ảnh hưởng của paraben đối với hệ thống sinh sản nam giới, nhưng các phát hiện cũng mâu thuẫn [26] Một nghiên cứu in vitro cho thấy tinh trùng người không thể sống được khi tiếp xúc với paraben ở nồng độ 1 mg/mL [57] Các nghiên cứu in vivo ở chuột cống lại cho thấy không có tác dụng gây độc tinh trùng ở nồng độ paraben 1% [43] Các kết quả trái ngược nhau cũng được báo cáo ở chuột nhắt, một nghiên cứu cho thấy số lượng và hoạt động tinh trùng giảm xuống, còn một nghiên cứu khác cho thấy không có tác dụng phụ về sinh sản [26] Ở những người đàn ông có vấn đề về khả năng sinh sản bao gồm số lượng tinh trùng thấp và khả năng di chuyển của tinh trùng giảm được khảo sát phơi nhiễm paraben bằng đo nồng độ paraben trong nước tiểu [11] Không tìm thấy sự tương quan giữa lượng tinh trùng hoặc tính di động với nồng độ paraben

Nồng độ paraben ở liều thấp khoảng 10 mg/kg/ngày gây stress ôxy hóa thông qua peroxid hóa lipid [11], làm thay đổi trọng lượng tử cung chuột cái [11] và thay đổi việc sản sinh tinh trùng hàng ngày ở chuột đực [43] Hơn nữa, việc tiếp xúc của chuột mẹ với isobutylparaben liều thấp có thể ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của con đực ở tuổi trưởng thành liên quan đến trạng thái lo âu và hành vi ở chuột [11]

Một vài nghiên cứu liên quan đến quần thể con người đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa nồng độ paraben trong nước tiểu và gen chỉ thị stress oxy hóa, suy giảm ADN tinh trùng hay các hoóc môn tuyến giáp trong huyết thanh [11] Mặc dù sự tương quan có thể là ngẫu nhiên, nhưng dường như không hợp lý để loại trừ giả thiết rằng paraben, thậm chí ở nồng độ thấp, ảnh hưởng đến sự cân bằng nội môi của cơ thể Hơn nữa, paraben ở nồng độ phát hiện trong mô vú của con người đã

được tìm thấy gây ra sự gia tăng các tế bào trong ống nghiệm, đặc biệt khi đấy là

khác nhau, tác động bất lợi tiềm tàng của chất bảo quản là đáng nghi ngại Rối loạn nội tiết ở môi trường thường là một ảnh hưởng của việc tiếp xúc không phải chỉvới một hợp chất đơn lẻ, mà thường là với một số chất ở nồng độ thấp Mặc dù ở các nồng độ dưới mức tác dụng quan sát được (được gọi là nồng độ không quan sát được tác dụng - NOEC), một hỗn hợp các chất gây gián đoạn nội tiết (EDCs) có thể gây phản ứng estrogen [4] Darbre (2009) đã kiểm tra tác động của paraben đối với

sự gia tăng tế bào ung thư vú MCF 7 Kết quả cho thấy paraben hỗn hợp ở nồng độ NOEC có thể tạo phản ứng estrogen bằng cách gia tăng sự tăng trưởng tế bào trong các tế bào ung thư vú MCF 7 Hơn nữa, phản ứng estrogen của hỗn hợp paraben có thể được tăng cường tại thời điểm nồng độ estradiol có mặt ở mức thấp Trong cơ thể, điều này có thể xảy ra trong chu kỳ kinh nguyệt, trước tuổi dậy thì hoặc sau khi

(BPA) và isobutylparaben (IBP) Kết quả cho thấy rằng BPA và IBP có thể có thêm một tiềm năng tăng estrogen thông qua con đường thụ thể trung gian estrogen [27] Các hiệu ứng bổ sung và hiệp đồng có thể có của paraben và EDCs khác sẽ là vô cùng quan trọng, bởi vì con người thường là tiếp xúc với một hỗn hợp các chất chứ không phải là một hợp chất duy nhất

Do đó, không thể bỏ qua vai trò có thể có của paraben trong quá trình gây ung thư Cần phải nghiên cứu thêm, bao gồm các nghiên cứu về cỡ mẫu lớn liên quan đến con người để đánh giá những tác động bất lợi của paraben Ngoài ra, cần

1.1.5 Một số phương pháp phân tích paraben trong mỹ phẩm

Một số phương pháp phân tích để xác định paraben có thể được tìm thấy trong cuốn sách do Salvador và Chisvert biên soạn từ năm 1980 đến năm 2006 [2] Wang và Liu tổng hợp và đánh giá cách xử lý mẫu và phương pháp phân tích dụng

cụ được sử dụng trong việc xác định các chất bảo quản khác nhau trong mỹ phẩm

[44] Trong những năm qua, các đánh giá khác nhau liên quan đến chủ đề này đã được công bố Nhìn chung, sự phức tạp của các nền mẫu mỹ phẩm và các trạng thái thể chất khác biệt của chúng đã dẫn đến sự phát triển của rất nhiều các phương pháp phân tích khác nhau Chiết pha rắn (SPE) rồi sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector

UV (HPLC-UV) hoặc sắc kí khí với detector quang phổ khối (GC-MS) thường được sử dụng rộng rãi để xác định paraben trong mỹ phẩm

Phương pháp chính thức để xác định paraben trong mỹ phẩm thì chỉ có phương pháp do EU thiết lập (Hình 1.2) Quy trình này phải qua nhiều khâu cho cả định tính và định lượng paraben Mặc dù vậy, trong quy trình định tính thì acid 4-hydroxybenzoic, methylparaben, ethylparaben và benzylparaben là không tách biệt Ngoài ra sự đồng tan của nhiều chất bảo quản khác và phụ gia mỹ phẩm là có thể ảnh hưởng đến việc định lượng Như vậy cần phải cải tiến phương pháp xử lý mẫu sao cho đơn giản, giảm thời gian xử lý, và để thu được các thông số phân tích tốt hơn Mục tiêu chính là nhằm đơn giản hóa việc chuẩn bị mẫu khi không gă ̣p vấn đề về nền mẫu

ĐỊNH LƯỢNG

Lắc 1 phút Thêm 10 ml chuẩn nội

Thêm 1 ml H 2 SO 4 2M và 50 ml EtOH/H 2 O (10:1)

Làm nguội Đun nóng 60°C (5 phút)

Chiết bằng 75 ml diethyl ether, lắc 1 phút

Điều chỉnh pH của lớp nước tới 2

(HCl)Chiết bằng diethyl ether trong 10phút,

lắc 1 phút

Thêm 60 ml nước vào 20 ml dịch chiết mẫu

Làm lạnh

Điều chỉnh pH đến 3 Chiết (40 ml Aceton, 60°C)

Acid hóa bằng 4 giọt HCl

Lọc

MẪU MỸ PHẨM (1g)

Hình 1 2 Phương pháp phân

1.1.6 Ca ́ c phương pháp xử lý mẫu

thể xảy ra do không có sự loại bỏ nền mẫu trong các quy trình này Pha loãng mẫu được thực hiện với dung môi, chẳng hạn như methanol [51], [62], ethanol [5], n-propanol [25], ethyl acetate [30], hoặc thậm chí là nước [46] Đồng nhất mẫu pha loãng thường được thực hiện bằng lắc xoáy, khuấy trộn hoặc siêu âm [5]

Trong hầu hết các trường hợp, pha loãng mẫu và đồng nhất hóa được thêm các bước tách bổ sung, ly tâm hoặc lọc, để loại bỏ một tỉ lệ lớn nền mẫu [62], [51] Các quá trình khác, như đun nóng, có thể là cần thiết khi mẫu có chứa một lượng lớn các thành phần tan trong chất béo [25], [12] Nói chung, thời gian chuẩn bị mẫu

từ 3-75 phút Các kỹ thuật phân tách như sắc kí lỏng (LC) [62], [25], [12], điện di mao quản (CE) [51], [46], [5] hoặc ít gặp hơn - sắc kí khí (GC) [30] là cần thiết để giúp tránh các nhiễu còn lại Kỹ thuật điện hóa hầu như không được sử dụng cho mục đích này

Một số vấn đề có thể gặp phải như ảnh hưởng nền mẫu với propylparaben hoặc methylparaben [62], sự tuyến tính kém trong việc dựng đường chuẩn đối với methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben [51] Phương pháp thêm chuẩn là cần thiết để dựng đường chuẩn trong nhiều trường hợp [5] Ngoài ra, trực

[12] đã báo cáo sự xuống cấp của cột trong sắc kí lỏng sau 100 lần tiêm Do đó, cần

sử dụng các phương pháp thích hợp để chiết xuất paraben trước khi tách sắc kí để loại trừ nhiễu nền Một loạt các phương pháp chiết xuất đã được công bố trong những năm gần đây:chiết pha rắn (SPE), chiết xuất pha rắn với sợi (SPME), vi

để cải thiện việc tách các nhiễu nền Số lượng các ứng dụng của các phương pháp này đang ngày càng gia tăng Tuy nhiên, một số vấn đề còn tồn tại, cụ thể là:

(1) SFE có thể được sử dụng để xác định paraben trong mỹ phẩm mà không cần tiền xử lý mẫu, nhưng điều chỉnh độ phân cực và áp lực vận hành cao là cần thiết;

(2) Không thể được loại bỏ hoàn toàn việc tiền xử lý mẫu khi SPE và SPME, đặc biệt trong pha loãng mẫu là cần thiết, tuy nhiên lại làm giảm độ nhạy;

(3) Mặc dù các chất hấp thụ liên kết hóa học silica như C18 hoặc C8 được dùng phổ biến trong xác định paraben, nhưng vấn đề chọn lọc sử dụng các pha cần được quan tâm;

(4) Các mẫu mỹ phẩm có thể gây tắc nghẽn các cột SPE và rút ngắn tuổi thọ sợi trong SPME

sinh [41], đặc biệt là sự hình thành nhũ tương ổn định Garcia Jimenez và cô ̣ng sự [24] đã trộn mẫu với 1 mL HCl (1: 1) và 10 mL NaCl bão hòa, 50 mL dietyl ether được sử dụng làm pha hữu cơ để chiết paraben từ keo bọt và gel làm sạch Sau ba

hơi đến khô; (5) Hòa tan với acetonitrile (ACN) Một cột sắc ký nguyên khối trong ống phân tích dòng chảy (FI) phân tách MP, EP, PP và BP trong các di ̣ch chiết này

khác nhau đã bi ̣ hạn chế bởi chiều dài cột

1.1.6.1 Chiết pha rắn – kĩ thuật mới để chiết paraben từ mỹ phẩm

Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng chiết lỏng lỏng đặt ra các vấn đề thực tế khi phân tích các mẫu mỹ phẩm, đặc biệt là sự hình thành nhũ tương, các bước bổ sung và tốn nhiều dung môi hữu cơ [41] Chiết pha rắn cải thiện các vấn đề này, do

đó rất nhiều ứng dụng của chiết pha rắn để xác định paraben đã được công bố

al [15] đã phân tích các loại kem, gel hoặc lotion có dầu, sau khi khuấy chúng với ethanol, lọc, rửa với hỗn hợp đệm natri tetraborat và ACN, pha loãng với nước và đuổi khí Sau đó, việc chiết xuất paraben được thực hiện bằng cách sử dụng cột C8

trên một hệ thống sắc ký điện động micell SPE phân tích dòng phun MEKC) Mặc dù vậy, nó không ngăn cản sự hình thành các bong bóng trong quá trình rửa giải với loại mẫu này

(FIA-SPE-Vì các quy trình SPE phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của chất hấp thụ, nên

phân cực và phân cực để xác định chúng Các chất hấp thụ liên kết hoá học có chứa silica, chẳng hạn như C18 hoặc C8 (pha đảo để chiết xuất chất không phân cực đến

số vấn đề chọn lọc liên quan đến việc sử dụng các pha này đã được nhấn mạnh [20],

vì vậy có thể cần các quy trình bổ sung, như làm khô và pha loãng, lọc và siêu âm sau khi SPE để cải thiện việc tách sắc ký khi sử dụng HPLC

Để tăng tính chọn lọc, các chất hấp thụ mới đã được đề xuất, như là các ống nano cacbon (CNTs), graphene và các hạt từ được chức hóa Các loại CNT đa vách (MWCNTs), với bề mặt có tính kị nước cao, tạo thuận lợi cho việc hấp thụ paraben theo cách chọn lọc, có thể tái tạo được khi sử dụng một pH thích hợp để tránh ion hóa paraben (trong trường hợp này là pH3) Các mẫu mỹ phẩm đã được pha loãng với nước để giảm thiểu sự chồng chéo lên nhau các tín hiệu sắc ký của MP, EP và các thành phần nền nhất định Bước clean-up giữa các mẫu cho phép tái sử dụng cùng một cột lên đến 200 lần Gần đây, một quy trình chiết pha rắn dựa trên graphene đã được phát triển cho phân tích MP, EP, PP và BP trong các mẫu mỹ

Các hạt nano từ tính bề mặt được chức hóa (NPs) cũng được sử dụng để chiết xuất ba paraben trong mẫu anion (pH> 8) từ kem và các mẫu kem đánh răng

pháp trùng hợp anilin với sự hiện diện của NPs và môi trường sulfuric Các NPs điện tích dương có thể giữ lại paraben bằng tương tác tĩnh điện, nhưng phải cần đến tiền xử lý mẫu trước đó (siêu âm với methanol, pha loãng nước, ly tâm, lọc và pha

và tái tạo bởi ACN Nhìn chung, quy trình SPE này được đặc trưng bởi thời gian chiết ngắn và không cần bước ly tâm hoặc lọc

1.1.6.2 Phân tán pha rắn - Matrix solid-phase dispersion (MSPD)

MSPD được sử dụng thành công cho các mẫu nhớt, rắn hoặc bán rắn, vì vậy

nó rất phù hợp với các mẫu mỹ phẩm Trong các quy trình MSPD, mẫu được phân tán lên chất hấp thụ rắn và sau đó được đưa vào một cột để phân tách Phương thức SPE này đã được đề xuất để xác định paraben trong nhiều loại mỹ phẩm, chẳng hạn như các sản phẩm lưu lại trên da và sản phẩm rửa trôi (ví dụ kem dưỡng thể, kem dưỡng ẩm, kem chống rạn da, kem bôi tay, make-up, kem chống nắng, thuốc khử mùi, dầu gội đầu, xà phòng nước và xà phòng rửa tay) [28] Mẫu mỹ phẩm trộn với

silica gel hoặc cát) vào một cối thủy tinh Tính chất của chất phân tán có tầm quan trọng đặc biệt đối với việc chiết xuất paraben Hỗn hợp đã được chuyển vào một cột với Florisil, và hexane / axeton (1: 1) để lấy một dịch chiết 5 mL Tạo dẫn xuất với

thường

1.1.6.3 Vi chiết xuất pha rắn ở dạng phân tán - Dispersive micro-solid-phase extraction (D-SPE)

độ SPE thay thế có thể tạo điều kiện cho việc phân tích loại mẫu này D-SPE là một

chung, các vấn đề liên quan đến sự tắc nghẽn cột và sự chậm trễ của các quy trình vận hành được loại bỏ Kỹ thuật này đã được sử dụng để xác định paraben trong dung dịch nước súc miệng và kem rửa tay, sử dụng các NPs từ tính chức hóa aminopropyl bằng GC với detector ion hoá ngọn lửa (GC-FID) [33] Chỉ có 5 mg NPs được sử dụng cùng với 10 mL dung dịch mẫu Mặc dù vậy, tiền xử lý mẫu là cần thiết Mẫu nước súc miệng được pha loãng hai lần với nước và kem tay đã được

pha loãng 5000 lần, siêu âm trong 30 phút và ly tâm trước khi chiết Các NPs từ tính được thu lại một cách dễ dàng ở đáy của ống hình nón bằng cách sử dụng từ trường bên ngoài Độ thu hồi từ 87 đến 100%

1.1.6.4 Chiết xuất pha rắn với sợi - Solid-phase microextraction with fibers (SPME)

SPME được phát triển như một giải pháp thay thế nhỏ gọn cho SPE, do chỉ

sử dụng một lượng nhỏ chất hấp thụ Cấu hình phổ biến nhất của SPME bao gồm các sợi silica nung chảy phủ polymer phù hợp như chất hấp thụ Có thể sử dụng hai chế độ SPME với sợi (SPME trực tiếp và SPME không gian hơi) Do tính chất không bay hơi của paraben nên trong phần lớn các trường hợp thường sử dụng SPME trực tiếp, tuy nhiên SPME không gian hơi cũng đã được áp dụng cho xác định paraben trong mỹ phẩm Việc xử lý làm giàu mẫu trước là cần thiết cho việc

áp dụng SPME trực tiếp vào mỹ phẩm Mặc dù SPME không gian hơi có thể thuận

dụng chế độ này

Như trong SPE, độ phân cực của paraben xác định loại lớp phủ được sử dụng Các sợi silica thương mại phủ polyacrylate (PA) thường được sử dụng để

các sợi thương mại khác nhau được phủ PA polydimethylsiloxane (PDMS), polydimetylsiloxan / divinylbenzen (PDMS / DVB), carboxen / polydimetyl-siloxan (CAR / PDMS) và Carbowax / divinylbenzene (CW / DVB) Việc xử lý mẫu trước

là cần thiết Do đó, ethanol được sử dụng để pha loãng và cải thiện sự phân tán của mẫu (0,1g mẫu trong 2 mL ethanol) và cần phải pha loãng với nước PA cho hiệu quả khai thác lớn nhất đối với paraben trong mỹ phẩm

Các chất hấp thụ mới cũng đã được đề xuất để đạt được tính chọn lọc, độ lặp

polyaniline-polypyrrole lắng đọng bằng điện hóa cho việc chiết xuất MP, EP và PP trong các loại nước dưỡng trên mặt đã được pha loãng 10 lần trước khi phân tích

Sự chọn lọc của lớp phủ là chìa khóa trong công việc này, ưu tiên là các hydrocarbon thơm trong sự có mặt alcol mạch ngắn và ceton Lớp phủ này có hiệu quả để xác định paraben trong mỹ phẩm có chứa ethanol bằng GC-FID Phương pháp thêm chuẩn là cần thiết để lập đường chuẩn

diacrylate poly (ethylene glycol) để có được các sợi thích hợp nhằm xác định paraben không anion trong mỹ phẩm Tính ổn định và khả năng tái lặp tốt, diện tích

khác nhau, chẳng hạn như kem chống nắng, kem/ nước thoa tay đã được pha loãng với dung dịch NaCl ở pH 5 (tỷ lệ pha loãng 1:25) và siêu âm trong 10 phút Ở đây

các sợi này

Chỉ có một ứng dụng của SPME không gian hơi đã được công bố để xác định

và SPME không gian hơi đối với GC-MS để xác định paraben và các chất chống

trifluoroacetamid và sản phẩm sau đó được hấp phụ trên sợi PA

1.1.6.5 Chiết xuất hấp thu ̣ trên thanh khuấy - Stir-bar sorptive extraction (SBSE)

định MP, EP, PP và BP trong mỹ phẩm bằng LC-UV Một thanh khuấy thương mại

có phủ sẵn PDMS được đưa vào lọ được đun nóng ở 40°C với 50 mg mẫu trước đó

thanh khuấy đã được xác nhận

Như trong SPE và SPME, cần thiết phải pha loãng mẫu đáng kể để tránh các

thấp từ mỹ phẩm SBSE có giới hạn phát hiện (LOD) tương tự như thu được trong

năng thương mại hóa nên đã hạn chế viê ̣c sử dụng kỹ thuật này

1.1.6.6 Kỹ thuật dựa trên vi chiết pha lỏng - Liquid-phase based techniques (LPME)

phương pháp khác nhau nhằm giảm thiểu việc sử dụng các dung môi độc hại và tích

để xác định paraben trong các mẫu mỹ phẩm, chẳng hạn như vi chiết đơn gio ̣t

emulsification microextraction - USAEME), dựa trên nguyên tắc SDME và DLLME, cũng được đề xuất để xác định paraben trong mỹ phẩm

Mirmahdieh [36] để xác định MP, EP, BP, PP và iso-propyl-paraben trong một số

mỹ phẩm nền nước (nước súc miệng, tẩy trang và gel tóc) bằng GC -MS Với sự

(lên đến 1200 lần) Khi độ nhạy được so sánh với các phương pháp khác

SFODME đã được sử dụng để phân tích kem chống nắng, gel sau cạo râu và các loại kem bằng HPLC-UV [34] Trong trường hợp này, 30 µL dung môi siêu phân tử có điểm nóng chảy là 10°C, các túi của axit decanoic và tetra-butyl amoni hydroxit, được đặt trên mẫu đã pha loãng (5 mg mẫu trong 150 mL của một dung dịch nước chứa methanol và HCl) Sau khi khuấy, lọ mẫu được làm lạnh để làm rắn chất chiết xuất, dễ dàng tách ra bằng cách ly tâm Sau đó, nó đã tan chảy trước khi

đo LOD tương tự hoặc thậm chí tốt hơn so với các phương pháp chiết xuất khác

Ngược lại với SDME, HF-LPME cho phép ổn định dung môi Msagati et al [58] đề xuất xác định paraben trong các sản phẩm chăm sóc da, gel sửa chữa tóc và dung dịch xà phòng làm sạch bằng HPLC-UV sau HF-LPME Trong trường hợp này, dung môi hữu cơ (di-n-hexyl ether) được cố định trong các lỗ rỗng của một sợi rỗng, bên trong có một dung dịch tiếp nhận (pH 11,8) Chiết xuất trong 30 phút với

định paraben trong mỹ phẩm Farajzadeh và cô ̣ng sự [37] đã sử dụng 20 µL octanol làm dung môi và 0,5 mL aceton làm chất phân tán để xác định paraben trong dung

LPME khác, pha loãng mẫu là cần thiết (ví dụ: pha loãng 1: 100 với nước khử ion)

phân tán và chloroform làm dung môi chiết xuất [47] Một tiền xử lý đầy đủ cho các

mẫu mỹ phẩm là cần thiết, cụ thể là, chiết xuất ethanol, lắc xoáy siêu âm, ly tâm,

Như đã đề cập, UAEME là một cách tiếp cận với DLLME sử dụng năng lượng siêu âm để thúc đẩy nhũ tương hóa Yamini và cô ̣ng sự [63] đã sử dụng UAEME để xác định MP, EP và PP với 40 µL octanol bằng HPLC-UV Dung môi được tiêm từ từ vào một lọ ly tâm chứa mẫu nước, sau đó được đặt bên trong bồn nước siêu âm và nhũ tương hình thành được ly tâm để tách pha hữu cơ Nói chung, DLLME cung cấp các quy trình nhanh hơn, nhạy hơn so với SDME và HF-LPME

sạch mẫu là cần thiết trong mọi trường hợp

1.1.6.7 Chiết xuất siêu tới hạn - Chiết xuất siêu tới hạn (SPE)

SFE đã được sử dụng để xác định paraben trong mỹ phẩm mà không cần

paraben, nên tính tới độ phân cực paraben vì nó có thể ảnh hưởng đến việc chiết

siêu tới hạn trước khi xác định MP, EP, PP và BP bằng phương pháp HPLC Các mẫu mỹ phẩm đã được cân trực tiếp trên một mảnh giấy lọc và sau đó chèn vào cell chiết xuất Thời gian chiết xuất 7 phút và nhiệt độ 60 ° C đủ để thu hồi lượng paraben Tuy nhiên, cần phải có áp lực vận hành cao (khoảng 27.500 kPa)

Bên cạnh áp lực gia tăng, bổ sung một số chất nền (ví dụ, methanol, ethanol, ACN hoặc axit axetic) có thể làm tăng tính hòa tan của CO2, vì vậy nó phù hợp hơn cho paraben Như vậy, Wang và cộng sự [53] đã sử dụng CO2 siêu tới hạn với 0.05% ACN để chiết MP, EP, PP và BP trước khi tách bằng điện di mao quản vùng Với một lượng nhỏ ACN việc chiết xuất paraben thư ̣c

Lee và cộng sự [38] đã sử dụng một hỗn hợp của mẫu mỹ phẩm và cát biển (nền trơ) để làm đầy lớp vỏ chiết Bằng cách này, bề mặt mẫu tăng lên, cho phép

động ở 14.000 kPa và 65 °C LC-MS được sử dụng để xác định bốn paraben SFE cũng đã được sử dụng trực tuyến với headspace SPME và GC-MS [60] Các mẫu

mỹ phẩm được chiết xuất với CO2 siêu tới hạn ở mức 13.840 kPa và 55°C trong thời gian chiết tĩnh 10 phút, sau đó là 15 phút chiết động

1.1.6.8 Chiết lỏng cao áp - Pressurized liquid extraction (PLE)

kem, kem dưỡng da và các sản phẩm chăm sóc tóc Viê ̣c chiết xuất được thực hiện trong 15 phút ở 120 °C và 1500 psi với hỗn hợp hexane và axeton (1: 1) Việc tách đồng thời một số thành phần không liên quan từ nền mỹ phẩm đã được giảm thiểu

vào tế bào PLE Không có ảnh hưởng nền được quan sát thấy trong những điều kiện này

Mặc dù sự phát triển của các chiến lược nhằm đơn giản hóa và đẩy nhanh việc chuẩn bị mẫu cần được theo đuổi, điều này không phải lúc nào cũng khả thi

do tính chất phức tạp của nền mẫu mỹ phẩm Xu hướng tương lai trong lĩnh vực này sẽ tập trung vào việc phát triển các quy trình khai thác mới cho phép làm sạch các mẫu mỹ phẩm, do đó tránh nhiễu mà không mất độ nhạy Các vật liệu nano có thể đóng góp vào việc đạt được các mục tiêu này, vì chúng có thể được

sử dụng trong chiết xuất pha rắn (SPE), vi chiết và cả lọc Các máy nano đã cho thấy khả năng trích xuất nhiều loại hợp chất vì bề mặt của chúng được phủ các phân tử chức năng, polyme hoặc các hạt nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả làm giàu mẫu

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.2.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của

sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố

đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ

phân tích

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc

ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2]

1.2.2 Cấu tạo máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu

Hình 1 3 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

Bộ phận tiêm mẫu

Cột sắc ký Detector

1.2.3 Detector và bộ phận ghi tín hiệu

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector khối phổ: thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như các chất có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp chất phân cực

Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí

1.2.4.1 Thời gian lưu

Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detector được gọi

không lưu gọi là thời gian chết

1.2.4.2 Đô ̣ phân giải

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

W1/2 1, W1/2 2 : lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

1.2.4.5 Tính đối xứng của píc sắc kí

b: nửa chiều rộng phía sau píc

a: nửa chiều rộng phía trước píc

1.2.4.6 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc kí được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng píc nhỏ

- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS)

1.2.5.2 Phân tích định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc [2]: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

Trong luận văn này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

❖ Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

❖ Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến

hành sắc ký Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định

S = a x C + b

S: Diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

C = (S-b)/a

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong

khoảng nồng độ tuyến tính của đường chuẩn

1.2.6 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – Vis, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – Vis (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic

Hình 1 4 Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có khả năng vẽ phổ UV – Vis của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để

Khi hệ số match xấp xỉ 1 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn Hệ

số match trên 0,90 thì chỉ ra hai phổ tương tự Hệ số match càng gần 1 thì sự tương

tự của hai phổ càng cao Hệ số match dưới 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau